CN111867644A - 用于治疗疾病的可植入的细胞敷料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含至少两层的多层基体，其中第一层包含生物可吸收材料并且第二层包含生物胶粘剂材料，其中第二层含有细胞。还提供了生产多层基体的方法和多层基体的用途。

Description

用于治疗疾病的可植入的细胞敷料
本发明涉及用于在医学(内科)中使用(包括治疗心脏病)的可植入的细胞敷料(dressing，包衣)，其由细胞外基体支撑的、自胶粘的、并入了供体细胞的可吸收的生物相容的贴片组成。
心力衰竭仍然是人类残疾和死亡的主要原因，并且开发新的、有效的、具有成本效益的用于治疗心力衰竭的策略是高度优先的。目前的研究已经表明移植干细胞/祖细胞改进了衰竭的心脏的心脏功能(P.Menasche,Cardiac cell therapy：Lessons fromclinical trials,J Mol Cell Cardiol,2011；50,258-265；M.A.Laflamme等,Heartregeneration,Nature 2011；473,326-335)。这种创新疗法已经在临床研究中使用源于骨髓的细胞、间充质干细胞、骨骼成肌细胞、心脏祖细胞等进行了测试。然而，目前在这些试验中观察到的疗效不如预期的那样显著。这种低效率的最重要问题之一是在细胞移植之后供体细胞植入不良，这很大程度上是由于通往心脏的细胞递送途径欠佳(N.G.Campbell等,Cell delivery routes for stem cell therapy to the heart：current and futureapproaches,J Cardiovasc Transl Res 2012；5(5),713-726；S.Fukushima et al.,Choice of cell-delivery route for successful cell transplantation therapy for the heart.Future Cardiol.2013；9,215-227).
当前可用的细胞递送方法包括心肌内、冠状动脉内和静脉内注射细胞悬浮液。然而，所有这些注射方法都造成令人失望的心脏内不良的供体细胞植入。一般来说，在这些注射方法之后，供体细胞的存在在第7天仅为<10％并且在第28天仅为<1％(K.Suzuki等,Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronaryinfusion：distribution,dynamics,and influence on cardiac function,Circulation2004；110,225-230；S.Fukushima等,Choice of cell-delivery route for skeletalmyoblast transplantation for treating post-infarction chronic heart failurein rat,PLoS ONE 2008；3(8),e3071；S.Fukushima等,Direct intramyocardial but notintracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmiasin a rat chronic ischemic heart failure model,Circulation 2007；115,2254-2261)。这些不良的结果主要是因为被注射的供体细胞在心脏内有限的初始保留和随后不良的细胞存活。这样的不良的供体细胞植入大大限制了基于细胞的疗法的治疗功效。此外，心肌内注射带有发生心率失常的风险，而冠状动脉内注射具有冠状动脉栓塞的风险(T.Narita等,The use of cell-sheet technique eliminates arrhythmogenicity ofskeletal myoblast-based therapy to the heart with enhanced therapeuticeffects,Int J Cardiol 2013；168,261-269；S.Fuskushima等,Direct intramyocardialbut not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventriculararrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model,Circulation 2007；115,2254-2261)。因此，开发更有效且更安全的干细胞/祖细胞至心脏的递送方法对于这种针对心力衰竭的新兴治疗方法的未来成功是关键的(T.Narita等,Bone marrow-derivedmesenchymal stem cells for the treatment of heart failure,Heart Fail Rev2015；20,53-68；S.Fukushima等,Choice of cell-delivery route for successful celltransplantation therapy for the heart,Future Cardiol 2013,9(2),215-227)。
为了解决该问题，已报道了利用与注射相对的心外膜放置。通过使用用温度响应的培养皿产生的“细胞膜片(cell sheets)”经此途径移植的细胞在移植1小时时显示出显著的95％的初始保留(与对于心肌内注射而言的15～30％相对比)，此后这产生了>5倍的供体细胞存在的提高(T.Narita等,The use of cell-sheet technique eliminatesarrhythmogenicity of skeletal myoblast-based therapy to the heart withenhanced therapeutic effects,Int J Cardiol 2013；168,261-269；T.Narita等,Theuse of scaffold-free cell sheet technique to refine mesenchymal stromal cell-based therapy for heart failure,Mol Ther 2013；21(4),860-867；N.Tano等,Epicardial placement of mesenchymal stromal cell sheets for the treatment ofischemic cardiomyopathy；in vivo proof-of-concept study,Mol Ther 2014；22(10),1864-1871)。大部分供体细胞保留在心外膜表面处，但通过附接该膜片从受体心肌萌发了新的血管。结果是，相对于心肌内注射，该方法实现了增强的心脏功能恢复。然而，细胞膜片对生产技术要求较高。难以维持足够的质量控制，并且该程序被延长到大约24小时。细胞膜片的处理还因为该膜片可易于撕裂而存在问题，并且长期储存/运输是困难的。因此，细胞膜片需要执业医师方面具有广泛的专业知识，这阻碍了此方法在临床中作为通用工具使用。
简单地滴下普通细胞悬浮液不允许供体细胞保持在心脏上；大部分细胞只会掉落。已经报道了使用水凝胶(比如纤维蛋白胶)使得能够将干细胞心外膜放置在心脏表面上。然而，水凝胶通常不那么坚硬，使得并入了干细胞的水凝胶往往由于与周边组织(如心包膜、肺和胸壁)的机械接触而被擦掉。此外，这些材料可成为术后壁粘连的起因，这可造成不良的情况。
因此需要克服这些问题的新方法，以便使得疾病的基于细胞的疗法能够成功。
本发明提供了以下：
<1>包含至少两层的多层基体，其中第一层包含生物可吸收材料并且第二层包含生物胶粘剂材料，其中第二层含有细胞。
<2>根据<1>所述的多层基体，其中细胞中对CD105、CD73和CD90呈阳性的细胞百分比为50％或更高，并且细胞中对CD45和CD34呈阳性的细胞百分比为10％或更低。
<3>根据<1>至<2>中任意项所述的多层基体，其中细胞中对CD142呈阳性的细胞百分比为50％或更高，并且细胞中对CD106呈阳性的细胞百分比为10％或更低。
<4>根据<1>至<3>中任意项所述的多层基体，其中所述细胞为间充质干细胞。
<5>根据<1>至<4>中任意项所述的多层基体，其中所述间充质干细胞源自胎儿附属物。
<6>根据<1>至<5>中任意项所述的多层基体，其中在第二层中所包含的细胞密度为0.3x 106细胞/cm2或更高。
<7>根据<1>至<6>中任意项所述的多层基体，其中多层基体的施用面积/体重(theadministrating area of the multilayer matrix per body weight，以单位体重计的多层基体的施用面积)为0.1cm2/kg或更高并且6.0cm2/kg或更低。
<8>根据<1>至<7>中任意项所述的多层基体，其中第二层包含至少两种生物胶粘剂材料。
<9>根据<1>至<8>中任意项所述的多层基体，其中生物胶粘剂材料为选自纤维蛋白原、凝血酶、明胶、层粘连蛋白、整合素、纤连蛋白和玻连蛋白中的至少一种。
<10>根据<1>至<9>中任意项所述的多层基体，其中生物胶粘剂材料包含生物可吸收材料。
<11>根据<1>至<10>中任意项所述的多层基体，其中第二层还含有二甲亚砜和清蛋白。
<12>根据<1>至<11>中任意项所述的多层基体，其中生物可吸收材料为选自胶原、明胶、纤维素、纤维素乙酸酯、壳聚糖、几丁质、聚乳酸酯、透明质酸、聚乙醇酸和聚乙烯醇中的至少一种。
<13>根据<1>至<12>中任意项所述的多层基体，其用于治疗对象的组织或器官的病变或创伤的方法。
<14>根据<13>所述的多层基体，其中所述器官是心脏。
<15>根据<13>所述的多层基体，其中所述组织是心肌。
<16>根据<1>至<15>中任意项所述的多层基体，其中第二层还含有药物(一种或多种)。
<17>根据<1>至<16>中任意项所述的多层基体，其中将细胞悬浮液施加至第二层，并且细胞悬浮液的体积为20μL/cm2或更高并且60μL/cm2或更低。
<18>根据<1>至<17>中任意项所述的多层基体，其中，在将细胞施加至多层基体之后，所施加的细胞的存活比率保持为70％或更高至少3个小时。
<19>包含至少两层的多层基体，其中第一层包含生物可吸收材料并且第二层包含生物胶粘剂材料，其中第二层含有细胞，其用于治疗对象的组织或器官的病变或创伤的方法，其中在施加多层基体之前，将包含药物(一种或多种)的溶液施加至第二层。
<20>生产包含至少两层的多层基体的方法，其中第一层包含生物可吸收材料并且第二层包含生物胶粘剂材料，其中第二层含有细胞，所述方法包括以下步骤；
A)制备细胞悬浮液和
B)将细胞悬浮液施加至多层基体的第二层。
<21>根据<20>所述的生产多层基体的方法，其中含有细胞的悬浮液的体积为20μL/cm2或更高并且60μL/cm2或更低。
<22>根据权利要求<20>或<21>所述的生产多层基体的方法，其中细胞悬浮液含有清蛋白和二甲亚砜。
<23>根据权利要求<22>所述的生产多层基体的方法，其中清蛋白的浓度为0.5重量％或更高并且8重量％或更低。
<24>根据权利要求<22>或<23>所述的生产多层基体的方法，其中二甲亚砜的浓度为3％或更高并且10％或更低。
<25>根据<20>至<24>中任意项所述的生产多层基体的方法，其中细胞悬浮液还含有羟乙基淀粉。
<26>根据<20>至<25>中任意项所述的生产多层基体的方法，其中细胞悬浮液的细胞浓度为5x 106细胞/mL或更高并且133x 106细胞/mL或更低。
