CN111848661A - 一种香豆素类荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光分子探针领域，公开了一种香豆素类荧光探针及其制备方法与应用。本发明的制备方法包括以7‑羟基香豆素为原料合成中间体7‑羟基‑8‑香豆素醛，再以中间体7‑羟基‑8‑香豆素醛为原料合成第二中间产物8‑(苯并[d]噻唑‑2‑基)‑7‑羟基‑2H‑苯并吡喃‑2‑酮，再与2,4‑二硝基苯磺酰氯通过取代反应合成香豆素类荧光探针。本发明荧光探针对ONOO‑有专一的选择性，可应用于过氧亚硝酸盐的体外荧光检测。
Description
技术领域
本发明属于荧光分子探针领域，涉及一种香豆素类荧光探针及其制备方法与应用，特别是涉及一种检测过氧亚硝酸盐(ONOO-)的香豆素类荧光探针的制备方法及应用。
背景技术
过氧亚硝酸盐(ONOO-)是生命系统中最重要的内源性活性氧(ROS)之一，在各种生理和病理过程(例如信号转导和抗菌活性)中起着至关重要的作用。但是，由于其强大的氧化和硝化能力，高水平的ONOO-可能会损坏许多生物分子，包括脂质，DNA，蛋白质和酶，这可能进一步影响细胞过程，甚至引起细胞坏死和凋亡，最终导致各种疾病的出现，例如心血管疾病和损伤，自身免疫和炎性疾病，阿尔茨海默氏病，甚至癌症。即使这些是已知事实，由于其在体内的低浓度，高反应性和短寿命，其在生命系统中的许多方面仍不清楚。因此，开发快速，选择性，灵敏的生物体内ONOO-检测方法，对进一步了解生物ONOO-具有十分重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种香豆素类荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针合成简单，结构新颖，应用于体外检测ONOO-，具有较好的选择性、灵敏性、抗干扰能力强等优点。
本发明提供了一种香豆素类荧光探针，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：
本发明还提供了一种上述香豆素类荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1.将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，70～100℃温度条件下反应，反应结束后降温至70℃以下，加入盐酸调节体系pH值至2-5，乙酸乙酯萃取，乙醇重结晶得到如式(Ⅰ’)所示结构的第一中间产物；
S2.将所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，110～120℃温度条件下反应，反应结束后加水析出固体，过滤得到如式(Ⅱ)所示结构的第二中间产物；
S3.将所述第二中间产物、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和碳酸钾溶于乙腈溶剂，在70～90℃反应，反应完毕后减压浓缩反应得到的产物，乙醇重结晶得到所述香豆素类荧光探针。
优选的，上述制备方法的步骤S1中，7-羟基香豆素与六次甲基四胺的摩尔比为1：(0.55～0.7)。
优选的，上述制备方法的步骤S1中，所述反应的时间为6～8h。
优选的，上述制备方法的步骤S2中，所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠的摩尔比为1：(1～1.2)：(0.86～1)。
优选的，上述制备方法的步骤S2中，所述反应的反应时间为1～3h。
优选的，上述制备方法的步骤S3中，第二中间产物、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯以及碳酸钾的摩尔比为1:(1～1.5)：(2.5～3.5)。
优选的，上述制备方法的步骤S3中，所述反应的反应时间为20～24h。
本发明还提供了一种上述香豆素类荧光探针或上述制备方法得到的香豆素类荧光探针在过氧亚硝酸盐的体外荧光检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明荧光探针具有香豆素荧光团，ONOO-氧化了该探针中的苯基硼酸酯基团，发生重排消除反应，以释放酚羟基，使得激发态分子内质子转移(ESIPT)过程很快恢复至荧光呈现状态，实现了对过氧亚硝酸盐的荧光识别，荧光强度变化显著，检测灵敏度高。
2.本发明荧光探针对ONOO-有较好的单一选择性，与其他常见待测物作用荧光信号基本没有变化，有较大的斯托克斯位移，较高的抗干扰能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对应本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图得到其他的附图。
图1为本发明实施例1中第一中间产物的1H-NMR谱图；
图2为本发明实施例1中第二中间产物的1H-NMR谱图；
图3为本发明实施例1中香豆素类荧光探针的1H-NMR谱图；
图4为本发明实施例2中香豆素类荧光探针对过氧亚硝酸盐(ONOO-)选择性识别的荧光发射光谱图；
图5为本发明实施例3中香豆素类荧光探针在过氧亚硝酸盐(ONOO-)及其他检测物质存在下的荧光发射强度变化图；
具体实施方式
本发明提供了一种香豆素类荧光探针，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：
该香豆素类荧光探针属于反应型荧光探针，ONOO-氧化了该探针中的苯基硼酸酯基团，发生重排消除反应，以释放酚羟基，实现了对ONOO-的荧光识别，检测灵敏度高。
上述香豆素类荧光探针的制备方法如下：
