CN111840554B - 防止或减轻rtPA用药后出血转化的方法和药物 - Google Patents

Abstract

本申请涉及药物的应用，其通过干预外周血免疫细胞来减轻与rtPA治疗脑梗死相关的出血转化。更具体地，本申请应用能减少外周血免疫细胞迁移的CCL抑制剂和整合素α4抑制剂，来减少与rtPA用药相关的出血转化。

Description

防止或减轻rtPA用药后出血转化的方法和药物

技术领域

本发明涉及防止或减轻重组组织型纤溶酶原激活物(rtPA)用药后出血转化的方法和药物。

背景技术

组织型纤溶酶原激活物(tPA)是人体内正常存在的分子，除了如名称所示能促进纤溶酶原的激活之外，还有多种其他活性，例如可作为细胞因子，促进内皮细胞表达促炎分子和促血脑屏障渗漏分子(如基质金属蛋白酶，简称MMP)。

rtPA是迄今唯一获批用于脑梗死的静脉溶栓的药物(商品名阿替普酶，由Boehringer供应中国市场)。但rtPA用药有严重副作用，例如出血转化，这可明显加重病人临床症状，甚至导致死亡。目前临床对于rtPA治疗脑梗死患者相关的出血转化尚无预防措施，只能在发现出血转化之后采取支持疗法，包括减少使用改善循环的药物、脱水降颅压等，但疗效不确切。

一般认为，rtPA导致脑梗死患者出血转化的机制是，rtPA作用于脑内血管结构，导致血脑屏障完整性的降低和血管外基质(ECM)的溶解。在本申请之前，没有人认识到，rtPA对外周免疫细胞有直接作用，而这种直接作用对出血转化有影响。本申请人发现了这种直接作用，明确了免疫细胞参与脑梗死后出血转化病理损害的事实，并找到了能减轻与rtPA用药相关的出血转化的方法和药物。

发明内容

本申请涉及减轻rtPA用药后出血转化的方法和药物。本文中，“出血转化”是指rtPA用药后继发的出血，例如脑实质出血。

本申请人发现，脑梗死后进行静脉rtPA溶栓治疗，可以引起外周血免疫细胞的快速反应，通过向中枢神经系统的迁移加重了血脑屏障的破坏和出血转化，因此rtPA对外周免疫细胞的活化可以作为减少rtPA治疗脑梗死相关出血转化的一个新靶点。

为此，本申请涉及通过干预外周免疫细胞来减轻与rtPA用药相关的出血转化的方法。优选地，所述干预是抑制外周血免疫细胞的迁移。

本文中，“免疫细胞”是指一般意义上的属于免疫系统的细胞。优选地，本申请的免疫细胞是在脑梗死部位及其周围血管中可见或增多的免疫细胞，或者是在出血转化区域可见或增多的免疫细胞。

相应地，本申请涉及免疫细胞迁移抑制剂在制备预防rtPA用药后出血转化的药物中的用途。优选地，所述rtPA用药是为了治疗脑梗死。

本文中，“免疫细胞迁移抑制剂”简称“迁移抑制剂”，是指减少或阻止外周血免疫细胞迁移的化合物或组合物。单独一种迁移抑制剂可以特异性抑制一种外周血免疫细胞的迁移，但更优选抑制不止一种外周血免疫细胞的迁移，例如抑制两种或两种以上、三种或三种以上、或者四种或四种以上外周血免疫细胞的迁移。

另一方面，本申请还涉及免疫细胞迁移抑制剂与rtPA的药物组合，是用于脑梗死且预防出血转化的药物组合。

又一方面，本申请涉及免疫细胞迁移抑制剂与rtPA联合用药，用于脑梗死病人且预防出血转化。

还有一方面，本申请涉及防止或减少出血转化的方法，是先给药免疫细胞迁移抑制剂再给药rtPA，或同时给药。

本申请免疫细胞迁移抑制剂的例子有，趋化因子抑制剂和整合素α4抑制剂。

本申请的趋化因子抑制剂通过结合趋化因子或抑制趋化因子活性，使原本要受趋化因子驱动而迁移的免疫细胞不发生或少发生迁移。

优选地，趋化因子抑制剂是CCL抑制剂。CCL是具有CC结构的趋化因子，其氨基端的头两个半胱氨酸(C)彼此相连、未间隔其它氨基酸。这种CC结构区别于CXC和CX₃C结构，后两者是其N端头两个C之间分别插有一个或三个其它氨基酸。本申请的CCL抑制剂能结合CCL或抑制CCL的趋化活性。

