CN111870706A - 一种可mri示踪显影的细胞微载体及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及显影剂技术领域,尤其涉及一种可MRI示踪显影的细胞微载体及制备方法。本发明提供的可MRI示踪显影的细胞微载体粒径为200μm~300μm,包括:GdPO4纳米粒或GdPO4水合物纳米粒,以及高分子壁材。其可作为细胞培养的微载体,特别适合用于搭载干细胞。由于纳米粒子的稳定性,使得其在体内显影增强效果不易衰退淬灭,借助于医用1,5T核磁便可以对材料的体内状况进行定位示踪,便捷同时贴合临床的转化应用,并且该材料具有良好的生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及显影剂技术领域,尤其涉及一种可MRI示踪显影的细胞微载体及制备方法。
背景技术
微载体是一种微小的球状颗粒,其在细胞立体培养中能使贴壁细胞在悬浮状态下贴附在颗粒表面单层生长,因而具有比普通平面培养更大的接触面积,利于细胞的大规模培养和收集。
在组织工程领域,微载体可以作为搭载干细胞的基质。在体外,微载体的立体三维培养可以在短时间扩增大量细胞;在体内,扩搭载干细胞的微球可通过注射方式植入于组织缺损处,用于缺损组织的再生治疗。微载体不同于其他大块组织工程材料,凭借其个体体积微小,既可以作为缺损不规则组织的填充,也可以作为深部组织可以注射治疗。在阿尔茨海默病,脑卒中等神经组织退行性疾病中,已有相关研究将微载体作为搭载干细胞修复的载体,微载体作为一个基质支撑干细胞在体内的存活并发挥更好的治疗效果,同时于小鼠体内实验或者体内类器官模型中取得一定疗效。
目前,通常采用的微载体由生物降解医用高分子材料制得。微载体在体内植入部位不正确或者移位将影响微载体搭载的细胞在体内的修复效果;同时,微载体降解速率与组织生长速度不匹配也会影响组织愈合质量。因此,简单快速地实现微载体体内示踪监测是研究中的难点。
但由于医用高分子与组织有着相似的密度值,植入体内后常规的影像学方法无法监测微载体的位置以及变化。微载体在体内的位置以及降解情况直接决定了微载体搭载的细胞在体内的修复效果和影响预后的评估以及治疗方案的调整。目前的显影材料多局限于支架的形式,显影剂用量较高,而可示踪的微载体多是采用荧光等生物发光物质标记,通过小动物活体成像仪或者体视荧光显微镜可以捕捉到荧光信号。但是生物荧光标记物通常存在荧光强度小、易淬灭等缺点,同时这种荧光物质在体内的高分辨示踪观察对显影设备的要求十分高。
顺磁性的纳米材料GdPO4·H2O由于Gd3+的8S7/2电子各向同性和f层7个电子半充满状态,使Gd3+具有高磁矩,具有增强MRI正向信号的能力,使含Gd材料可用于MRI造影剂。GdPO4·H2O相比于其他含Gd材料由于具有额外一分子水可以弛豫更多的氢质子,导致相同磁场条件下更强的弛豫效应,进而呈现更好的复合材料显影效果。如果能够将GdPO4用作细胞微载体,则可以实现良好的示踪显影剂。但是一方面,GdPO4在辐射下有可能对细胞产生杀伤效果;另一方面,如何使细胞载体能够更好的包封GdPO4提高对细胞的担载效果也是需要解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供一种可MRI示踪显影的细胞微载体及制备方法,该载体具有良好示踪显影效果,且具有良好的生物相容性。
本发明提供的可MRI示踪显影的细胞微载体,其粒径为200μm~300μm,其制备原料包括:GdPO4水合物纳米粒和高分子壁材;
所述高分子壁材包括PLGA、PGA或PEG中至少一种。
一些实施例中,所述细胞微载体的制备原料包括GdPO4·H2O纳米粒和PLGA。
一些实施例中,所述细胞微载体中,所述GdPO4·H2O纳米粒与PLGA的质量比为(0.5~16):1000。
一些具体实施例中,所述GdPO4·H2O纳米粒与PLGA的质量比为0.5:1000、1:1000、2:1000、4:1000、8:1000、16:1000。作为优选,所述GdPO4·H2O纳米粒与PLGA的质量比8:1000。
本发明中,通过GdPO4·H2O纳米粒子被高分子材料包被制备获得微载体,通过毒性以及显影性的评估得到的微载体具有更适宜的Gd3+浓度和更适宜的高分子材料种类以及用量,使得微载体达到体内显影且低毒性的特性。这种可核磁显影的微载体可携带细胞或治疗药物并于体内精确定位和示踪,达到评估预后和指导治疗的目的。
本发明所述细胞微载体的制备方法,包括:将GdPO4·H2O纳米颗粒溶液与NMP溶液经超声分散后,加入PLGA搅拌、超声分散后,经高压静电发生装置中制得所述细胞微载体。
