CN111870602A - 含炔基钌配合物作为抑制剂或药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含炔基钌配合物作为抑制剂或药物的应用。神经元Tau蛋白的R2和R3多肽片段是Tau蛋白发生自聚集的关键片段，该自聚集会形成神经纤维性缠结，从而导致阿尔茨海默症。实验证明，含炔基钌配合物对Tau蛋白的R2和R3多肽片段自聚集具有抑制作用；同时，钌(II)配合物具有细胞毒性低、光物理性质稳定、水溶性好等优点，末端修饰炔基则可以提升其与Tau蛋白的结合能力，从而表现为对R2、R3多肽片段的聚集产生较强的抑制效果，因此，该含炔基钌配合物可以作为Tau蛋白的R2和R3多肽片段自聚集的抑制剂，也可以作为治疗阿尔茨海默症的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种含炔基钌配合物作为抑制剂或药物的应用。
背景技术
阿尔茨海默症是一种很常见的神经退行性疾病，尤其是在老年人群众发病率极高，预计到2040年，世界患病总人数就会达到8110万。阿尔茨海默症有几个显著的病理特征：一是神经元外β淀粉样蛋白(Aβ)异常聚集形成的老年斑，二是神经元内Tau蛋白异常聚集形成的神经纤维缠结，另外还有神经元丧失、脑皮质细胞减少等。
Tau蛋白是一种与微管组装密切相关的含磷糖蛋白，也就是一种微管相关蛋白，是细胞骨架中非常重要的组成部分。它的基因位于17号染色长臂上，在被翻译后共有六种不同的Tau蛋白亚型，在这些亚型的序列中，有四段重复序列，分别为R1、R2、R3、R4，聚集主要发生在R2和R3片段，因为两者均含有半胱氨酸残基，上面的巯基在开始会形成二硫键，促进聚集的进一步进行，所以本发明的研究对象为R2和R3多肽片段。
钌(II)配合物拥有丰富的理化性质，细胞毒性低、光物理化学性质稳定、水溶性好、荧光寿命长等一系列优点，被广泛应用于癌症治疗、荧光成像等领域。炔基是缺电子基团，可以改变配合物的电子结构，提升其与蛋白质的结合能力，考虑到炔基可能与巯基发生点击反应，影响到蛋白聚集，因此含炔基的钌配合物是一种生化性能优异、潜在的抗阿尔茨海默症的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含炔基钌配合物作为抑制剂或药物的应用。具体而言，该含炔基钌配合物可以作为用于抑制Tau蛋白的R2和R3多肽片段自聚集的抑制剂，也可以作为治疗阿尔茨海默症的药物。其中，R2多肽片段的序列为：275VQIIN KKLDL SNVQSKCGSK DNIKH VPGGG S305；R3多肽片段的序列为：306VQIVY KPVDL SKVTS KCGSL GNIHHKPGGG Q336。
为了证明抑制效果，本发明也提供了一种用于检测含炔基钌配合物对Tau蛋白关键片段自聚集抑制作用的方法。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种含炔基钌配合物作为Tau蛋白的R2和R3多肽片段自聚集的抑制剂的应用。
其中，上述的炔基钌配合物的结构式包括如下的Ru-A2和Ru-B2；钌(II)配合物Ru-A1为Ru-A2的前体，钌(II)配合物Ru-B1为Ru-B2的前体。上述物质的结构式如下所示：
进一步地，本发明的含炔基钌配合物能够用于治疗阿尔茨海默症的药物。Tau蛋白的R2、R3多肽片段是Tau蛋白发生自聚集形成神经纤维性缠结的关键片段，因此可以作为含炔基钌配合物抑制剂的作用靶点，并利用含炔基钌配合物对其的抑制作用，成为潜在预防、缓解和治疗阿尔茨海默症的药物。
本发明提供一种含炔基钌配合物对Tau蛋白关键片段自聚集抑制作用的检测方法，其包括如下步骤：分别配制300μM的R2和R3多肽储备液于离心管内，封口膜密封，放入4℃冰箱内，预先作用三天左右。实验过程中以pH为7.5的Tris-HCl作为缓冲溶液，引入肝素(heparin)、硫磺素S(ThS)，然后再加入一定浓度的含炔基钌配合物储备液，利用FL、TEM及ITC等仪器方法进行分析。