<27>根据<20>至<26>所述的生产多层基体的方法，其中细胞中对CD105、CD73和CD90呈阳性的细胞百分比为50％或更高，并且细胞中对CD45和CD34呈阳性的细胞百分比为10％或更低。
<28>根据<20>至<27>所述的生产多层基体的方法，其中细胞中对CD142呈阳性的细胞百分比为50％或更高，并且细胞中对CD106呈阳性的细胞百分比为10％或更低。
<29>根据<20>至<28>所述的生产多层基体的方法，其中所述细胞为间充质干细胞。
<30>根据<20>至<29>所述的生产多层基体的方法，其中所述间充质干细胞源自胎儿附属物。
<31>根据<20>至<30>所述的生产多层基体的方法，其中当将细胞悬浮液施加至多层基体时细胞密度为0.3x 106细胞/cm2或更高。
<32>根据<20>至<31>所述的生产多层基体的方法，其中多层基体的施用面积/体重为0.1cm2/kg或更高并且6.0cm2/kg或更低。
<33>根据<20>至<32>所述的生产多层基体的方法，其中，在将细胞施加至多层基体之后，所施加的细胞的存活比率保持为70％或更高至少3个小时。
<34>根据<20>至<33>所述的生产多层基体的方法，其中生物可吸收材料为选自胶原、明胶、纤维素、纤维素乙酸酯、壳聚糖、几丁质、聚乳酸酯、透明质酸、聚乙醇酸和聚乙烯醇中的至少一种。
<35>根据<1>所述的多层基体用于治疗对象的组织或器官的病变或创伤的用途。
<36>根据<35>所述的多层基体的用途，其中在施加多层基体之前将包含细胞的悬浮液施加至第二层。
<37>根据权利要求1所述的多层基体用于生产用于治疗对象的组织或器官的病变或创伤的试剂的用途。
<38>根据<37>所述的多层基体的用途，其中在施加多层基体之前将包含细胞的悬浮液施加至第二层。
<39>部件的试剂盒，其包含至少在容器中的细胞悬浮液和包含至少两层的多层基体，其中第一层包含生物可吸收材料并且第二层包含生物胶粘剂材料。
<40>根据<39>所述的部件的试剂盒，其中细胞中对CD105、CD73和CD90呈阳性的细胞百分比为50％或更高，并且细胞中对CD45和CD34呈阳性的细胞百分比为10％或更低。
<41>根据<39>或<40>所述的部件的试剂盒，其中细胞中对CD142呈阳性的细胞百分比为50％或更高，并且细胞中对CD106呈阳性的细胞百分比为10％或更低。
<42>根据<39>至<41>中任意项所述的部件的试剂盒，其中所述细胞为间充质干细胞。
<43>根据<42>所述的部件的试剂盒，其中所述间充质干细胞源自胎儿附属物。
<44>根据<39>至<43>中任意项所述的部件的试剂盒，其中多层基体和细胞的比率为0.3x 106细胞或更多，以每1cm2多层基体计。
<45>根据<39>至<44>中任意项所述的部件的试剂盒，其中多层基体和细胞的比率为20μL或更高并且60μL或更低，以每1cm2多层基体计。
<46>根据<39>至<45>中任意项所述的部件的试剂盒，其中多层基体的施用面积/体重为0.1cm2/kg或更高并且6.0cm2/kg或更低。
<47>根据<39>至<46>中任意项所述的部件的试剂盒，其中生物可吸收材料为选自胶原、明胶、纤维素、纤维素乙酸酯、壳聚糖、几丁质、聚乳酸酯、透明质酸、聚乙醇酸和聚乙烯醇中的至少一种。
因此，提供了包含至少两层的多层基体，其中第一层包含生物可吸收材料并且第二层包含生物胶粘剂材料，其中第二层含有细胞。所述多层基体可用于治疗对象的组织或器官的病变或创伤的方法。
本发明的基体可为多层基体，其由至少一个由生物可吸收材料制成的层和至少一个由生物胶粘剂材料制成的层组成。但在实践中，在多种情况中双层是合适的。然而，可按需要添加额外的层以提供进一步的稳定性或生物活性。例如可添加涂敷有促进病变或创伤的治疗的药物的层。
第一层包含生物可吸收材料。术语“生物可吸收材料”指的是在活体中被降解和吸收并且为基体提供结构(体)的材料。结构(体)可为适合于细胞植入的支架的形式。该层可保护第二层免受周围组织的摩擦或机械损害。适宜地，基体可为天然的或合成的。
生物可吸收材料没有特别的限制，只要在施用至活体时其不存在有害效果，比如对活体的副作用，并且在活体环境中不会劣化。生物可吸收材料可为生物可吸收聚合物。生物可吸收材料的实例包括胶原以及胶原、明胶和胶原肽。生物可吸收材料的实例包括多糖以及纤维素、纤维素乙酸酯、氧化再生纤维素、壳聚糖、几丁质和透明质酸。生物可吸收材料的实例还包括以下提及的那些以及聚糖乳酸复合物(polyglactin)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸酯、聚乙醇酸和聚乙烯醇。例如，胶原优选用作生物可吸收材料。可按需要使用任何类型的胶原，例如原纤状或非原纤状胶原。合适的胶原的实例包括I型，II型，III型，IV型和/或V型胶原，或其混合物。胶原可来自任何一般合适的来源，包括人、马、猪、牛、山羊和/或绵羊。明胶、纤维素、纤维素乙酸酯、壳聚糖、几丁质、聚乳酸酯、透明质酸和聚乙烯醇可优选地用作不同于胶原的实例。
任选地，生物可吸收材料可包含额外组分，比如防腐剂和/或稳定剂。防腐剂和/或稳定剂的合适的实例包括清蛋白，核黄素，氯化钠，柠檬酸钠，和/或盐酸L-精氨酸，或其混合物。
在一个实例中，生物可吸收材料可包括马胶原、人清蛋白、核黄素、氯化钠、柠檬酸钠和盐酸L-精氨酸。
生物可吸收材料的形式理想地为片状的。优选使用多孔的片比如无纺布或海绵或膜状片。
第二层包含生物胶粘剂材料。术语“生物胶粘剂材料”指的是对器官或组织呈现为胶粘剂的材料。生物胶粘剂材料在使用时为基体提供粘附至组织或器官表面的能力。进一步地，第二层优选为对细胞和生物可吸收材料表现出低毒性的材料，但不限于此。生物胶粘剂材料可由细胞外基体比如纤维蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白组成。生物胶粘剂材料可由细胞粘附分子比如整合素和选择素组成。生物胶粘剂材料可由凝血酶和明胶组成。优选使用纤维蛋白原和/或凝血酶，它们适宜地以粉末(适宜地为无水的)的形式提供，使得生物胶粘剂材料可在需要使用时即时地制备。这在实践中意味着在需要使用基体时将培养基(mediu，介质)施加至第二层(以下也称作生物胶粘剂层)。第二层可包含至少两种生物胶粘剂材料。
生物胶粘剂材料可包含其他组分，比如抑肽酶和/或纤溶酶原。
进一步地，该多层基体优选为这样的材料，其使得施加了该材料的细胞可长时间保持高存活率。具体地，当将施加至多层基体的细胞保持在37℃时，优选的是在施加前的活细胞的70％或更高(更优选80％或更高，还更优选90％或更高)在至少3小时后存活。进一步地，更优选的是在施加前的活细胞的70％或更高(更优选80％或更高，还更优选90％或更高)在至少6小时后存活。
在使用中，施加至第二层的细胞悬浮液可包含有/没有药物的细胞和水溶液。该溶液可包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、含有二价阳离子的Ringer’s溶液(例如，氯化钙或氯化镁)或培养基。该培养基可包括HBSS(+)，HBSS(-)，RPMI，IMEM，DMEM，MEM，和/或细胞防腐剂，其可任选地补充有血清、血浆或含蛋白质的溶液。市售的低温保存溶液可优选用作该溶液。例如，CP-1(由Kyokuto Pharmaceutical Industry Co.，Ltd.制造)，BAMBANKER(由LymphotecCorporation制造)，STEM-CELLBANKER(由Nippon Zenyaku Kogyo Co.，Ltd.制造)，ReproCryo RM(由ReproCell制造)，CryoNovo(Akron Biotechnology，MSC FreezingSolution(由BiologicalIndustries制造)，CryoStor(由HemaCare制造)等。细胞防腐剂可为一种或两种或更多种的以上列出的溶液中与一种或两种或更多种低温防腐剂(比如二甲亚砜，清蛋白，甘油，羟乙基淀粉，或葡聚糖)的组合的溶液。二甲亚砜的浓度优选为3重量％或更高，4重量％或更高，5重量％或更高。二甲亚砜的浓度的上限为10重量％或更低，9重量％或更低，8重量％或更低，7重量％或更低。清蛋白的浓度优选为0.5重量％或更高，1重量％或更高，2重量％或更高，3重量％或更高。清蛋白的浓度的上限为8重量％或更低，7重量％或更低，6重量％或更低，5重量％或更低。羟乙基淀粉的浓度优选为3重量％或更高，4重量％或更高，5重量％或更高。羟乙基淀粉的浓度的上限为9重量％或更低，8重量％或更低，7重量％或更低。细胞防腐剂的一个实例包括5重量％的二甲亚砜、6重量％的羟乙基淀粉和4重量％的人血清蛋白的组合物。
在细胞防腐剂与多层基体的组合的一个实例中，悬浮在细胞防腐剂中并且以冷冻状态供应的细胞在临床实践中解冻，并且直接施加至多层基体，不存在通过离心等去除细胞防腐剂的特殊步骤。因此，经细胞涂覆的多层基体的制备的过程的时间段可被缩短。例如，可在10分钟内将所述细胞施加至多层基体或患者。
在细胞防腐剂与多层基体的组合的一个实例中，悬浮在细胞防腐剂中并且以冷冻状态供应的细胞在临床实践中解冻，并且通过离心用溶液(比如盐水，磷酸盐缓冲盐水，Ringer’s溶液)和培养基清洗。然后，将细胞悬浮在溶液中，制备成合适的细胞浓度并且施加至多层基体。
待并入至基体中的药物(一种或多种)可为保护受体心脏或供体细胞的药物，激活供体细胞的功能或强化供体细胞的表型的药物，或引起血管生成、消炎和组织修复的药物。因此药物可包括生长因子(例如IGF-1)、血管生成因子(例如VEGF)、细胞因子(例如IL-10)、趋化因子(例如SDF-1)、类固醇、酶(例如超氧化物歧化酶)或这些的组合。
待并入至基体中的细胞可为干细胞、祖细胞、前体细胞、体细胞，或细胞系，例如诱导多能干(iPS)细胞、胚胎干(ES)细胞、间充质干细胞(MSC)、心脏祖细胞、心肌细胞。所述干细胞可为其衍生物，例如用于分化的细胞类型的祖干细胞。MSC可源自任何合适的来源，包括羊膜、绒毛膜、胎盘、胎膜、骨髓、脐带血和脂肪组织。所述ES细胞可来自沉积的ES细胞系。所述ES细胞可源自孤雌激活卵母细胞。适宜地，所述细胞对供体可为同种异体的。所述细胞还可为自体同源的，或在一些情况中是异种的。MSC可比ES细胞、iPS细胞、心肌祖细胞和心肌细胞为更有利的，因为MSC是低免疫原性的，使得在向患者施用同种异体的MSC时，不会引发免疫应答。
术语“间充质干细胞(MSC)"指的是满足以下定义的并且可与"间充质细胞"互换使用的干细胞。如本文中所使用的，"间充质干细胞"可被描述为"MSC"。间充质干细胞的定义如下：
i)在用标准培养基的培养条件下粘附至塑料。
ii)对表面抗原CD105、CD73和CD90为阳性；对CD45、CD34、CD11b、CD79α和HLA-DR为阴性。
待并入至基体中的细胞是为了形成，例如，细胞团块、细胞聚集体、细胞悬浮液。
在本发明的细胞中，间充质干细胞，优选在体外培养最高达20天或更长，更优选40天或更长，60天或更长，80天或更长，100天或更长。细胞可在上述条件中在保持正常的染色体组型的情况下和不停止生长的情况下培养。间充质干细胞可传代1次或更多次，优选2次或更多次，更优选3次或更多次，还优选5次或更多次，还优选10次或更多次。传代的次数的上限没有特别限制，但其为，例如，50次或更少次，40次或更少次，30次或更少次。间充质干细胞的群体倍增优选为10次或更多次，更优选20次或更多次，30次或更多次，40次或更多次，50次或更多次。群体倍增的上限没有特别限制，但其为，例如，100次或更少次，80次或更少次，60次或更少次。群体倍增为在培养时间期间细胞群体分裂的次数并且通过下式计算；[log10(在培养结束时的细胞数)-log10(在培养开始时的细胞数)]/log102。
