CN111876362A - 一种生态微生物菌剂的制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种生态微生物菌剂的制备工艺，具体涉及微生物制备领域，其中制作方法包括有以下步骤：步骤一：原料处理；步骤二：制备细菌菌群溶液载体；步骤三：DNA分析；步骤四：原位细胞裂解；步骤五：DNA纯化。本发明整体工艺步骤合理，优化了中草药的提取技术，基于DNA提取技术的中草药细菌提取技术，通过DNA提取技术可以得到的产品含高达122种微生物，多种微生物的共同作用，更有利于吸收、分解有害气体，同时，这些微生物又可以产生无机酸，同时形成不利于腐败微生物生活的酸性环境，并从根本上降解分解产生恶臭气体的物质，能够根据臭气的不同成份，通过自有技术去筛选、驯化、培养特有的微生物，使产品更有针对性，具备较高的实用性。

Description

一种生态微生物菌剂的制备工艺
技术领域
本发明属于微生物制备技术领域，尤其涉及一种生态微生物菌剂的制备工艺。
背景技术
相比传统的微生物提取技术，微生物群落多样性及结构分析是将微生物进行分离培养,然后通过一般的生物化学性状及特定的表现型来分析。传统提取技术存在以下局限性：
局限于从固体培养基上分离微生物；
纯培养方法和原理大多从医药微生物引过来的，有些方法对特定微生物研究并不很适合,譬如某些微生物处于贫营养，而在实验室用营养丰富的牛肉汁蛋白胨来测定某一环境中活细菌的总数，大量的贫营养微生物不适宜生长，测定结果误差大；
大多数微生物在现阶段是无法培养的；
故简单提取和平板培养计数不能得到微生物在特定生态系统中的生活特征和生态功能的信息，从而埋没了大量有很大应用价值的微生物资源。
发明内容
本发明提供一种生态微生物菌剂的制备工艺，旨在解决上述存在的问题。
本发明是这样实现的，本发明提供如下技术方案：一种生态微生物菌剂的制备工艺，其中微生物菌剂的制作方法包括有以下步骤：
步骤一：原料处理，将各种中草药进行筛选，选取表皮完好的中草药，并截取其中等大部分的草药段；
步骤二：制备细菌菌群溶液载体，微生物的种类高达122种，可同时含有厌氧菌、好氧菌和兼性菌，利用细菌菌群溶液载体让这122种细菌可以在在同一环境下共存；
步骤三：DNA分析，将步骤一中的草药段放置在分析仪中，利用计算机模型对数种中草药进行DNA分析；
步骤四：原位细胞裂解，使得中草药中提取的DNA更具代表性，必须保证样品中所有的微生物细胞裂解放出核酸，在此过程中主要运用到了以下两种方法：
方法一：采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+sds的组合方法，以此来促进中草药中的DNA进行PCR扩增。
方法二：使用液氮冻融以及玻璃珠振荡法代替传统液氮研磨技术；
步骤五：DNA纯化，本产品主要结合了两种方法尽可能多地去除粗提的DNA中的污染物，经过以上步骤之后，进行稀释即可部分被限制性酶切和扩增；
步骤六：从样本中提取微生物DNA，将提取后的DNA放置在细菌菌群溶液载体中；
步骤六：将存放于载体中的菌剂置于无菌环境中，观察一个月时间，对内部的成分进行检测。
在一个优选地实施方式中，所述步骤二中，细菌培养特定溶液载体的溶液主要来自于新鲜中草药的细胞液，主要提取艾草、蒲公英以及鱼腥草植物内的中草药细胞液；再取适量份的樟木粉、竹炭粉、蒸馏水与细胞液进行均匀混合，将液体培养液利用离心机作离心处理，将多余的杂质去除，保留单纯的液体培养液，再将单纯的液体培养液利用冰柜作冷冻处理，冷冻温度保持在-80～-50摄氏度的范围之内，冷冻72小时，使用时提前取出经处理后与微生物进行配比。
在一个优选地实施方式中，所述步骤三中，结合结构生物学对DNA高级结构的预测分析，运用计算机模型对各个细菌DNA的功能区序列进行设计和优化密码子，从而得到能够高效表达出目标细菌功能的基因序列，再将上述目标序列连接到合适的表达载体上，然后利用氯化铯密度梯度超速离心纯化，从样本中提取微生物DNA，从而以基因组的多样性反映物种的多样性。
在一个优选地实施方式中，所述步骤四中，其中的溶菌酶通过破坏中草药的细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