S1.将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，70～100℃温度条件下反应，反应结束后降温至70℃以下，加入盐酸调节体系pH值至2-5，乙酸乙酯萃取，乙醇重结晶得到如式(Ⅰ’)所示结构的第一中间产物；
S2.将所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，110～120℃温度条件下反应，反应结束后加水析出固体，过滤得到如式(Ⅱ)所示结构的第二中间产物；
S3.将所述第二中间产物、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和碳酸钾溶于乙腈溶剂，在70～90℃反应，反应完毕后减压浓缩反应得到的产物，乙醇重结晶得到所述香豆素类荧光探针。
本发明香豆素类荧光探针的制备可采用以下反应式表示：
具体的，将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，70～100℃温度条件下反应，反应结束后降温至70℃以下，加入盐酸调节体系pH值至2-5，乙酸乙酯萃取，乙醇重结晶得到第一中间产物7-羟基-8-香豆素醛，本发明中7-羟基香豆素与六次甲基四胺的摩尔比优选为1：(0.55～0.7)，更优选为1:0.55，反应时间优选为6～8h。
得到第一中间产物7-羟基-8-香豆素醛后，将7-羟基-8-香豆素醛、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，110～120℃温度条件下反应，加水析出固体，过滤得到第二中间产物8-(苯并[d]噻唑-2-基)-7-羟基-2H-苯并吡喃-2-酮，本发明中第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠的摩尔比优选为1：(1～1.2)：(0.86～1)，更优选为1：1：0.86，反应的时间优选为1～3h。
得到第二中间产物8-(苯并[d]噻唑-2-基)-7-羟基-2H-苯并吡喃-2-酮后，将第二中间产物、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯以及碳酸钾溶于乙腈溶剂，在70～90℃反应，反应完毕后减压浓缩，乙醇重结晶得到香豆素类荧光探针。本发明中第二中间产物、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯以及碳酸钾的摩尔比为1:(1～1.5)：(2.5～3.5)，更优选为1:1.2:3，反应时间优选为20～24h。
本发明通过将第二中间产物中可产生激发态分子内质子转移(excited-stateintramolecular proton transfer，ESIPT)机理，羟基官能团用苯基硼酸酯封闭，使母体荧光关闭。然后当该荧光探针用于检测ONOO-时，ONOO-氧化了该探针中的苯基硼酸酯基团，发生重排消除反应，以释放酚羟基，使得ESIPT过程很快恢复至on-state状态，实现了对过氧亚硝酸盐的荧光识别，检测响应快，灵敏度高。
本发明提供的上述香豆素类荧光探针或上述制备方法制备的香豆素类荧光探针可以应用在过氧亚硝酸盐的体外荧光检测中。
为了进一步说明本发明，下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下，所获得的的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。
仪器与试剂：
以下所有的荧光测量在Hitachi F-7000荧光光度计上进行；核磁共振光谱在Bruker DRX-400光谱仪上获得(用氘代氯仿和氘代二甲亚砜作为核磁溶剂)，溶液的pH值用Mettler toledodelta 320pH计测定。
7-羟基香豆素(化合物1)从北京翰隆达科技发展有限公司购得。
六次甲基四胺从上海迈瑞尔化学技术有限公购得。
2-氨基苯硫酚在上海国药集团有限公司购得。
偏亚硫酸钠在上海国药集团有限公司购得。
碳酸钾在上海国药集团有限公司购得。
4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯在上海迈瑞尔化学技术有限公购得。
实验过程中所用的水均为去离子水。
除非特别指明外，其它的化学试剂都是分析纯，不需要进一步的纯化和处理，可以直接使用。
实施例1：香豆素类荧光探针L的制备
第一中间产物的合成：将10g(61.6mmol)的7-羟基香豆素(化合物1)和4.8g(33.88mmol)的六次甲基四胺放入100mL的圆底烧瓶中，加入30mL乙酸溶解，加热至90℃，搅拌反应8h后停止反应；降温至70℃，加入50mL的1mol/L的盐酸溶液搅拌调至PH值为2～5；加入冰水，加入乙酸乙酯溶剂萃取，萃取三次，每次加入30mL，再用无水硫酸钠干燥有机相，减压抽滤，滤液减压旋蒸除去溶剂乙酸乙酯，得黄色固体；然后用无水乙醇重结晶黄色固体得1.8g第一中间产物，产率为18％。
第二中间产物的合成：将0.69g(3.67mmol)的7-羟基香豆素醛(第一中间产物)放入50mL的圆底烧瓶中，用5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解，在磁力搅拌下加入0.4g(3.67mmol)的二氨基苯硫酚和0.6g(3.15mmol)的偏亚硫酸钠，加热至120℃，搅拌反应3h后停止反应；将反应液冷却至室温，加入50ml去离子水使固体析出，过滤并用去离子水洗涤，真空干燥，得到淡黄色固体(第二中间产物)0.92g，产率为90％
