CN111888390A - 夏桑菊提取物在抑制人类冠状病毒中的应用 - Google Patents

夏桑菊提取物在抑制人类冠状病毒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了夏桑菊提取物在抑制人类冠状病毒中的应用，所述的夏桑菊提取物包含夏桑菊浸膏和野菊花浸渍液，其中夏桑菊浸膏作用浓度为0‑32.77mg生药/mL、野菊花浸渍液作用浓度为0‑0.0.35mg生药/mL，且二者作用浓度不同时为0。本发明为治疗人类冠状病毒引起的疾病的提供了一种新思路，本发明提供的方法实施简单，抑制效果显著，且原料易得，适于推广。

Description

夏桑菊提取物在抑制人类冠状病毒中的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及夏桑菊浸膏和野菊花浸渍液在抑制人类冠状病毒中的应用。
背景技术
冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一个大型病毒家族，在自然界广泛存在。冠状病毒仅感染脊椎动物，与人和动物的多种疾病有关，可引起人和动物呼吸道、消化道和神经系统疾病。
已知感染人的冠状病毒共有7种，其中四种在人群中较为常见(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1)，另外三种是MERS病毒(中东呼吸综合征病毒MERS-CoV)、SARS病毒(严重急性呼吸综合征病毒SARS-CoV)和2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。
夏桑菊为夏枯草、桑叶、野菊花三味药材经加工制成，具有清肝明目，疏风散热，除湿痹，解疮毒之功效。夏桑菊可以用于风热感冒，目赤头痛，高血压，头晕耳鸣，咽喉肿痛，疔疮肿毒等症。
夏桑菊还具有清除自由基、消炎、抑病毒等作用。据报道，星群夏桑菊配方有效部位成分具有杀灭甲型流感病毒H3N2亚型、高致病性禽流感病毒H5N1亚型和乙型流感病毒株的作用，可用于人的甲型流感、乙型流感和禽流感的防治。经实验验证，夏桑菊作用流感病毒感染的细胞株后可抑制Iκκα、Iκκβ、NF-κBp50、NF-κBp65的磷酸化，且作用随时间延长而增强，表明夏桑菊对流感病毒的抑制作用可能是通过抑制NF-κB的激活而发挥作用的。
中国专利201610345710.7中公开了夏桑菊在制备防治登革热的药物中的新应用，在体外培养细胞中进行夏桑菊的抗病毒试验，检测药物对登革热DENV-1病毒的抑制作用，结果表明，夏桑菊在体外细胞水平具有抑制登革热DENV-1病毒的致细胞病变的作用，在登革热DENV-1病毒经夏桑菊预处理后感染细胞后，抗病毒效果明显。
目前尚未有夏桑菊在抑制人类冠状病毒作用方面的专利或报道。本发明的提出为2019-nCoV疫情防控工作提供的一条新思路。
发明内容
本发明提供的夏桑菊浸膏和野菊花提取物在抑制人类冠状病毒中的应用，实施方法简单，抑制效果显著，且原料易得，适于推广。
一方面，本发明提供了夏桑菊提取物在抑制人类冠状病毒中的应用。
所述的夏桑菊提取物包含夏桑菊浸膏和野菊花浸渍液。
所述夏桑菊浸膏的作用浓度为0-32.77mg生药/mL，所述野菊花浸渍液作用浓度为0-0.0.35mg生药/mL，且二者的作用浓度不同时为0。
优选地，所述夏桑菊浸膏的作用浓度为32.77mg生药/mL，所述野菊花浸渍液作用浓度为0.35mg生药/mL。
所述夏桑菊浸膏的制备方法为：以夏枯草∶桑叶∶野菊花重量比为500∶175∶80为原料，取原料中野菊花重量的8％-20％，加所取野菊花重量的1.5-10倍的50％-95％体积浓度的乙醇溶液，在15℃-40℃下用浸渍法或渗漉法提取得野菊花醇提取物I；
取余下的野菊花和夏枯草和桑叶，加水煎煮1-3次，每次1-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约药材重量1/2，得浓缩液，然后加乙醇至浓缩液中，使浓缩液的含醇量体积浓度达63％后，静置过夜24小时以上，滤取上清液，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度在30℃为1.25-1.26的浸膏，为水提取物II；
合并野菊花醇提取物I和水提取物II。
所述野菊花浸渍液的制备方法为浸渍法或渗漉法；
所述的浸渍法为取野菊花，分成三份，三份的重量比为4-6∶2-4∶1-3，分别装入容器中，用1.5-3倍的野菊花重量的95％乙醇浸渍，先加入第1份中，浸渍1-3天后，放出液移入第2份中，浸渍1-3天后，放出液移入第3份中，浸渍1-3天后，浸出液滤过，得野菊花醇提取物；
