CN111867549B - 用于使用封闭的2-aa进行聚糖分析的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在标记聚糖以供分析的程序中使用以叔丁氧羰基(“Boc”)基团封闭的邻氨基苯甲酸(2‑AA)的方法，以及提供2‑AA‑Boc和用于使封闭的2‑AA解封闭的酸、用于聚糖标记和分析的试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
此申请要求2018年2月2日提交的美国临时专利申请号62/625,846的优先权和权益，将其内容通过提述并入本申请以用于所有目的。
联邦资助声明
不适用。
发明背景
确定生物样品的聚糖(glycan)特征在很多情况下已经具有重要性。例如，需要确定糖蛋白诸如抗体治疗剂的聚糖特征，以确保一致的生物学特性。此外，此类治疗剂的生产过程中需要监测糖基化谱，以防止可能不利地影响该药剂的产量或特性的发酵条件变化。
已经开发了多种标记物，这样的标记物上附接的聚糖可以通过分析来检测，例如通过观察标记的聚糖的荧光对标记的聚糖进行质谱分析。糖蛋白上存在的N-聚糖经常通过以下方式进行分析：用PNGase F酶从糖蛋白释放出N-聚糖，并用试剂(诸如共有的美国专利号8,124,792和8,445,292中教导的试剂)标记所得的葡基胺。标记聚糖的另一种方式是使用2-氨基苯甲酰胺(“2-AB”)或邻氨基苯甲酸(“2-AA”)等荧光染料将它们还原性胺化。参见，例如，Bigge等,“Nonselective and Efficient Fluorescent Labeling of GlycansUsing 2-Amino Benzamide and Anthranilic Acid,”Anal.Biochem.230:229-238(1995)。随后一般通过例如高效液相色谱法(“HPLC”)或毛细管电泳来分离出标记的聚糖，然后提供给分析装置，诸如荧光检测器。
尽管2-AB仍广泛用于通过还原性胺化来标记聚糖，但至少在美国，由于管制物质法案(Controlled Substances Act.)21U.S.C.§§801等等施加的限制，将2-AA用于这些目的变得更加困难。该法案第802(34)节将邻氨基苯甲酸、其酯类及其盐列为用于制备管制物质的“第1清单化学制品”。第1清单化学制品要遵守关于记录保存、分发和运输的各种要求。2-AA被认为标记聚糖的敏感性比2-AB稍高。如果有一种方便的方式以适合于聚糖分析的形式提供2-AA，但遵守药品监督局(Drug Enforcement Administration，“DEA”)关于邻氨基苯甲酸、其酯和其盐的规则，将是令人期望的。
对于使2-AA可用于聚糖的还原性胺化和标记，同时仍遵守控制2-AA、其酯和其盐的分布和运输的DEA法规的方法和试剂盒仍有需求。令人惊讶地，本发明以被认为可以满足这些和其它需求。
发明概述
在一些实施方案中，本发明提供用邻氨基苯甲酸(“2-AA”)标记聚糖的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：获得与叔丁氧羰基(“Boc”)基团缀合的2-AA(“2-AA-Boc”)，通过在足以从所述2-AA-Boc中去除Boc基团的时间和温度下将所述2-AA-Boc与酸一起温育来去除所述Boc基团，由此获得2-AA，以及在允许2-AA标记聚糖的条件下温育含有2-AA和聚糖的溶液，由此用2-AA标记聚糖。在一些实施方案中，所述酸是三氟乙酸、二氟乙酸或盐酸。在一些实施方案中，所述酸是二氟乙酸(“DFA”)。在一些实施方案中，所述足以从2-AA-Boc中去除Boc基团的温度为50-90℃。在一些实施方案中，所述足以从2-AA-Boc中去除Boc基团的温度为约70℃。在一些实施方案中，所述足以从2-AA-Boc中去除Boc基团的时间为约1小时至过夜。在一些实施方案中，与所述2-AA-Boc一起温育的酸是无溶剂(neat)的。在一些实施方案中，与所述2-AA-Boc一起温育的酸在非质子、有机溶剂中。在一些实施方案中，所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜(“DMSO”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)或N-甲基甲酰胺。在一些实施方案中，所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜。在一些实施方案中，所述酸以1M至6M的浓度存在。在一些实施方案中，所述酸是DFA且以约4M的浓度存在。在一些实施方案中，所述酸在水溶液中，且所述方法进一步包括在将所述酸与所述2-AA-Boc温育后干燥所述2-AA，以在将所述2-AA与聚糖温育之前去除所述水溶液。在一些实施方案中，所述2-AA与聚糖的温育是在约50-90℃下。在一些实施方案中，所述2-AA与所述聚糖的温育是在约65℃下。在一些实施方案中，所述2-AA的溶液和所述聚糖进一步包含还原剂。在一些实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠或甲基吡啶硼烷。