现已知的CCL趋化因子超过20种以上，它们分别能趋化不同的免疫细胞，并且单独一种CCL能趋化一种或一种以上的免疫细胞。例如，CCL2可趋化单核/巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞，CCL3和CCL7可趋化单核/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞，CCL8可趋化单核/巨噬细胞，等等。相应地，单独一种CCL抑制剂可以抑制一种或一种以上CCL，例如抑制两种或两种以上、三种或三种以上、或者四种或四种以上CCL的作用。例如，Bindarit作为一种CCL抑制剂，能抑制CCL2、CCL7、CCL8三者。

本申请的整合素α4抑制剂简称“α4抑制剂”，是指与α4整合素(即含α4亚基的整合素)结合或抑制α4整合素的化合物或组合物。整合素属于细胞表面粘附分子家族的一员，主要由α亚基和β亚基非共价结合成异二聚体多肽。目前已发现的α、β亚基各有超过10种以上。例如，α4亚基可以与多种β亚基结合，故本文的“α4整合素”或“含α4亚基的整合素”包括α4亚基与不同β亚基结合而成的整合素，常见的例如α4β1整合素、α4β7整合素。α4β1在所有的循环白细胞表面表达，可介导单核细胞和嗜酸性粒细胞与内皮细胞的粘附及其穿越内皮的迁移行为。故，对整合素的α4亚基进行阻断，可减少免疫细胞向病灶组织的浸润。α4β7在T细胞、B细胞、自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞上表达，可参与肠相关淋巴组织中的白细胞聚集。

本申请α4抑制剂的例子有，抗α4整合素的抗体或可溶型α4配体等。

在一个优选方面，本申请的抗α4整合素抗体是特异性抗α4亚基的抗体。例如，所述抗体与α4整合素的α4亚基结合、和/或至少部分地抑制α4整合素的活性(尤其结合活性或信号转导活性)，如抑制α4整合素与VCAM-1或与纤连蛋白的结合。

抗α4亚基的抗体的一个实例是抗α4单克隆抗体。

在另一优选方面，本申请的抗α4整合素抗体可以特异性针对一种α4整合素，也可以同时针对一种以上α4整合素，例如同时抗α4β1和α4β7的抗体。优选地，不管能抗几种α4整合素，本申请的抗α4整合素抗体都能有效抑制含α4亚基的整合素与其配体的结合。

本申请的可溶型α4配体包括可溶性VCAM-1、其活性片段、或VCAM-1融合蛋白，例如双功能VCAM-1/Ig融合蛋白。例如，可溶型α4配体优先竞争细胞表面的α4整合素结合位点，引起与施用抗α4整合素抗体等效的作用。

本申请的α4抑制剂还包括能结合α4配体但不激发α4整合素依赖性信号传递的可溶性α4整合素变体，它可作为野生型α4整合素的竞争抑制剂。

本申请的α4抑制剂还包括抗α4整合素的抗体或可溶型α4配体与其它分子的融合体，所述其它分子例如免疫球蛋白(Ig)分子、Fc片段、免疫球蛋白重链C末端结构域、聚亚烷基二醇聚合物例如PEG，等等。

本申请人取大鼠血液经体外处理制成血栓，再通过外科手术将该血栓导入大鼠大脑中动脉，建立了血栓栓塞性大鼠脑梗死模型。在造模后3小时之时，先是注射本申请的迁移抑制剂，不间隔地接着注射rtPA进行溶栓。

在rtPA注射前以及注射后不同时点，分别从大鼠尾静脉和脑组织取样，分析多种免疫细胞亚群的数量(图1和3)，还用CD69来标记血样中活化的淋巴细胞的数量(图2)。已知CD69是最快响应免疫细胞活化信号的一种跨膜糖蛋白分子，因此，CD69⁺细胞数的变化反映了相应细胞亚群的活化状态。另外，用流式细胞术分析血样中外周血免疫细胞表达rtPA结合受体的情况(图4)。