胎儿附属物来源的MSC(例如，羊膜来源的MSC)在更高的初始细胞产出和更大量的增殖能力方面比骨髓来源的或脂肪组织来源的MSC可为更有利的。胎儿附属物是医疗废物并且因此胎儿附属物来源的MSC不存在患者或自愿供体中的侵入性活组织检查(biopsy)和伦理问题。由于更高的初始细胞产出，还可优选使用脂肪组织来源的MSC。
术语"胎儿附属物"是用来意指胎膜、胎盘、脐带和羊水的。此外，术语"胎膜"意指含有围绕着胚胎的羊水的妊娠囊，并且可包含羊膜、绒毛膜和蜕膜。在这些之中，羊膜和绒毛膜源自胚胎。术语"羊膜"指示的是位于胎膜的最内层上的含有非常少的血管的透明薄膜。羊膜的内层(其也称作"上皮细胞层")覆盖有具有分泌功能的上皮细胞的单层，并且因此，分泌羊水。另一方面，羊膜的外层(其也称作对应于间质的"细胞外基质层")含有间充质干细胞。
胎儿附属物来源的间充质干细胞可包括这样的细胞群体，其包括通过使胎儿附属物比如羊膜经受酶处理的间充质干细胞。所述酶可包括胶原酶和/或金属蛋白酶。作为金属蛋白酶，可提及嗜热菌蛋白酶和/或分散酶(dispase，中性蛋白酶)，但对其没有特别限制。酶处理可优选通过将胶原酶和金属蛋白酶组合而进行。更优选地，胎儿附属物通过将前述的酶组合而同时立即(at once)处理。对于胎儿附属物的酶处理，优选的是通过将羊膜沉浸在酶溶液中和用搅拌装置搅拌来处理已经用清洗溶液比如生理盐水溶液或Hank’s平衡盐溶液清洗过的羊膜。作为该搅拌装置，例如，从有效地释放胎儿附属物的细胞外基质层中含有的间充质干细胞的角度来看，可使用搅拌器或振动器，但不限于此。在酶处理之后，可通过已知方法分离和纯化间充质干细胞，比如过滤器、离心、中空纤维分离膜、细胞分类器等。优选地，间充质干细胞通过过滤器被纯化。在用双重或更多重介质或平衡盐缓冲溶液(比如生理盐水，Dulbecco’s磷酸盐缓冲溶液(DPBS)，Earle’s平衡盐溶液(EBSS)，Hanks平衡盐溶液(HBSS)，磷酸盐缓冲溶液(PBS)等)稀释滤液之后，可通过离心而收取通过过滤器的间充质干细胞。
可使用脂肪组织来源的MSC，其购自市售的脂肪来源的干细胞以及来自间质(基质，stromal)血管组分(SVF)(通过收集来自哺乳动物的脂肪组织并且用酶比如胶原酶对其进行该处理)。
培养间充质干细胞的方法，例如可包括在未涂覆的塑料培养容器中以100至20,000细胞/cm2的密度接种细胞群体的步骤。细胞密度的下限更优选为200细胞/cm2或更高，进一步优选400细胞/cm2或更高，进一步优选1,000细胞/cm2或更高。细胞密度的上限更优选为10,000细胞/cm2或更低，进一步优选8,000细胞/cm2或更低，进一步优选6,000细胞/cm2或更低。在培养方法的另一个实施方式中，例如，通过向基础培养基添加生长因子比如人血小板裂解物(hPL)、胎牛血清(FBS)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、牛血小板裂解物、牛富血小板血浆来源的血清、人富血小板血浆来源的血清或其他血清来培养细胞。该基础培养基没有特别限制，例如，优选使用BME培养基，BGJb培养基，CMRL 1066培养基，Glasgow MEM培养基，改进的MEM Zinc Option培养基，IMDM培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium)，Medium 199培养基，Eagle MEM培养基，αMEM Minimum Essential Medium Eagle)培养基，DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle's Medium)，Ham’s F10培养基，Ham’sF12培养基，RPMI 1640培养基，Fischer’s培养基和其混合培养基，比如DMEM/F12培养基Dulbecco’s Modified eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12Ham))。
被培养的细胞可进一步传代和培养，例如，用来自塑料培养容器的细胞脱离剂处理细胞。然后，对获得的细胞悬浮液进行离心，去除上层清，以及将获得的细胞团块再次悬浮在培养基中。最后，在填充培养基的塑料培养容器中接种细胞，并且在CO2恒温箱中培养。细胞脱离剂的实例可为胰蛋白酶、胶原酶、分散酶、乙二胺四乙酸(EDTA)等。可优选使用市售的细胞脱离剂，比如胰蛋白酶-EDTA溶液(由Thermo Fisher Scientific制造)，TrypLESelect(由Thermo Fisher Scientific制造)，Accutase(由Stemcell Technologies制造)，Accumax(由Stemcell Technologies制造)，等。根据前述的本发明的细胞培养方法，可提供安全的细胞制剂(preparation)(制药组合物，药物组合物)。
本发明的细胞培养方法可包括低温保存细胞的步骤。在低温保存步骤的实施方式中，在使细胞解冻后，细胞可被分离、收集、培养、使用或混合至多层基体。在低温保存时，细胞可在任何储存容器中被冷冻。这样的储存容器的实例包括，但不限于，冷冻管、冷冻小瓶、冻存袋、输液袋等。细胞可在任何低温保存溶液中被低温保存，其在“施加至第二层的细胞悬浮液”的实施方式中举例说明。
生产多层基体的方法可包括制备细胞悬浮液的步骤。细胞悬浮液由细胞和溶液两者组成。该溶液可包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、含有二价阳离子的Ringer’s溶液(例如，氯化钙或氯化镁)或培养基。该培养基可包括HBSS(+)，HBSS(-)，RPMI，IMEM，DMEM，MEM，和/或细胞防腐剂，其可任选地补充有血清、血浆、含蛋白质的溶液。市售的低温保存溶液可优选用作所述溶液。例如，CP-1(由Kyokuto Pharmaceutical Industry Co.，Ltd.制造)，BAMBANKER(由Lymphotec Corporation制造)，STEM-CELLBANKER(由Nippon Zenyaku KogyoCo.，Ltd.制造)，ReproCryo RM(由ReproCell制造)，CryoNovo(Akron Biotechnology，MSCFreezing Solution(由Biological Industries制造)，CryoStor(由HemaCare制造)等。细胞防腐剂可为一种或两种或更多种的以上列出的溶液与一种或两种或更多种低温防腐剂(比如二甲亚砜，清蛋白，甘油，羟乙基淀粉，或葡聚糖)的组合的溶液。二甲亚砜的浓度优选为3重量％或更高，4重量％或更高，5重量％或更高。二甲亚砜的浓度的上限为10重量％或更低，9重量％或更低，8重量％或更低，7重量％或更低。清蛋白的浓度优选为0.5重量％或更高，1重量％或更高，2重量％或更高，3重量％或更高。清蛋白的浓度的上限为8重量％或更低，7重量％或更低，6重量％或更低，5重量％或更低。羟乙基淀粉的浓度优选为3重量％或更高，4重量％或更高，5重量％或更高。羟乙基淀粉的浓度的上限为9重量％或更低，8重量％或更低，7重量％或更低。细胞防腐剂的一个实例包括5重量％的二甲亚砜、6重量％的羟乙基淀粉和4重量％的人血清蛋白的组合物。
在制备细胞悬浮液的步骤的实施方式中，先用来自塑料培养容器的细胞脱离剂处理被培养的细胞。然后对获得的细胞悬浮液进行离心，去除上层清液，以及将获得的细胞团块再次悬浮在待成为细胞悬浮液的溶液中。可直接或经由低温保存将细胞悬浮液施加至多层基体的第二层。细胞悬浮液的浓度可为5x106细胞/mL或更高，6x106细胞/mL或更高，8x106细胞/mL或更高，10x106细胞/mL或更高，20x106细胞/mL或更高，40x106细胞/mL或更高，60x106细胞/mL或更高。细胞悬浮液的细胞浓度没有上限，因为随着细胞浓度提高可实现显著疗效。然而，优选的是细胞悬浮液的浓度为133x106细胞/mL或更低，100x 106细胞/mL或更低。例如，优选使用10x 106细胞/mL至80x 106细胞/mL。当细胞数小于5x 106细胞/mL时，添加至多层基体的细胞数过小，并且可能没有实现疗效。当细胞数超过133x 106细胞/mL时，细胞变为团块使得细胞悬浮液的制备在物理上变得困难。
生产多层基体的方法可包括将细胞悬浮液施加至多层基体的第二层的步骤。在将细胞悬浮液施加至第二层的步骤的实施方式中，细胞悬浮液可被带到带有钝针头的注射器中并且被平坦地施加在生物胶粘剂层上。添加的细胞悬浮液的体积可为20μL/cm2或更高，22μL/cm2或更高，24μL/cm2或更高。细胞悬浮液的体积的上限为60μL/cm2或更低，55μL/cm2或更低，50μL/cm2或更低。当该体积小于20μL/cm2时，纤维蛋白原/凝血酶侧变得不够湿润，可能发生低劣的粘合纤维蛋白的形成和对组织或器官的粘附能力可能降低。当该体积超过60μL/cm2时，悬浮液的量变得过大使得一部分悬浮液可能从生物胶粘剂层滴下并且不能将全部量的细胞施加至多层基体。
在本发明中对CD105、CD73和CD90为阳性且对CD45和CD34为阴性的细胞，通常定义为间充质干细胞。对CD105、CD73和CD90呈阳性的前述的细胞的百分比为50％或更高。该百分比为优选60％或更高，更优选70％或更高，并且进一步优选90％或更高。对CD45和CD34呈阳性的前述的间充质干细胞的百分比为10％或更低，优选5％或更低，并且更优选3％或更低。
在本发明中优选使用对CD142呈阳性的细胞，因为CD142阳性细胞分泌与凝固或细胞粘附相关的组织因子，使得可实现高细胞植入(保留)率。在本发明中使用的对CD142呈阳性的前述的细胞的百分比为50％或更高。该百分比优选为60％或更高，更优选70％或更高，并且进一步优选90％或更高。在本发明中使用的对CD106呈阳性的前述的细胞的百分比，为10％或更低。百分比优选为5％或更低，并且更优选3％或更低。表达标记(CD73，CD90，CD105，CD34，CD45，CD142，和CD106)可通过任何给定的检测方法检测，其在本领领域中是已知的。检测表达标记的方法的实例包括流式细胞仪和细胞染色，但不限于此。在使用荧光标记抗体的流式细胞仪中，当检测到发出比阴性对照(同型对照)更强的荧光的细胞时，细胞被认定相对于所涉及的标记为“阳性”。在本领域中已知的任何给定的抗体都可用作荧光标记抗体。这样的荧光标记抗体的实例包括用异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝素(APC)等标记的抗体，但不限于此。在细胞染色中，当在显微镜下观察到带有颜色或发出荧光的细胞时，细胞被认定相对于所涉及的标记为“阳性”。细胞染色可为免疫细胞染色(其中使用抗体)，或非免疫细胞染色(其中不使用抗体)。
检测前述的表面抗原的时机没有特别限制，但例如，在细胞培养期间，在低温保存之前，在解冻之后，在制备制药组合物之前，在将其混合至多层基体之前或在施用至患者之前。
术语“试剂盒”指的是试剂盒产品，其由包装在容器中的多层基体(作为密封的剂型的形式)和包装在容器中的细胞悬浮液组成。在试剂盒的一个实施方式中，多层基体和细胞悬浮液可分开提供但一起使用。在试剂盒的另一个实施方式中，多层基体和细胞悬浮液可同时提供并且一起使用。细胞悬浮液和多层基体在使用前组合，例如，在施用之前，将细胞悬浮液施加在多层基体中和/或施加在多层基体上。试剂盒可为制药组合物。根据本发明，可在本发明中提供制药组合物，其包含细胞群体(其包含间充质干细胞)、药学上可接受的介质和药学上可接受的多层基体。本发明的制药组合物可为用药学上可接受的介质稀释的包含间充质干细胞的细胞群体。前述药学上可接受的介质没有特别限制，只要其为可施用至患者或对象的溶液即可。药学上可接受的介质可为输注液，例如，用于注射的水，生理盐水，5％葡萄糖，Ringer’s溶液，Ringer’s乳酸盐溶液，Ringer’s乙酸盐溶液，碳酸氢盐Ringer’s溶液，氨基酸溶液，起始溶液脱水补充剂(2号溶液)，维持性输注溶液(3号溶液)，术后恢复溶液(4号溶液)，Plasma-Lyte A。制药组合物的包装可为冷冻管、冷冻小瓶、冻存袋、输液袋等。