所述的渗漉法为取野菊花，装入渗漉筒中，加入野菊花重量的2-3倍的95％体积浓度的乙醇溶液浸泡12小时-24小时后，再加入野菊花重量的7-8倍95％体积浓度的乙醇以每分钟1-4mL的流速进行渗漉，收集乙醇液即得野菊花醇提取物。
所述的人类冠状病毒为2019-nCoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV中的一种或多种。
优选地，所述的人类冠状病毒为HCoV-229E，所述的HCoV-229E在感染细胞时的滴度为50-200TCID50。
另一方面，本发明提供了一种抑制人类冠状病毒的药物组合物。
所述的组合物中包括0-32.77mg生药/mL的夏桑菊浸膏和0-0.0.35mg生药/mL的野菊花提取物，且二者的浓度不同时为0。
所述夏桑菊浸膏的制备方法为：以夏枯草∶桑叶∶野菊花重量比为500∶175∶80为原料，取原料中野菊花重量的8％-20％，加所取野菊花重量的1.5-10倍的50％-95％体积浓度的乙醇溶液，在15℃-40℃下用浸渍法或渗漉法提取得野菊花醇提取物I；
取余下的野菊花和夏枯草和桑叶，加水煎煮1-3次，每次1-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约药材重量1/2，得浓缩液，然后加乙醇至浓缩液中，使浓缩液的含醇量体积浓度达63％后，静置过夜24小时以上，滤取上清液，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度在30℃为1.25-1.26的浸膏，为水提取物II；
合并野菊花醇提取物I和水提取物II。
所述野菊花浸渍液的制备方法为：浸渍法或渗漉法；
所述的浸渍法为：取野菊花，分成三份，三份的重量比为4-6∶2-4∶1-3，分别装入容器中，用1.5-3倍的野菊花重量的95％乙醇浸渍，先加入第1份中，浸渍1-3天后，放出液移入第2份中，浸渍1-3天后，放出液移入第3份中，浸渍1-3天后，浸出液滤过，得野菊花醇提取物；
所述的渗漉法为：取野菊花，装入渗漉筒中，加入野菊花重量的2-3倍的95％体积浓度的乙醇溶液浸泡12小时-24小时后，再加入野菊花重量的7-8倍95％体积浓度的乙醇以每分钟1-4mL的流速进行渗漉，收集乙醇液即得野菊花醇提取物。
优选地，所述的组合物中包括32.77mg生药/mL的夏桑菊浸膏和0.35mg生药/mL的野菊花提取物。
再一方面，本发明提供了一种医疗器械或医疗设施。
所述的医疗器械或医疗设施包含前述的抑制人类冠状病毒的药物组合物。
本发明提供的夏桑菊提取物在抑制人类冠状病毒时，能降低病毒核酸的表达作用，能够有效防止冠状病毒感染引起的病变，且细胞毒性小。本发明提供的夏桑菊提取物制备方法简单，原料易得，有很好的实际应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1夏桑菊浸膏和野菊花浸渍液在体外培养A549细胞上对人类冠状病毒(HCoV-229E)的抑制作用
夏桑菊浸膏来自广州白云山星群(药业)股份有限公司，批号为B200208，其药物含量为7.78g生药/g。
其具体制备方法为：以夏枯草∶桑叶∶野菊花重量比为500∶175∶80为原料，取原料中野菊花重量的8％-20％，加所取野菊花重量的1.5-10倍的50％-95％体积浓度的乙醇溶液，在15℃-40℃下用浸渍法或渗漉法提取得野菊花醇提取物I；
取余下的野菊花和夏枯草和桑叶，加水煎煮1-3次，每次1-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约药材重量1/2，得浓缩液，然后加乙醇至浓缩液中，使浓缩液的含醇量体积浓度达63％后，静置过夜24小时以上，滤取上清液，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度在30℃为1.25-1.26的浸膏，为水提取物II；
合并野菊花醇提取物I和水提取物I。
野菊花浸渍液来自广州白云山星群(药业)股份有限公司，批号为B200202，药液浓度为1.33g生药/mL。
其具体制备方法为渗漉法：取野菊花，装入渗漉筒中，加入野菊花重量的2-3倍的95％体积浓度的乙醇溶液浸泡12小时-24小时后，再加入野菊花重量的7-8倍95％体积浓度的乙醇以每分钟1-4mL的流速进行渗漉，收集乙醇液即得野菊花醇提取物。
本实施例将夏桑菊浸膏和野菊花浸渍液复配得到原药，原药的配制方法如下：
按夏桑菊浸膏(g)：野菊花浸渍液(mL)＝16:1混合。
得到的原药中夏桑菊浸膏浓度为1.08g浸膏/mL，即8.40g生药/mL；野菊花浸渍液的浓度为67.16μL浸渍液/mL，即89.32mg生药/mL。
以上原药在实验中需要稀释时采用DMEM培养基按照体积比例稀释后使用。
本实施例中所使用的相关实际来源信息如下：
Figure BDA0002652830170000051