在上述检测方法基础上，所述的其中各物质的浓度为：肝素3.8μΜ、ThS10μΜ、R2/R3多肽储备液15μΜ。
其中，荧光光谱法(FL)检测的方法是：利用ThS的荧光动力学扫描(Time scan)、ThS波长扫描(Wavelength scan)、R3内源荧光猝灭法来进行检测。以动力学扫描为例，分别比较加入和未加入含炔基钌配合物时特定波长下的荧光值，而荧光值的高低与蛋白聚集程度呈正相关。实验结果表明当加入配合物之后，荧光值会降低，并且随着浓度的增加继续下降。
透射电子显微镜(TEM)检测的方法是：采用观察加入和未加入含炔基钌配合物时，由肝素引发蛋白聚集的形貌特征，发现未加入配合物，视野内有大量蛋白聚集细丝，而加入配合物之后，蛋白细丝明显减少。
等温滴定量热法(ITC)检测的方法是：在样品池中加入蛋白，滴定池中加入配合物，然后用配合物来滴定蛋白，观察体系内热量的变化，可以得出含炔基钌配合物与蛋白的作用是一个放热反应。
本发明的检测原理是：利用肝素来引发Tau蛋白关键片段的聚集，而ThS则会与聚集的蛋白结合，在一定激发波长下产生荧光发射，荧光强度值与聚集程度成正比。具体实验方法如下：
1、荧光动力学扫描：依次加入R2/R3、ThS、Tris-HCl、含炔基钌配合物和肝素，保证其最终浓度与上述浓度一致，再用荧光光谱仪监测其特定激发波长下的荧光发射强度，至荧光强度几乎不改变。荧光波长扫描：加入的物质与动力学一样，含炔基钌配合物的浓度由低到高改变，培养4小时，依次检测荧光强度，由曲线计算得到IC50。内源荧光猝灭：针对R3，控制其浓度为30μM，然后往体系内每次加入10μL 200μM的钌配合物，直至其内源荧光基本完全猝灭。
2、TEM检测：依次向离心管中加入R2/R3、Tris-HCl、含炔基钌配合物、肝素，同时有一组不加入配合物做对照，浓度与上述一致，然后37℃培养4小时，离心取上清液，并用2％的乙酸双氧铀染色一分钟，敷于铜网上，制样完成，在TEM下观察蛋白形貌。
3、ITC检测：向ITC的注射器中吸入80μL含炔基钌配合物储备液(200μM)，样品池中加入100μLR2/R3多肽储备液(30μM)。体系恒温为25℃，搅拌速度为300rpm，第一滴设置为0.4μL，以后每次滴1.6μL，共计25滴，滴定间隔为120s。
其中，上述实验材料均高温灭菌。
其中，R2序列：275VQIIN KKLDL SNVQS KCGSK DNIKH VPGGG S305
其中，R3序列：306VQIVY KPVDL SKVTS KCGSL GNIHH KPGGG Q336。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明通过实验证明了含炔基钌配合物可以作为Tau蛋白关键片段自聚集的抑制剂。实验结果表明含炔基钌配合物可以作为潜在的预防、缓解和治疗阿尔茨海默症的药物。推测含炔基钌配合物(含炔基)可以与Tau蛋白的R2和R3片段(含巯基)发生巯基-炔基间的反应，从而对R2和R3片段的自聚集产生抑制作用。
总之，本发明通过FL、TEM及ITC等仪器方法研究了含炔基钌配合物对R2、R3多肽片段的自聚集抑制情况，提出了一种可能的抑制模型，为筛选出科学有效的Tau蛋白自聚集抑制剂奠定了一定的理论基础，同时也为以后能够预防、缓解和治疗阿尔茨海默症提供了一个新的平台。
附图说明
图1是本发明的四种钌(II)配合物的结构式；其中，Ru-B2和Ru-A2含炔基；
图2是R3与不同浓度的Ru-A2的荧光动力学曲线；其中，指示框中指示线的高低顺序与所指示曲线末端的高低顺序相同；图2至图5的指示顺序同理；
图3是R3与不同浓度的Ru-B2的荧光动力学曲线；
图4是R2与不同浓度的Ru-A2的荧光动力学曲线；
图5是R2与不同浓度的Ru-B2的荧光动力学曲线；其中，指示框中指示线的高低顺序与所指示曲线最高峰的高低顺序相同；以下带最高峰的曲线指示顺序同理；
