CN111836878A - 改进的细胞培养装置 - Google Patents

Abstract

描述了一种减少或防止球状体团聚的方法，所述方法包括使用细胞培养装置，所述细胞培养装置包括：细胞培养室，所述细胞培养室包括底部和从所述底部延伸以包围所述细胞培养室的体积的侧壁；所述细胞培养室的所述底部或所述侧壁中的适于流体连通到所述室中的入口；细胞培养室的所述底部或所述侧壁中的适于流体连通到所述室外的出口；其中所述细胞培养室的所述底部包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

Description

改进的细胞培养装置

技术领域

本发明涉及细胞培养装置、其方法和用途。用于本公开的一种特定的细胞培养类型是3D器官型细胞或组织，也称为球状体。

背景技术

使用2维细胞培养系统的毒理学研究已用于检验一种或多种试剂(例如，药物)对细胞存活和酶活性等的影响。虽然使细胞在塑料表面上呈平坦层生长是简明易懂的并且允许对细胞生理学和对刺激的反应的若干方面进行研究，但此类细胞培养未能反映出器官的实际结构和构造。在2维单层中，胞外基质、细胞与细胞和细胞与基质的相互作用消失，这些相互作用是分化、增殖和细胞功能必不可少的。

3维培养系统可以形成具有与体内.观察到的特征相似的特征的功能组织。与2维培养系统相比，3维细胞培养允许细胞在所有三个维度上与其周围环境相互作用，并且是更生理学相关的。此类细胞培养可以在活力、增殖、分化、形态、对刺激的反应、药物代谢、基因表达和蛋白质合成等等方面显示出改善。3维细胞培养可以比传统2维细胞单层更生理学相关的方式产生特定的组织样结构，并模拟真实组织的功能和反应。

已经开发了用于2维和3维细胞培养的不同技术。3维细胞培养方法包括使用悬滴板、磁悬浮或生物材料支架。

在一种球状体制备方法中，将细胞接种到孔中，然后使其在孔的底部聚集。一旦细胞形成团聚体，它们将在每个孔中形成单个或多个球状体。从这里开始，可以将球状体用于任何所需目的(诸如在评估球状体的实验中)，这可以包括它们的活力、形态或功能等。

本发明寻求提供与3维细胞培养有关的改进。

发明内容

本发明人一直在研究3维细胞培养。出乎意料的是，他们观察到，在3维细胞培养过程中，球状体可能会在同一位置团聚或融合在一起，形成单个大组织。这可能是有问题的，因为当球状体融合在一起时，它们会形成较大的组织。这意味着几乎不可能确切地确定该较大的组织中存在的球状体的数量，这意味着该组织不能用于其他实验，在这些实验中，知道球状体的精确数量非常重要。在不希望受理论束缚的情况下，发明人已观察到，与朝向球状体外侧定位的细胞相比，球状体中间的细胞较少触及营养物，使得朝向球状体中间的细胞倾向于死亡。当球状体团聚时(这可能在细胞培养5小时后发生)，这将非常成问题，因为球状体中的细胞数量越多，触及营养物的机会就越少。这也进一步增加了球状体内死细胞的数量。这可能由于许多原因而成为问题，包括：(1)从死细胞释放的分子可能对球状体中的其他细胞产生负面影响；(2)死细胞不具有代谢活性，因此球状体的代谢活性将会降低；(3)许多检测要求使用单个球状体或已知数量的球状体。本发明的发明人试图解决在3维细胞培养中球状体团聚的问题。他们令人惊讶地发现，可以通过在细胞培养室的底部(诸如多孔板的孔)上形成不连续表面，使得在该室中的不连续表面上的球状体捕获在不连续表面中，从而很好地解决该问题。这有效地减少了球状体的团聚或融合程度或防止了球状体的团聚或融合。有利地，发明人发现根据本公开球状体可以保持为单独的单个球状体。

在本发明的一个方面，公开了一种减少或防止球状体团聚的方法，该方法包括使用细胞培养装置，该细胞培养装置包括：细胞培养室，该细胞培养室包括底部和从该底部延伸以包围细胞培养室的体积的侧壁；细胞培养室的底部或侧壁中的适于流体连通到室中的入口；细胞培养室的底部或侧壁中的适于流体连通到室外的出口；其中细胞培养室的底部包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

在本发明的一个实施方案中，该方法包括：(i)提供一个或多个单独的球状体；(ii)将所述一个或多个单独的球状体转移到细胞培养装置的细胞培养室中；(iii)在细胞培养装置中温育所述一个或多个单独的球状体；(iv)在细胞培养装置的不连续表面上获取所述一个或多个单独的球状体。

在本发明的一个实施方案中，在步骤(ii)中转移已知数量的单独的球状体，并且在步骤(iv)中获取已知数量的单独的球状体。

在本发明的一个实施方案中，不连续表面包括多个凹槽，其中所述凹槽的深度和宽度在约200至约1000μm之间，适当地，在约200至约600μm之间。

在本发明的一个实施方案中，凹槽在细胞培养室的底部上形成多个同心环。

在本发明的一个实施方案中，其中不连续表面包括具有封闭的底部和开放的顶部的多个孔洞，所述孔洞的尺寸在深度和宽度上对应于比球状体的最大直径大约10％。

在本发明的一个实施方案中，细胞培养室由PEEK制造。

在本发明的一个实施方案中，细胞培养室被适当地涂覆，其中涂层是聚(对二甲苯)聚合物的涂层。

在本发明的一个实施方案中，将约40至约100个球状体转移到细胞培养装置的细胞培养室中。

在本发明的一个实施方案中，将培养基流适当地施加到细胞培养装置的细胞培养室中，其中流速在约10至约1000μL/min之间。

在本发明的另一方面，公开了细胞培养装置用于减少或防止球状体团聚的用途，所述细胞培养装置包括：细胞培养室，该细胞培养室包括底部和从该底部延伸以包围细胞培养室的体积的侧壁；细胞培养室的底部或侧壁中的适于流体连通到室中的入口；细胞培养室的底部或侧壁中的适于流体连通到室外的出口；其中细胞培养室的底部包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

本发明的另一方面，公开了一种多孔细胞培养板，其中该多孔细胞培养板的孔中的至少一个和/或包含在该多孔细胞培养板的孔中的至少一个中的插入物包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

在本发明的另一方面，公开了一种在多孔细胞培养板中使用的插入物，该插入物包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

在一个实施方案中，板和/或插入物由PEEK制造。

在一个实施方案中，孔中的至少一个和/或插入物被适当地涂覆，其中涂层是聚(对二甲苯)聚合物的涂层。

在一个实施方案中，至少一个孔和/或插入物包括单独的单个球状体。

在一个实施方案中，细胞培养室的底部为大致圆形形状

在一个实施方案中，底部的直径在约6mm±5％至约22mm±5％之间，适当地，其中底部的直径为约6mm±5％、约11mm±5％、约16mm±5％或约22mm±5％。

在一个实施方案中，不连续表面包括多个凹槽，其中凹槽的深度和宽度对应于球状体的最大直径±10％。

在一个实施方案中，多个凹槽的深度和宽度在约200至约1000μm之间，适当地，在约600至约1000μm之间。

在一个实施方案中，凹槽在细胞培养室的底部上形成多个同心环。

在一个实施方案中，不连续表面包括具有封闭的底部和开放的顶部的多个孔洞，所述孔洞的尺寸在深度和宽度上对应于球状体的最大直径约10％。

在一个实施方案中，细胞培养室包括用于培养球状体的细胞培养基。

在一个实施方案中，细胞培养室包括捕获在细胞培养室的不连续表面中的单独的球状体。

在一个实施方案中，球状体是肺球状体。

在一个实施方案中，当细胞培养室中存在流体时，从细胞培养室的入口到出口的流体流量在约10至约1000μL/min之间，适当地，约1至约500μL/min，适当地，为约40μL/min。

在一个实施方案中，细胞培养室中的剪切应力小于约0.1达因/cm²(诸如约0.08达因/cm²或更小或约0.04达因/cm²)

在一个实施方案中，细胞培养装置是多孔板，并且所述多孔板的每个室是孔，所述多孔板包括至少两个孔。

在一个实施方案中，室中的至少一个的底部包括连续的平坦表面。

在一个实施方案中，至少一个室包括定位在室的底部上方的插入物，适当地，其中该插入物位于室内部的可渗透膜的顶部，以形成能够在空气/液体界面处培养细胞的表面。

在一个实施方案中，包括连续的平坦表面的至少一个室的深度与包括不连续表面的至少一个室的深度不同，适当地，其中包括连续的平坦表面的至少一个室的深度小于包括不连续表面的至少一个室的深度。