在一个优选地实施方式中，所述步骤五中，在DNA纯化的过程中，需要使用到氯化铯密度梯度超速离心纯化含有DNA的溶液，随即利用醋酸甲进行沉淀一段时间，温度保持在室温状况下。
在一个优选地实施方式中，所述醋酸甲的浓度保持在0.05-0.1g/L，其中的醋酸甲在释放的过程中，定时释放，且定量释放。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
整体工艺步骤合理，优化了中草药的提取技术，基于DNA提取技术的中草药细菌提取技术，通过DNA提取技术可以得到的产品含高达122种微生物，多种微生物的共同作用，更有利于吸收、分解有害气体，同时，这些微生物又可以产生无机酸，同时形成不利于腐败微生物生活的酸性环境，并从根本上降解分解产生恶臭气体的物质，能够根据臭气的不同成份，通过自有技术去筛选、驯化、培养特有的微生物，使产品更有针对性，具备较高的实用性。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种生态微生物菌剂的制备工艺，其中微生物菌剂的制作方法包括有以下步骤：
步骤一：原料处理，将各种中草药进行筛选，选取表皮完好的中草药，并截取其中等大部分的草药段；
步骤二：制备细菌菌群溶液载体，微生物的种类高达122种，可同时含有厌氧菌、好氧菌和兼性菌，利用细菌菌群溶液载体让这122种细菌可以在在同一环境下共存，其中细菌培养特定溶液载体的溶液主要来自于新鲜中草药的细胞液，主要提取艾草、蒲公英以及鱼腥草植物内的中草药细胞液；再取适量份的樟木粉、竹炭粉、蒸馏水与细胞液进行均匀混合，将液体培养液利用离心机作离心处理，将多余的杂质去除，保留单纯的液体培养液，再将单纯的液体培养液利用冰柜作冷冻处理，冷冻温度保持在-80摄氏度的范围之内，冷冻72小时，使用时提前取出经处理后与微生物进行配比；
步骤三：DNA分析，将步骤一中的草药段放置在分析仪中，结合结构生物学对DNA高级结构的预测分析，运用计算机模型对各个细菌DNA的功能区序列进行设计和优化密码子，从而得到能够高效表达出目标细菌功能的基因序列，再将上述目标序列连接到合适的表达载体上，然后利用氯化铯密度梯度超速离心纯化，从样本中提取微生物DNA，从而以基因组的多样性反映物种的多样性；
步骤四：原位细胞裂解，使得中草药中提取的DNA更具代表性，必须保证样品中所有的微生物细胞裂解放出核酸，在此过程中主要运用到了以下两种方法：
方法一：采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+sds的组合方法，以此来促进中草药中的DNA进行PCR扩增，其中的溶菌酶通过破坏中草药的细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解；
方法二：使用液氮冻融以及玻璃珠振荡法代替传统液氮研磨技术；
步骤五：DNA纯化，本产品主要结合了两种方法尽可能多地去除粗提的DNA中的污染物，经过以上步骤之后，进行稀释即可部分被限制性酶切和扩增，在DNA纯化的过程中，需要使用到氯化铯密度梯度超速离心纯化含有DNA的溶液，随即利用醋酸甲进行沉淀一段时间，温度保持在室温状况下；醋酸甲的浓度保持在0.05-0.1g/L，其中的醋酸甲在释放的过程中，定时释放，且定量释放；
步骤六：从样本中提取微生物DNA，将提取后的DNA放置在细菌菌群溶液载体中；
步骤六：将存放于载体中的菌剂置于无菌环境中，观察一个月时间，对内部的成分进行检测。
实施例2：
一种生态微生物菌剂的制备工艺，其中微生物菌剂的制作方法包括有以下步骤：
步骤一：原料处理，将各种中草药进行筛选，选取表皮完好的中草药，并截取其中等大部分的草药段；
步骤二：制备细菌菌群溶液载体，微生物的种类高达122种，可同时含有厌氧菌、好氧菌和兼性菌，利用细菌菌群溶液载体让这122种细菌可以在在同一环境下共存，其中细菌培养特定溶液载体的溶液主要来自于新鲜中草药的细胞液，主要提取艾草、蒲公英以及鱼腥草植物内的中草药细胞液；再取适量份的樟木粉、竹炭粉、蒸馏水与细胞液进行均匀混合，将液体培养液利用离心机作离心处理，将多余的杂质去除，保留单纯的液体培养液，再将单纯的液体培养液利用冰柜作冷冻处理，冷冻温度保持在-65摄氏度的范围之内，冷冻72小时，使用时提前取出经处理后与微生物进行配比；
