CN111876327B - 一种用于法医复杂样本精子快速分离的方法及其分离装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物测试技术领域，尤其涉及一种用于法医复杂样本精子快速分离的方法及其装置。本发明装置通过压电陶瓷片和外围驱动电路，将超声场力作用于精子快速分离微流控芯片，在不破坏法医样本中各类细胞完整性的前提下，实现对法医复杂混合样本中精子的高纯度分离。本发明方法具有快速、便捷等优势，可以从法医复杂混合样本中在不破坏细胞完整型的前提下，实现对精子的高纯度分离，同时去除混合样本中的其他悬浮杂质。可广泛用于性侵案件中，从混合斑中快速、可靠、准确的获得犯罪嫌疑人的精子样本，用于后续实验从而获取犯罪嫌疑人的生物信息。

Description

一种用于法医复杂样本精子快速分离的方法及其分离装置
技术领域
本发明涉及生物测试技术领域，尤其涉及一种用于法医复杂样本精子快速分离的方法及其装置。
背景技术
性侵案件中的法医样本常因混入受害者的组织细胞及游离核酸而受污染，实验室常用差分提取法依次裂解阴道上皮细胞与精子细胞，进而分析施暴者的遗传特征。然而这种方法操作复杂，难以自动化操作，且所得样本中难以完全去除女性上皮细胞所含核酸物质。美国弗吉尼亚大学James Landers实验室开发了基于超声的差分提取法，通过超声谐振场将精子细胞捕获从而洗脱已裂解的上皮细胞，然而仍需裂解细胞等复杂样本预处理步骤。但微流控技术为法医样本的自动化预处理提供了可能。
发明内容
本发明的目的是提出一种用于法医复杂样本精子快速分离的方法及其分离装置，通过压电陶瓷片和外围驱动电路，将超声场力作用于精子快速分离微流控芯片，在不破坏法医样本中各类细胞完整性的前提下，实现对法医复杂混合样本中精子的高纯度分离。
本发明提出的用于法医复杂样本精子快速分离的装置，包括硅片、玻璃片、引流管、压电陶瓷片、信号放大电路和信号生成模块；所述的硅片的上表面加工有多条凹槽，加工有凹槽的硅片与玻璃片相对固定后，硅片上的凹槽与玻璃片形成液体流道，引流管通过倒锥压环与相应的液体流道相连通；所述的压电陶瓷片与硅片的下表面相对固定；所述的信号生成模块和信号放大电路通过信号线与压电陶瓷片相连。
上述用于法医复杂样本精子快速分离的装置中，所述的液体流道包括前腔室、中间通道、后腔室、第一缓冲液入口流道、样本入口流道、第一废液出口流道、第二废液出口流道、第二缓冲液入口流道、上皮细胞出口流道和精子细胞出口流道；所述的前腔室通过中间通道与后腔室相互连通，所述的第一缓冲液入口流道、样本入口流道、第一废液出口流道和第二废液出口流道分别与前腔室相互连通，所述的第二缓冲液入口流道、上皮细胞出口流道和精子细胞出口流道分别与后腔室相互连通。
本发明提出的用于法医复杂样本精子快速分离的方法，包括以下步骤：
(1)搭建一个用于法医复杂样本精子快速分离的装置，包括硅片、玻璃片、引流管、压电陶瓷片、信号放大电路和信号生成模块；所述的硅片的上表面加工有多条凹槽，加工有凹槽的硅片与玻璃片相对固定后，硅片上的凹槽与玻璃片形成液体流道，引流管通过倒锥压环与相应的液体流道相连通；所述的压电陶瓷片与硅片的上表面相对固定；所述的信号生成模块和信号放大电路通过信号线与压电陶瓷片相连；所述的液体流道包括前腔室、中间通道、后腔室、第一缓冲液入口流道、样本入口流道、第一废液出口流道、第二废液出口流道、第二缓冲液入口流道、上皮细胞出口流道和精子细胞出口流道；所述的前腔室通过中间通道与后腔室相互连通，所述的第一缓冲液入口流道、样本入口流道、第一废液出口流道和第二废液出口流道分别与前腔室相互连通，所述的第二缓冲液入口流道、上皮细胞出口流道和精子细胞出口流道分别与后腔室相互连通；
(2)通过引流管向第一缓冲液入口流道中通入第一磷酸缓冲盐溶液，向样本入口流道中通入混合样本，向第二缓冲液入口流道通入第二磷酸缓冲盐溶液,第一磷酸缓冲盐溶液、混合样本和第二磷酸缓冲盐溶液的流速比为5:1:4；