在一个实施方案中，细胞培养室包括用于在空气-液体界面处培养细胞的细胞培养基。

在一个实施方案中，细胞培养室包括定位在可渗透膜上的细胞，所述细胞能够在空气-液体界面处生长。

在一个实施方案中，细胞是肺细胞。

在一个实施方案中，至少两个孔彼此流体连通。

适当地，不连续表面如本文所定义。

适当地，使用计算机数控加工或注射成型将不连续表面提供到底部。

适当地，该装置是多孔板。

适当地，该室是孔。

附图说明

图1是具有多个同心凹槽的孔的横截面，所述多个同心凹槽用于捕获单独的球状体(在图4中标记为“参见细节B”)。尺寸单位为毫米。

图2是具有多个同心凹槽的孔的平面图，所述多个同心凹槽用于捕获单独的球状体(在图4中标记为“参见细节B”)。尺寸单位为毫米。

图3是包含微流体通道的孔的平面图(在图4中标记为“参见细节C”)。尺寸单位为毫米。

图4是多孔板的平面图，该多孔板包含具有用于捕获单独的球状体(标记为“参见细节B”)的多个同心凹槽的孔和包含插入物(标记为“参见细节C”)的孔。所述孔通过通道连接，使得第一孔(“参见细节B”)和第二孔(“参见细节C”)中的每一个彼此流体连通。尺寸单位为毫米。

图5是图4中的线C-C的剖视图。

图6是在底部具有多个孔洞以实现捕获单独的球状体(在图8中标记为“参见细节B”)的功能的孔的横截面。

图7是具有如图6所示用于在底部捕获单独的球状体的多个孔洞的孔的平面图。尺寸单位为毫米。

图8是多孔板的平面图，该多孔板包含具有用于捕获单独的球状体(标记为“参见细节B”)的多个孔洞的孔和包含插入物(标记为“参见细节C”)的孔。所述孔通过通道连接，使得第一孔(“参见细节B”)和第二孔(“参见细节C”)中的每一个彼此流体连通。尺寸单位为毫米。

图9是图8中的线C-C的剖视图。

图10示出了如图所示为两个不同的孔中的每一个计算的剪切应力的结果以及用于计算剪切应力的参数。

图11(a)示出了团聚的球状体。图11(b)示出了根据本公开获得的单独形式的非团聚球状体。

图12示出了在4℃下温育8小时后，PEEK板和PDMS板中残留的烟碱的量的比较图。

具体实施方式

除非另有说明，否则本公开的实践采用工程、微工程、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。这类技术在例如以下文献中充分解释：Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,HumanaPress；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.CeIMs编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编,1987)；Introduction to Cell and TissueCulture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,IB.Griffiths和D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley andSons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等人编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)。除非另有说明，否则采用市售试剂盒和试剂的程序通常将根据制造商确定的方案使用。

本文中使用的技术术语和表达一般被赋予在分子生物学、微生物学、细胞生物学和生物化学的相关领域中经常应用于它们的含义。所有以下术语定义适用于本申请的整个内容。

如本文所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/种”和“该/所述”既包括单数指代物也包括复数指代物。

术语“和/或”意指(a)或(b)或者(a)和(b)两者。

如本文所用，术语“包括”与“包含”或“含有”同义，并且是包括性的或开放式的，且不排除其他未引述的成员、要素或方法步骤。

术语“由……组成”意指排除其他组分，并且仅具有所引述的要素且不具有其他要素。

通过端点进行的数值范围表述包括被纳入各自范围内的所有数字和分数，以及所引述的端点。

如本文所用，当提及诸如参数、量、时间持续期等等的可测量值时，术语“约”意味着涵盖指定值的和从指定值的变化，尤其是指定值的和从指定值的+/-10％或更少、优选地+/-5％或更少、更优选地+/-1％或更少、以及还更优选地+/-0.1％或更少的变化，只要这些变化适合于在本公开中实施即可。应当理解，修饰词“约”所指代的值本身也是明确地且优选地公开的。

尽管术语“一个或多个”，诸如一组成员中的一个或多个成员本身是明确的，但是通过进一步的例证，该术语尤其涵盖对所述成员中的任一者，或对所述成员中的任两者或多者，例如所述成员的任三者、四者、五者、六者或七者等，以及最多所有所述成员的提及。

细胞培养

细胞培养一般是指在人造环境中生长前从组织移出细胞。可以直接从含有待培养的细胞的组织移出待培养的细胞，并且任选地在培养前用酶或机械方式处理。作为替代，待培养的细胞可以来源于先前建立的细胞株系或细胞系。

细胞的体外培养为研究细胞的各个方面提供了必要的材料，所述各个方面包括：生理学；生物化学；试剂(包括气溶胶)的作用；试剂的筛选和开发或优化；试剂功效的研究；试剂吸收的研究；毒性筛选；毒理学；目标发现；药代动力学；药效学；以及再生医学。

细胞通常在包括室或容器的细胞培养装置中生长。此类细胞培养装置的实例包括瓶、皿和板(诸如微量滴定板、多孔板或微孔板)、烧瓶(诸如普通烧瓶和多层细胞生长烧瓶)、器皿和生物反应器。培养中的细胞通常会附着在浸没在合适的细胞培养物或维持培养基中的容器底部并在其底部生长。室或容器将包括用于引导细胞培养基流入和流出室或容器的孔口。

本公开的细胞培养装置包括细胞培养室，该细胞培养室包括底部和从该底部延伸以包围细胞培养室的体积的侧壁。用于引导细胞培养基流入和流出室的孔口可以包括：(1)细胞培养室的底部或侧壁中的适于流体连通到室中的入口；以及(2)细胞培养室的底部或侧壁中的适于流体连通到室外的出口。该细胞培养室包括如下所述的适于减少或防止球状体的团聚的不连续表面。适当地，入口和出口位于不连续表面的上方。

细胞培养装置

在一个实施方案中，细胞培养装置是平板形式的多孔板，其包括至少两个孔形式(例如，多个或数个孔)的室。通常，整个板是矩形的，根据需要，孔容量可以为几微升至几毫升。

在至少两个孔中的至少一个中，孔的底部包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

多孔板可以以各种格式制造(诸如24孔、48孔、96孔、384孔或1536孔/室格式)，并且由技术人员基于要进行的实验的大小和选择来容易地选择。多孔板可以是可商购获得的并且是技术人员所熟知的标准板。

适当地，当室为孔的形式时，其底部为大致圆形形状。

适当地，底部的直径在约6mm±5％至约22mm±5％之间，适当地，其中底部的直径为约6mm±5％、约11mm±5％、约16mm±5％或约22mm±5％。

多孔板可以被构造成包含至少两个顺序布置的孔。多孔板可以被构造成包含至少两个线性布置的孔。

多孔板中的孔排列成行。例如，8孔板可被构造成2个线性行，每行4个相邻的孔。又如，24孔板可被构造成4个线性行，每行6个相邻的孔。又如，48孔板可被构造成6个线性行，每行8个相邻的孔。又如，96孔板可被构造成8个线性行，每行12个相邻的孔。如果需要，多孔板甚至可以制造或定制，以在板中提供所需数量的孔。

细胞培养装置在装置的顶部可以装配有盖子，这有助于降低细胞培养基的蒸发和污染的风险。盖子优选地不密封，使得空气可以在装置内部循环，这可以有助于细胞的培养/维持。

细胞培养装置的组成没有特别的限制，只要它没有细胞毒性并且适于细胞培养即可。它可以由丙烯酸树脂、聚乙醇酸、苯乙烯型树脂、聚乳酸、丙烯酸或苯乙烯型共聚物树脂、聚碳酸酯树脂、聚乙烯醇基树脂、聚酯基树脂、乙烯或乙烯醇共聚物树脂、氯乙烯树脂、热塑性弹性体、有机硅树脂或其任意组合制造。它可以由聚四氟乙烯(PTFE)、不锈钢(例如，316L/1.4435)、聚醚醚酮(PEEK)、聚丙烯或聚砜或其一种或更多种的组合制造。如果需要，可以施用涂层，诸如聚(对二甲苯)聚合物或聚-2-hema。

在某些实施方案中，特别优选使用PEEK，因为它具有不吸收小分子(诸如烟碱和NNK)的优点，如下所述。

如果需要，可以通过计算机辅助设计(CAD)来设计细胞培养装置，或者，如果细胞培养装置基于标准多孔板，则该标准多孔板将是可商购获得的。CAD板可以使用本领域所熟知的方法通过微机械加工来生产。

细胞培养装置(诸如多孔板)包含在细胞培养室的底部或侧壁中的适于流体连通到室中的入口和细胞培养室的底部或侧壁中的适于流体连通到室外(优选地到邻近的孔中)的出口。这允许流体(诸如培养基)在球状体上流动，并使球状体暴露于流体流。在某些实施方案中，这可以通过例如在细胞培养板的一个或多个孔中形成至少一个孔洞，然后经由一个或多个孔洞将一个或多个孔连接到通道(例如，导管或管道)来实现。在一个实施方案中，一个或多个通道被直接加工或嵌入细胞培养板内部以将至少两个孔连接。适当地，一个或多个通道在细胞培养室下方延伸。通道的两端都可以包含开口。通道可以是微流体通道。通常，开口的至少一端连接到泵。开口的每一端都可以终止于同一个泵或不同的泵。