实施例中所选用的人肺癌细胞A549购自北京北纳创联生物技术研究院，常规方法传代，液氮保存备用。
人类冠状病毒(HCoV-229E)，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，常规方法传代，-80℃冰箱保存备用。
本实施例中细胞病变的判断按以下6级标准：
－：细胞生长正常，无病变出现；
±：细胞病变少于整个单层的10％；
+：细胞病变约占整个单层细胞的25％以下；
++：细胞病变约占整个单层细胞的50％以下；
+++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以下；
++++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。
1、药物对体外培养A549细胞的毒性试验
原药按1:16倍比稀释为药液，再做2倍倍比稀释，共8个稀释度，加到已长成单层的A549细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度做4个复孔，同时设置正常细胞作为对照组。将培养板置37℃，5％CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，连续96h，确定细胞不出现明显病变的最低稀释倍数(最大无毒浓度TC0)，并按Reed-Muench法计算50％细胞毒性浓度(TC50)。药物对体外培养A549细胞的毒性作用检测结果如下所示：
Figure BDA0002652830170000061
注：1111,2222,3333,4444指每个浓度做4个复孔，结合细胞病变判断标准，1111代表4个复孔上每个复孔的病变程度均为+(25％以下)，2222代表4个复孔上每个复孔的病变程度均为++(50％以下)，3333代表4个复孔上每个复孔的病变程度均为+++(75％以下)，4444代表每个复孔病变程度均为4个+(75％以上)。
计算结果如下：
Figure BDA0002652830170000062
以上结果显示了药物的最大无毒浓度(TC0)，以下试验时采用TC0浓度以下的6个浓度(1:256、1:512、1:1028、1:2048、1:4096、1:8192)进行。
2、药物在体外培养A549细胞上对人类冠状病毒(HCoV-229E)的抑制作用
取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接种HCoV-229E病毒液，接种滴度为100TCID50，100μL/孔，置37℃、5％CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，依次加入无毒浓度以下6个稀释度(1:256、1:512、1:1028、1:2048、1:4096、1:8192)的各药液，100μL/孔，每个稀释度做4个复孔，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃、5％CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，96小时后病毒对照组细胞病变为+++至++++时记录试验结果。并取上清液检测病毒核酸。
按Reed-Muench计算50％抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI)，TI＝TC50/IC50。
3、病毒核酸检测方法(RT-PCR法)
(1)细胞中核酸的裂解处理：
1)按照说明书将各个试剂配好备用；
2)吸取560μL配制好的Buffer AVL-carrier RNA至1.5mL的离心管中；
3)加入140μL细胞培养上清液至第2步准备好的管中，涡旋振荡15秒；
4)室温下(15-25℃)孵育10分钟；5)快速离心以去除附着于内壁与内盖的水滴；
6)加入560μL乙醇(96-100％)至样本中，短暂离心15秒混匀，混匀后，快速离心去除附着于内壁与内盖的水滴；
7)小心吸取630μL上一步获得的溶液至QIAamp Mini column上(柱子放置于1个2毫升的收集管内)，小心不要碰到柱子的边缘，盖上盖子，6000x g(8000rpm)下离心1分钟。将QIAamp Mini column移至一个新的2mL收集管，丢弃带有流出液的旧管；
8)小心打开盖子，重复第7步操作；
9)小心打开盖子，加入500μL Buffer AW1，盖上盖子，6000x g(8000rpm)下离心1分钟，将QIAamp Mini column移至一个新的2mL收集管，丢弃带有流出液的旧管；
10)小心打开盖子，加入500μL Buffer AW2，盖上盖子全速离心(20000x g；14000rpm)3分钟；