(3)开启信号生成模块和信号放大电路的电源；
(4)通过引流管从第一废液出口流道和第二废液出口流道收集废液，从上皮细胞出口流道收集除精子外的上皮细胞，从精子细胞出口流道收集分离出来的高纯度精子。
本发明提出的用于法医复杂样本精子快速分离的方法及其分离装置，其优点是：
本发明的用于法医复杂样本精子快速分离装置，通过压电陶瓷片和外围驱动电路，将超声场力作用于精子快速分离微流控芯片，在不破坏法医样本中各类细胞完整性的前提下，实现对法医复杂混合样本中精子的高纯度分离。本发明分离装置通过成熟的微加工技术，便捷、快速的制备出带有特定管道结构的硅片，通过阳极键合的方式与玻璃进行键合，制备出精子快速分离微流控芯片。通过与之配套的信号发生器和信号放大电路装配后形成整体装置。
本发明的用于法医复杂样本精子快速分离的方法，具有简单、快速等优势，可以从混合样本中在不破坏细胞完整型的前提下，去除样本中的游离核酸等杂质，实现对精子的高纯度分离，同时对混合样本的要求较低，只需将拭子等取样器件上的细胞重悬于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，并过滤去除较大的颗粒状杂质即可。此超声精子分离装置体积小巧、方便集成，实现了样本进精子出的全自动化操作，且不易碎坏，可重复使用。与传统的差分提取法相比较，超声精子分离装置不需要对不同种细胞依次裂解与反复离心的操作，不需要额外试剂，操作简便，不易出现操作失误，同时所需时间更短，可以更快速的实现从混合样本中对精子进行高纯度分离。
附图说明
图1是本发明提出的用于法医复杂样本精子快速分离装置的结构示意图。
图2是图1所示的分离装置中硅片1上的液体流道的示意图。
图1和图2中，1是硅片，2是玻璃片，3倒锥压环，4是引流管，5是压电陶瓷片，6是信号放大电路，7是信号生成模块，8是第一缓冲液入口，9是样本入口，10是第一废液出口，11是第二废液出口，12是第二缓冲液入口，13是上皮细胞出口，14是精子细胞出口，15是前腔室，16是中间通道，17是后腔室。
具体实施方式
本发明提出的用于法医复杂样本精子快速分离的装置，其结构如图1所示，包括硅片1、玻璃片2、引流管4、压电陶瓷片5、信号放大电路6和信号生成模块7；所述的硅片1的上表面加工有多条凹槽，加工有凹槽的硅片1与玻璃片2相对固定后，硅片1上的凹槽与玻璃片2形成液体流道，引流管4通过倒锥压环3与相应的液体流道相连通；所述的压电陶瓷片5与硅片1的下表面相对固定；所述的信号生成模块7和信号放大电路6通过信号线与压电陶瓷片5相连。
上述用于法医复杂样本精子快速分离的装置中，液体流道的结构如图2所示，包括前腔室15、中间通道16、后腔室17、第一缓冲液入口流道8、样本入口流道9、第一废液出口流道10、第二废液出口流道11、第二缓冲液入口流道12、上皮细胞出口流道13和精子细胞出口流道14；所述的前腔室15通过中间通道16与后腔室17相互连通，所述的第一缓冲液入口流道8、样本入口流道9、第一废液出口流道10和第二废液出口流道11分别与前腔室15相互连通，所述的第二缓冲液入口流道12、上皮细胞出口流道13和精子细胞出口流道14分别与后腔室17相互连通。
本发明提出的用于法医复杂样本精子快速分离的方法，该方法包括以下步骤：
(1)搭建一个用于法医复杂样本精子快速分离的装置，包括硅片1、玻璃片2、引流管4、压电陶瓷片5、信号放大电路6和信号生成模块7；所述的硅片1的上表面加工有多条凹槽，加工有凹槽的硅片1与玻璃片2相对固定后，硅片1上的凹槽与玻璃片2形成液体流道，引流管4通过倒锥压环3与相应的液体流道相连通；所述的压电陶瓷片5与硅片1的上表面相对固定；所述的信号生成模块7和信号放大电路6通过信号线与压电陶瓷片5相连；所述的液体流道包括前腔室15、中间通道16、后腔室17、第一缓冲液入口流道8、样本入口流道9、第一废液出口流道10、第二废液出口流道11、第二缓冲液入口流道12、上皮细胞出口流道13和精子细胞出口流道14；所述的前腔室15通过中间通道16与后腔室17相互连通，所述的第一缓冲液入口流道8、样本入口流道9、第一废液出口流道10和第二废液出口流道11分别与前腔室15相互连通，所述的第二缓冲液入口流道12、上皮细胞出口流道13和精子细胞出口流道14分别与后腔室17相互连通；