在第二组实施方案中，本发明提供通过还原性胺化用邻氨基苯甲酸(“2-AA”)标记聚糖的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含：含有与叔丁氧羰基(“Boc”)基团缀合的2-AA(“2-AA-Boc”)的容器，和含有适用于从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的酸的容器，所述酸的浓度足以从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团。在一些实施方案中，所述适用于从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的酸适用于在无水条件下去除所述Boc基团。在一些实施方案中，所述酸是三氟乙酸、二氟乙酸或盐酸。在一些实施方案中，所述酸是二氟乙酸。在一些实施方案中，所述二氟乙酸是无溶剂的。在一些实施方案中，所述酸在非质子、有机溶剂中。在一些实施方案中，所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜(“DMSO”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)或N-甲基甲酰胺。在一些实施方案中，所述非质子、有机溶剂是DMSO。在一些实施方案中，所述酸以1M至6M的浓度存在于所述非质子、有机溶剂中。在一些实施方案中，所述酸以约4M的浓度存在于所述非质子、有机溶剂中。在一些实施方案中，所述2-AA-Boc的量为5-10mg。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含还原剂。在一些实施方案中，所述还原剂是氰基硼氢化钠。在一些实施方案中，所述还原剂是甲基吡啶硼烷。在一些实施方案中，所述还原剂溶解在有机溶剂中。在一些实施方案中，所述溶剂是DMSO。
发明详述
还原性胺化是标记聚糖以进行分析的常用方法。两种荧光团——邻氨基苯甲酸(2-氨基苯甲酸，又称“2-AA”)，和2-氨基苯甲酰胺，又称“2-AB”——由于附接于聚糖的稳定性和敏感性而被广泛用于通过还原性胺化来标记聚糖。根据Sigma-Aldrich网站，2-AA标记聚糖的敏感性比2-AB稍高。不幸的是，如“发明背景”中所述，美国药品监督局(“DEA”)对邻氨基苯甲酸、其酯类及其盐类的使用施加了限制和保存记录的要求，因为它们也可用于合成管制物质安眠酮。这些限制使得在美国更加难以将2-AA用于聚糖标记和分析的合法用途。
令人惊讶地，本发明提供了标记聚糖以用于分析的试剂盒和方法，这些试剂盒和方法允许运输和使用2-AA的衍生物，其不是邻氨基苯甲酸，也不是邻氨基苯甲酸的酯或盐，但只需对标记聚糖的标准工作流程稍微修改，就可以允许引入和使用该衍生物用于标记聚糖。
本发明的试剂盒和方法采用氨基被叔丁氧羰基(“Boc”)基团保护的2-AA。在肽合成过程中，在有机合成中使用Boc基团保护氨基是众所周知的。通常，添加Boc保护基，进行期望的合成步骤，并通过将带有Boc基团的化合物与酸一起温育来去除该保护基。取决于酸，温育可以在环境温度下进行，但优选在50-90℃的温度下进行。(为了便于提述，本文中有时将2-AA分子的氨基部分附接了Boc基团的2-AA称为“2-AA-Boc”，也称为“封闭的2-AA”或“受保护的2-AA”。从2-AA-Boc中去除Boc基团有时称为“脱保护的”2-AA或“解封闭的”2-AA。
尽管氨基的保护和脱保护在肽合成中的使用是众所周知的，但它尚未普遍用于聚糖的标记和分析中，也没有具体在聚糖标记中使用2-AA，因为2-AA的封闭和解封闭增加标记工作流程的步骤和时间，与从业者减少步骤数目和进行分析的时间的通常期望形成鲜明对比。因此，封闭2-AA上的氨基或使用Boc保护的2-AA形式是违反直觉的。但是，此处2-AA与Boc的缀合产生不是2-AA或2-AA的酯或盐的化合物，因此被认为不是清单1化学制品。此外，脱保护步骤导致2-AA与酸以混合物存在。酸与2-AA的这种组合可用于通过还原性胺化标记聚糖。