病变或创伤可为心脏病、脊髓损伤或溃疡。病变或创伤可为疾病过程的结果或作为外科手术程序的一部分的外科手术的结果。术语“器官”指的是执行特定功能或一组功能的一组组织。器官可为心脏、肝脏、肾、肺、脾或胰腺。术语“组织”指的是器官中具有类似的结构和功能的细胞的聚集体。组织可为皮肤，骨骼肌或神经组织，例如脊髓、大脑或神经节。组织可为胃肠(GI)道例如食管、胃、肠和直肠/肛门的组成要素。心脏病可包括急性心肌梗塞(AMI)、缺血性心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心肌炎和其他类型的急性和慢性心力衰竭。
本发明的方法可应用于经历心脏外科手术(比如冠状动脉旁路移植术(CABG)，左心室辅助装置植入，瓣膜修复/置换和先天性疾病的矫正外科手术)的心脏病患者。这些患者的数量是不少的，并且随着老年群体的提高，这样的心脏病的发生率可能会激增。已知加入细胞疗法增强了CABG的结果(Donndorf等,Intramyocardial bone marrow stem celltransplantation during coronary artery bypass surgery：A meta-analysis,JThoracic Cardiovasc Surg2011；142(4),911-920)。经由旁路的提高的血液流动和通过细胞疗法的提高的血管生成会协同增强心肌灌注。继而，通过CABG改进的灌注会帮助供体细胞存活并且改进细胞疗法的效果。
本发明的方法还可单独地经由开胸手术或通过使用内窥镜、胸腔镜或纵隔镜而应用至心脏病患者。所述方法还可与经皮冠状动脉介入治疗组合应用。
本发明因此还延伸至治疗患有组织或器官的病变或创伤(例如心肌梗塞)的患者的方法，包括将多层基体施加至组织或器官的表面，其中所述多层基体包含至少两层，其中第一层包含生物可吸收材料以及第二层包含生物胶粘剂材料，并且其中在施加多层基体之前将细胞悬浮液施加至第二层。适宜地，将多层基体施加至心脏的心外膜。本发明因此提供了细胞例如干细胞的心外膜放置(或“细胞敷料”)方法。
将细胞悬浮液和/或药物添加至第二层提供了足以激活生物胶粘剂材料(例如纤维蛋白原和凝血酶)以产生纤维蛋白胶的水分源。纤维蛋白胶可将细胞和/或药物保持在器官或组织的表面上，这产生了比之前的移植方法比如心肌内注射和细胞片更高的细胞和/或药物的植入(保留)率。
根据本发明，因此提供了如上所述的多层基体和细胞悬浮液的组合，其用于在组织或器官的病变或创伤(例如心肌梗塞)的治疗中的分开的顺序施用、逐步或同时施用。
治疗方法可在外科手术程序期间进行以修复受损的器官，例如CABG。本发明因此包括细胞涂覆的多层基体在外科手术的方法中治疗患有心脏病(包括心肌梗塞和心肌病)的患者的用途。
因此提供了部件的试剂盒，其包含如上所述的多层基体和细胞悬浮液和/或药物。
因此提供了细胞涂覆的多层基体的制备方法，所述细胞涂覆的多层基体包含至少两层，其中第一层包含生物可吸收材料以及第二层包含生物胶粘剂材料，并且包括将细胞悬浮液施加至多层基体的第二层。
在本发明的一个实施方式中，多层基体可包含两层，其中第一层包含生物可吸收材料并且第二层包含生物胶粘剂材料，其中生物可吸收材料为用以下赋形剂配制的马胶原：人清蛋白，核黄素，氯化钠，柠檬酸钠，和盐酸L-精氨酸。所述生物胶粘剂材料为人纤维蛋白原和人凝血酶。
适宜地，生物胶粘剂材料作为生物可吸收材料上的干涂层制备，其中人纤维蛋白原以2.0mg至10.0mg/cm2，例如5.5mg/cm2存在以及人凝血酶以0.5IU至5.0IU/cm2，例如2.0IU/cm2存在。
细胞可以以下密度添加至生物胶粘剂层：0.3x 106或更高/cm2多层基体，更优选0.5x 106/cm2或更高，进一步优选1x 106或更高/cm2。添加至生物胶粘剂层的细胞密度没有上限，因为随着细胞密度变大，可实现显著的疗效。然而，优选的是细胞可以以下密度添加：4.2x 106/cm2多层基体或更低，更优选4.1x 106/cm2或更低，进一步优选4.0x 106/cm2或更低。例如，优选使用0.5x 106/cm2或4.0x 106/cm2。当密度小于0.3x 106/cm2时，添加的细胞数过少并且不能实现疗效。在本发明中，添加至生物胶粘剂层的细胞的密度可取决于患者的体重和严重程度而设置在有利的范围中。还有，在本发明中，可施用比常规细胞片更高密度的细胞。
以超过4x 106细胞/cm2的密度将细胞施加至多层基体在物理上可能是困难的，因为细胞变成了团块或悬浮液的量变得过大使得不能将细胞施加至多层基体。例如，添加的细胞悬浮液的体积可为20μL/cm2至60μL/cm2。当体积小于20μL/cm2时，纤维蛋白原/凝血酶侧没有变得足够湿润，可能发生低劣的纤维蛋白的形成并且对组织或器官的粘附能力可能降低。当体积超过60μL/cm2时，悬浮液的量变得过大使得一部分悬浮液可能从生物胶粘剂层滴下并且不能将全部量的细胞施加至多层基体。在本发明中，添加至生物胶粘剂层的细胞悬浮液的体积可取决于患者的体重和严重程度而设置在有利的范围中。还有，在本发明中，可通过向生物胶粘剂层添加高体积的细胞悬浮液而施用比常规细胞片更高密度的细胞。
添加至生物胶粘剂层的细胞可以以下浓度添加：5x 106细胞/mL至133x106细胞/mL，更优选10x 106细胞/mL至80x 106细胞/mL。当细胞数小于5x 106细胞/mL时，添加的细胞数过少，并且可能不能实现疗效。当细胞数超过133x 106细胞/mL时，细胞变成团块使得细胞悬浮液的制备在物理上变得困难。在本发明中，添加至生物胶粘剂层的细胞浓度可取决于患者的体重和严重程度来设置在有利的范围中。还有，在本发明中，可通过将高浓度的细胞悬浮液添加至生物胶粘剂层来施用比常规细胞片更高的细胞密度。
多层基体可制备为随时可用的密封剂型。密封剂型可在罩板包装中供应以便保存内容物。合适的包装尺寸为(1.0至10cm)x(1.0至10cm)，例如9.5cm x 4.8cm，4.8cm x4.8cm，3.0cm x 2.5cm，2.5cm x 2.5cm，或1.0cm x1.0cm。所述包装可含有一个或多个基体。替代地，在外科手术程序期间，可将基体裁切成一定尺寸。
在将多层基体施用至哺乳动物时，多层基体的施用面积/体重优选为0.1cm2/kg或更高。其更优选为1cm2/kg或更高，并且进一步优选2cm2/kg或更高。多层基体的施用面积/体重优选为6cm2/kg或更低。其更优选为5cm2/kg或更低。如果多层基体的施用面积小于0.1cm2/kg，可能不能获得治疗效果，因为施用的细胞数过少。多层基体的面积没有上限，因为随着面积变大可实现显著疗效。然而，如果多层基体的施用面积超过6cm2/kg，疗效可能饱和。
例如，在将多层基体施用至体重为40-100kg的人并且2cm2/kg的多层基体被施加至人时，施用至人的多层基体的面积为80-200cm2。例如，在将多层基体施用至体重为15-30kg的猪并且3cm2/kg的多层基体被施加至猪时，施用至猪的多层基体的面积为45-90cm2。例如，在将多层基体施用至体重为150-300g的大鼠并且5cm2/kg的多层基体被施加至大鼠时，施用至大鼠的多层基体的面积为0.75-1.5cm2。
与其他方法相比，本发明的方法在可行性和用于心力衰竭的干细胞疗法/祖细胞疗法的效率方面具有如下多个重要的优点：
(1)相对于目前的注射方法(心肌内，冠状动脉内和静脉内注射)的优点：
(i)与任何目前的注射方法相比，本发明的方法实现了显著地更高的初始保留和在心脏中提高的供体细胞的存在，因为纤维蛋白胶可将细胞保留在心脏表面上。这会产生增强用于治疗心力衰竭的细胞疗法的疗效。
(ii)心肌内细胞注射导致心脏内供体细胞簇的形成，这涉及炎症。心肌内的这种异质性可成为发生心率失常的源头。该不良的变化不会通过本发明的方法发生。
(iii)冠状动脉内注射具有冠状动脉栓塞的风险。这在较大细胞类型(比如MSC)被注射到有疾病的、变窄的冠状动脉中时是特别关键的。静脉内注射带有肺栓塞的风险。而对比之下，本发明的方法完全没有这样的风险。
(iv)静脉内注射(以及冠状动脉内和心肌内注射)造成供体细胞向不期望的器官(例如肺)的异位递送，这可引起不良的效果。本发明的方法的这种并发症(复杂)情况的风险显著较低(因为大部分供体细胞保留在心脏表面上)。
(2)相对于其他心外膜放置方法的优点
(i)使用任何组织工程构造体，包括并入了干细胞的细胞片技术和生物构造体(比如胶原海绵)，都需要延长的时间来在高级细胞处理设施中生产。对比之下，当供体细胞以外部方式提供时，所述方法由细胞悬浮液和如本文中所述的合适的基底基体材料在普通外科手术室或其他处理(治疗)室中生产。在各医院中都不必须需要特定的细胞处理设施。
(ii)组织工程构造体(包括并入了干细胞的细胞片和组织工程构造体)的质量控制/保证的要求是非常高的。这些产品的储存和运输/递送也是有挑战性的。这一关注在本发明治疗方法中被消除，因为在没有储存的情况下刚好在放置至心脏之前将供体细胞添加至生物相容的贴片。运输/储存干细胞的方法已被建立。不需要运输/递送脆弱的最终生物产品(最终细胞-多层基体复合体)。
(iii)包括细胞片的组织工程构造体不能用非粘附的流动(floating)细胞生产。例如，未分级的(unfractionated)骨髓单核细胞(BMMNC)是临床研究中最常用的供体细胞类型，但这些大多是流动细胞并且不能形成细胞片。对比之下，本发明的方法可应用粘附性和非粘附性细胞两者。
(iv)细胞片是相当脆弱的，需要极度谨慎和专家专业技能，而本发明的多层基体是足够牢固的且易于处理。
(v)包括并入了干细胞的生物构造体的组织工程构造体需要缝合来固定在心脏表面上，这可损害心脏或冠状血管。而在本发明中，不需要具有如此风险的程序。
(vi)细胞片不能自由地设置细胞密度。而在本发明中，细胞密度可取决于患者的体重和严重程度通过调节在多层基体上和/或多层基体中的细胞浓度和细胞悬浮液的体积来设置在有利的范围中。还有，在本发明中，可施用比细胞片更高剂量的细胞。
本发明的方法是简单且直接的并且可通过任何普通临床医生/医院工作人员实施，而不需要丰富的专业知识或特定的设备，如细胞处理中心。在手术室/治疗室中，细胞敷料的生产的整个过程在仅10分钟内就完成了。立即地，该产品可简单地施加至患者。因此，在需要时，本发明的方法在外科手术期间能够容易地被加入。
可优选地使用市售的生物可吸收材料支撑的(负载的)纤维蛋白贴片
Figure BDA0002682586410000197
因为出于在外科手术(包括心脏手术)期间的止血目的，其已经广泛的用于临床实践。该材料(其安全性已经被证实并且GMP-品级的生产设施已经建立)可直接作为适当的源材料用于本发明的方法。
本发明的第二和后续的方面的优选的特征比照第一方面。
现在将通过参考以下实施例和附图进一步描述本发明，所述实施例和附图仅出于说明的目的而给出。在实施例中，参考了多个附图，其中
图1示出了使用
Figure BDA0002682586410000191
(单层材料)进行的细胞移植的程序。
图2示出了使用
Figure BDA0002682586410000192
(单层材料)、使用10x 106大鼠骨髓单核细胞(BMMNC)进行细胞移植的不成功的结果。在心肌梗塞之后28天之时，将
Figure BDA0002682586410000193
复合体移植在大鼠心脏表面上(SF-BMMNC组)。对照组在心肌梗塞之后28天之时接受假手术。在治疗之后第28天之时通过超声波心动描记术测量心脏功能。
图3示出了使用
Figure BDA0002682586410000194
和间充质干细胞进行细胞移植的不成功的结果。在心肌梗塞之后28天之时，借助于