11)将柱子放在一个干净的1.5mL的离心管，丢弃含有流出液的旧管，小心打开盖子，加60μL平衡好的Buffer AVE至膜上，盖上盖子，室温下孵育一分钟，6000x g(8000rpm)离心1分钟，于-20℃可保存1月或-80℃下保存1年。
(2)核酸测定：
1)对照品核酸处理：DEPC-H2O作为阴性对照。阳性对照品进行10、100、1000倍梯度稀释。
2)试剂配制：取n×18μL HCoV-229E核酸荧光PCR检测混合液，n×1μL内部对照品，与n×1μL RT-PCR酶(n为反应管数)，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒。
3)加样：取上述混合液20μL置于PCR管中，然后将样品核酸提取液、DEPC-H2O、阳性对照品各5μL分别加入PCR管中，改进管盖，离心数秒使所有液体置于底部，立即进行PCR扩增反应。
4)PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪，循环参数设置为：45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃，反应体系为25μL。
荧光通道检测选择：选用FAM和HEX/VIC/JOE通道。
备注：若使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。
5)计算方法：
通道 Ct值 结果判断
1 FAM UNDET或40 样本低于检测值限，报告为阴性
2 FAM ≦38 报告为阳性
3 FAM 38-40 复检一次，如仍为38-40，则报告为阴性
药物在体外培养A549细胞上对HCoV-229E的抑制作用实验中细胞病变结果数据如下：
Figure BDA0002652830170000081
注：1111,2222,3333,4444指每个浓度做4个复孔，结合细胞病变判断标准，1111代表4个复孔上每个复孔的病变程度均为+(25％以下)，2222代表4个复孔上每个复孔的病变程度均为++(50％以下)，3333代表4个复孔上每个复孔的病变程度均为+++(75％以下)，4444代表每个复孔病变程度均为4个+(75％以上)。
Figure BDA0002652830170000082
以上结果显示：混合药物对HCoV-229E致体外培养A549细胞病变有一定程度的抑制作用，作用强度的大小与药物浓度相关，IC50为2.8μL混合药物/mL，即夏桑菊浸膏23.53mg生药/mL、野菊花浸渍液0.25mg生药/mL。
药物在体外培养A549细胞上对HCoV-229E的抑制作用实验中RT-PCR核酸检测结果如下：
Figure BDA0002652830170000091
结果显示：细胞对照组无HCoV-229E病毒核酸表达；病毒感染后对照组可检测出HCoV-229E病毒核酸高表达；夏桑菊浸膏和野菊花浸渍液混合物在药物浓度3.9μL混合物/mL时，即含有夏桑菊浸膏32.77mg生药/mL、野菊花浸渍液0.35mg生药/mL，有一定降低HCoV-229E病毒核酸表达作用。
结果分析：
本试验采用人类冠状病毒HCoV-229E病毒感染体外培养A549细胞模型，通过观察药物的TC0、TC50、IC50、TI以及病毒核酸表达量，评价药物在体外对HCoV-229E的抑制作用。根据本实验可以得到以下结论：
1、夏桑菊提取物对体外培养A549细胞的最大无毒浓度为夏桑菊浸膏32.77mg生药/mL、野菊花浸渍液0.35mg生药/mL。
2、在无毒浓度下夏桑菊提取物在体外对HCoV-229E感染引起A549细胞病变有一定程度的抑制作用，TI＝2。
3、夏桑菊提取物在含有夏桑菊浸膏32.77mg生药/mL、野菊花浸渍液0.35mg生药/mL的药物浓度下，有一定降低HCoV-229E病毒核酸表达作用。
实施例2夏桑菊浸膏和野菊花浸渍液在体外培养A549细胞中对人类冠状病毒(HCoV-HKU1)的抑制作用
参考实施例1的方法，检测夏桑菊浸膏和野菊花浸渍液在体外培养A549细胞中对人类冠状病毒(HCoV-HKU1)的抑制作用。
结果表明：
1、夏桑菊提取物对体外培养A549细胞的最大无毒浓度为夏桑菊浸膏32.77mg生药/mL、野菊花浸渍液0.35mg生药/mL。
2、在无毒浓度下夏桑菊提取物在体外对HCoV-HKU1感染引起A549细胞病变有一定程度的抑制作用，TI＝2。
3、夏桑菊提取物在含有夏桑菊浸膏32.77mg生药/mL、野菊花浸渍液0.35mg生药/mL的药物浓度下，有一定降低HCoV-HKU1病毒核酸表达作用。

Claims (10)