添加和去除Boc保护基
t-Boc保护基的添加和去除已经实践了数十年。参见，例如，Lundt等,“Removal oft-butyl and t-butoxycarbonyl protecting groups with trifluoroacetic acid,”Chem.Biol.&Drug Design,12(5):258-268(1978)；Atherton等,J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,13:537-539(1978)；Hemmasi和Bayer,Int J Pept Protein Res.9(1):63-70(1977)；Schnolzer等,“In situ neutralization in Boc-chemistry solid phasepeptide synthesis.Rapid,high yield assembly of difficult sequences,”Int JPept Protein Res.1992Sep-Oct；40(3-4):180-93；和Han等,“Fast,efficient andselective deprotection of tert-butoxycarbonyl(Boc)group using HCl/dioxane(4m),”J.Peptide Res.,58,338–341(2001)。Boc保护基的添加和去除在例如Green andWuts,“Protective Groups in Organic Synthesis,Wiley-Interscience,NY(1999),第518-525和736-739页中有一般性的教导。
Boc保护的2-AA可购自，例如，Sigma Aldrich Corp.(St.Louis,MO，该公司将其列为“2-(Boc-氨基)苯甲酸”，和Bachem(Bachem Americas,Inc.,Torrance,CA,catalognumber A-3240)。或者，可以通过已知技术将Boc基团添加至化合物，诸如2-AA。例如，维基百科指出，可在“水溶液条件下，在碱诸如碳酸氢钠的存在下，使用二碳酸氢二叔丁酯添加Boc保护基。氨基的保护也可在乙腈溶液中使用4-二甲基氨基吡啶(DMAP)作为碱来实现”。该文进一步报道，可通过使用强酸诸如“无溶剂的或溶于二氯甲烷中的三氟乙酸，或甲醇中的HCl”来去除Boc基团。该文总结了多篇研究报告，如教导了在环境温度下用3M盐酸和乙酸乙酯对受保护的产物脱保护30分钟，在65℃下加热受保护的化合物与盐酸水溶液和甲苯，以及将受保护的化合物溶解在二氯甲烷和三氟乙酸(“TFA”)的50/50混合物中。
以上引用的Schnolzer参考文献教导了使用100％TFA从氨基酸中快速去除Boc保护基的方法。如上所述，脱保护方案通常要求使用强酸，诸如3M盐酸或三氟乙酸。
本领域已知的一些脱保护方案使用溶于水溶液中的酸去除Boc基团。水溶液可用于本发明的方法和试剂盒中(溶于水溶液中的酸有时在本文中称为“酸水溶液”)。在这些方法中，在2-AA被脱保护后使用“干燥”步骤去除水，因为随后的聚糖还原性氨化必须在无水条件下进行。在优选的实施方案中，所述酸是无溶剂的，或者溶于非质子有机溶剂(诸如二甲基亚砜(“DMSO”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)或N-甲基甲酰胺)中，所述非质子有机溶剂与还原性氨化相容，以便无需在2-AA被解封闭后在标记感兴趣的聚糖之前将其去除。可使用四氢呋喃，但由于其易挥发，因此是次优选的。在一些优选的实施方案中，所述有机溶剂是DMSO。所选的酸和有机溶剂的混合物有时在本文中称为“酸溶液”。
使用无溶剂酸或溶于有机溶剂中的酸，可以省略在2-AA解封闭和随后使用解封闭的2-AA进行的聚糖还原性胺化之间的“干燥”(dry down)步骤，因此是优选的。如上所述，可以使用无溶剂的酸。如果使用有机溶剂，则优选以为1M至6M，更优选约3-5M，甚至更优选约4M的浓度使用所述酸，其中“约”在此处意指±0.25M。
在优选的实施方案中，通过将2-AA-Boc与酸、酸水溶液或酸性溶液在足以从封闭的2-AA中去除所述Boc基团的时间和温度下一起温育来使2-AA-Boc脱保护。如果在酸水溶液中使2-AA-Boc脱保护，则然后可使用“干燥”步骤使脱保护的2-AA处于无水状态，可即时用于标记聚糖。