Figure BDA0002682586410000195
将4x106大鼠骨髓来源的间充质干细胞(MSC)移植在大鼠心脏表面上(SF-MSC组)。在心肌梗塞之后28天之时，对照组接受假手术。在治疗之后第28天之时通过超声波心动描记术测量心脏功能。
图4示出了供体细胞在
Figure BDA0002682586410000196
(SF)辅助的细胞递送之后的渗漏。一定数量的供体细胞(用红色荧光染料，CM-DiI标记)在SF辅助的细胞递送之后保留在心脏表面上(图4(a)&4(b))。接着借助于
Figure BDA00026825864100002018
的心外膜放置DiI(粉色)标记的BMMNC(图4(c))，从心包液收集细胞。发现许多供体BMMNC泄露在(掉落)心包腔中(黄色箭头)。
图5示出了
Figure BDA0002682586410000201
(多层纤维蛋白密封剂贴片)的结构。
图6示出了
Figure BDA0002682586410000202
辅助的心外膜放置干细胞的方法。
图7示出了在大鼠急性心肌梗塞模型中心外膜放置
Figure BDA0002682586410000203
-间充质干细胞(MSC)在第28天的治疗功效。在心肌梗塞之后1小时之时，借助于
Figure BDA0002682586410000204
将1x 106大鼠胎膜来源的MSC移植在鼠心脏表面上(TS组)。在心肌梗塞之后1小时之时，对照组接受假手术。在治疗之后第28天之时通过超声波心动描记术测量心脏功能。
图8示出了在大鼠急性心肌梗塞模型中在
Figure BDA0002682586410000205
疗法之后第5天之时的宏观观察。在借助于
Figure BDA0002682586410000206
在心外膜放置1x 106大鼠胎膜来源的MSC之后第5天之时，发现
Figure BDA0002682586410000207
复合体牢固的粘附至心脏表面。
图9示出了在
Figure BDA0002682586410000208
疗法之后第28天之时在大鼠急性心肌梗塞模型中的宏观观察。在借助于
Figure BDA0002682586410000209
在心外膜放置1x106大鼠胎膜MSC之后第28天之时，
Figure BDA00026825864100002010
复合体已大部分消失。没有发现不良的变化(并发症)。
图10示出了在大鼠心脏上的
Figure BDA00026825864100002011
移植之后第5天之时的供体细胞存活。在借助于
Figure BDA00026825864100002012
在心外膜放置1x 106大鼠胎膜来源的MSC之后的第5天之时，在心脏表面上观察到大量的供体MSC(橙色)。MSC向心肌的迁移非常少，而一些MSC沉淀在胶原海绵层中。
图11示出了在大鼠心脏上的
Figure BDA00026825864100002013
移植之后第28天之时的供体细胞存活。在借助于
Figure BDA00026825864100002014
在心外膜放置1x 106大鼠胎膜来源的MSC之后的第28天之时，在心脏表面上观察到大量的供体MSC(橙色)。MSC向心肌的迁移非常少。
Figure BDA00026825864100002015
的胶原似乎被吸收或消失。
图12示出了在大鼠心肌梗塞后缺血性心力衰竭模型中第28天之时心外膜放置
Figure BDA00026825864100002016
的治疗功效。在大鼠(缺血性心力衰竭模型)中在左冠状动脉结扎四周之后，在心脏表面上放置用一系列大鼠胎膜来源的MSC接种的
Figure BDA00026825864100002017
仅TachoSil(仅有TS的组)，或不放置(假手术组)。在治疗之后第28天之时通过超声波心动描记术(上部道区)和导管插入术(下部道区)测量心脏功能。
图13示出了通过在大鼠心肌梗塞后缺血性心力衰竭模型中心外膜放置
Figure BDA0002682586410000211
的改进的对受损心肌的修复。在大鼠中在左冠状动脉结扎四周之后，在心脏表面上放置用4x 106大鼠胎膜来源的MSCs接种的
Figure BDA0002682586410000212
(TS+MSC组)，仅
Figure BDA0002682586410000213
(仅有TS的组)，或不放置(假手术组)。治疗四周之后，在心肌梗塞的远端和边界两个区域中，与假手术组和仅有TS的组相比，TS+MSC组显示出了显著减轻的病理性纤维化(A)、降低的心肌肥大(B；WGA＝麦胚凝集素)和改进的微血管形成(C)。分别地，在A，B，C中比例尺；10，50，30mm。
图14示出了在猪心脏上心外膜放置
Figure BDA0002682586410000214
的可行性。将两块混有1mL的5x 107细胞/mL猪骨髓来源的MSC的
Figure BDA0002682586410000215
(25cm2)放置在猪(20-22kg)的跳动的心脏表面上。除了技术可行性之外，MSC(用CM-DiI标为橙色)的显著的保留和存活在第1天在组织结构学方面得到证实。比例尺＝100μm。
图15示出了在猪心脏上心外膜放置
Figure BDA0002682586410000216
的可行性。将两块混有1mL的8x 107细胞/mL人羊膜来源的MSC的
Figure BDA0002682586410000217
(25cm2)放置在猪(20-22kg)的跳动的心脏表面上。除了技术可行性之外，MSC(用CM-DiI标为橙色)的显著的保留和存活在第1天在组织结构学方面得到证实。比例尺＝400μm。
图16示出了在猪心脏上心外膜放置
Figure BDA0002682586410000218
的可行性。将混有1mL的8x 107细胞/mL人羊膜来源的MSC的
Figure BDA0002682586410000219
(9cm2)放置在猪(20-22kg)的跳动的心脏表面上。除了技术可行性之外，MSC(用CM-DiI标为橙色)的显著的保留和存活在第1天在组织结构学方面得到证实。比例尺＝400μm。
图17示出了在猪心脏上心外膜放置
Figure BDA00026825864100002110
的可行性。将混有1mL的8x 107细胞/mL人羊膜来源的MSC
Figure BDA00026825864100002111
(9cm2)放置在猪(20-22kg)的跳动的心脏表面上。除了技术可行性之外，MSC(用CM-DiI标为橙色)的显著的保留和存活在第1天在组织结构学方面得到证实。比例尺＝400μm。
实施例1：使用单层基体
Figure BDA0002682586410000221
放置心外膜细胞的不成功的试验
首先使用单层基体尝试心外膜放置干细胞。测试了最广泛使用的临床批准的基体，临床上用于防止外科手术后粘连的
Figure BDA0002682586410000222
(Sanofi)。在心肌梗塞之后28天之时，大鼠骨髓单核细胞(10x 106)或骨髓来源的间充质干细胞(MSC；4x 106)溶解在30μL的HBSS中并且放置在1cm2
Figure BDA0002682586410000223
上，其被倒置并且直接被放置在大鼠心脏表面上(图1)。
然而，与假手术治疗组相比(图2和3)，使用了两种细胞类型的该方法在第28天之时都没有实现显著改进的心脏功能(通过超声波心动描记术测量)。此外，在移植之后1小时，发现一定量的供体细胞保留在心脏表面上(图4a和4b)，而在心包腔中观察到相当数量的供体细胞。该结果表明
Figure BDA0002682586410000224
不足以将供体细胞保持在心脏表面上并且显著数量的移植细胞从心脏释放/掉落(图4c)。
实施例2：制备含细胞的多层基体(细胞敷料)
为了解决单层基体辅助的心外膜放置(实施例1)的问题，我们发明了使用两层(组织相容且生物可吸收)基体。
Figure BDA0002682586410000225
(由TAKEDA/Nycomed生产；由TAKEDA/Baxter/CSLBehring出售)是这样的两层基体的实例(图5)。基体的前层由胶原海绵组成，而背面包括粉末状的纤维蛋白原和凝血酶。一旦细胞悬浮液掉落在背面上，纤维蛋白原和凝血酶就反应以产生纤维蛋白，这为供体细胞提供了舒适的支撑以用于保持和沉淀。纤维蛋白具有相当的粘性，因此可在没有任何缝合的情况下牢固地粘附至心脏表面。胶原海绵的前层为纤维蛋白-干细胞复合体提供支撑，使得能够容易地处理并入了干细胞的基体的最终产物。该层还可用于防止移植干细胞受到来自心脏外部的机械应力(即肺、心包膜和胸壁对细胞的摩擦)。
目前，
Figure BDA0002682586410000226
广泛地用于不同目的(包括心脏手术的外科手术期间的止血)。该产品的局部放置和按压有效停止通过外科手术程序不可控制的轻微出血。该产品在患者中的安全性已经被证实。
Figure BDA0002682586410000227
(由Ethicon生产；由Ethicon/Omrix Biopharmaceuticals N.V.出售)也是这样的多层基体的实例。
Figure BDA0002682586410000228
是氧化再生纤维素和薇乔网(vicrylmesh)(由聚乳酸和聚乙醇酸制成)支撑的纤维蛋白贴片并且作为药物产品出售。该基体的前层由氧化再生纤维素和薇乔网组成，而背面包括粉末状的纤维蛋白原和凝血酶。一旦细胞悬浮液掉落在背面上，纤维蛋白原和凝血酶就反应以产生纤维蛋白，这为供体细胞提供了舒适的支撑以用于保持和沉淀。纤维蛋白具有相当的粘性，因此可在没有任何缝合的情况下牢固地粘附至心脏表面。氧化再生纤维素和薇乔网的前层为纤维蛋白-干细胞复合体提供支撑，使得能够容易地处理并入了干细胞的基体的最终产物。该层还可用于防止移植干细胞受到来自心脏外部的机械应力(即肺、心包膜和胸壁对细胞的摩擦)。目前，
Figure BDA0002682586410000231
广泛地用于不同目的(止血包括心脏手术的外科手术期间)。该产品的局部放置和按压有效停止通过外科手术程序不可控制的轻微出血。该产品在患者中的安全性已经被证实。
实施例3：制造
Figure BDA0002682586410000232
体外复合体的优化
我们优化了生产
Figure BDA0002682586410000233
复合体的程序。通过对MSC悬浮液进行离心来产生细胞团块。将团块溶解在不同体积的普通溶液(即HBSS或PBS)中以制得合适的细胞悬浮液(图6)。
将细胞悬浮液温和地滴在1cm2
Figure BDA0002682586410000234
(纤维蛋白侧)上并且使用移液器吸头或细胞刮刀(图6)散布在表面上。将其倒置并且放置在塑料培养皿上。过小的体积不能制得均匀的纤维蛋白层，而过大的体积导致在倒置时MSC从
Figure BDA0002682586410000235
渗漏。
这些实验的结果显示约30(±10)μL MSC悬浮液/1cm2
Figure BDA0002682586410000236
是生产多层基体或细胞敷料的最佳条件。该程序产生了在遍及
Figure BDA0002682586410000237
各处的并入的合适的均匀纤维蛋白生产/在纤维蛋白中供体MSC的容纳，并且在倒置时观察到无渗漏。
实施例4：体内试验和使用
Figure BDA0002682586410000238
的心外膜细胞放置的优化
Figure BDA0002682586410000239
为市售可得的两层基体，其被临床批准用于在外科手术期间的止血。本发明人已经发现该产品适合用于本文描述的治疗心脏病的细胞敷料疗法并且还适合用于本文描述的病变或创伤的其他治疗。
Figure BDA00026825864100002310