图6是R3与不同浓度的Ru-A2的波长扫描曲线及IC50计算曲线；
图7是R3与不同浓度的Ru-B2的波长扫描曲线及IC50计算曲线；
图8是四种钌(II)配合物对R3的IC50总结表；
图9是R2与不同浓度的Ru-A2的波长扫描曲线及IC50计算曲线；
图10是R2与不同浓度的Ru-B2的波长扫描曲线及IC50计算曲线；
图11是四种钌(II)配合物对R2的IC50总结表；
图12是在293K和310K时Ru-A2对R3的内源荧光猝灭图；
图13是Ru-A2对R3内源荧光猝灭的Stern-Volmer曲线；
图14是在293K和310K时Ru-B2对R3的内源荧光猝灭图；
图15是Ru-B2对R3内源荧光猝灭的Stern-Volmer曲线；
图16是四种钌(II)配合物的荧光猝灭参数总结表；
图17是含炔基钌配合物对R3自聚集抑制效果的TEM图(分别对应的是不加配合物、加入Ru-A2、加入Ru-B2)；
图18是含炔基钌配合物对R2自聚集抑制效果的TEM图(分别对应的是不加配合物、加入Ru-A2、加入Ru-B2)；
图19是Ru-A2与R3作用的ITC曲线；
图20是Ru-B2与R3作用的ITC曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种含炔基钌配合物作为抑制剂或药物的应用。
人类神经元内Tau蛋白是与阿尔茨海默症密切相关的蛋白之一。神经元Tau蛋白的R2和R3多肽片段是Tau蛋白发生自聚集的关键片段，该自聚集会形成神经纤维性缠结，从而导致阿尔茨海默症。实验证明，含炔基钌配合物对Tau蛋白的R2和R3多肽片段自聚集具有抑制作用，同时，钌(II)配合物具有细胞毒性低、光物理性质稳定、水溶性好等优点，末端修饰炔基则可以提升其与Tau蛋白的结合能力，从而表现为对R2、R3多肽片段的聚集产生较强的抑制效果，因此，该含炔基钌配合物可以作为Tau蛋白的R2和R3多肽片段自聚集的抑制剂，也可以作为治疗阿尔茨海默症的药物。
基于上述目的，本发明提供了一种含炔基钌配合物作为Tau蛋白的R2、R3多肽片段自聚集的抑制剂的应用。
其中，如图1所示，本发明的炔基钌配合物的结构式为：
本发明的含炔基钌配合物可以用作治疗阿尔茨海默症的药物。
本发明为含炔基钌配合物对Tau蛋白关键片段自聚集抑制作用的应用和检测方法。Tau蛋白是与阿尔茨海默症密切相关的蛋白之一，而R2、R3多肽片段则是Tau蛋白发生自聚集形成神经纤维性缠结的关键片段，因此将其作为抑制剂的靶点是科学合理的。钌(II)配合物具有细胞毒性低、光物理性质稳定、水溶性好等优点，末端修饰炔基则可以提升其与蛋白的结合能力，在此发明中表现为对R2、R3多肽片段较强的抑制聚集效果，推测可以发生巯基-炔基间的点击反应。本发明通过FL、TEM及ITC等仪器方法研究了两种含炔基钌配合物对R2、R3多肽片段的自聚集抑制情况，提出了一种可能的抑制模型，为筛选出科学有效的Tau蛋白自聚集抑制剂奠定了一定的理论基础，同时也为以后能够预防、缓解和治疗阿尔茨海默症提供了一个新的平台。
以下对含炔基钌配合物的抑制效果进行实验检测。
含炔基钌配合物对Tau蛋白关键片段自聚集抑制作用的检测方法包括如下步骤：分别配制300μM的R2和R3多肽储备液于离心管内，封口膜密封，放入4℃冰箱内，预先作用三天左右。实验过程中以pH为7.5的Tris-HCl作为缓冲溶液，引入肝素(heparin)、硫磺素S(ThS)，然后再加入一定浓度的含炔基钌配合物储备液，利用FL、TEM及ITC等仪器方法进行分析。分析方法如下：
(1)、FL(荧光光谱法)是利用ThS的荧光动力学扫描(Time scan)、ThS波长扫描(Wavelength scan)、R3内源荧光猝灭法来进行检测。其中各物质的浓度为：肝素3.8μΜ、ThS10μΜ、R2/R3多肽储备液15μΜ。对于动力学扫描，分别比较加入和未加入含炔基钌配合物时特定波长下的荧光值，而荧光值的高低与蛋白聚集程度呈正相关。实验结果表明当加入配合物之后，荧光值会降低，并且随着浓度的增加继续下降。对于波长扫描，分别加入不同浓度的含炔基钌配合物，在37℃下培养4小时，比较特定波长下的荧光强度，计算得出配合物对关键片段的IC50。