可以使用多种连接器将通道连接到第一泵。一个实例是鲁尔连接器(诸如鲁尔锁接头)或简单的管连接器。

通道可以被构造成根据需要将第一行孔和第二行孔以及可选地第三行孔等流体连通地连接在一起。通道可以被构造成U形弯头以连接不同行的孔。U形弯头可以位于细胞培养装置的内部或外部。当环路位于细胞培养装置的外部时，则可以使用连接器(诸如鲁尔连接器或鲁尔锁连接器或简单的管连接器)将U形弯头密封并接合到细胞培养装置上。

管材可用于将不同的通道连接在一起，诸如硅管材或

管材。

当流体在通道中传送时，如果需要，可以将其从泵中传送出来，然后再返回到泵中。流体可以根据需要以顺时针或逆时针方式循环通过孔。如果需要，可以使用多于一个泵。

在某些实施方案中，当细胞培养室中存在流体时，从细胞培养室的入口到出口的流体流量为约10至约1000μL/min，适当地约1至约500μL/min，适当地约10至约500μL/min，适当地约40μL/min，或适当地约1至约60μL/min。如本领域技术人员将理解的，当流体在固体边界上方流动时，将在该边界上产生剪切应力，这可能引起暴露于剪切应力的细胞的扰动。在本公开的上下文中，当流体移动通过细胞培养装置时，将产生剪切应力。理想的是，细胞培养室中的剪切应力小于约0.1达因/cm²(诸如约0.08达因/cm²或更小或0.04达因/cm²或更小)，因为这不会引起暴露于剪切应力的细胞的扰动。在不同类型的细胞培养室中，剪切应力可以不同。例如，具有不连续表面的细胞培养室可具有约0.04达因/cm²的剪切应力。例如，具有平坦且连续表面的细胞培养室可具有约0.08达因/cm²的剪切应力。适当地，具有不连续表面的细胞培养室中的剪切应力低于具有平坦且连续表面的细胞培养室中的剪切应力。

为了可以使用光学分析进行筛选，室或容器或孔的底部可以由具有70％或80％或90％或更高的总透光率的材料制造。

在一个实施方案中，细胞培养装置使用一种在本领域中广泛可用的微流体细胞培养板。例如，M04S微流体细胞培养板可从Cellasic(California,USA)获得，并且包含4个独立的孔/室，每个孔/室的直径为2.8mm，高度为120微米。

一方面，本公开的细胞培养装置为多孔细胞培养板的形式。多孔细胞培养板的至少一个孔可以包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。如技术人员将理解的，细胞培养装置(诸如多孔细胞培养板)可以包括可以装配在一起以形成完整细胞培养装置的各种组成部件。在使用中，并非所有这些组成部件都必须存在于装置中。因此，例如，如本文下面所期望的，用于本公开的某些细胞可以任选地在可以容纳于细胞培养板的孔中的插入物中培养。因此，另一方面，还描述了一种在细胞培养装置(诸如多孔细胞培养板)中使用的插入物，该插入物包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。如本文详细描述的，细胞培养装置和/或插入物可以由PEEK制造。细胞培养装置和/或插入物可以如本文详细描述的适当地涂覆，其中涂层是聚(对二甲苯)聚合物的涂层。如本文详细描述的，细胞培养装置和/或插入物可以包括单独的单独的球状体。泵

用于本公开的一个或多个泵可以是可操作以使流体循环的容积泵，诸如蠕动泵。如本领域中所理解的，蠕动泵是用于移动流体的泵。流体可以容纳在本文所述的通道内，该通道可以是装配在泵壳内部的挠性管。替代地，如果将通道直接加工(例如，嵌入)到板上，则可以使用适配器将加工或嵌入的通道连接到泵。附接在泵的外圆周上的转子压缩挠性管或通道。当转子转动时，管或通道的处于压缩下的部分被挤压闭合，以迫使流体通过管或通道。

在一个实施方案中，一个或多个泵包括具有编码器的步进电动机或无刷电动机。

每个电动机可由电动机控制器控制，该电动机控制器的操作和传感器可由微控制器控制。

插入物

根据需要，用于本公开的某些细胞可以在可以容纳于细胞培养装置的孔中的插入物中培养。细胞通常在插入物中包含的可渗透膜上生长。一般来讲，细胞将在可渗透膜的顶部生长。插入物放置在孔或室中。当孔或室中充满流体(诸如细胞培养基)时，流体将穿过可渗透膜并与细胞接触，从而可以在插入物中培养细胞。不同类型的细胞可以在插入物中培养，如本文所述。插入物是可商购获得的。例如，可以使用ThinCert^TM可渗透细胞培养插入物(USA Scientific,Florida,USA)。这些插入物可具有各种尺寸和光洁度，并且可以由技术人员容易地选择以用于本公开。每个插入物可具有自动定位的悬挂器，其通过将插入物定位成稍微偏离中心来消除毛细效应并使移液器最大程度地进入。ThinCert^TM细胞培养插入物与标准多孔板兼容。又如，可以使用

HTS

-可渗透支架(SigmaAldrich,Dorset,United Kingdom)。

HTS

-可渗透支架具有24或96孔阵列，所述孔具有通过刚性托盘连接的可渗透插入物。如本文所述，公开了一种在多孔细胞培养板中使用的插入物，该插入物包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

不连续表面

根据本公开，细胞培养室的底部(诸如多孔板中的孔的底部)或插入物包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。应当理解，并非可能包含在细胞培养装置中的每个室或孔或插入物都需要包括不连续表面，因为并非所有的室或孔都可以用于培养球状体，并且插入物可能不存在于每个孔中。例如，一些孔可用于培养其他细胞类型，其无需使用不连续表面或插入物。例如，一些孔可用于培养其他细胞类型，其需要或不需要使用插入物来形成空气-液体界面。

适当地，不连续表面捕获球状体以减少或防止球状体的团聚或融合。适当地，不连续表面捕获单独的球状体以减少或防止球状体的团聚或融合。

在某些实施方案中，不连续表面由一个或多个凹槽形成。凹槽可以起到捕获球状体的作用，以减少或防止球状体的团聚。一个或多个凹槽的尺寸通常将对应于球状体的最大直径±10％，使得球状体可以被捕获或保持在一个或多个凹槽中。适当地，一个或多个凹槽将覆盖细胞培养室的底部或插入物的大部分，因为细胞培养室的底部或插入物上平坦表面的存在可能导致球状体团聚，这可能导致不期望的大细胞团聚体的形成。在某些实施方案中，细胞培养室的底部或插入物的至少70％、80％、90％、95％、99％或100％将包含不连续表面，诸如一个或多个凹槽。

适当地，在细胞培养室的底部或插入物中的不连续表面(诸如多个凹槽)的深度和宽度在约200μm至约1000μm之间，适当地，在约200μm至约600μm之间。还公开了约600μm至约1000μm的深度和宽度。实际的深度和宽度将由打算在细胞培养室或插入物中使用并捕获的球状体的尺寸确定。因此，例如，一些球状体的最大直径为约600μm，在这种情况下，不连续表面(诸如多个凹槽)的深度和宽度将为约600μm±10％。在一些实施方案中，期望不连续表面(诸如多个凹槽)的深度和宽度大于球状体的最大直径，诸如球状体的最大直径的20％、30％、40％、50％或60或更大。在一个实施方案中，球状体的最大直径为600μm，并且不连续表面(诸如多个凹槽)的高度为约1mm，宽度为约1mm或约2mm。

一般来讲，凹槽的形状可以是呈一定形状的平坦底部，U形、V形或V形的平坦底部等。在一个实施方案中，凹槽具有V形的平坦底部。在一个实施方案中，凹槽的开口的最大宽度为约2.4mm，凹槽的深度为约1mm，并且在凹槽的底部上的平坦底部的宽度为约400μm。根据该实施方案的凹槽的相对两侧的角度为约90度。

转到图1，示出了包括细胞培养室12的细胞培养装置10，该细胞培养室在其底部上具有多个凹槽16，所述多个凹槽包含V形凹槽，每个V形凹槽都具有平坦底部。凹槽中的开口的最大宽度为约2.4mm，凹槽的深度为约1mm，并且在凹槽的底部上的平坦底部的宽度为约400μm。凹槽的相对两侧的角度为约90度。尽管多个凹槽被示出为具有相同的形状，但是设想可以使用不同形状的凹槽。例如，细胞培养室的底部或插入物可包括多个凹槽，其中凹槽中的一个或多个的形状不同。因此，细胞培养室的底部或插入物可包括包含两种或更多种呈一定形状的平坦底部的多个凹槽，所述多个凹槽具有U形、V形或V形的平坦底部等。

在某些实施方案中，凹槽在细胞培养室的底部或插入物上形成多个同心环。在一个实施方案中，同心环的半径为约1.05mm、约3.45和约5.85mm。转到图2，示出了具有由凹槽16形成的多个同心环17的细胞培养室12的底部，同心环的半径为约1.05mm、约3.45和约5.85mm。

现在转到图4，示出了多孔板形式的细胞培养装置10的平面图。细胞培养装置10包含多个呈孔形式的细胞培养室12，这些孔包含多个同心凹槽17或包含微流体通道18。孔线性布置成行。行可被构造成包含至少一个孔，所述至少一个孔包含同心凹槽17。行可被构造成包含至少一个包含同心凹槽17的孔和至少一个包含微流体通道18的孔，如图4所示。