易于处理(柔软且易于通过剪刀裁切)。在将细胞悬浮液放置在纤维蛋白胶粉末上时，纤维蛋白原/凝血酶侧变得湿润，产生粘合纤维蛋白。这保持住了供体细胞并且还使得产品能够在没有任何缝合的情况下粘附至心脏表面。除了这些效果以外，该方法作为协助心外膜放置干细胞的材料还具有许多优点，包括防止外科手术后心包粘连(纤维蛋白是产生术后壁粘连的主要角色)的潜力和改进供体干细胞的功能性/存活(图6)。
将200g的大鼠麻醉，并且通过左侧开胸手术随着打开心包膜使得心脏(心外膜)暴露。用8-0缝合物结扎左冠状动脉以引起心肌梗塞。在通过心室颜色和运动的变化(结扎之后1小时)来确认梗塞之后，将溶解在30μL HBSS中的一百万个大鼠胎膜来源的MSC散布在1cm2
Figure BDA0002682586410000241
上以生产
Figure BDA0002682586410000242
复合体。将其放置在心外膜心脏表面上(针对缺血区域)，其中纤维蛋白/MSC侧直接与心脏表面接触(图6)。为了准确和易于放置，在放置之前将
Figure BDA0002682586410000243
裁切成3块。为了增强
Figure BDA0002682586410000244
复合体在心脏上的附着，温和且轻轻地按压复合体(没有细胞悬浮液渗漏或发生不良的心脏事件)。所有程序都是简单直接的并且
Figure BDA0002682586410000245
复合体牢固地固定在跳动的心脏上。
在放置
Figure BDA0002682586410000247
之后第5天之时，发现
Figure BDA0002682586410000246
复合体牢固的粘附至心脏表面(图8)。
实施例5：在大鼠急性心肌梗塞模型中的体内概念论证数据
将溶解在30μL HBSS中的一百万个大鼠胎膜来源的MSC散布在1cm2
Figure BDA0002682586410000249
上以生产
Figure BDA0002682586410000248
复合体。将200g的大鼠麻醉，并且通过左侧开胸手术随着打开心包膜使得心脏(心外膜)暴露。用8-0缝合物结扎左冠状动脉以引起心肌梗塞。
在通过心室颜色和运动的变化(结扎之后1小时)来确认梗塞之后，将
Figure BDA00026825864100002410
放置在心外膜心脏表面上(针对缺血区域)，其中纤维蛋白/MSC侧直接与心脏表面接触。为了准确和易于放置，在放置之前将
Figure BDA00026825864100002411
裁切成3块。为了增强
Figure BDA00026825864100002412
复合体在心脏上的附着，温和且轻轻地按压复合体(没有细胞悬浮液渗漏或发生不良的心脏事件)。
对于对照组，引发心肌梗塞但没有加入治疗。将胸部闭合并且将大鼠返回至正常的笼子。
所有程序都是简单直接的并且
Figure BDA00026825864100002413
复合体牢固地固定在跳动的心脏上。在整个被研究的治疗后日子里，没有观察到不良的事件(在大鼠死亡率、一般行为、食物摄入、体重变化方面)。
在治疗后4周之时，超声波心动描记术表明与对照组相比，在TS组中(
Figure BDA0002682586410000251
治疗)左心室射血分数(＝LVEF，整体心功能指标)显著改进(图7；在各组中，n＝7)。心肌梗塞后心脏扩张(LVD＝左心室收缩尺寸)减弱。存在舒张期心脏尺寸减小的倾向(LVDd＝左心室舒张期尺寸)，但这在统计学上不显著(p＝0.0979)。
在第28天之时通过直接目视没有清楚地检测到
Figure BDA0002682586410000252
复合体(图9)，表明大部分
Figure BDA0002682586410000253
在此时已降解和被吸收。没有观察到不良的事件，比如积液或术后心包粘连，这表明了该治疗的安全性。
免疫组织学分析表明了在治疗后第7和28天之时，供体细胞在心脏表面上的显著保留和存活(在移植之前，MSC用橙色荧光染料标记)(图10和11)。大部分MSC保留在心脏表面上。
实施例6：在大鼠后心肌梗塞缺血性心肌病模型中使用
Figure BDA0002682586410000259
的心外膜细胞 放置的体内概念论证数据。
通过在大鼠中左冠状动脉结扎诱发心肌梗塞之后四周，在心外膜心脏表面上(针对缺血区域)放置与不同数量的(分别地，0.5，1，2，4x 106细胞)溶解在30μL HBSS中的大鼠胎膜来源的MSC混合的
Figure BDA0002682586410000255
(1cm2)(TS+MSC组)，仅
Figure BDA0002682586410000254
(仅有TS的组)，或不放置(假手术组)，其中纤维蛋白/MSC侧直接与心脏表面接触(图6)。为了准确和易于放置，在放置之前将
Figure BDA0002682586410000256
裁切成3块。所有程序都是简单直接的并且
Figure BDA0002682586410000257
复合体牢固地固定在跳动的心脏上。
治疗四周之后，超声波心动描记术(图12上部图板)和心脏导管插入术(图12下部图板)表明心外膜放置
Figure BDA0002682586410000258
复合体与细胞数成比例地改进了心脏功能和结构。与TachoSil辅助放置相同数量的MSC相比，通过心肌内注射(IM)的功能改进发生的程度较低。
治疗四周之后，与假手术组和仅有TS的组相比，TS+MSC组在心肌梗塞的远端和边界两个区域中显示出了显著减轻的病理性纤维化(图13A)、降低的心肌肥大(图13B；WGA＝麦胚凝集素)和改进的微血管形成(图13C)。
实施例7：评估施加至多层基体的细胞存活率
在以下步骤中获得人羊膜来源的MSC。在知情同意的情况下从怀孕的患者以无菌的方式采集胎儿附属物(羊膜)。所得羊膜并且放置在含有生理盐水溶液的无菌桶中。羊膜用Hanks’平衡盐溶液(不含Ca·Mg)清洗以去除粘附的血液和凝块。向羊膜添加240PU/mL胶原酶和200PU/mL分散酶I，并且在50rpm的条件下在37℃下搅拌90min。所得含有羊膜MSC的细胞悬浮液用尼龙网过滤器(孔径：95μm)过滤并且去除剩下的未消化的羊膜。在CellStack(6,000细胞/cm2)中用含有10％FBS的αMEM培养以上获得的含有羊膜MSC的细胞群体直到细胞为次汇合的(subconfluent)。然后，细胞用TrypLE Select处理并且从Cell Stack分离。以6,000细胞/cm2的细胞密度在含有10％FBS的αMEM中培养所得的细胞悬浮液。该细胞培养和传代重复5次(共6次传代)。
将在以上程序中获得的6次传代的人羊膜来源的MSC以8x 107--细胞/mL的密度悬浮在含有5重量％DMSO的盐水、6重量％羟乙基淀粉、4％人血清蛋白和50重量％PRMI1640的混合溶液(CP-1溶液)中，并且将其冷冻并且储存在液氮中。可合适地将其用作羊膜MSC药物。在该药物解冻之后，30μL(2.4x 106细胞)被收集并且散布在
Figure BDA0002682586410000263
(1cm2)的纤维蛋白层上以制备
Figure BDA0002682586410000261
复合体。然后，将MSC
Figure BDA0002682586410000262
复合体施加至含有RPMI1640(200μL)的12孔板，使得纤维蛋白层在上。12孔板盖有盖子，并且在37℃下静置。在3、6和10个小时后，将从12孔板取出的
Figure BDA0002682586410000264
复合体添加至Eppendorf管，所述Eppendorf管含有添加有10IU/mL纳豆激酶的盐水(500μL)，并且在37℃下培育10分钟以释放细胞。从Eppendorf管中移除
Figure BDA0002682586410000265
并且添加PRMI1640(500μL)。然后，在400g下对所述管进行离心3分钟，并且去除上层清液。进一步地，添加PRMI1640以制备1x 106细胞/mL的细胞悬浮液(100μL)，并且以相同的方式添加PRMI1640以制备1x 106细胞/mL的细胞悬浮液(100μL)。向其添加7-AAD(Via ProbeTM，BD bioscience)(10μL)，并且在暗处静置细胞悬浮液15分钟。然后，通过使用流式细胞仪测量：(A)刚好在解冻后的细胞和(B)在制备
Figure BDA0002682586410000266
复合体之后的细胞的7-AAD阳性比率(死亡细胞比率)。从获得的值通过下式计算细胞存活比率。结果是，在3、6和10个小时之后的细胞存活比率分别为95％、96％和92％。(细胞存活比率)＝[100－((B)的7-AAD阳性比率)％/(100－((A)的7-AAD阳性率)％]
这些结果示出了
Figure BDA0002682586410000267
可以高细胞活力保持细胞。因此，纤维蛋白原/凝血酶可优选地用作生物胶粘剂材料并且胶原可优选地用作生物可吸收材料。
实施例8：在猪模型中使用
Figure BDA0002682586410000272
的心外膜细胞放置体内可行性数据。
通过在全身麻醉和机械通气的条件下的开胸手术，将两块与1mL的5x107细胞/mL猪骨髓来源的MSC混合的
Figure BDA0002682586410000271
(25cm2)放置在猪(20-22kg)的跳动的心脏表面上。
除了技术可行性之外，在第1天在组织结构学方面确认了MSC(用CM-DiI标为橙色)的显著保留和存活(图14)。
Figure BDA0002682586410000273
复合体强烈地粘附至心脏表面。还有，在这些研究中没有观察到急性不良事件，包括发生心率失常和免疫反应。
组织学分析表明了供体细胞在第一天之时在心脏表面上的显著保留和存活(在移植之前，MSC用橙色荧光染料标记)(图14)。大部分MSC保留在心脏表面上。比例尺＝100μm。
在大型动物模型的先前实验中(使用水凝胶辅助的心外膜放置)，已经揭示了机械摩擦是待保留在心脏表面上的供体细胞的主要问题。本发明的多层基体能够成功的将干细胞心外膜放置在心脏表面(如下文)上，而使用其他膜(比如单层膜，
Figure BDA0002682586410000274
和
Figure BDA0002682586410000275
)则不能实现。
Figure BDA0002682586410000276
(由Pfizer生产)是生物胶粘剂材料的实例。
Figure BDA0002682586410000277
是无菌的压缩海绵，其由明胶制成并且作为医疗产品销售。目前，这种商品广泛地用于不同目的(止血)。该产品在患者中的安全性已经被证实。
Figure BDA0002682586410000279
(由Koken生产)是生物胶粘剂材料的实例。
Figure BDA0002682586410000278
为局部止血片，其由胶原制成并且作为医疗产品销售。目前，该商品广泛地用于不同目的(止血)。该产品在患者中的安全性已经被证实。
Figure BDA00026825864100002710
(由Ethicon生产)是生物胶粘剂材料的实例。
Figure BDA00026825864100002711
是抗粘连片，其由再生的氧化纤维素制成并且作为医疗产品销售。目前，该商品广泛地用于不同目的(防止术后粘连)。该产品在患者中的安全性已经被证实。
实施例9：在猪模型中使用
Figure BDA00026825864100002712
的心外膜细胞放置的体内可行性数据。
通过在全身麻醉和机械通气的条件下的开胸手术，将两块根据实施例7获得的与1mL的8x 107细胞/mL人羊膜来源的MSC药物混合的
Figure BDA0002682586410000281
(25cm2)，放置在猪(20-22kg)的跳动的心脏表面上。
除了技术可行性之外，在第1天在组织结构学方面确认了MSC(用CM-DiI标为橙色)的显著保留和存活(图15)。
Figure BDA0002682586410000282
复合体强烈地粘附至心脏表面。