在手术后24小时之时，通过核磁扫描得出脑梗死体积和出血转化的体积，其中一组平面影像示于图11中；还通过神经功能缺损评分来反映急性期的神经功能缺损症状(图7和10)。

在手术后直至28天时，通过定期的行为实验，来检查大鼠远期的神经功能恢复状况(图7和10)。

结果，本申请人发现，rtPA用药后不久，外周血免疫细胞数量大大增多(图1)，多种免疫细胞快速活化(图2)。例如，rtPA用药后仅仅过了1小时，就有中性粒细胞、单核细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、和B细胞的数量明显增多(图1和2)。而这个时间点，还远未到出血转化出现的时候。

如此快速的响应，可归因于多种免疫细胞表面有rtPA结合分子存在。一旦rtPA输入静脉，马上就能借由这些分子而与免疫细胞结合。例如，已知膜联蛋白A2和低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP 1)是体内可与rtPA结合的细胞表面受体。本申请人通过流式细胞术发现，外周血免疫细胞中表达膜联蛋白A2的细胞占比较高，例如，约40％的中性粒细胞、单核细胞和CD4⁺T，约80％的CD8⁺T细胞和B细胞都表达膜联蛋白A2；表达LRP1的细胞也不少，例如，约12％的中性粒细胞和单核细胞、近30％的B细胞都表达LRP1(图4)。可见，静脉输入的rtPA确实有直接与免疫细胞结合的途径。

相信本领域技术人员能理解，外周血免疫细胞如此快速的增多，可以使途经脑梗死区域血管的免疫细胞也大大增多。当这些细胞响应脑梗死而穿越脑血管壁、去发挥清除破损组织的作用时，就有可能加重血管壁的损伤，并因此导致或加重出血转化。即，静脉输入的rtPA可通过直接作用于外周血免疫细胞来影响脑梗死后出血转化。rtPA的这种直接作用比已知引起出血转化的其它因素要更早起效。如果能尽早形成不利于外周血免疫细胞的迁移的条件，就可以减少抵达脑组织的免疫细胞数量，减轻出血转化的发生或者程度。

为此，本申请人给脑缺血模型大鼠分别施用了α4单克隆抗体和CCL抑制剂，再注射rtPA。结果发现，与各自对照组相比，出血转化减少且脑水肿减轻(图5和8)、神经功能改善(图7和10)，相应影像学也有改善(图11)。

鉴于α4单克隆抗体和CCL抑制剂在化学结构、作用机制、和靶向的免疫细胞个数及种类上都有明显差异，但都获得了减少出血转化的结果，本申请人相信，通过抑制外周血免疫细胞来抑制出血转化的思路广泛适用于多种不同的迁移抑制剂。并且，无需要求该抑制剂只针对一种免疫细胞而发挥迁移抑制作用。

附图说明

图1.脑缺血大鼠rtPA用药前后，外周血中性粒细胞、单核细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的数量(10⁴/mL)随时间的变化，反映了rtPA用药对外周血免疫细胞的影响。手术组+rtPA：通过手术建立脑缺血模型，术后3小时注射rtPA；手术组+生理盐 水：通过手术建立脑缺血模型，术后3小时注射生理盐水；假手术组+rtPA：进行同样的手术操作但未放置血栓，术后3小时注射rtPA；假手术组+生理盐水：进行同样的手术操作但未放置血栓，术后3小时注射生理盐水。

图2.脑缺血大鼠rtPA用药前后，外周血各种CD69⁺免疫细胞的数量(10³/mL)随时间的变化，反映了rtPA用药对外周血免疫细胞活化的影响(分组同图1)。

图3.脑缺血大鼠rtPA用药后，脑组织各种免疫细胞的数量(10⁴/mL)随时间的变化，反映了rtPA用药对免疫细胞向脑内迁移的影响(分组同图1)。

图4.流式细胞术检测结果，显示大鼠外周血不同免疫细胞亚群的膜联蛋白A2表达和LRP1表达。

图5.脑缺血大鼠rtPA溶栓前给予α4单克隆抗体，在缺血后24小时之时测定的出血转化体积(mm³)和梗死侧脑水肿占比(％体积，是梗死侧半球体积相比于对侧半球体积增加的部分占对侧半球体积的百分比)。α4单克隆抗体+rtPA：缺血后3小时注射α4单克隆抗体，接着注射rtPA；同型IgG+rtPA：缺血后3小时注射与α4单克隆抗体同型的IgG(IgG2a同型对照抗体)，接着注射rtPA。