通道19连接包含多个同心凹槽17的孔和包含微流体通道18的孔。每个孔包含入口和出口，用于使流体输送进入每个孔和输送离开每个孔。尽管图4示出了细胞培养装置10中包含同心凹槽17或包含微流体通道18的每个细胞培养室12，但是技术人员将理解，没有必要使每个细胞培养室12都以这种方式构造，并且细胞培养室12中的一个或多个可以不包含同心凹槽17和/或不包含微流体通道18。根据需要，一些细胞培养室12可以是空的并且可以不被使用。

在某些实施方案中，不连续表面由一个或多个凹槽形成，所述一个或多个凹槽被成形为横跨细胞培养室的底部或插入物的波浪形。

在某些实施方案中，不连续表面包括多个孔洞。孔洞通常具有封闭的底部和开放的顶部。孔洞起到捕获单独的球状体的作用，以减少或防止球状体的团聚。孔洞的尺寸通常将对应于球状体的最大直径±10％，使得球状体可以被捕获或保持在孔洞中。不连续表面可包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200或更多个横跨细胞培养室的底部分布的孔洞。不连续表面可包含横跨细胞培养室的底部分布的130至160个孔洞。不连续表面可包含横跨细胞培养室的底部分布的130至150个孔洞。不连续表面可包含横跨细胞培养室的底部或插入物分布的130至140个孔洞。一般来讲，孔洞的形状可包括呈一定形状的平坦底部，U形、V形或V形的平坦底部等。孔洞的形状没有特别限制，只要孔洞能够容纳球状体的最大直径±10％以捕获单独的球状体即可。在某些实施方案中，孔洞的深度和宽度在约200至约1000μm之间，适当地，在约600至约1000μm之间。在某些实施方案中，细胞培养室的底部或插入物的至少70％、80％或90％或更多将被孔洞填充。

转到图6，示出了包括细胞培养室(孔)22的细胞培养装置20，该细胞培养室(孔)在其底部上具有多个孔洞26。孔洞具有封闭的底部和开放的顶部。每个孔洞的最大宽度为约0.8mm，凹槽的深度为约0.5mm。孔洞的相对两侧的角度为约118度。尽管多个孔洞被示出为具有相同的形状，但是设想可以使用不同形状的孔洞。例如，细胞培养室的底部或插入物可包括多个孔洞，其中孔洞中的一个或多个的形状不同。因此，细胞培养室的底部或插入物可包括包含两种或更多种呈一定形状的平坦底部的多个孔洞，所述多个孔洞具有U形、V形或V形的平坦底部等。

图7示出了图6所示的细胞培养装置20的平面图。细胞培养室22的半径为约8mm。包含多个孔洞26的室22的底部的半径为约5.8mm。每个孔洞26的半径为约0.4mm。

现在转到图8，示出了多孔板形式的细胞培养装置20的平面图。细胞培养装置21包含多个呈孔形式的细胞培养室22，这些孔包含多个同心孔洞27或包含微流体通道28。孔22线性布置成行。行可被构造成包含至少一个孔，所述至少一个孔包含多个孔洞27。行可被构造成包含至少一个包含多个孔洞27的孔和至少一个包含微流体通道28的孔。通道29连接包含多个孔洞27的孔和包含微流体通道28的孔。每个孔包含入口和出口，用于使流体输送进入每个孔和输送离开每个孔。

尽管图8示出了细胞培养装置21中包含孔洞27或包含微流体通道28的每个细胞培养室22，但是技术人员将理解，没有必要使每个细胞培养室22都以这种方式构造，并且细胞培养室22中的一个或多个可以不包含孔洞27和/或不包含微流体通道28。根据需要，一些细胞培养室22可以是空的并且可以不被使用。

当根据本公开使用时，横跨细胞培养装置的多个细胞培养室的深度无需相同，并且设想，细胞培养室(诸如多孔板的孔)可具有不同的深度。在一个实施方案中，包括不连续表面或孔洞的细胞培养室的深度大于包括插入物的细胞培养室的深度。连接至少两个细胞培养室的通道可以处于相同的高度，使得通道位于距至少两个细胞培养室的底部不同距离处。这种构型确保了流入室中的流体不会扰动或干扰捕获在不连续表面上的球状体，同时确保了流体仍可以穿过插入物的可渗透膜。

图5中描绘了这种构型，其中示出了包括第一细胞培养室12a和第二细胞培养室12b的细胞培养装置10，所述第一细胞培养室在其底部上具有多个凹槽16，所述第二细胞培养室在其中具有微流体通道18。第一细胞培养室12a的深度大于第二细胞培养室12b的深度。第一细胞培养室12a的深度为约20mm，第二细胞培养室12b的深度为约18.3mm。通道19与细胞培养室12a和12b中的每一个流体连通。通道19位于距与第二细胞培养室12b相比更远的第一细胞培养室12a的底部位置。

图9中也描绘了类似的构型，其中示出了包括第一细胞培养室22a和第二细胞培养室22b的细胞培养装置20，所述第一细胞培养室在其底部上具有多个孔洞26，所述第二细胞培养室在其中具有微流体通道28。第一细胞培养室22a的深度大于第二细胞培养室22b的深度。第一细胞培养室22a的深度为约20mm，第二细胞培养室12b的深度为约18.3mm。通道29与细胞培养室22a和22b中的每一个流体连通。通道29位于距与第二细胞培养室22b相比更远的第一细胞培养室22a的底部位置。

球状体可用于各种实验中，以评估它们的活力、形态和功能等中的一项或多项。在此类实验中，确保在每个实验中使用相同数量的细胞(其也意指相同数量的球状体)非常重要。在不使用根据本公开的不连续表面的情况下，几个球状体可以融合在一起以形成较大的组织。很难确切地确定该较大的组织中存在的球状体的数量，这意味着该组织不能用于其他实验。当使用不连续表面时，它会增加球状体之间的距离并减少或防止其融合，这意味着由于已知球状体的数量，它们可以用于其他实验。

因此，根据本公开的一个方面，公开了一种减少或防止球状体团聚的方法，该方法包括使用细胞培养装置，该细胞培养装置包括：细胞培养室，该细胞培养室包括底部和从该底部延伸以包围细胞培养室的体积的侧壁；细胞培养室的底部或侧壁中的适于流体连通到室中的入口；细胞培养室的底部或侧壁中的适于流体连通到室外的出口；其中细胞培养室的底部包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

在一个实施方案中，该方法包括：(i)提供一个或多个单独的球状体；(ii)将所述一个或多个单独的球状体转移到细胞培养装置的细胞培养室中；(iii)在细胞培养装置中温育所述一个或多个单独的球状体；(iv)

在细胞培养装置的不连续表面上获取所述一个或多个单独的球状体。

可以从一个实体(诸如细胞培养板的孔)转移所提供的单独的球状体。该实体可以与细胞培养装置的细胞培养室分开，单独的球状体将被转移到该细胞培养室中。换句话说，该实体可以与细胞培养装置的细胞培养室物理地分开。温育一段时间后，在多孔板的每个孔中存在或形成单个单独的球状体或多个单独的球状体。从这里，可以将单独的球状体转移到细胞培养装置的细胞培养室中，该细胞培养室包括本文所述的不连续表面并且可选地被涂覆。有利地，可以在步骤(ii)中转移已知数量的单独的球状体，然后可以在步骤(iv)中获取已知数量的单独的球状体。在一个实施方案中，将约40至约100个球状体转移到细胞培养装置的细胞培养室中。可以将在步骤(iv)中获取的已知数量的单独的球状体温育一段时间。在步骤(iv)中获取的已知数量的单独的球状体可以根据需要进行进一步实验分析。在本公开的一个实例中，细胞被接种在多孔板的经过可选的低附着处理和具有可选的U形底部的每个孔中。使细胞在孔的底部团聚。一旦细胞形成团聚体，它们将例如在约3天内形成球状体。温育后，在多孔板的每个孔中形成单个球状体或多个球状体。球状体的大小取决于每个孔中接种的细胞的数量。从这里，将单独的球状体转移到细胞培养装置的细胞培养室中，该细胞培养室包括本文所述的不连续表面并且可选地被涂覆。每个单独的球状体均从多孔板独立地转移到细胞培养装置的细胞培养室中。在一个实施方案中，将约40至100个单独的球状体转移到细胞培养装置的细胞培养室中。最后，将细胞培养装置连接至产生培养基流的泵。已知数量的单独的球状体可以在此状态下保持约1至约28天，然后再用于其他实验。

细胞来源

本公开利用了多种细胞来源。在一个实施方案中，本公开排除了从受试者分离或获得细胞样品的步骤。细胞可以冷冻保存。细胞可以在3维细胞培养物中。细胞可以是组织的形式。细胞可以是球状体的形式。细胞可以活跃地分裂。细胞可以在有细胞培养基(例如，包含营养物(例如，蛋白质、肽、氨基酸)、能量(例如，碳水化合物)、必需金属和矿物质(例如，钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐)、缓冲剂(例如，磷酸盐、乙酸盐)、pH变化指示剂(例如，酚红、溴甲酚紫)、选择剂(例如，化学品、抗微生物剂)等)存在的细胞培养装置中培养。单种细胞培养基可用于生长相同或不同类型的细胞。不同的细胞培养基可用于生长不同类型的细胞。由于细胞培养基根据本公开进行循环，因此将发生不同细胞培养基的混合。