组织学分析表明了供体细胞在第一天之时在心脏表面上的显著保留和存活(在移植之前，MSC用橙色荧光染料标记)(图15)。大部分MSC保留在心脏表面上。比例尺＝400μm。
没有急性不良事件，包括发生心率失常和免疫反应，据我们研究没有发生。
关于所使用的人羊膜来源的MSC，如下分析对表面抗原(CD73，CD90，CD105，CD34，CD45，CD106，和CD142)呈阳性的细胞比率，在测量条件下，待分析的细胞数为10,000细胞，并且流速设置为"慢(Slow)"(14μL/min)，使用由Becton,Dickinson and Company(BD)制造的BD AccuriTM C6流式细胞仪。
(1)测量结果以直方图的形式示出，其中纵轴表明细胞数并且横轴表明抗体标记染料的荧光强度。
(2)测定荧光强度较强的细胞群体占使用用作同型对照的抗体测量的全部细胞的0.1％至1.0％之处的荧光强度
(3)计算具有比以上(2)中测定的荧光强度更高的荧光强度的细胞与用抗各种类型的抗原的抗体测量的全部细胞的比率。
结果是，CD73-阳性率为50％或更高(具体地，100％)，CD90-阳性率为50％或更高(具体地，100％)，CD105-阳性率为50％或更高(具体地，99％)，CD34-阳性率低于5％(具体地，0％)，CD45-阳性率低于5％(具体地，1％)，CD106-阳性率低于5％(具体地，0％)，并且CD142-阳性率为50％或更高(具体地，98％)。在本测量中，作为同型对照抗体，使用PEMouseIgG1，κ同型对照(BD/众数：555749)，FITC Mouse IgG1，κ同型对照(BD/众数：550616)，FITC Mouse IgG2a，κ同型对照，REA Control(S)-PE同型对照抗体(MiltenyiBiotec/130-104-612)。作为针对CD73抗原的抗体，使用PE Mouse Anti-Human CD73(BD/众数：550257)；作为针对CD90抗原的抗体，使用FITC Mouse Anti-HumanCD90(BD/众数：555595)；作为针对CD105抗原的抗体，使用Anti-Human抗体FITC Conjugate(AnCell/众数：326-040)；作为针对CD34抗原的抗体，使用PE Mouse Anti-Human CD34(BD/众数：343505)；作为针对CD45抗原的抗体，使用FITC Mouse Anti-Human CD45(BD/众数：555482)；作为针对CD106抗原的抗体，使用CD106-PE，人类单克隆(Miltenyi Biotec/130-104-163)；并且作为针对CD142抗原的抗体，使用PE Mouse Anti-Human CD142(BD/众数：561713)。
实施例10：评估施加至多层基体的人羊膜来源的MSC的存活率
将根据实施例7获得的人羊膜来源的MSC以1x 107细胞/mL的密度悬浮在含有5重量％DMSO的盐水、6重量％羟乙基淀粉、4％人血清蛋白和50重量％PRMI1640的混合溶液(CP-1溶液)中，将其冷冻并且储存在液氮中。在解冻之后，30μL(0.3x 106细胞)被收集并且散布在
Figure BDA0002682586410000292
(1cm2)的纤维蛋白层上以制备
Figure BDA0002682586410000291
复合体。然后，将MSC
Figure BDA0002682586410000293
复合体施加至含有RPMI1640(200μL)的12孔板，使得纤维蛋白层在上。12孔板盖有盖子，并且在37℃下静置。在3、6和10个小时后，将从12孔板取出的
Figure BDA0002682586410000294
复合体添加至Eppendorf管，所述Eppendorf管含有添加有10IU/mL纳豆激酶的盐水(500μL)，并且在37℃下培育10分钟以释放细胞。将
Figure BDA0002682586410000295
从Eppendorf管中移除，并且添加PRMI1640(500μL)。然后，在400g下对所述管进行离心3分钟，并且去除上层清液。进一步地，添加PRMI1640以制备1x 106细胞/mL的细胞悬浮液(100μL)，并且以相同的方式添加PRMI1640以制备1x 106细胞/mL的细胞悬浮液(100μL)。向其添加7-AAD(ViaProbeTM，BD bioscience)(10μL)，并且在暗处静置细胞悬浮液15分钟。然后，通过使用流式细胞仪测量：(A)刚好在解冻后的细胞和(B)在制备
Figure BDA0002682586410000296
复合体之后的细胞的7-AAD阳性比率(死亡细胞比率)。从获得的值通过下式计算细胞存活比率。结果是，在3、6和10个小时之后的细胞存活比率分别为96％、82％和83％。(细胞存活比率)＝[100－((B)的7-AAD阳性比率)％/(100－((A)的7-AAD阳性率)％]
实施例11：在大鼠后心肌梗塞缺血性心肌病模型中使用
Figure BDA0002682586410000297
的心外膜细胞 放置的体内概念论证数据。
将人羊膜来源的MSC以8x 107细胞/mL的密度悬浮在含有5重量％DMSO的盐水、6重量％羟乙基淀粉、4％人血清蛋白和50重量％PRMI1640的混合溶液(CP-1溶液)中，将其冷冻并且储存在液氮中。在刚解冻之后，25μL(2x 106细胞)被收集并且散布在
Figure BDA0002682586410000301
(1cm2)的纤维蛋白层上以制备
Figure BDA0002682586410000302
复合体。在心外膜心脏表面(针对缺血区域)上放置
Figure BDA0002682586410000303
复合体(TS+MSC组)或不放置(假手术组)，其中纤维蛋白/MSC侧直接与大鼠的心脏表面(在通过左冠状动脉结扎诱发心肌梗塞之后已过四周)接触。为了准确和易于放置，在放置之前将
Figure BDA0002682586410000304
裁切成3块。所有程序都是简单直接的并且
Figure BDA0002682586410000305
复合体牢固地固定在跳动的心脏上。治疗四周之后，超声波心动描记术和心脏导管插入术表明，与假手术组相比，心外膜放置
Figure BDA0002682586410000306
复合体改进了心脏功能和结构。TS+MSC组显示出了约10％的LVEF提高。关于所使用的人羊膜来源的MSC，如下分析对表面抗原(CD73，CD90，CD105，CD34，CD45，CD106，和CD142)呈阳性的细胞比率，CD73-阳性率为50％或更高(具体地，100％)，CD90-阳性率为50％或更高(具体地，100％)，CD105-阳性率为50％或更高(具体地，100％)，CD34-阳性率低于5％(具体地，0％)，CD45-阳性率低于5％(具体地，0％)，CD106-阳性率低于5％(具体地，1％)，并且CD142-阳性率为50％或更高(具体地，95％)。
实施例12：在猪模型中使用
Figure BDA0002682586410000307
基体的心外膜细胞放置的体内 可行性数据。
将9cm2的
Figure BDA0002682586410000308
(作为生物可吸收材料)放在9cm2的
Figure BDA0002682586410000309
(作为生物胶粘剂材料)上，并且其四个角用缝合线固定。然后，将根据实施例7获得的1mL的8x 107细胞/mL人羊膜来源的MSC药物(但供体羊膜与实施例7不同)，放在
Figure BDA00026825864100003010
侧并且通过在全身麻醉和机械通气的条件下的开胸手术，将其放置在猪(20-22kg)的跳动的心脏表面上。
除了技术可行性之外，在第1天在组织结构学方面确认了MSC(用CM-DiI标为橙色)的显著保留和存活(图16)。
Figure BDA00026825864100003011
复合体强烈地粘附至心脏表面。还有，没有急性不良事件，包括发生心率失常和免疫反应，据我们研究没有发生。
组织学分析表明了供体细胞在第一天之时在心脏表面上的显著保留和存活(在移植之前，MSC用橙色荧光染料标记)(图16)。大部分MSC保留在心脏表面上。比例尺＝400μm。
用于体内研究的人羊膜MSC药物由不同于实施例7的供体获得。根据实施例7分析对表面抗原(CD73，CD90，CD105，CD34，CD45，CD106，和CD142)呈阳性的细胞比率。
结果是，观察到与实施例7中的供体相同的特性。CD73-阳性率为50％或更高(具体地，100％)，CD90-阳性率为50％或更高(具体地，100％)，CD105-阳性率为50％或更高(具体地，99％)，CD34-阳性率低于5％(具体地，0％)，CD45-阳性率低于5％(具体地，0％)，CD106-阳性率低于5％(具体地，1％)，并且CD142-阳性率为50％或更高(具体地，95％)。在本测量中，作为同型对照抗体，使用PE Mouse IgG1，κ同型对照(BD/众数：555749)，FITC MouseIgG1，κ同型对照(BD/众数：550616)，FITC Mouse IgG2a，κ同型对照，REA Control(S)-PE同型对照抗体(Miltenyi Biotec/130-104-612)。作为针对CD73抗原的抗体，使用PE MouseAnti-Human CD73(BD/众数：550257)；作为针对CD90抗原的抗体，使用FITC Mouse Anti-Human CD90(BD/众数：555595)；作为针对CD105抗原的抗体，使用Anti-Human抗体FITCConjugate(AnCell/众数：326-040)；作为针对CD34抗原的抗体，使用PE Mouse Anti-HumanCD34(BD/众数：343505)；作为针对CD45抗原的抗体，使用FITC Mouse Anti-Human CD45(BD/众数：555482)；作为针对CD106抗原的抗体，使用CD106-PE，人类单克隆(MiltenyiBiotec/130-104-163)；并且作为针对CD142抗原的抗体，使用PE Mouse Anti-Human CD142(BD/众数：561713)。
还有，根据实施例7评估施加至
Figure BDA0002682586410000311
基体的细胞存活率。结果是，在3、6和10个小时之后的细胞存活比率分别为97％、95％和90％。
这些结果示出了
Figure BDA0002682586410000312
基体，以及
Figure BDA0002682586410000313
对生物组织的显著的粘附能力，并且
Figure BDA0002682586410000314
基体可以高细胞活力保持细胞。如以上描述地，使用单层膜比如
Figure BDA0002682586410000315
和
Figure BDA0002682586410000316
造成不成功的干细胞在猪心脏表面上的心外膜放置，然而，将这些单层膜组合以形成多层基体而制成的
Figure BDA0002682586410000317
基体实现了干细胞在猪心脏表面上的显著保留。作为该实施例的结果，由胶原和明胶层制成的含有细胞的多层基体可优选地用作用于心脏病比如缺血性心肌病的药物。
实施例13：在猪模型中使用
Figure BDA00026825864100003212
的心外膜细胞放置的体 内可行性数据。
将9cm2的
Figure BDA0002682586410000321
(作为生物可吸收材料)放在9cm2的
Figure BDA0002682586410000322
(作为生物胶粘剂材料)上，并且其四个角用缝合线固定。然后，将根据实施例12获得的1mL的8x107细胞/mL人羊膜来源的MSC药物(羊膜供体与实施例12相同)放在
Figure BDA0002682586410000323