在一些实施方案中，2-AA的解封闭和用2-AA标记聚糖是在同一容器中进行的(所谓的“一锅法”程序)。这避免了反应物多次转移到另一容器中，每次转移可导致某些待分析的聚糖的损失。例如，可将2-AA-Boc与酸、酸水溶液或酸性溶液混合在小瓶中，然后将小瓶置于加热块持续一段期望的时间，从一小时至过夜。通常将小瓶加热至50-90℃。在一些优选的实施方案中，将小瓶加热至约70℃，其中在温度情况下的“约”意指±5℃。
如果已使用酸水溶液使2-AA-Boc脱保护，则通常随后将其干燥，然后添加有机酸，再添加待标记的聚糖。在优选的实施方案中——其中2-AA-Boc已通过在足以去除Boc基团的时间和温度下在无水条件下与酸一起温育(诸如与无水酸或非质子有机溶剂中的酸一起温育)而脱保护——可将聚糖样品直接添加到无水溶液中，用已解封闭的2-AA通过还原性胺化加以标记。例如，如方案1所示，可通过将2-AA-Boc在DMSO中与酸(如TFA)在70℃温育过夜来使2-AA-Boc解封闭：
方案1
正如技术人员将理解的，用于使用特定的酸从受保护的氨基酸去除Boc基团的其它温育时间与温度的组合在本领域中是已知的，并且可以容易地为了从2-AA-Boc中去除Boc基团的目的而调整适用。由于二氟乙酸(DFA)不如通常用于肽合成的脱保护Boc基团中所用的TFA酸强，如果使用DFA，与使用TFA作为酸的方案相比，解封闭2-AA的温育时间或温度或二者应适当增加，以反映DFA的较弱强度。任何特定的时间和温度都可用任何特定的溶剂中任何特定浓度的任何特定酸容易地测试，以确定其是否导致2-AA-Boc完全解封闭。由于2-AA和2-AA-Boc二者均有荧光性，因此对于所得产物，可以通过例如进行HPLC、检查洗脱产物的荧光并确定2-AA和2-AA-Boc的相对量，容易地测试是否完全脱保护。
在还原性胺化标记聚糖的全程中优选存在还原剂。由于还原剂在此类标记中的使用在本领域中是众所周知的，此处仅简要描述。适用于聚糖的还原性胺化的还原剂包括氰基硼氢化钠和甲基吡啶硼烷。还原剂通常在有机溶剂(诸如DMSO或四氢呋喃(THF))中，但是在某些工作流程中，可以在还原剂呈固体形式时向其加入酸或酸溶液，让还原剂随后溶解在酸或酸溶液中。通常以含有还原剂的溶液与含有2-AA和酸的溶液或酸溶液为1:1、1:2、1:3或1:4的比例添加还原剂。最终混合物中还原剂浓度通常为0.5至2M。
未封闭的2-AA可在正常的工作流程中用于感兴趣的聚糖的还原性胺化。2-AA通常以0.1M至2M的浓度，更优选以0.3M至1M的浓度，更优选以约0.3M至约0.6M的浓度，最优选以0.4M的浓度用于聚糖的标记，其中“约”在此处意指±0.05M。
试剂盒
本发明提供包含2-AA-Boc和用于使2-AA-Boc解封闭的试剂的试剂盒。例如，该试剂盒可提供一个或多个容器，所述容器包含一定量的适用于所选数目的聚糖分析的2-AA-Boc。
例如，可使用多孔板，诸如96孔板，用2-AA标记聚糖。方便地，可选择容器中的2-AA-Boc的量，使得解封闭后，产生的2-AA的量足以标记96孔板的孔中的聚糖样品。标记聚糖所用的2-AA的量相当少，～40mg的2-AA通常足以标记96孔板的所有孔中的聚糖。所述试剂盒进一步包括一个或多个装有选用于使2-AA-Boc解封闭的酸、酸水溶液或酸溶剂溶液的容器。方便地，容纳2-AA-Boc的容器，容纳酸、酸水溶液或酸性溶剂溶液的容器，或这两种容器具有这样的尺寸，使得一旦2-AA-Boc与酸或包含酸的溶液已经混合在一起，装有所得混合物的容器可以放进加热块中，并在选择的温度下温育以去除Boc基团，得到解封闭的2-AA。
用于标记的解封闭的2-AA的容器通常含有5-30mg的0.4M左右的2-AA溶液。含有相同量和浓度的2-AA-Boc的容器，一旦解封闭，将产生等量的2-AA用于标记。
在优选的实施方案中，该试剂盒不与已经混合有2-AA-Boc和酸的容器一起运输或分发，因为这样将在分发和运输期间产生包含一些解封闭的2-AA和酸的混合物。预期仅在要进行聚糖样品的标记和分析的地点才将2-AA-Boc和酸混合在一起，并且通常将在即将进行聚糖样品的还原性胺化之前混合。
该试剂盒可进一步包括可用于2-AA的还原性胺化的还原剂。例如，该试剂盒可包括氰基硼氢化钠或甲基吡啶硼烷作为还原剂。还原剂在将酸或酸性溶液与2-AA-Boc温育之前添加至酸或包含酸的溶液中。
试剂盒优选进一步包括关于使用所包括的试剂提供解封闭的2-AA的说明，该说明包括使用所提供的酸或酸性溶液使2-AA-Boc解封闭的时间和温度条件。
由2-AA标记的聚糖的分析