式(I)所示化合物(香豆素类荧光探针)的合成：将第二中间产物(0.3780g，1.28mmol)和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(0.4532g，1.536mmol)溶于20mL乙腈溶液中，在磁力搅拌下加入碳酸钾(0.5307g，3.84mmol)，将混合液加热回流，搅拌反应20h后停止反应，得到反应产物。将得到反应产物减压浓缩，然后用乙醇重结晶得白色固体得0.23g，产率为35.2％。
分别对第一中间产物、第二中间产物和式I所示化合物(香豆素类荧光探针)进行1H-NMR谱图测定，测试结果分别如图1，图2和图3所示。
实施例2：香豆素类荧光探针L对ONOO-的选择性检测
配置摩尔浓度为1.0mmol/L的香豆素类荧光探针二甲亚砜标准液；
在DMSO和PBS混合缓冲溶剂(v:v＝80:20)中，并向其中分别加入香豆素类荧光探针二甲亚砜标准液和摩尔浓度为10mmol/L的待测物溶液以及0.7mmol/L ONOO-溶液；搅拌均匀后等待15min检测溶液的荧光发射光谱变化；
其中，待测物包括：Al3+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Pb2+、Zn2+、Cys、GSH、Hcy、HNO3、NO、tBnoo·、H2O2、·OH、ClO-；
如图4所示，在不加入任何待测物时，荧光探针L溶液在500nm处几乎没有发射峰，当加入ONOO-后，荧光探针溶液在500nm处出现了很强的发射峰，加入其他待测物时，Al3+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Pb2+、Zn2+、Cys、GSH、Hcy、HNO3、NO、tBnoo·、H2O2、·OH、ClO-后，荧光探针溶液在500nm处没有发射峰，故实验结果表明，只有ONOO-，才能引起荧光探针溶液在500nm处出现明显的荧光增强，且对ONOO-的效果极好。该香豆素类荧光探针在DMSO:PBS＝80:20的缓冲溶液(pH＝7.40)中对ONOO-具有很好的单一选择性。
实施例3：香豆素类荧光探针L对ONOO-识别竞争实验：
在DMSO和PBS混合缓冲溶剂(v:v＝80:20)中，向其中分别加入香豆素类荧光探针二甲亚砜标准液，再分别加入10mmol/L的其他待测物(Al3+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Pb2+、Zn2+、Cys、GSH、Hcy、HNO3、NO、tBnoo·、H2O2、·OH、ClO-)，检测溶液的荧光发射光谱分别取500nm处的荧光发射强度，然后再向以上各个含有待测物的溶液中加入0.7mmol/L的ONOO-，搅拌均匀15min后检测溶液的荧光发射光谱分别取500nm处的荧光发射强度，作图结果如图5所示(图中1-19分别对应Al3+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Pb2+、Zn2+、Cys、GSH、Hcy、HNO3、NO、tBnoo·、H2O2、·OH、ClO-)。由图5所知，共存的其他待测物对ONOO-的荧光识别没有干扰，探针的抗干扰能力强。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种香豆素类荧光探针，其特征在于，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：
2.一种权利要求1所述香豆素类荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将7-羟基香豆素与六次甲基四胺，溶于乙酸溶剂，70～100℃温度条件下反应，反应结束后降温至70℃以下，加入盐酸调节体系pH值至2-5，乙酸乙酯萃取，乙醇重结晶得到如式(Ⅰ’)所示结构的第一中间产物；
S2.将所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶剂，110～120℃温度条件下反应，反应结束后加水析出固体，过滤得到如式(Ⅱ)所示结构的第二中间产物；
S3.将所述第二中间产物、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯和碳酸钾溶于乙腈溶剂，在70～90℃反应，反应完毕后减压浓缩反应得到的产物，乙醇重结晶得到所述香豆素类荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，7-羟基香豆素与六次甲基四胺的摩尔比为1：(0.55～0.7)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述反应的时间为6～8h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述第一中间产物、2-氨基苯硫酚和偏亚硫酸钠的摩尔比为1：(1～1.2)：(0.86～1)。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述反应的反应时间为1～3h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，第二中间产物、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯以及碳酸钾的摩尔比为1:(1～1.5)：(2.5～3.5)。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述反应的反应时间为20～24h。
9.权利要求1所述的香豆素类荧光探针或权利要求2至8任意一项所述制备方法得到的香豆素类荧光探针在过氧亚硝酸盐的体外荧光检测中的应用。
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