1.夏桑菊提取物在抑制人类冠状病毒中的应用，其特征在于，所述的夏桑菊提取物包含夏桑菊浸膏和野菊花浸渍液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述夏桑菊浸膏的作用浓度为0-32.77mg生药/mL，所述野菊花浸渍液作用浓度为0-0.0.35mg生药/mL，且二者的作用浓度不同时为0。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述夏桑菊浸膏的作用浓度为32.77mg生药/mL，所述野菊花浸渍液作用浓度为0.35mg生药/mL。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述夏桑菊浸膏为以夏枯草∶桑叶∶野菊花重量比为500∶175∶80为原料的提取物，其制备方法为：
取原料中野菊花重量的8％-20％，加所取野菊花重量的1.5-10倍的50％-95％体积浓度的乙醇溶液，在15℃-40℃下用浸渍法或渗漉法提取得野菊花醇提取物I；
取余下的野菊花和夏枯草和桑叶，加水煎煮1-3次，每次1-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约药材重量1/2，得浓缩液，然后加乙醇至浓缩液中，使浓缩液的含醇量体积浓度达63％后，静置过夜24小时以上，滤取上清液，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度在30℃为1.25-1.26的浸膏，为水提取物II；
合并野菊花醇提取物I和水提取物II。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述野菊花浸渍液的制备方法为浸渍法或渗漉法；
所述的浸渍法为：取野菊花，分成三份，三份的重量比为4-6∶2-4∶1-3，分别装入容器中，用1.5-3倍的野菊花重量的95％乙醇浸渍，先加入第1份中，浸渍1-3天后，放出液移入第2份中，浸渍1-3天后，放出液移入第3份中，浸渍1-3天后，浸出液过滤，得野菊花醇提取物；
所述的渗漉法为：取野菊花，装入渗漉筒中，加入野菊花重量的2-3倍的95％体积浓度的乙醇溶液浸泡12小时-24小时后，再加入野菊花重量的7-8倍95％体积浓度的乙醇以每分钟1-4mL的流速进行渗漉，收集乙醇液即得野菊花醇提取物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的人类冠状病毒为2019-nCoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV中的一种或多种。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的人类冠状病毒为HCoV-229E，所述的HCoV-229E在感染细胞时的滴度为50-200TCID50。
8.一种抑制人类冠状病毒的药物组合物，其特征在于，所述的组合物中包括0-32.77mg生药/mL的夏桑菊浸膏和0-0.0.35mg生药/mL的野菊花提取物，且二者的浓度不同时为0；
所述夏桑菊浸膏的制备方法为：以夏枯草∶桑叶∶野菊花重量比为500∶175∶80为原料，取原料中野菊花重量的8％-20％，加所取野菊花重量的1.5-10倍的50％-95％体积浓度的乙醇溶液，在15℃-40℃下用浸渍法或渗漉法提取得野菊花醇提取物I；
取余下的野菊花和夏枯草和桑叶，加水煎煮1-3次，每次1-2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约药材重量1/2，得浓缩液，然后加乙醇至浓缩液中，使浓缩液的含醇量体积浓度达63％后，静置过夜24小时以上，滤取上清液，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度在30℃为1.25-1.26的浸膏，为水提取物II；
合并野菊花醇提取物I和水提取物II；
所述野菊花浸渍液的制备方法为浸渍法或渗漉法；
所述的浸渍法为：取野菊花，分成三份，三份的重量比为4-6∶2-4∶1-3，分别装入容器中，用1.5-3倍的野菊花重量的95％乙醇浸渍，先加入第1份中，浸渍1-3天后，放出液移入第2份中，浸渍1-3天后，放出液移入第3份中，浸渍1-3天后，浸出液滤过，得野菊花醇提取物；
所述的渗漉法为：取野菊花，装入渗漉筒中，加入野菊花重量的2-3倍的95％体积浓度的乙醇溶液浸泡12小时-24小时后，再加入野菊花重量的7-8倍95％体积浓度的乙醇以每分钟1-4mL的流速进行渗漉，收集乙醇液即得野菊花醇提取物。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的组合物中包括32.77mg生药/mL的夏桑菊浸膏和0.35mg生药/mL的野菊花提取物。
10.一种医疗器械或医疗设施，其特征在于，所述的医疗器械或医疗设施包含权利要求8或9所述的药物组合物。
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