在一些实施方案中，一种或多种试剂包括在一种细胞培养基或多种细胞培养基中。可以使用本领域所熟知的方法从组织或流体中分离细胞。细胞可以从干细胞分化(诸如胚胎干细胞或诱导性多能干细胞)或直接从体细胞分化。细胞可以是天然细胞或变异细胞(例如，包含一种或多种非天然基因变异的细胞)。细胞可以是疾病细胞或疾病模型细胞。例如，细胞可以是癌细胞或可以被诱导为过度增殖状态的细胞(例如，转化细胞)。

细胞可以是或可以来源于人或动物受试者，或来源于人或动物细胞，包括许多哺乳动物物种中的任一种，适当地是人，但包括大鼠、小鼠、猪、兔和非人灵长类动物等。细胞和细胞系可以从商业来源获得。细胞可以来自或来源于任何期望的组织或器官类型，包括但不限于肾上腺、膀胱、血管、骨、骨髓、脑、软骨、宫颈、角膜、子宫内膜、食管、胃肠系统、免疫系统(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞和树突细胞)、肝、肺、淋巴系统、肌肉(例如，心肌)、神经系统、卵巢、胰腺(例如，胰岛细胞)、垂体腺、前列腺、肾、唾液腺、皮肤、腱、睾丸和甲状腺。

肺细胞(包括肺上皮细胞)是一种特别令人感兴趣的细胞类型。支气管和/或其他气道上皮细胞尤其用于本公开中。可以通过在支气管镜检查程序期间刷拭供体肺来收集人类支气管上皮细胞。在一个实施方案中，肺细胞是正常人类支气管上皮(Normal HumanBronchial Epithelial，NHBE)细胞。肺上皮细胞可以被培养成单层未分化细胞，或在空气-液体界面处进一步发育成器官型肺上皮细胞状组织。可以从具有不同病变的人或动物受试者，包括被归类为吸烟者或非吸烟者的受试者，获得肺上皮细胞。

肝细胞是另一种特别令人感兴趣的细胞类型.在一个实施方案中，所用细胞是肝细胞。肝细胞是肝的细胞，其构成肝脏细胞质质量的70％-85％。肝细胞的功能性高度取决于其形成极性表型的能力，极性表型只在3维培养中建立。肝细胞的一种来源是原代肝细胞，其是广泛用于研究肝脏生理学和病理学的许多方面的体外模型。用于分离人类肝细胞的技术可以基于捐赠肝的两步胶原蛋白酶灌注。然而，这些细胞表达代谢酶不超过5天。另一限制是其短存活力。这些缺点可以通过使用替代的、寿命长的肝细胞系(诸如人或动物肝祖细胞系)来克服。人肝祖细胞系的一个这样的实例是HepaRG^TM细胞系(ThermoFisherScientific)。HepaRG^TM细胞保留了原代人肝细胞的许多特征。与原代肝细胞相比，它们具有更高的肝脏特异性和代谢基因表达，并且具有更长的寿命。3维球状体中HepaRG^TM细胞的重组进一步延长了寿命并提高了代谢能力，这表明球状体可能为毒性测试提供更好的体外肝脏模型。还可以用原代肝细胞与肝星形细胞或原代肝细胞与脂肪组织衍生干细胞的混合物创造肝球状体。

在一个实施方案中，肺细胞是肺上皮细胞，诸如支气管和/或其他气道上皮细胞。

在一个实施方案中，肝细胞(liver cell)是肝细胞(hepatocyte)，适当地，是HepaRG细胞。

细胞组合

设想了本文所述的任何细胞的组合的使用。设想了在细胞培养装置中或在包括细胞培养装置的系统或装置中的本文所述的任何细胞的组合的使用。细胞的一种示例性组合是肝细胞和肺细胞的组合。设想了将肺上皮细胞(诸如支气管和/或其他气道上皮细胞)和肝细胞(诸如HepaRG^TM细胞)的组合。如果需要，可以将其他细胞与该组合一起使用。

该组合的不同细胞可以在单独的孔中培养。

3维细胞培养

本公开结合了“3维细胞培养”的使用，其包括在使用或不使用培养基或支架(诸如插入物中的可渗透膜)的情况下提供细胞在3维中培养的任何方法。已经开发了许多不同的3维细胞培养方法，包括球状体培养和器官型培养。3维细胞可以在本文所述的细胞培养装置中生长和/或维持。

术语“球状体”采用如所述领域中通常所了解的含义，其是在3维上分裂成细胞球的单细胞，或在3维上多个细胞的聚集体，在球状体内的3维细胞生长中使用或不使用基质或支架进行支撑。三维球状体可以是黏附球状体或悬浮生长的球状体。

在一些实施方案中，球状体包含单种细胞类型。在一些实施方案中，球状体包含多于一种细胞类型。在一些实施方案中，当生长多于一个球状体时，每个球状体是相同类型的，而在其他实施方案中，生长两种或更多种不同类型的球状体。

根据细胞通讯和细胞外基质的发展，三维球状体更紧密地类似体内组织。该基质帮助细胞在球状体内移动，类似于细胞在活组织中移动的方式。因此，球状体是有很大改良的用于分化、存活、细胞迁移、细胞极化、基因表达和生长的模型。

球状体可以使用所属领域中众所周知的各种方法收获和研究，所述方法包括用板式读取器测量的比色、荧光和发光分析法，或它们可以容易地通过显微法来观测。其他技术包括Western、Northern或Southern印迹、组织学技术(例如，免疫组织化学、原位杂交、免疫荧光)等。还设想了使用光学成像方法，诸如反向明场显微镜法和荧光显微镜法。

使用3维球状体的应用包括在更接近体内环境的环境中体外细胞和组织增殖的研究、化合物的筛选、毒理学检测、细胞治疗、细胞递送、试剂递送、生物化学替代、生物活性分子的产生、组织工程、生物材料和临床试验等。

球状体在三维细胞培养中的使用一般在Expert Opin.Drug Discov.(2015)10，519–540中进行综述。

3维器官培养系统(尤其是微型形式的那些)可以用于本公开，因为它们允许研究器官如何在微观尺度上起作用。可以研究对某些刺激的反应、对一种或多种试剂的反应以及此类试剂的药代动力学行为。微型3维细胞培养系统允许对细胞组或器官组进行组合研究。这允许不同组织之间相互作用的复杂性得以再现。3维器官培养物可以是器官型的，这意味着其试图再现器官或器官系统的主要功能。还设想了使孔互连的微型流体系统。

一方面，提供了一种球状体培养，其中球状体在培养5小时后或在培养5天后呈单独的单个球状体的形式。换句话说，球状体没有团聚或融合。

基于肝脏的3维培养

肝脏在解毒、碳水化合物、脂质和蛋白质的代谢以及内源性和外源性物质的生物转化中发挥重要作用。肝功能性与由所谓肺叶组成的复杂3维结构内所包埋的高度专业化细胞(大部分是肝细胞)的装配紧密关联。化合物的生物转化通常会产生无毒且更易溶的代谢物，然而，偶尔会形成更多的毒性代谢物，从而引起肝毒性。

肝细胞可以经由各种方法保持3维，包括使用夹心式培养、固体支架材料(诸如聚苯乙烯支架)、水凝胶(诸如I型胶原蛋白)或自组装成球状体。

虽然新鲜分离的原代人肝细胞的使用可以是优选的肝细胞类型，但它们的可用性有限。人类肝细胞系的其他选择包括HepG2和Hep2/C3A细胞。一种尤其合适的细胞来源是HepaRG^TM细胞系。人类肝细胞的其他来源是人类胚胎干细胞(hESC)来源的肝细胞和来源于诱导多能干细胞(iPSC)的肝细胞。

在一个实施方案中，球状体是或来源于肝细胞以形成3维肝球状体。此类肝球状体可以使用本领域已知的和描述于例如ALTEX(2014)31,441–477和Toxicol.Sci.(2013)133,67-78中的各种方法来制备。

基于肺的3维培养

因为呼吸道的形态从上呼吸道变成下呼吸道，所以已经使用原代气道上皮细胞或细胞系建立许多不同的细胞培养模型并且涵盖其用于本公开中。确切使用哪些细胞或细胞系的选择将取决于用于所给出研究的呼吸道的关注区域。

由于肺表面暴露于空气，因此可以在空气-液体界面处培养细胞模型，以更真实地模拟肺。

在一个实施方案中，肺3维培养物是或来源于肺细胞以形成3维器官型组织。此类肺组织可以使用本领域已知的多种方法(诸如描述于ALTEX(2014)31,441–477和Toxicol.(2013)133,67-78中的那些)来制备。