一些实施例中,所述GdPO4·H2O溶液的浓度为0.05mg/mL~1.6mg/mL;所述NMP的浓度为10mL。一些实施例中,所述GdPO4·H2O溶液的浓度为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL;
本发明中,两步超声分散参数一致,所述超声分散的参数包括:室温水浴超声30min;所述搅拌的参数包括:室温60rpm搅拌8~12h;
所述高压静电发生装置的参数包括:27G针头、55℃、距液面高度4cm、电压8.5kV、推速0.1cm/min。
本发明中,所述GdPO4·H2O纳米颗粒的制备方法包括:
所述GdPO4·H2O纳米颗粒的制备方法包括:
将1mol/L的Gd(NO3)3溶液与乙二醇混合,制得溶液A;
将NH4H2PO4和尿素溶于水,至NH4H2PO4浓度为0.05g/mL,尿素浓度为0.1g/mL,获得溶液B;
将溶液B与溶液A混合,制得溶液C,加入甘氨酸,搅拌溶解后于180℃反应24h,获得GdPO4·H2O纳米颗粒。
一些实施例中,所述NH4H2PO4、尿素和甘氨酸的质量比为1:2:8;所述Gd(NO3)3溶液与乙二醇的体积比为1:25;所述溶液A与溶液B的体积比为4:1。
本发明中,在制备获得GdPO4·H2O纳米颗粒后,还包括降至室温,然后离心、洗涤沉淀、烘干的步骤。所述室温为18~30℃。
所述经高压静电发生装置后,还包括真空干燥的步骤。所述真空干燥的参数包括:10℃,真空干燥过夜。
本发明所述的细胞微载体或所述制备方法制得的细胞微载体在体外细胞培养和/或细胞移植。
本发明提供的可MRI示踪显影的细胞微载体粒径为200μm~300μm,包括:GdPO4纳米粒或GdPO4水合物纳米粒,以及高分子壁材。由于纳米粒子的稳定性,使得其在体内显影增强效果不易衰退淬灭,借助于医用1,5T核磁便可以对材料的体内状况进行定位示踪,便捷同时贴合临床的转化应用,并且该材料具有良好的生物相容性。
附图说明
图1示实施例2制得细胞微载体形态;
图2示对比例1制得细胞微载体形态;
图3示实施例2制备的细胞微载体的体外核磁T1相显影图;
图4示实施例2制备的细胞微载体的体外核磁T1维彩定量图;
图5示实施例2制备的细胞微载体的安全性检测结果;
图6示实施例2制备的细胞微载体的体内示踪结果。
具体实施方式
本发明提供了一种可MRI示踪显影的细胞微载体及制备方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
1)制备GdPO4·H2O纳米粒子:将1ml1M的Gd(NO3)3溶液加入25mL乙二醇中,混合均匀;称取0.25g NH4H2PO4、0.5g尿素溶于5mL去离子水中,再加入上述溶液并混合均匀;称取甘氨酸2.0g加入上述溶液中,搅拌30min;将上述溶液转入50mL聚四氟乙烯反应釜中,180℃反应24h;降至室温后离心洗涤沉淀,烘干得GdPO4·H2O产物。经检测颗粒长:100-200nm宽15-35nm。
实施例2
制备GdPO4·H2O/PLGA微载体:将实施例1制得的GdPO4·H2O纳米粒分别按0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL浓度加入10mLNMP溶液中,超声分散混匀;称取PLGA1g加到上述溶液中,搅拌过夜至PLGA溶解均匀后再次超声分散均匀。通过高压静电发生装置,将混合溶液通过27G针头,在55℃、距液面高度4cm、电压8.5kV、推速0.1cm/min的条件下制得直径在200-300μm的球状微载体,其中GdPO4·H2O纳米粒子均匀分布在PLGA当中,即PLGA微球当中均匀镶嵌着GdPO4·H2O纳米粒子(图1),微粒成球形。经过真空干燥后可以在4℃长期保存。
对比例1
制备GdPO4·H2O/PLGA微载体:将实施例1制得的GdPO4·H2O纳米粒分别按0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.6mg/mL浓度加入10mLNMP溶液中,超声分散混匀;称取PLGA1g加到上述溶液中,搅拌过夜至PLGA溶解均匀后再次超声分散均匀。通过高压静电发生装置,将混合溶液通过24G针头,在65℃、距液面高度5cm、电压8.1kV、推速0.1cm/min的条件下制得微载体如图2,微粒性状不规则。
效果验证
1、显影效果