图6.流式细胞术检测α4单克隆抗体对于脑内浸润的免疫细胞数量的影响。(分组同图5)

图7.脑缺血大鼠rtPA溶栓前给予α4单克隆抗体，在缺血后24小时之时得出的改良神经功能缺损评分，反映了溶栓后急性期神经功能缺损的状况；在缺血后1、3、7、14、28天时进行的运动感觉神经功能评价，反映了远期感觉运动神经功能的恢复状况(分组同图5)。

图8.脑缺血大鼠rtPA溶栓前给予CCL抑制剂，在缺血后24小时之时测定的出血转化体积(mm³)和梗死侧脑水肿占比(％体积)。CCL抑制剂+rtPA：缺血后3小时注射CCL抑制剂，接着注射rtPA；溶剂+rtPA：缺血后3小时注射溶剂，接着注射rtPA。

图9.流式细胞术检测CCL抑制剂对于脑内浸润免疫细胞数量的影响。(分组同图8)

图10.脑缺血大鼠rtPA溶栓前给与CCL抑制剂，在缺血后24小时之时得出的改良神经功能缺损评分，反映了溶栓后急性期神经功能缺损的状况；在缺血后1、3、7、14、28天时进行的运动感觉神经功能评价，反映了远期感觉运动神经功能的恢复状况(分组同图8)。

图11.典型核磁梗死区(第1排，梗死部位如虚线框所示)，出血转化区(第2排，出血部位如箭头所示)，分组同图5或图8。

实施例

1、脑梗死后rtPA治疗相关出血转化模型的制备

取成年雄性Wistar大鼠股动脉血液，将其吸入PE50管子，26℃放置2小时后，置于4℃冰箱过夜。次日，将含有大鼠血栓的PE50剪成4cm长的分段，用含生理盐水的注射器将血栓冲出，置于生理盐水中，然后用PE10管子反复冲洗血栓。冲洗完成后，将制备好的血栓吸入提前烧制拉长的PE50管子中，管子前端直径为0.3mm左右。

将大鼠麻醉后置于手术台，固定，消毒颈部皮肤，切开皮肤后，暴露右侧颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉。然后将含有制备好的血栓的导管自颈总动脉插入颈内动脉，直至大脑中动脉起点，用微量注射器将血栓缓慢注入，然后抽出导管，结扎血管的皮肤切口。

在造模3小时后，在大鼠微静脉置入静脉导管，按10mg/kg体重输入rtPA，前10％团注，剩余90％在30分钟内逐渐输入。

2、药物的制备

CCL2抑制剂bindarit(CAS 130641-38-2，购于Selleckchem)溶于0.5％羧甲基纤维素(“溶剂”)，按50mg/kg体重灌胃给药，对照组给予该溶剂。

α4单克隆抗体(MRα4-1，BD Bioscience)是小鼠抗大鼠CD49d单抗。CD49d本身是整合素的α亚基，其构成α4β1异二聚体的α亚基部分。因此，抗CD49d单抗特异性针对整合素的α4亚基。将该单抗按1mg/只腹腔注射，对照组给予小鼠IgG2a同型对照抗体。

以上两种迁移抑制剂的给药时间都是缺血后3小时、rtPA静脉注射前。

3、实验方法

在rtPA注射前、rtPA注射后15分钟、rtPA注射后1小时、rtPA注射后4小时、以及rtPA注射后12小时，分别采大鼠外周血进行免疫细胞亚群分析，同时还分析全脑组织中向脑内浸润的免疫细胞亚群数目(流式细胞术，每组大鼠8只)。