筛选

本公开的细胞培养装置可以可选地用于实时采样或筛选。可以任选地实时确定一种或多种试剂对细胞培养装置中包含的细胞的作用。细胞培养装置可用于例如试剂/药物发现、试剂/药物表征、功效测试和毒性测试等。它可以用作采样或筛选装置的一部分。此类测试包括但不限于药理作用评估、致癌性评估、医学显像剂特性评估、半衰期评估、辐射安全性评估、基因毒性测试、免疫毒性测试、生殖和发育测试、药物/试剂相互作用评估、剂量评估、吸附评估、处置评估、代谢评估、消除研究等。特定的细胞类型可用于特定的测试(例如，肝细胞用于肝毒性，肾近端小管上皮细胞用于肾毒性，血管内皮细胞用于血管毒性，神经元和神经胶质细胞用于神经毒性，心肌细胞用于心脏毒性)。

一方面，描述了一种用于评估细胞或组织对试剂的反应的体外方法，所述方法包括：(i)使本文所述的细胞培养装置中包含的细胞或组织与至少一种试剂接触；以及(ii)在与至少一种试剂接触后测量一种或多种反应；其中与至少一种试剂接触之前和之后的一种或多种反应的差异表明所述试剂调节了细胞或组织的反应。

另一方面，描述了一种用于评估两种或更多种细胞、组织或器官对试剂的反应的体外方法，所述方法包括：(i)使如本文所述的细胞培养装置中包含的细胞、组织或器官中的至少一者与至少一种试剂接触；以及(ii)在与至少一种试剂接触后测量一种或多种细胞、组织或器官中的一种或多种反应；其中在与至少一种试剂接触之前和之后的一种或多种细胞中的一种或多种反应的差异表明所述试剂调节了至少一种细胞、组织或器官的反应。

适当地，测量或确定至少一种试剂进入细胞或组织中的作用或渗透。适当地，测量或确定细胞或组织中至少一种试剂的生物活化。适当地，测量或确定细胞或组织对至少一种试剂的代谢。这些步骤可以同时或彼此相继进行。

一种或多种试剂对试剂(诸如气溶胶)渗透到一种或多种细胞、组织或器官中以及其被另一种细胞或组织进一步生物激活或代谢的作用可以使用本领域众所周知的各种方法来确定。

可以将试剂添加到细胞培养装置中，并且可以监测或确定其对包含在其中的培养的细胞或组织的作用。可以测量的作用的实例包括氧气的消耗、二氧化碳的产生、细胞活力、蛋白质的表达、酶的活性、渗透、渗透/屏障功能、表面活性剂产生、对细胞因子的反应、转运体功能、细胞色素P450表达、白蛋白分泌等等。

可以将细胞培养装置暴露于气溶胶中，并且可以监测或确定所述气溶胶对包含在其中的培养的细胞或组织的作用。可以测量的作用的实例包括氧气的消耗、二氧化碳的产生、细胞活力、蛋白质的表达、酶的活性、渗透、渗透/屏障功能、表面活性剂产生、对细胞因子的反应、转运体功能、细胞色素P450表达、白蛋白分泌等等。

可以与不同浓度的试剂平行进行多种分析法，以获得对多种浓度的差异反应。如本领域中已知，测定试剂的有效浓度的方法通常使用由1:10或其他对数标度稀释产生的一系列浓度。必要时，浓度可以用第二连续稀释进一步细化。通常，这些浓度之一充当阴性对照。

试剂

试剂可以是任何感兴趣的化合物，包括小的有机化合物、多肽、肽、较高分子量的碳水化合物、多核苷酸、脂肪酸和脂质、纳米颗粒、气溶胶或气溶胶的一种或多种组分等、药物、毒素、病原体、抗原、抗体和小分子等。试剂可以单独筛选，或者在化合物组或化合物组合文库中筛选。试剂可从包括合成或天然化合物的文库的多种来源获得。可以使用呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库。天然或以合成方式产生的文库和通过常规化学、物理和生物化学手段修饰的化合物可以用于产生组合文库。已知的药剂可以进行定向或随机的化学改性，例如酰化、烷基化、酯化、酸化以产生结构类似物以供筛选。当使用组合文库进行筛选时，可以筛选化学上相似或不同的试剂的大文库。在组合筛选中，发现的命中数与测试的试剂数成比例。可以筛选大量化合物，每天能测试数千种化合物，其中可以应用实验室自动化和机器人技术。可以在所属领域中发现用于合成分子文库的方法的许多实例。小的有机化合物包括分子量低于约5,000道尔顿、通常低于约2,500、通常低于约2,000、更通常低于约1,500、适当地约100至约1,000道尔顿的化合物。小的有机化合物可以是生物或合成有机化合物。小的有机化合物中存在的原子一般是在包含碳、氢、氧和氮的群组中，并且如果呈药物学上可接受的形式，那么可以包括卤素、硼、磷、硒和硫。一般来说，氧、氮、硫或磷如果存在的话，那么结合于碳或彼此一或多种或结合于氢，从而形成多种官能团，例如羧酸、醇、硫醇、羧酰胺、氨基甲酸酯、羧酸酯、酰胺、醚、硫醚、硫酯、磷酸酯、膦酸酯、烯烃、酮、胺、醛等。如本文所用，术语“小的有机化合物”还包括分子量小于约5,000道尔顿的小肽、小寡核苷酸、小多糖、脂肪酸、脂质等。

药剂的实例描述于The Pharmacological Basis of Therapeutics,Goodman andGilman,McGraw-Hill,New York,N.Y.,(1996),,第九版中。试剂可以是毒素。

可以分析溶液中的试剂和可以溶解在适当溶剂中的固体样品。气态形式的试剂也可以通过将样品暴露在气体中一段时间来进行分析。所关注的样品包括环境样品、生物样品、制造样品、化合物文库以及合成和天然存在的化合物。

可以筛选具有至少约5,000道尔顿、更通常至少约10,000道尔顿的分子量的多肽。测试多肽一般将具有约5,000至约5,000,000道尔顿或更大分子量，更通常约20,000至约1,000,000道尔顿分子量。可以考虑各种多肽，例如具有类似结构特征的多肽家族、具有特定生物功能的多肽、与特定微生物、尤其是致病微生物相关的多肽。这类多肽包括细胞因子或白细胞介素、酶、鱼精蛋白、组蛋白、白蛋白、免疫球蛋白、硬多肽、磷酸化多肽、粘多肽、紫色多肽、脂质多肽、糖多肽、T细胞受体、蛋白多糖、促生长素、促乳素、胰岛素、胃蛋白酶、在人类血浆中发现的多肽、凝血因子、血型因子、肽和多肽激素、癌症抗原、组织特异性抗原、营养标记物和合成肽，这些可以糖化或不糖化。

可以筛选多核苷酸。测试多核苷酸可以是天然化合物或合成化合物。多核苷酸包括寡核苷酸并且由例如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸等天然核苷酸和其衍生物构成，不过还涵盖非天然核苷酸模拟物，例如2'修饰的核苷、肽核酸和寡聚核苷膦酸酯。更高分子量多核苷酸可以具有约20到约5,000,000个或更多个核苷酸。

可以测量的一个或多个变量包括细胞、亚细胞物质、亚细胞组分或细胞产物的可定量元素，特别是可以在高通量分析系统或装置中精确测量的元素。输出可以是任何细胞、细胞组分或细胞产物的特征、条件、状态或功能，包括存活力、呼吸、代谢、细胞表面决定子、受体、蛋白质或其构形或翻译后修饰、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、DNA、RNA等等或来源于这类细胞组分的部分。虽然变量可以提供定量读数，但在一些情况下，可以获得半定量或定性结果。读出变量可包括例如单个值、平均值、中值或其方差。

可以使用多种方法来测量一个或多个变量以确定细胞、组织或器官对试剂的反应。为了测量存在的试剂的量，一种方法是用可检测部分标记试剂，所述可检测部分可以是荧光的、发光的、放射性的、酶活性的等。荧光和发光部分可用于标记生物分子、结构或细胞类型。免疫荧光部分可以不仅结合于特定蛋白质，而且还结合特定构象、裂解产物或如磷酸化等位点改性。个别肽和蛋白质可以被工程化成自动发荧光。可以使用免疫分析技术，例如免疫组织化学、放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)和相关非酶技术。这些技术利用特异性抗体作为报告分子，这些特异性抗体由于高度特异性地连接到单分子标靶而尤其适用。基于细胞的ELISA或相关非酶或基于荧光的方法能够测量细胞表面参数。