(2)通过引流管4向第一缓冲液入口流道中通入磷酸缓冲盐溶液(PBS)，向样本入口流道9中通入混合样本，向第二缓冲液入口流道12通入磷酸缓冲盐溶液(PBS),磷酸缓冲盐溶液、混合样本和磷酸缓冲盐溶液的流速比为5:1:4；
(3)开启信号生成模块7和信号放大电路6的电源；
(4)通过引流管4从第一废液出口流道10和第二废液出口流道11收集废液，从上皮细胞出口流道13收集除精子外的上皮细胞，从精子细胞出口流道14收集分离出来的高纯度精子。
本发明的一个实施例中，如图1所示的用于法医复杂样本精子快速分离装置的构建过程，包括以下步骤：
(1)制备带有特定管道结构的硅片1：
(1-1)在铬板上采用制版方法，制备得到带有特定管道结构的掩模铬板，备用；
(1-2)将硅片先后用丙酮和异丙醇反复冲洗三次，用氮气吹干表面，再放置于100-120℃的热板上保持1-2分钟，本发明的一个实施例中使用120℃、90秒，使硅片完全干燥；
(1-3)将干燥后的硅片置于匀胶机上，在硅片的表面旋涂光刻胶，在硅片的表面形成5-10微米厚的光刻胶胶薄层；本发明的一个实施例中使用AZ4620光刻胶，先以700转每分钟旋涂9秒钟，然后以3000转每分钟旋涂40秒；
(1-4)将步骤(1-3)带有旋涂光刻胶的硅片放置于光刻机上，将步骤(1-1)带有特定管道结构的掩模铬板放置于涂有光刻胶的硅片上方，使掩模铬板上的管道结构在垂直方向上都在硅片的大小范围内，并使硅片与带有特定管道结构的掩模铬板紧密贴合，采用光刻方法，从带有特定管道结构的掩模铬板的上方进行光刻，再放入显影液中，将被曝光部分的光刻胶去除，在硅片表面制备得到特定管道结构，用去离子水清洗，氮气吹干；
(1-5)采用深硅刻蚀方法，对带有特定管道结构的硅片1刻蚀要求的深度，本发明的一个实施例中刻蚀深度为100微米；采用丙酮和超声结合的方法进行清洗，将剩余的光刻胶完全去除，用去离子水冲洗，氮气吹干，得到带有特定管道结构的硅片1。
(2)在步骤(1)的带有特定管道结构的硅片1上键合玻璃2，制备精子分离芯片，包括以下步骤：
(2-1)取与步骤(1)的带有特定管道结构的硅片1大小相同的玻璃2，用马克笔标记出特定管道结构的出入口；
(2-2)采用直径为1毫米，并带有金刚石的钻头，使用台钻在玻璃表面马克笔标记处钻出通孔；
(2-3)将步骤(2-2)的玻璃2与步骤(1)的带有特定管道结构的硅片1，放入丙酮中超声清洗10分钟，用异丙醇和去离子水冲洗，氮气吹干，将两者紧密贴合，并将步骤(2-2)玻璃2上的通孔与步骤(1)带有特定管道结构的硅片1上特定管道结构的出入口完全对齐；
(2-4)采用阳极键合方法，将步骤(2-3)紧密贴合的玻璃1和带有特定管道结构的硅片2进行不可逆键合。
(3)在步骤(2)精子分离芯片的玻璃通孔上，采用AB胶粘倒锥压环或聚二甲基硅氧烷(PDMS)3，使倒锥压环或聚二甲基硅氧烷(PDMS)3的中空部分与玻璃通孔完全重合，待AB胶凝固后，将引流管4插入倒锥压环或聚二甲基硅氧烷(PDMS)3中，用AB胶封闭倒锥压环或聚二甲基硅氧烷(PDMS)3与引流管4的连接处；
(4)在步骤(3)连接好倒锥压环或聚二甲基硅氧烷(PDMS)3和引流管4的精子分离芯片的带有特定管道结构的硅片1下方，采用502胶粘上压电陶瓷片5，并使压电陶瓷片5覆盖全部的特定管道结构，得到超声精子分离芯片；
(5)采用AD9850信号模块7作为压电陶瓷驱动电路的信号输入，根据实际需求提供不同的波形和幅值；
(6)采用三级放大电路6作为压电陶瓷驱动电路的信号放大部分，将步骤(5)产生的信号放大后输入至压电陶瓷片5，用于驱动压电陶瓷片5。