对实施例1制备的微载体进行体外显影,其中图3示其在体外核磁T1相下的显影效果,图4示其在体外核磁T1维彩定量下的显影效果,图中微载体中GdPO4·H2O的质量分数从左到右分别是0.05%,0.1%,0.2%,0.4%,0.8%,1.6%,随着GdPO4·H2O的浓度的提高,显影效果增强,浓度为0.8%的组分显影效果最突出,此后不再增强,反而有所下降。
2、细胞培养效果
SH-SY5Y细胞系从SIBS(中国科学院上海细胞生物学研究所)中获得,培养于含10%胎牛血清、100单位/mL青霉素G、100mg/mL链霉素和2mM谷氨酰胺的高糖DMEM培养基(HyClone)中。通过浸提液在SH-SY5Y细胞中检测实施例1制得微载体MCs的细胞毒性,并用CCK-8法测定细胞毒性。将400mg实施例1制得微载体浸泡在37℃培养基中并置于120rpm的摇床摇晃72小时,并取得浸提液。SH-SY5Y细胞在96孔组织培养板中培养(Costar,1×104细胞,每孔100mol/L)。用浸提液替代培养液,孵育24h,用CCK-8法测定提取液的细胞毒性。
图5结果显示,毒性试验的结果可以发现,从0.8%开始含实施例1制得微载体的材料浸提液毒性试验看出材料的毒性开始出现但毒性并不高,下降不超过20%,在毒性允许范围内。
3、体内显影效果
大鼠麻醉后在前囟和后囟中点右侧开一个骨窗,然后连接液压打击装置对小鼠造成一个液压冲击的损伤。造模后,小鼠头皮进行缝合后生长一周,一周后重新打开伤口处。这时由于损伤后的炎症反应,损伤的大鼠脑组织部位会形成一个皮层组织缺损,造模成功。
将实施例2制得的微载体(0.8%Gd)植入损伤处并缝合头皮,然后第二天用1.5T的核磁去观察。图4显示以微载体培养的细胞移植后,三只小鼠都能够良好的显影。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种可MRI示踪显影的细胞微载体,其特征在于,其粒径为200μm~300μm,其制备原料包括:GdPO4水合物纳米粒和高分子壁材;
所述高分子壁材包括PLGA、PGA或PEG中至少一种。
2.根据权利要求1所述的细胞微载体,其特征在于,制备原料包括GdPO4·H2O纳米粒和PLGA。
3.根据权利要求2所述的细胞微载体,其特征在于,所述GdPO4·H2O纳米粒与PLGA的质量比为(0.5~16):1000。
4.权利要求2或3所述细胞微载体的制备方法,包括:将GdPO4·H2O纳米颗粒溶液与NMP溶液经超声分散后,加入PLGA搅拌、超声分散后,经高压静电发生装置中制得所述细胞微载体。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述GdPO4·H2O溶液的浓度为0.05mg/mL~1.6mg/mL;所述NMP的体积为10mL。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,
所述超声分散的参数包括:室温水浴超声30min;
所述搅拌的参数包括:室温60rpm搅拌8~12h;
所述高压静电发生装置的参数包括:27G针头、55℃、距液面高度4cm、电压8.5kV、推速0.1cm/min。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述GdPO4·H2O纳米颗粒的制备方法包括:
将1mol/L的Gd(NO3)3溶液与乙二醇混合,制得溶液A;
将NH4H2PO4和尿素溶于水,至NH4H2PO4浓度为0.05g/mL,尿素浓度为0.1g/mL,获得溶液B;
将溶液B与溶液A混合,制得溶液C,加入甘氨酸,搅拌溶解后于180℃反应24h,获得GdPO4·H2O纳米颗粒。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,
所述NH4H2PO4、尿素和甘氨酸的质量比为1:2:8;
所述Gd(NO3)3溶液与乙二醇的体积比为1:25;
所述溶液A与溶液B的体积比为4:1。
9.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述经高压静电发生装置后,还包括真空干燥的步骤。
10.权利要求1~4任一项所述的细胞微载体或权利要求5~9任一项所述制备方法制得的细胞微载体在体外细胞培养、细胞移植、体内显影和/或药物示踪中的应用。
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GR01 | Patent grant | ||
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