可以将筛选分析的结果与从参考化合物、浓度曲线、对照等获得的结果进行比较。试剂可以是气溶胶，例如烟雾，或来源于烟雾的气溶胶。

气溶胶

当包含在本公开的细胞培养装置中时，本公开的实施方案可用于研究气溶胶对细胞、器官或组织的作用或气溶胶向细胞、器官或组织中的渗透。气溶胶可以由气溶胶形成装置获得或产生。吸烟制品和可抽吸制品是气溶胶形成装置的类型。吸烟制品或可抽吸制品的实例包含但不限于香烟、小雪茄和雪茄。在某些气溶胶形成装置而不是燃烧中，烟草组合物或另一气溶胶形成材料被一个或多个电加热元件进行加热，以产生气溶胶。在另一类型的被加热的气溶胶形成装置中，通过将热量从可燃性燃料元件或热源转移到物理上分开的气溶胶形成材料来产生气溶胶，所述气溶胶形成材料可以位于热源内、热源周围或热源下游。通常在被加热的吸烟制品中，通过将热量从热源转移到物理上分开的气溶胶形成基材或材料来生成气溶胶，所述气溶胶形成基材或材料可以位于热源内、热源周围或热源下游。在抽吸期间，挥发性化合物通过来自热源的热转移从气溶胶形成材料释放，并且夹带在被抽吸穿过吸烟制品的空气中。随着所释放的化合物冷却，化合物凝结以形成由使用者吸入的气溶胶。如本文中使用的术语“气溶胶形成材料”用于描述能够在加热挥发性化合物时释放的材料，其可以形成气溶胶。气溶胶形成材料可以是基于植物的。气溶胶形成材料的实例包括但不限于烟草组合物、烟草、烟草提取物、烟丝、切丝填料、烘烤的烟草、膨胀烟草、均质烟草、再造烟草和烟斗烟草。替代地，所述气溶胶形成材料可以包含非植物类材料。

气溶胶可以呈烟雾形式。如本文所用，术语“烟雾”用于描述由燃烧产生(诸如由吸烟或通过燃烧气溶胶形成材料而产生)的一种类型的气溶胶。烟雾包括多种试剂，其可以在需要时作为单独的化合物提供以进行研究。此类试剂的实例包括不含烟碱的干燥颗粒物质、一氧化碳、甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、甲基乙基酮、丁醛、苯并[a]芘、苯酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、儿茶酚、间苯二酚、对苯二酚、1,3-丁二烯、异戊二烯、丙烯腈、苯、甲苯、吡啶、喹啉、苯乙烯、N′-亚硝基降烟碱(NNN)、N′-亚硝基新烟草碱(NAT)、N′-亚硝基新烟碱(NAB)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯、氧化氮(NOx)、氢氰酸、氨、砷、镉、铬、铅、镍、硒和汞。

本文所述的细胞培养装置可以暴露于烟雾不同的时间量。可以使用

暴露模块来递送烟雾(参见Chem Cent J.(2014)8(1):62)。可以使用限定的每支香烟的喷烟次数和限定的每分钟暴露的喷烟次数，并且香烟的数量可以变化以适应暴露浓度。参考香烟(诸如参考香烟3R4F)可以用作烟雾来源，并在基本符合国际标准化组织吸烟制度(ISO2000)的吸烟机器人上抽烟。

制造

可以使用各种制造方法来制造细胞培养装置。例如，该装置可以使用注射成型的零件组装或制造为单个部件。不连续表面可以使用计算机数控加工或注射成型来制备或施加。尽管不是必需的，但是为了光学透明度，保持不大于2mm的厚度是有利的。分开的零件可以通过各种方法来组装，包括但不限于：粘合或溶剂粘结、热密封或焊接、压缩、超声焊接、激光焊接和/或通常用于在零件之间产生密封的任何其他方法。

PEEK

如本文所述，细胞培养装置可以由PEEK制造，因为它具有不吸收小分子的优点。例如，已经测试了PEEK对烟碱和NNK的吸收，发现这些分子没有被该材料捕获。这一点非常重要，因为使用PEEK不会捕获小的疏水分子。因此，此类细胞培养装置特别适用于测试对容纳在该装置或其他此类装置内的细胞或组织的药物作用，而没有药物浓度(或其代谢物的浓度)被材料改变的任何风险。因此，公开了一种包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养装置或在细胞培养装置中使用的插入物。

因此，还公开了一种由PEEK(专门地)制造的细胞培养装置。

还公开了一种包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养板。

还公开了一种由PEEK(专门地)制造的细胞培养板。

还公开了一种包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养板的孔。

还公开了一种由PEEK(专门地)制造的细胞培养板的孔。

还公开了一种包含PEEK或由PEEK组成的插入物。

还公开了一种由PEEK(专门地)制造的插入物。

还公开了一种包含PEEK或由PEEK组成的多孔细胞培养板。

还公开了一种由PEEK(专门地)制造的多孔细胞培养板。

适当地，细胞培养装置、细胞培养板、孔或多孔细胞培养板或插入物包含一种或多种小的疏水分子，诸如一种或多种小的疏水试剂。在一个实施方案中，试剂包括烟草生物碱或由烟草生物碱组成。

在一个实施方案中，试剂包括：由化学式1：

表示的结构或其药学上可接受的盐或其混合物；

或更适当地，由化学式2：

表示的结构或其药学上可接受的盐或其混合物；

其中：

z为0或1；

R₁表示H或C₁-C₇烷基；

R₂表示H、＝O或C₁-C₇烷基；

R₃表示H、卤素或C₁-C₇烷基；

并且虚线表示

(a)单键；

(b)一个碳/碳双键或碳/氮双键和其余的单键；或者

(c)独立地选自碳/氮双键和碳/碳双键的两个共轭双键和其余的单键。

适当地，由化学式2表示的试剂为：

或其药学上可接受的盐或其混合物。

适当地，由化学式2表示的试剂为：

或其药学上可接受的盐或其混合物。

更适当地，由化学式1或化学式2表示的试剂为烟草生物碱。

更适当地，由化学式1或化学式2表示的试剂为烟碱、新烟碱、降烟碱、新烟草碱、可替宁、麦斯明或其药学上可接受的盐或其混合物。

“烟草生物碱”是指来自或可来源于烟草植物的生物碱，并且可包括合成的烟草生物碱。“烟草植物”是指属于烟草属(Nicotiana)的植物，包括黄花烟草(N.rustica)和烟草(N.tabacum)(例如LA B21、LN KY171、TI 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。其他物种包括无茎烟草(N.acaulis)、尖叶烟草(N.acuminata)、非洲烟草(N.africana)、花叶烟草(N.alata)、阿米基诺氏烟草(N.ameghinoi)、抱茎烟草(N.amplexicaulis)、阿伦兹氏烟草(N.arentsii)、渐狭叶烟草(N.attenuata)、阿姆布吉烟草(N.azambujae)、贝纳莫特氏烟草(N.benavidesii)、本赛姆氏烟草(N.benthamiana)、印度烟草(N.bigelovii)、博内里烟草(N.bonariensis)、洞生烟草(N.cavicola)、克利夫兰氏烟草(N.clevelandii)、心叶烟草(N.cordifolia)、伞床烟草(N.corymbosa)、迪伯纳氏烟草(N.debneyi)、木丝烟草(N.excelsior)、福尔吉特氏烟草(N.forgetiana)、香烟草(N.fragrans)、粉蓝烟草(N.glauca)、粘烟草(N.glutinosa)、古特斯比氏烟草(N.goodspeedii)、哥西氏烟草(N.gossei)、杂交烟草(N.hybrid)、因古儿巴烟草(N.ingulba)、卡瓦卡米氏烟草(N.kawakamii)、奈特氏烟草(N.knightiana)、郎氏烟草(N.Iangsdorffii)、渐尖叶烟草(N.linearis)、长花烟草(N.Iongiflora)、海滨烟草(N.maritima)、特大管烟草(N.megalosiphon)、摩西氏烟草(N.miersii)、夜花烟草(N.noctifIora)、裸茎烟草(N.nudicaulis)、欧布斯特烟草(N.obtusifolia)、西方烟草(N.occidentalis)、西方亚种香芥烟草(N.occidentalis subsp.hesperis)、耳状烟草(N.otophora)、圆维烟草(N.paniculata)、少花烟草(N.pauciflora)、矮牵牛状烟草(N.petunioides)、蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草(N.quadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(N.raimondii)、波缘烟草(N.repanda)、莲座烟草(N.rosulata)、莲座亚种因古儿巴烟草(N.rosulata subsp.ingulba)、圆叶烟草(N.rotundifolia)、赛特氏烟草(N.setchelIii)、拟似烟草(N.simulans)、前叶烟草(N.solanifolia)、斯佩格茨氏烟草(N.spegazzinii)、斯托可通氏烟草(N.stocktonii)、香甜烟草(N.suaveolens)、美花烟草(N.sylvestris)、拟穗状烟草(N.thyrsiflora)、绒毛烟草(N.tomentosa)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、三角叶烟草(N.trigonophylla)、荫生烟草(N.umbratica)、波叶烟草(N.undulata)、颤毛烟草(N.velutina)、序叶烟草(N.wigandioides)和花烟草(N.x sanderae)。适当地，烟草植物是烟草。

“C₁-C₇烷基”是指通常具有1至7个碳原子的直链和支链饱和烃基；更适当地是C₁-C₆烷基；更适当地是C₁-C₃烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊-1-基、戊-2-基、戊-3-基、3-甲基丁-1-基、3-甲基丁-2-基、2-甲基丁-2-基、2,2,2-三甲基乙-1-基、正己基、正庚基等。适当地，烷基是甲基。