侧上并且通过在全身麻醉和机械通气的条件下的开胸手术将其放置在猪(20-22kg)的跳动的心脏表面上。
除了技术可行性之外，在第1天在组织结构学方面确认了MSC(用CM-DiI标为橙色)的显著保留和存活(图16)。
Figure BDA0002682586410000324
复合体强烈地粘附至心脏表面。还有，没有急性不良事件，包括发生心率失常和免疫反应，据我们研究没有发生。
组织学分析表明了供体细胞在第一天之时在心脏表面上的显著保留和存活(在移植之前，MSC用橙色荧光染料标记)(图16)。大部分MSC保留在心脏表面上。比例尺＝400μm。
还有，根据实施例12评估施加至
Figure BDA0002682586410000325
基体的细胞存活率。结果是，在3、6和10个小时之后的细胞存活比率分别为95％、92％和90％。
这些结果示出了
Figure BDA0002682586410000326
基体，以及
Figure BDA0002682586410000327
对生物组织的显著的粘附能力，并且
Figure BDA0002682586410000328
基体可以高细胞活力保持细胞。如以上描述地，使用单层膜比如
Figure BDA0002682586410000329
和
Figure BDA00026825864100003210
造成不成功的干细胞在猪心脏表面上的心外膜放置，然而，将这些单层膜组合以形成多层基体而制成的
Figure BDA00026825864100003211
基体实现了干细胞在猪心脏表面上的显著保留。作为该实施例的结果，由再生的氧化纤维素和明胶层制成的含有细胞的多层基体可优选地用作用于心脏病比如缺血性心肌病的药物。
实施例14：施加至多层基体的人脂肪组织来源的MSC的存活率的评估
人脂肪组织来源的干细胞(Lonza，PT-5006)被解冻并且以6,000细胞/cm2的密度用含有5％人血小板裂解物的αMEM培养直到细胞为次汇合的。然后，细胞用于TrypLESelect处理并且从培养皿脱离并且用含有5％人血小板裂解物的αMEM清洗。将细胞悬浮液离心并且将细胞团块以8x 107细胞/mL的密度悬浮在含有5重量％DMSO的盐水、6重量％羟乙基淀粉、4％人血清蛋白和50重量％PRMI1640的混合溶液(CP-1溶液)中，将其冷冻并且储存在液氮中。根据实施例7分析对表面抗原(CD73，CD90，CD105，CD34，CD45，CD106，和CD142)呈阳性的细胞比率。结果是，CD73-阳性率为50％或更高(具体地，100％)，CD90-阳性率为50％或更高(具体地，95％)，CD105-阳性率为50％或更高(具体地，99％)，CD34-阳性率低于5％(具体地，0％)，CD45-阳性率低于5％(具体地，0％)。在解冻该脂肪组织来源的MSC之后，30μL(2.4x106细胞)被收集并且散布在
Figure BDA0002682586410000331
(1cm2)的纤维蛋白层上以制备
Figure BDA0002682586410000332
复合体。然后，将
Figure BDA0002682586410000333
复合体施加至含有RPMI1640(200μL)的12孔板，使得纤维蛋白层在上。12孔板盖有盖子，并且在37℃下静置。在3、6和10个小时后，将从12孔板取出的
Figure BDA0002682586410000334
复合体添加至Eppendorf管，所述Eppendorf管含有添加有10IU/mL纳豆激酶的盐水(500μL)并且在37℃下培育10分钟以释放细胞。从Eppendorf管中移除
Figure BDA0002682586410000335
并且添加PRMI1640(500μL)。然后，在400g下对所述管进行离心3分钟，并且去除上层清液。进一步地，添加PRMI1640以制备1x106细胞/mL的细胞悬浮液(100μL)，并且以相同的方式添加PRMI1640以制备1x 106细胞/mL的细胞悬浮液(100μL)。向其添加7-AAD(Via ProbeTM，BD bioscience)(10μL)，并且在暗处静置细胞悬浮液15分钟。然后，通过使用流式细胞仪测量：(A)刚解冻的细胞和(B)在制备
Figure BDA0002682586410000337
复合体之后的细胞的7-AAD阳性比率(死亡细胞比率)。从获得的值通过下式计算细胞存活比率。结果是，在3、6和10个小时之后的细胞存活比率分别为92％、90％和81％。(细胞存活比率)＝[100－((B)的7-AAD阳性比率)％/(100－((A)的7-AAD阳性率)％]
该结果表明脂肪组织来源的MSC也可优选地与多层基体一起使用。
还有，通过将脂肪组织来源的MSC和多层基体的复合体施加至心脏，可预期显著的疗效，因为已知的是脂肪组织来源的MSC对于心脏病比如缺血性心肌病是有用的(D.Mori等,Cell Spray Transplantation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem CellRecovers Ischemic Cardiomyopathy in a Porcine Model,Transplantation 2018；)。
实施例15：施加至
Figure BDA0002682586410000336
的人羊膜来源的MSC的存活率的评估。
Figure BDA0002682586410000341
(由Nipro生产)为伤口保护试剂，其由几丁质制成并且作为医疗产品在日本销售。将1cm2的
Figure BDA0002682586410000342
(W-A型，作为生物可吸收材料)放在1cm2的
Figure BDA0002682586410000343
(作为生物胶粘剂材料)上，并且其两个对角用缝合线固定。然后，将根据实施例12获得的30μL的8x 107细胞/mL人羊膜来源的MSC药物(羊膜供体与实施例12相同)放在
Figure BDA0002682586410000344
侧上。然后，根据实施例7评估施加至
Figure BDA0002682586410000345
基体的细胞存活率。结果是，在3、6和10个小时之后的细胞存活比率分别为96％、94％和90％。这些结果示出了
Figure BDA0002682586410000346
基体可以高细胞活力保持细胞。作为该实施例的结果，含有细胞的由几丁质和明胶层制成的多层基体可优选地用作用于细胞疗法的药物。
实施例16：施加至
Figure BDA0002682586410000347
的人羊膜来源的MSC的存活率的评 估。
Figure BDA0002682586410000348
(由Gunze生产)是由聚乙醇酸制成的组织增强剂并且作为医疗产品在日本销售。将1cm2的
Figure BDA0002682586410000349
(S型，作为生物可吸收材料)放在1cm2的
Figure BDA00026825864100003410
(作为生物胶粘剂材料)上，并且其两个对角用缝合线固定。然后，将根据实施例12获得的30μL的8x 107细胞/mL人羊膜来源的MSC药物(羊膜供体与实施例12相同)放在
Figure BDA00026825864100003411
侧上。然后，根据实施例7评估施加至
Figure BDA00026825864100003412
基体细胞存活率。结果是，在3、6和10个小时之后的细胞存活比率分别为96％、94％和91％。这些结果示出了
Figure BDA00026825864100003413
基体可以高细胞活力保持细胞。作为该实施例的结果，含有细胞的由聚乙醇酸和明胶层制成的多层基体可优选地用作用于细胞疗法的药物。
实施例17：评估施加至
Figure BDA00026825864100003414
的人羊膜来源的MSC的存活 率。
将1cm2的
Figure BDA00026825864100003415
(作为生物可吸收材料)放在1cm2的
Figure BDA00026825864100003416
(作为生物胶粘剂材料)上，并且其两个对角用缝合线固定。然后，将根据实施例12获得的30μL的8x 107细胞/mL人羊膜来源的MSC药物(羊膜供体与实施例12相同)，放在
Figure BDA00026825864100003417
的纤维蛋白原-凝血酶侧上。然后，根据实施例7评估施加至
Figure BDA0002682586410000352
基体的细胞存活率。结果是，在3、6和10个小时之后的细胞存活比率分别为96％、96％和93％。这些结果示出了
Figure BDA0002682586410000351
基体可以高细胞活力保持细胞。作为该实施例的结果，由再生的氧化纤维素、胶原和纤维蛋白原层制成的含有细胞的多层(三层)基体可优选地用作用于细胞疗法的药物。
小结
本文中的实施例显示出可制备细胞敷料多层基体，其适合于治疗急性心肌梗塞以及慢性心力衰竭。虽然单层基体不能实现这样的治疗，但我们发现两层基体能够建立干细胞的心外膜放置。这种组合物的心外膜放置是可行的并且有效的将供体细胞保持在心脏以及将供体细胞植入至心脏。这种组合物的治疗功效还在两种心脏病模型中得到了证实。还证实了在大型动物中的可行性。
该方法允许即时并且现场生产组织工程多层基体，其可立即施加至患者(在心脏表面上)。“细胞敷料”疗法所需要的全部程序对任何普通的临床医生/医院工作人员都是极其简单并且切实可行的，无需特殊设备或专业技能。当从外部供应供体细胞时，“细胞敷料”可在外科手术室中无需任何特殊设备(比如高级的细胞处理中心)而生成。生成/放置的整个过程会在半小时内完成，对临床工作人员或患者造成非常小的额外负担。因此，将此种治疗加入常规心脏外科手术(已知细胞疗法增强冠状动脉旁路移植外科手术的效果)是非常容易并且合理的。此治疗也可单独进行(伴随开胸程序或使用内窥镜等)。

Claims (13)

1.包含至少两层的多层基体，其中第一层包含生物可吸收材料并且第二层包含生物胶粘剂材料，其中第二层含有细胞。
2.根据权利要求1所述的多层基体，其中细胞中对CD105、CD73和CD90呈阳性的细胞百分比为50％或更高，并且细胞中对CD45和CD34呈阳性的细胞百分比为10％或更低。
3.根据权利要求1至2中任意项所述的多层基体，其中细胞中对CD142呈阳性的细胞百分比为50％或更高，并且细胞中对CD106呈阳性的细胞百分比为10％或更低。
4.根据权利要求1至3中任意项所述的多层基体，其中所述细胞为间充质干细胞。
5.根据权利要求1至4中任意项所述的多层基体，其中所述间充质干细胞源自胎儿附属物。
6.根据权利要求1至5中任意项所述的多层基体，其中在第二层中所包含的细胞密度为0.3×106细胞/cm2或更高。
7.根据权利要求1至6中任意项所述的多层基体，其中多层基体的施用面积/体重为0.1cm2/kg或更高并且6.0cm2/kg或更低。
8.根据权利要求1至7中任意项所述的多层基体，其中第二层包含至少两种生物胶粘剂材料。
9.根据权利要求1至8中任意项所述的多层基体，其中生物胶粘剂材料为选自纤维蛋白原、凝血酶、明胶、层粘连蛋白、整合素、纤连蛋白和玻连蛋白中的至少一种。
10.根据权利要求1至9中任意项所述的多层基体，其中第二层还含有二甲亚砜和清蛋白。
11.根据权利要求1至10中任意项所述的多层基体，其中生物可吸收材料为选自胶原、明胶、纤维素、纤维素乙酸酯、壳聚糖、几丁质、聚乳酸酯、透明质酸和聚乙醇酸中的至少一种。
12.生产包含至少两层的多层基体的方法，其中第一层包含生物可吸收材料并且第二层包含生物胶粘剂材料，其中第二层含有细胞，该方法包括以下步骤；
A)制备细胞悬浮液和
B)将细胞悬浮液施加至多层基体的第二层。
13.根据权利要求1所述的多层基体用于治疗对象的组织或器官的病变或创伤的用途。
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