步骤三：DNA分析，将步骤一中的草药段放置在分析仪中，结合结构生物学对DNA高级结构的预测分析，运用计算机模型对各个细菌DNA的功能区序列进行设计和优化密码子，从而得到能够高效表达出目标细菌功能的基因序列，再将上述目标序列连接到合适的表达载体上，然后利用氯化铯密度梯度超速离心纯化，从样本中提取微生物DNA，从而以基因组的多样性反映物种的多样性；
步骤四：原位细胞裂解，使得中草药中提取的DNA更具代表性，必须保证样品中所有的微生物细胞裂解放出核酸，在此过程中主要运用到了以下两种方法：
方法一：采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+sds的组合方法，以此来促进中草药中的DNA进行PCR扩增，其中的溶菌酶通过破坏中草药的细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解；
方法二：使用液氮冻融以及玻璃珠振荡法代替传统液氮研磨技术；
步骤五：DNA纯化，本产品主要结合了两种方法尽可能多地去除粗提的DNA中的污染物，经过以上步骤之后，进行稀释即可部分被限制性酶切和扩增，在DNA纯化的过程中，需要使用到氯化铯密度梯度超速离心纯化含有DNA的溶液，随即利用醋酸甲进行沉淀一段时间，温度保持在室温状况下；醋酸甲的浓度保持在0.05-0.1g/L，其中的醋酸甲在释放的过程中，定时释放，且定量释放；
步骤六：从样本中提取微生物DNA，将提取后的DNA放置在细菌菌群溶液载体中；
步骤六：将存放于载体中的菌剂置于无菌环境中，观察一个月时间，对内部的成分进行检测。
实施例3：
一种生态微生物菌剂的制备工艺，其中微生物菌剂的制作方法包括有以下步骤：
步骤一：原料处理，将各种中草药进行筛选，选取表皮完好的中草药，并截取其中等大部分的草药段；
步骤二：制备细菌菌群溶液载体，微生物的种类高达122种，可同时含有厌氧菌、好氧菌和兼性菌，利用细菌菌群溶液载体让这122种细菌可以在在同一环境下共存，其中细菌培养特定溶液载体的溶液主要来自于新鲜中草药的细胞液，主要提取艾草、蒲公英以及鱼腥草植物内的中草药细胞液；再取适量份的樟木粉、竹炭粉、蒸馏水与细胞液进行均匀混合，将液体培养液利用离心机作离心处理，将多余的杂质去除，保留单纯的液体培养液，再将单纯的液体培养液利用冰柜作冷冻处理，冷冻温度保持在-50摄氏度的范围之内，冷冻72小时，使用时提前取出经处理后与微生物进行配比；
步骤三：DNA分析，将步骤一中的草药段放置在分析仪中，结合结构生物学对DNA高级结构的预测分析，运用计算机模型对各个细菌DNA的功能区序列进行设计和优化密码子，从而得到能够高效表达出目标细菌功能的基因序列，再将上述目标序列连接到合适的表达载体上，然后利用氯化铯密度梯度超速离心纯化，从样本中提取微生物DNA，从而以基因组的多样性反映物种的多样性；
步骤四：原位细胞裂解，使得中草药中提取的DNA更具代表性，必须保证样品中所有的微生物细胞裂解放出核酸，在此过程中主要运用到了以下两种方法：
方法一：采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+sds的组合方法，以此来促进中草药中的DNA进行PCR扩增，其中的溶菌酶通过破坏中草药的细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解；
方法二：使用液氮冻融以及玻璃珠振荡法代替传统液氮研磨技术；
步骤五：DNA纯化，本产品主要结合了两种方法尽可能多地去除粗提的DNA中的污染物，经过以上步骤之后，进行稀释即可部分被限制性酶切和扩增，在DNA纯化的过程中，需要使用到氯化铯密度梯度超速离心纯化含有DNA的溶液，随即利用醋酸甲进行沉淀一段时间，温度保持在室温状况下；醋酸甲的浓度保持在0.05-0.1g/L，其中的醋酸甲在释放的过程中，定时释放，且定量释放；
步骤六：从样本中提取微生物DNA，将提取后的DNA放置在细菌菌群溶液载体中；
步骤六：将存放于载体中的菌剂置于无菌环境中，观察一个月时间，对内部的成分进行检测。
分别取上述实施例1-3所制得的微生物菌剂进行使用，分三组分别试用一个月，得到以下数据：
Figure BDA0002633189280000101