在缺血后24小时之时，用核磁扫描评价大鼠脑梗死体积和出血转化的体积。用改良神经功能缺损评分(mNSS)来评价大鼠急性期神经功能缺损症状。

缺血后后1、3、7、14、28天，用粘纸揭除试验和转角试验来评价大鼠远期感觉运动功能的恢复。

4、实验结果

4.1rtPA用药对脑缺血大鼠外周血免疫细胞亚群的影响

如图1所示，与大鼠脑缺血后3小时之时(此时尚未注射rtPA)的数据相比，rtPA注射后1小时之时，手术组+rtPA相比于其它三组，外周血的中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的数目明显增加。两个手术组在单纯缺血阶段(没加rtPA)，单核细胞数目就已递增(因为脑缺血的刺激)，但rtPA注射后1小时的细胞数增幅更明显。

如图2所示，一方面，与缺血后3小时相比，rtPA注射后15分钟和1小时之时的各类D69⁺免疫细胞的数量都大大增加；另一方面，虽然缺血本身引起D69⁺免疫细胞的数量增加，但在相同时间点，rtPA注射比生理盐水注射引起的D69⁺免疫细胞数的增幅更大。

综上可见，大鼠脑缺血后，静脉输入rtPA引起不止一种免疫细胞的快速活化和外周血免疫细胞数的大大增多。

4.2rtPA用药对免疫细胞向脑内迁移的影响

如图3所示，自rtPA输入后，随着时间的进展，脑缺血大鼠脑内免疫细胞的数量随时间而增加，每一种免疫细胞都是如此。这说明，源源不断地有免疫细胞从外周循环进入脑内。图3还显示，每个时段都是rtPA注射组的细胞数比生理盐水注射组的明显更多。这说明，rtPA用药确实增加了免疫细胞向脑内的迁移。

4.3 rtPA受体在外周免疫细胞上的表达

如图4所示，中性粒细胞、单核细胞、CD4⁺T细胞都有大约40％占比的细胞表达膜联蛋白A2，而CD8⁺T细胞和B细胞群体中表达膜联蛋白A2的细胞占比更高达80％。这说明，膜联蛋白A2在多种免疫细胞中广泛且高水平的表达。至于另一种受体LRP1，可在10-13％的中性粒细胞、单核细胞、和自然杀伤细胞中找到，B细胞群体甚至有将近30％的细胞表达LRP1。静脉输入的rtPA可以通过表面的膜联蛋白A2和/或LRP1而与免疫细胞结合，这更说明，rtPA可通过直接作用于外周免疫细胞而影响脑缺血后出血转化。

4.4对出血转化的疗效

如图5所示，与同型IgG+rtPA组相比，rtPA用药前给予α4单克隆抗体，抑制了免疫细胞与内皮细胞的相互作用，使缺血后24小时之时的出血转化体积明显减少，缺血侧脑水肿也明显减轻，流式数据显示，α4单克隆抗体明显抑制了淋巴细胞向脑内的浸润(图6)。如图7所示，与同型IgG相比，α4单克隆抗体减轻了缺血后24小时的神经功能缺损症状，并促进了远期的感觉运动神经功能的恢复。

如图8所示，与溶剂+rtPA对照组相比，rtPA用药前给予CCL抑制剂使缺血后24小时之时的出血转化体积明显减少，缺血侧脑水肿体积也明显减小，CCL抑制剂明显减少了中性粒细胞，单核细胞向脑内的浸润(图9)。如图10所示，与单纯rtPA溶栓组相比，rtPA用药前给予CCL抑制剂使缺血后24小时之时的神经功能缺损症状得到改善，远期感觉运动神经功能恢复得更好。

图11显示了经不同处理的大鼠的典型核磁影像。在第一排的核磁影像中，虚线框出了梗死区。第二排的核磁影像中，箭头所指为出血转化区。可见，α4单克隆抗体和CCL抑制剂分别比各自的对照引起更少的出血转化区分布，且单个出血转化区的体积更小。

以上对本申请进行了详细说明，但所述内容仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在权利要求范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.α4单克隆抗体在制备预防阿替普酶用药后出血转化的药物中的应用。

2.一种预防阿替普酶用药后出血转化的药物组合物，其特征在于，由α4单克隆抗体与阿替普酶组成。

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