一旦已经发生2-AA-Boc的脱保护，则可通过标准技术，诸如Abo等,“Determination of monosaccharides derivatized with 2-aminobenzoic Acid bycapillary electrophoresis,”Methods Mol Biol.2013；984:45-50，Rustighi等,“Analysis of N-acetylaminosugars by CE:a comparative derivatization study,”Electrophoresis.2009Aug；30(15):2632-9，或Jiang等,Anal Chim Acta.2017Apr 15；962:32-40中描述的标准技术，使用所得的解封闭的2-AA标记感兴趣的聚糖。方便地，可将待分析的一种或多种聚糖添加至含有现已解封闭的2-AA的接收器皿中，并按照标准的、众所周知的流程，诸如以上引用的参考文献中描述的内容，进行还原性胺化以标记聚糖。反过来，可将现已解封闭的2-AA用移液器移取、倾倒或以其他方式转移到含有待标记的聚糖的单独容器中，并且可以在该单独容器中进行聚糖的还原性胺化。任选地，可进行清洗步骤以去除任何多余的标记物。用2-AA通过还原性胺化标记的聚糖的常用清洗方法包括亲水性相互作用液相色谱法或“HILIC”，或使用石墨化碳。然后可通过标准方法(诸如以上引用的参考文献中的标准方法)分析标记的聚糖。例如，可以从接收器皿中用移液器移取或洗脱标记的聚糖，通过高效液相色谱法或毛细管电泳进行分离，并通过观察分离的、标记的聚糖的荧光来检测标记的聚糖的存在。
实施例
实施例1：
此实施例阐述使2-AA-Boc脱保护并在聚糖标记方案中使用所得的解封闭的2-AA的示例性工作流程。
将5mg的2-AA-Boc粉末放入小瓶中，向其中加入0.15mL的4M TFA的DMSO溶液。当2-AA-Boc已溶解在溶液中时，将小瓶放在加热块中的孔中，70℃下温育过夜以从2-AA-Boc中去除Boc基团，得到解封闭的2-AA。将小瓶从加热块中取出并冷却，然后加入还原剂以准备进行聚糖标记。用移液器将5μL的含有新鲜解封闭的2-AA的溶液移取到小瓶中，加入5μL的2M氰基硼氢化钠的DMSO溶液。然后将通过酶消化从感兴趣的糖蛋白中释放的、经干燥的聚糖添加到该小瓶中，并重新溶解在含有新鲜解封闭的2-AA和还原剂的溶液中。可根据需要旋转小瓶或涡旋小瓶，以确保所有干燥的聚糖均与溶液接触并重新溶解。然后将含有已溶解在溶液中的聚糖的小瓶放在加热块中的孔中，65℃下温育3小时，由此产生还原性胺化和聚糖的标记。
应理解，本文描述的实施例和实施方案仅出于说明性目的，本领域技术人员能够想到各种修改或改变，这样的修改或改变将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过提述以其整体并入本文。
Claims (32)
1.一种用邻氨基苯甲酸2-AA标记聚糖的方法，所述方法包括：(a)获得与叔丁氧羰基Boc基团缀合的2-AA，即2-AA-Boc，
(b)通过在无水条件下在足以从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的时间和温度下将所述2-AA-Boc与酸一起温育来去除所述Boc基团，由此获得含有2-AA的无水溶液，以及
(c)在允许所述2-AA标记所述聚糖的条件下温育所述含有2-AA的无水溶液和所述聚糖，由此用2-AA标记所述聚糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸是三氟乙酸、二氟乙酸或盐酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述酸是二氟乙酸DFA。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述足以从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的温度为50-90℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述足以从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的温度为70℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述足以从所述2-AA-Boc中除去所述Boc基团的时间为1小时至过夜。