(7)将步骤(4)的超声精子分离芯片、步骤(6)的三级放大电路6和步骤(5)的AD9850信号模块7相连接，得到超声精子分离装置。
以下结合附图，详细介绍本发明的用于法医复杂样本精子快速分离的装置的工作原理和工作过程：
(1)向超声精子分离装置中的第一缓冲液入口8中通入磷酸缓冲盐溶液(PBS)，从样本入口9中通入混合样本，从第二缓冲液入口12中通入磷酸缓冲盐溶液(PBS),三者流速比可调，本发明的一个实施例中三者流速比为5:1:4；
(2)打开AD9850信号模块7和三级放大电路6的电源，受到激励的压电陶瓷片5在前腔室15和后腔室17中形成超声场，在超声场的作用下，混合样本在通过前腔室时细胞碎片、游离DNA等杂质被分离并从废液出口一10和废液出口二11排出。余下的上皮细胞和精子通过中间通道16流入后腔室17，在超声场的作用下，混合样本在通过后腔室时，上皮细胞与精子被分离；
(3)从废液出口一10和废液出口二11收集废液，从上皮细胞出口14收集除精子外的上皮细胞，从精子细胞出口13收集分离出来的高纯度精子。

Claims (2)

1.一种用于法医复杂样本精子快速分离的装置，其特征在于装置包括硅片、玻璃片、引流管、压电陶瓷片、信号放大电路和信号生成模块；所述的硅片的上表面加工有多条凹槽，加工有凹槽的硅片与玻璃片相对固定后，硅片上的凹槽与玻璃片形成液体流道，引流管通过倒锥压环与相应的液体流道相连通；所述的压电陶瓷片与硅片的下表面相对固定；所述的信号生成模块和信号放大电路通过信号线与压电陶瓷片相连；
其特征在于所述的液体流道包括前腔室、中间通道、后腔室、第一缓冲液入口流道、样本入口流道、第一废液出口流道、第二废液出口流道、第二缓冲液入口流道、上皮细胞出口流道和精子细胞出口流道；所述的前腔室通过中间通道与后腔室相互连通，所述的第一缓冲液入口流道、样本入口流道、第一废液出口流道和第二废液出口流道分别与前腔室相互连通，所述的第二缓冲液入口流道、上皮细胞出口流道和精子细胞出口流道分别与后腔室相互连通；所述后腔室的宽度大于所述前腔室的宽度；在所述前腔室的宽度方向上，所述中间通道连接在所述前腔室的中间位置。
2.一种用于法医复杂样本精子快速分离的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)搭建一个用于法医复杂样本精子快速分离的装置，包括硅片、玻璃片、引流管、压电陶瓷片、信号放大电路和信号生成模块；所述的硅片的上表面加工有多条凹槽，加工有凹槽的硅片与玻璃片相对固定后，硅片上的凹槽与玻璃片形成液体流道，引流管通过倒锥压环与相应的液体流道相连通；所述的压电陶瓷片与硅片的上表面相对固定；所述的信号生成模块和信号放大电路通过信号线与压电陶瓷片相连；所述的液体流道包括前腔室、中间通道、后腔室、第一缓冲液入口流道、样本入口流道、第一废液出口流道、第二废液出口流道、第二缓冲液入口流道、上皮细胞出口流道和精子细胞出口流道；所述的前腔室通过中间通道与后腔室相互连通，所述的第一缓冲液入口流道、样本入口流道、第一废液出口流道和第二废液出口流道分别与前腔室相互连通，所述的第二缓冲液入口流道、上皮细胞出口流道和精子细胞出口流道分别与后腔室相互连通；所述后腔室的宽度大于所述前腔室的宽度；在所述前腔室的宽度方向上，所述中间通道连接在所述前腔室的中间位置；
(2)通过引流管向第一缓冲液入口流道中通入第一磷酸缓冲盐溶液，向样本入口流道中通入混合样本，向第二缓冲液入口流道通入第二磷酸缓冲盐溶液,第一磷酸缓冲盐溶液、混合样本和第二磷酸缓冲盐溶液的流速比为5:1:4；
(3)开启信号生成模块和信号放大电路的电源；
(4)通过引流管从第一废液出口流道和第二废液出口流道收集废液，从上皮细胞出口流道收集除精子外的上皮细胞，从精子细胞出口流道收集分离出来的高纯度精子。
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