由上表可知，实施例2中步骤合理，优化了中草药的提取技术，基于DNA提取技术的中草药细菌提取技术，通过DNA提取技术可以得到的产品含高达122种微生物，多种微生物的共同作用，更有利于吸收、分解有害气体，同时，这些微生物又可以产生无机酸，同时形成不利于腐败微生物生活的酸性环境，并从根本上降解分解产生恶臭气体的物质，能够根据臭气的不同成份，通过自有技术去筛选、驯化、培养特有的微生物，使产品更有针对性，具备较高的实用性。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种生态微生物菌剂的制备工艺，其特征在于：其中微生物菌剂的制作方法包括有以下步骤：
步骤一：原料处理，将各种中草药进行筛选，选取表皮完好的中草药，并截取其中等大部分的草药段；
步骤二：制备细菌菌群溶液载体，微生物的种类高达122种，可同时含有厌氧菌、好氧菌和兼性菌，利用细菌菌群溶液载体让这122种细菌可以在在同一环境下共存；
步骤三：DNA分析，将步骤一中的草药段放置在分析仪中，利用计算机模型对数种中草药进行DNA分析；
步骤四：原位细胞裂解，使得中草药中提取的DNA更具代表性，必须保证样品中所有的微生物细胞裂解放出核酸，在此过程中主要运用到了以下两种方法：
方法一：采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+sds的组合方法，以此来促进中草药中的DNA进行PCR扩增；
方法二：使用液氮冻融以及玻璃珠振荡法代替传统液氮研磨技术；
步骤五：DNA纯化，本产品主要结合了两种方法尽可能多地去除粗提的DNA中的污染物，经过以上步骤之后，进行稀释即可部分被限制性酶切和扩增；
步骤六：从样本中提取微生物DNA，将提取后的DNA放置在细菌菌群溶液载体中；
步骤六：将存放于载体中的菌剂置于无菌环境中，观察一个月时间，对内部的成分进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种生态微生物菌剂的制备工艺，其特征在于：所述步骤二中，细菌培养特定溶液载体的溶液主要来自于新鲜中草药的细胞液，主要提取艾草、蒲公英以及鱼腥草植物内的中草药细胞液；再取适量份的樟木粉、竹炭粉、蒸馏水与细胞液进行均匀混合，将液体培养液利用离心机作离心处理，将多余的杂质去除，保留单纯的液体培养液，再将单纯的液体培养液利用冰柜作冷冻处理，冷冻温度保持在-80～-50摄氏度的范围之内，冷冻72小时，使用时提前取出经处理后与微生物进行配比。
3.根据权利要求1所述的一种生态微生物菌剂的制备工艺，其特征在于：所述步骤三中，结合结构生物学对DNA高级结构的预测分析，运用计算机模型对各个细菌DNA的功能区序列进行设计和优化密码子，从而得到能够高效表达出目标细菌功能的基因序列，再将上述目标序列连接到合适的表达载体上，然后利用氯化铯密度梯度超速离心纯化，从样本中提取微生物DNA，从而以基因组的多样性反映物种的多样性。
4.根据权利要求1所述的一种生态微生物菌剂的制备工艺，其特征在于：所述步骤四中，其中的溶菌酶通过破坏中草药的细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
5.根据权利要求1所述的一种生态微生物菌剂的制备工艺，其特征在于：所述步骤五中，在DNA纯化的过程中，需要使用到氯化铯密度梯度超速离心纯化含有DNA的溶液，随即利用醋酸甲进行沉淀一段时间，温度保持在室温状况下。
6.根据权利要求5所述的一种生态微生物菌剂的制备工艺，其特征在于：所述醋酸甲的浓度保持在0.05-0.1g/L，其中的醋酸甲在释放的过程中，定时释放，且定量释放。
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CN112375698A (zh) * 2020-11-04 2021-02-19 苏州路易兴环保科技有限公司 一种中草药细菌菌群培养溶液

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112375698A (zh) * 2020-11-04 2021-02-19 苏州路易兴环保科技有限公司 一种中草药细菌菌群培养溶液

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