对于R2和R3来说，只有R3上的酪氨酸残基使其具有内源荧光，所以针对R3，控制其浓度为30μM，然后往体系内每次加入10μL 200μM的钌配合物，直至其内源荧光基本完全猝灭。
(2)、利用透射电子显微镜(TEM)观察加入和未加入含炔基钌配合物时，由肝素引发蛋白聚集的形貌特征，发现未加入配合物，视野内有大量蛋白聚集细丝，而加入之后，蛋白细丝明显减少。体系内各物质浓度如上面所述，不加入ThS，37℃下培养4小时，离心取上清液，并用2％的乙酸双氧铀染色一分钟，敷于铜网上，制样完成。
(3)、利用等温滴定量热法(ITC)是在样品池中加入蛋白，滴定池中加入配合物，然后用配合物来滴定蛋白，观察体系内热量的变化，可以得出含炔基钌配合物与蛋白的作用是一个放热反应。
检测例1
含炔基钌配合物对Tau蛋白关键片段自聚集抑制作用的荧光检测方法，包括如下步骤：
1、配制Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝7.50)：准确称取6.05gTris盐，溶解于800mL灭菌三重蒸馏水中，用稀盐酸缓慢调节pH至7.50，转移至1000mL容量瓶，再用三重蒸馏水定容。
2、配制ThS溶液(0.2mΜ)：准确称取2.4mg ThS，用25mL上述缓冲液溶解，振荡摇匀，保存备用。
3、配制肝素溶液(76μΜ)：准确称取5mg肝素，用10.8mL上述缓冲液溶解，振荡摇匀，保存备用。
4、配制R2/R3溶液(1mg/mL，300μΜ)：准确称取1mg R2或R3，置于离心管中，用1mL上述缓冲液溶解，密封保存于4℃冰箱备用。
5、配制乙酸双氧铀溶液(2％)：准确称取20mg乙酸双氧铀，用1mL三重蒸馏水溶解，离心，取上清液备用。
6、配制含炔基钌配合物溶液(200μΜ/20μM)：准确称取2mg钌配合物于15mL离心管中，加入150μL DMSO溶解，再用三重蒸馏水定容至10mL，振荡摇匀，保存备用，此时得到的溶液浓度为200μM。取200μM溶液1mL于15mL离心管中，用三重蒸馏水定容至10mL，得到浓度为20μM的溶液。
7、配制DMSO稀释液(1.5％)：移取150μL DMSO，用三重蒸馏水定容至10mL，超声振荡，摇匀备用。
8、(1)、荧光动力学测量：向1.5mL离心管中依次加入50μL R2/R3溶液、50μL ThS溶液、一定体积Tris-HCl缓冲液、一定体积DMSO稀释液、一定体积钌配合物溶液、50μL肝素溶液，用移液枪吞吐均匀，保证最后体系内各组分浓度为肝素3.8μΜ、ThS10μΜ、R2/R3多肽储备液15μΜ。然后将溶液迅速转移到比色皿中，开始测量，荧光仪恒温37℃。
测量类型：Time scan，激发波长：440nm，发射波长：500nm。
图2是R3与不同浓度的Ru-A2的荧光动力学曲线。如图2中，指示框内的R3代表末端最高的曲线；指示框内的R3+0.5μM Ru-A2表示末端次高的曲线，以此类推。下图同理。图2所得的结论：随着Ru-A2浓度的不断升高，R3多肽片段的聚集程度不断下降，Ru-A2对R3多肽片段聚集的抑制效果呈现浓度响应效应。
图3是R3与不同浓度的Ru-B2的荧光动力学曲线。图3所得的结论为：随着Ru-B2浓度的不断升高，R3多肽片段的聚集程度不断下降，Ru-B2对R3多肽片段聚集的抑制效果呈现浓度响应效应。
图4是R2与不同浓度的Ru-A2的荧光动力学曲线。图4所得的结论为：随着Ru-A2浓度的不断升高，R2多肽片段的聚集程度不断下降，Ru-A2对R2多肽片段聚集的抑制效果呈现浓度响应效应。
图5是R2与不同浓度的Ru-A2的荧光动力学曲线。图5所得的结论为：随着Ru-B2浓度的不断升高，R2多肽片段的聚集程度不断下降，Ru-B2对R2多肽片段聚集的抑制效果呈现浓度响应效应。
图2至图5的指示框内的上下次序分别与曲线(末端)的上下次序相对应。