7.根据权利要求1所述的方法，其中与所述2-AA-Boc一起温育的所述酸是无溶剂的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中与所述2-AA-Boc一起温育的所述酸在非质子、有机溶剂中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜DMSO、二甲基甲酰胺DMF或N-甲基甲酰胺。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸以1M至6M的浓度存在。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述酸是DFA且以4M的浓度存在。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸在水溶液中。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的所述温育是在50-90℃下。
15.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的所述温育是在65℃下。
16.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)的所述溶液进一步包含还原剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述还原剂是氰基硼氢化钠或甲基吡啶硼烷。
18.一种用于通过还原胺化用邻氨基苯甲酸2-AA标记聚糖的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)含有与叔丁氧羰基Boc基团缀合的2-AA，即2-AA-Boc的容器，和(b)含有足以从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的浓度的适用于从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的酸的容器，其中所述适用于从所述2-AA-Boc中去除所述Boc基团的酸适用于在无水条件下去除所述Boc基团。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述酸是三氟乙酸、二氟乙酸或盐酸。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述酸是二氟乙酸。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述二氟乙酸是无溶剂的。
22.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述酸在非质子、有机溶剂中。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述非质子、有机溶剂是二甲基亚砜DMSO、二甲基甲酰胺DMF或N-甲基甲酰胺。
24.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述非质子、有机溶剂是DMSO。
25.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述酸以1M至6M的浓度存在于所述非质子、有机溶剂中。
26.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述酸以4M的浓度存在于所述非质子、有机溶剂中。
27.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述2-AA-Boc的量为5-10mg。
28.根据权利要求18所述的试剂盒，其进一步包含还原剂。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述还原剂是氰基硼氢化钠。
30.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述还原剂是甲基吡啶硼烷。
31.根据权利要求28所述的试剂盒，进一步地，其中所述还原剂溶解在有机溶剂中。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，进一步地，其中所述溶剂是DMSO。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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