图2至图5的结果对比能说明：Ru-A2和Ru-B2这两种含炔基钌配合物均能对R2和R3多肽片段的聚集表现出较强的抑制效果，并且均随着配合物浓度的提高，其抑制效果增强。同时在相同浓度下，含有两个炔基的Ru-B2比含有一个炔基的Ru-B1的抑制效果要更强。
(2)、荧光波长扫描测量：溶液配制过程与动力学类似，配得一系列钌配合物浓度不一样的溶液，密封，置于37℃恒温培养箱中培养4小时，按照浓度从低到高的顺序，测量各溶液的荧光值。
测量类型：Wavelength scan，激发波长：440nm，扫描范围：460-600nm。
图6是R3与不同浓度的Ru-A2的波长扫描曲线(图6a)及IC50计算曲线(图6b)。每幅图中的左图为a，右图为b，以下同理。图6所得的结论为：随着Ru-A2浓度的不断增加，荧光发射峰的峰值不断下降，直到几乎完全猝灭，说明Ru-A2可以几乎完全抑制R3多肽片段的聚集。用加入一定浓度Ru-A2时的荧光峰值Ft与不加入肝素时相应发射波长下的荧光强度值F0这两者的差值(Ft-F0)，比上仅加入肝素时的荧光峰值F1与F0的差值(F1-F0)，即(Ft-F0)/(F1-F0)，将此值乘以100％对Ru-A2浓度作图，拟合曲线，得到总坐标为50时相应的浓度值即IC50，以下同理。
图7是R3与不同浓度的Ru-B2的波长扫描曲线(图7a)及IC50计算曲线(图7b)。图7所得的结论为：随着Ru-B2浓度的不断增加，荧光发射峰的峰值不断下降，直到几乎完全猝灭，说明Ru-B2可以几乎完全抑制R3多肽片段的聚集。同样我们也可以计算得到Ru-B2对R3多肽片段聚集的IC50。
图8是四种钌(II)配合物对R3的IC50总结表。图8所得的结论为：与传统的抑制剂相比，四种钌(II)配合物对R3的IC50较低，说明有较为不错的抑制潜力，同时带有炔基的配合物比不带有炔基的配合物IC50低了近十倍，炔基在抑制过程中起了非常重要的作用。
图9是R2与不同浓度的Ru-A2的波长扫描曲线(图9a)及IC50计算曲线(图9b)。图9所得的结论为：随着Ru-A2浓度的不断增加，荧光发射峰的峰值不断下降，直到几乎完全猝灭，说明Ru-A2可以几乎完全抑制R2多肽片段的聚集。同样我们也可以计算得到Ru-A2对R2多肽片段聚集的IC50。
图10是R2与不同浓度的Ru-B2的波长扫描曲线(图10a)及IC50计算曲线(图10b)。图10所得的结论为：随着Ru-B2浓度的不断增加，荧光发射峰的峰值不断下降，直到几乎完全猝灭，说明Ru-B2可以几乎完全抑制R2多肽片段的聚集。同样我们也可以计算得到Ru-B2对R2多肽片段聚集的IC50。
图11是四种钌(II)配合物对R2的IC50总结表。图11所得的结论为：与传统的抑制剂相比，四种钌(II)配合物对R2的IC50较低，说明有较为不错的抑制潜力，同时带有炔基的配合物比不带有炔基的配合物IC50低了近十倍，炔基在抑制过程中起了非常重要的作用。
图6至图11的指示框内的上下次序分别与曲线(末端)的上下次序相对应。
图6至图11的结果对比能说明：Ru-A2和Ru-B2这两种含炔基钌配合物在一定浓度下，可以几乎完全抑制R2、R3多肽片段的聚集。比较四种配合物相应的IC50，含有炔基的比不含有炔基的配合物的IC50要小了十倍左右，同时含有两个炔基的比含有一个炔基的配合物的IC50也要小一些，说明含炔基的钌配合物是一种作用效果较好的抑制剂。
(3)、内源荧光猝灭：移取100μL R3溶液于1.5mL离心管，加入900μL上述缓冲液，此时R3浓度为30μΜ，混合均匀，转移至比色皿中测量荧光值，然后取出比色皿，向其中滴加10μL 200μΜ钌配合物溶液，吞吐均匀，测量荧光值，重复上述操作至荧光值几乎不发生变化，此时可认为猝灭完全，实验结束。
测量类型：Wavelength scan，激发波长：225nm，扫描范围：270-470nm。
图12是在293K和310K时Ru-A2对R3的内源荧光猝灭图。图12所得的结论为：在293K和310K时，Ru-A2可以明显猝灭R3的内源荧光，浓度越高，猝灭效果越明显。
图13是Ru-A2对R3内源荧光猝灭的Stern-Volmer曲线。图13所得的结论为：以R3内源荧光峰值与加入Ru-A2时的荧光峰值这两者的比值，对Ru-A2浓度作图，拟合曲线，以下同理。KSV随着温度的升高而降低，说明Ru-A2对R3的猝灭是静态猝灭。
图14是在293K和310K时Ru-B2对R3的内源荧光猝灭图；图14所得的结论为：在293K和310K时，Ru-B2可以明显猝灭R3的内源荧光，浓度越高，猝灭效果越明显。
图15是Ru-B2对R3内源荧光猝灭的Stern-Volmer曲线。图15所得的结论为：KSV随着温度的升高而降低，说明Ru-B2对R3的猝灭是静态猝灭。
图16是四种钌(II)配合物的荧光猝灭参数总结表。图16所得的结论为：Ru-A2和Ru-B2对R3的猝灭主要是静态猝灭，而Ru-A1和Ru-B1对R3的猝灭主要是动态猝灭，静态猝灭是指两者之间形成了较为稳定的复合物，动态猝灭是指两者之间发生了碰撞。由此推测含炔基的钌配合物可能与R2多肽片段发生了共价结合。
检测例2：
TEM检测具体包括如下步骤：
(1)、配制空白组对照的溶液：50μL多肽溶液+890μL缓冲溶液+10μL DMSO稀释液+50μL肝素溶液。
(2)、配制含炔基钌配合物溶液：50μL多肽溶液+800μL缓冲溶液+100μL 20μM含炔基钌配合物溶液+50μL肝素溶液。
(3)、将上述两类溶液置于37℃的恒温培养箱培养4h，低速离心取上清液7μL滴加于铜网之上，待自然晾干之后，再滴加7μL乙酸双氧铀溶液，晾干后置于TEM中观察形貌。
图17是含炔基钌配合物对R3自聚集抑制效果的TEM图(分别对应的是不加配合物、加入Ru-A2、加入Ru-B2)。图17所得的结论为：在由肝素单独引发聚集的R3多肽片段TEM图中，有大量纤维细丝的缠绕和聚集，当加入配合物后，视野内纤维细丝的数量大大减少，缠绕和聚集现象几乎消失，表明配合物具有良好的抑制效果。
图18是含炔基钌配合物对R2自聚集抑制效果的TEM图(分别对应的是不加配合物、加入Ru-A2、加入Ru-B2)。图18所得的结论同R3多肽片段。
图17至图18的结果对比能直观表明含炔基钌配合物可以有效抑制R2、R3多肽片段的自聚集。
检测例3：
ITC检测具体包括如下步骤：
注射器中吸入80μL 200μΜ含炔基钌配合物溶液，样品池中加入100μL R2/R3多肽储备液(30μM)，体系温度恒温25℃，搅拌速度为300rpm。滴定时第一滴设置为0.4μL，以后每次滴1.6μL，滴定间隔120s。
图19是Ru-A2与R3作用的ITC曲线。图19有上下两幅图，上图表示将配合物滴加到R3蛋白中后，体系的热量随时间变化的原始数据，下图表示积分后的热量随摩尔比的变化数据。Ru-A2与R3的作用是一个放热反应。
图20是Ru-B2与R3作用的ITC曲线。图20表示Ru-B2与R3的作用是一个放热反应。
图19至图20的结果对比说明：带有炔基的配合物与R3多肽片段的结合较强，其反应的ΔG较低，反应倾向于自发。
总之，本发明通过实验提供了含炔基钌配合物可以作为Tau蛋白关键片段自聚集抑制剂的应用，实验结果表明配合物可以作为潜在的预防、缓解和治疗阿尔茨海默症的药物。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种含炔基钌配合物作为Tau蛋白的R2和R3多肽片段自聚集的抑制剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的炔基钌配合物的结构式为：
3.一种含炔基钌配合物作为用于治疗阿尔茨海默症的药物的用途。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的炔基钌配合物的结构式为：
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