“卤素”是指F、Cl、Br或I。适当地，卤素是Cl。

在另一个实施方案中，所述试剂是烟草特有的亚硝胺(TSNA)，其是由包括烟碱、降烟碱、新烟草碱和新烟碱的烟草生物碱的仲胺和叔胺的亚硝化形成的化学品。TSNA存在于一些烟草和烟草产品中。适当地，TSNA是N-亚硝基烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟碱(NAB)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)丁醛(NNA)、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)、4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁醇(异-NNAL)、或4-(甲基亚硝氨基)-4-(3-吡啶基)-1-丁酸(异-NNAC)或其药学上可接受的盐或其混合物。更适当地，TSNA是4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)或其药学上可接受的盐。

适当地，有机溶剂选自：饱和脂族烃(例如，正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷)；芳族烃(例如，苯、甲苯、二甲苯)；脂族醇(例如，甲醇、乙醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、2-甲基-丙-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-2-醇、戊-1-醇、3-甲基-丁-1-醇、己-1-醇、2-甲氧基-乙醇、2-乙氧基-乙醇、2-丁氧基-乙醇、2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-丁氧基-乙氧基)-乙醇)；醚，条件是所述醚不是四氢呋喃(例如，二乙醚、二异丙醚、二丁醚、1,2-二甲氧基-乙烷、1,2-二乙氧基-乙烷、1-甲氧基-2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙烷、1-乙氧基-2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙烷、1,4-二噁烷)；酮(例如，丙酮、甲基乙基酮)；酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯)；含氮溶剂(例如，甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、N-甲基-吡咯烷酮、吡啶、喹啉、硝基苯)；含硫溶剂，条件是所述含硫溶剂不是二甲亚砜(例如，二硫化碳、四氢噻吩-1,1-二氧化物)；以及含磷溶剂(例如，六甲基磷酰三胺)。

在一个实施方案中，有机溶剂是饱和脂族烃(例如，正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷)。

在一个实施方案中，有机溶剂是芳族烃(例如，苯、甲苯、二甲苯)。

在一个实施方案中，有机溶剂是脂族醇(例如，甲醇、乙醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、2-甲基-丙-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-2-醇、戊-1-醇、3-甲基-丁-1-醇、己-1-醇、2-甲氧基-乙醇、2-乙氧基-乙醇、2-丁氧基-乙醇、2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙醇、2-(2-丁氧基-乙氧基)-乙醇)。

在一个实施方案中，有机溶剂是醚，条件是所述醚不是四氢呋喃(例如，二乙醚、二异丙醚、二丁醚、1,2-二甲氧基-乙烷、1,2-二乙氧基-乙烷、1-甲氧基-2-(2-甲氧基-乙氧基)-乙烷、1-乙氧基-2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙烷、1,4-二噁烷)。

在一个实施方案中，有机溶剂是酮(例如，丙酮、甲基乙基酮)。

在一个实施方案中，有机溶剂是酯(乙酸甲酯、乙酸乙酯)。

在一个实施方案中，有机溶剂是含氮溶剂(例如，甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、N-甲基-吡咯烷酮、吡啶、喹啉、硝基苯)。

在一个实施方案中，有机溶剂是含硫溶剂，条件是所述含硫溶剂不是二甲亚砜(例如，二硫化碳、四氢噻吩-1,1-二氧化物)。

在一个实施方案中，有机溶剂是含磷溶剂(例如，六甲基磷酰三胺)。

在一个实施方案中，有机溶剂不是石油醚。

在一个实施方案中，有机溶剂不是甲苯。

在一个实施方案中，有机溶剂不是丙酮。

在一个实施方案中，有机溶剂不是乙醇。在一个实施方案中，试剂是烟碱或NNK或其组合。

适当地，上文所讨论的方法包括使细胞培养装置中的细胞与如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂接触的附加步骤。

适当地，细胞培养装置可包括包含在细胞培养基中的细胞和任选地如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂。

还公开了一种用于确定一种或多种试剂对细胞的作用(例如，暴露反应)的方法，所述方法包括：(i)使细胞与本文所述的包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养装置(诸如细胞培养板或多孔细胞培养板或插入物)接触；(ii)使细胞暴露于如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂；以及(iii)确定一种或多种试剂对细胞的作用。

还公开了一种用于确定一种或多种试剂对细胞的作用(例如，暴露反应)的方法，所述方法包括：(i)使细胞与本文所述的由PEEK制造(专门地)的细胞培养装置(诸如细胞培养板或多孔细胞培养板或插入物)接触；(ii)使细胞暴露于如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂；以及(iii)确定如上文所讨论的小的疏水分子或有机溶剂对细胞的作用。

还公开了一种用于降低或抑制如上文所讨论的一种或多种小的疏水分子或有机溶剂在本文所述的细胞培养装置中的吸收的方法，所述方法包括使试剂与包含PEEK或由PEEK组成的细胞培养装置接触。还在以下实施例中描述了本发明，提供所述实施例以更详细地描述本发明。这些实施例阐述目前设想用于进行本发明的优选模式，意图说明而不是限制本发明。

实施例

实施例1

为了避免球状体的团聚，设计用于肝球状体的孔被适配为在孔的底部包含同心凹槽。这些凹槽的目的是在组织之间形成空间隔离，以防止它们团聚或融合在一起。为了证明凹槽的功能，将40个球状体(每个球状体由约25,000个细胞组成)放置在距有凹槽的孔中或具有平坦表面的孔(即，没有凹槽)中。5天后，存在于具有平坦表面的孔中的球状体开始团聚在一起(见图11A)，形成聚集体。在具有凹槽的孔中未观察到这一现象(见图11B)。图11A中所示的组织(3个球状体团聚或融合形成一个单元)不能用于通常对球状体进行的进一步实验(诸如测量ATP含量)，因为几个球状体的团聚或融合会对获得的结果产生不利影响。图11B中培养的组织没有团聚或融合，被用于进一步的实验。

实施例2

已经测试了用于制造细胞培养装置的多种材料。用于细胞培养装置的一种材料PEEK是一种耐磨的强塑性聚合物。PEEK在药物测试中是有利的，因为它是不吸收的，这与例如通常使用的聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)相反，已知后者会保留小的疏水性分子，诸如烟碱。已经发现PEEK不保留烟碱或另一种小的疏水分子NNK。因此，该细胞培养装置适用于测试对容纳在该细胞培养装置内的组织的药物作用，而没有药物浓度(或其代谢产物浓度)被材料改变的风险。

PEEK细胞培养装置的生物相容性用器官型肺模型和肝模型进行测试。

肺模型由接种在Transwell^TM插入物上并进一步在气-液界面培养以确保细胞分化成杯状细胞和纤毛细胞的正常人支气管上皮(NHBE)细胞组成。使用这些组织，我们可以证明肺组织可以在PEEK板中存活4周，如由以下所证明的：

·纤毛细胞和杯状细胞的存在与在24孔聚碳酸酯板中维持相同持续时间的对照组织(来自同一批次)中观察到的比例相似。

·完整的形态。在板中维持的组织和在24孔板中维持4周的组织的组织学分析证实了相似的形态。在这两种条件下维持的组织之间，杯状细胞、基底细胞和纤毛细胞的上皮厚度、分化状态和比例是相似的。

·稳定的ATP含量。ATP用于细胞中的多个过程，所有代谢活性细胞都含有ATP，这使ATP含量测量成为组织健康的良好指标。与对照组织相比，在板中维持4周的组织具有相似的ATP含量(ATP减少约10％)。

·活跃的纤毛细胞跳动。纤毛细胞不仅仍以与对照组织中相同的比例存在，而且还仍以与对照组织中观察到的频率相似的频率活跃地跳动。

·较高的跨上皮电阻(TEER)。TEER测量上皮组织紧密中连接的完整性，因此是屏障完整性的有力指标。维持在PEEK板中的组织的TEER值比对照组织高50％。

·保留了代谢能力。通过将组织暴露于特定的CYP酶诱导剂来测试细胞色素P450(CYP)诱导性(代谢能力的标志)。在诱导48小时后，发现CYP1A1活性增加了100倍，证明保持在板中的组织的保留了代谢能力。

作为肝模型，使用由HepaRG^TM细胞组成的球状体。在PEEK板中培养4周后，用这些肝球状体获得的第一结果证明：

·白蛋白稳定分泌到循环培养基中。白蛋白是肝功能的关键标记物。发现PEEK板内的白蛋白分泌在4周内保持稳定，与对照组织中观察到的白蛋白浓度相似。

·保留了代谢能力。通过将组织暴露于特定的CYP酶诱导剂来测试细胞色素P450(CYP)诱导性(代谢能力的标志)。在诱导48小时后，发现CYP1A1活性与对照组织中观察到的活性相似

PEEK具有不吸收小分子的优点。测试了PEEK对烟碱和NNK的吸收，发现分子没有被该材料捕获。这一点非常重要，因为已知用于可商购获得的板的材料(诸如PDMS)会捕获小的疏水分子。图12示出了在4℃下温育8小时后，比较PEEK板和PDMS板中残留烟碱的量的图的结果。可以看出，与PDMS板中约35％的烟碱相比，约100％的烟碱残留在PEEK板中。因此，使用PDMS的用于可商购获得的材料将捕获小的疏水分子。

实施例3

冷冻保存的小瓶中提供了约1000万个

细胞。制备球状体的第一步是解冻冷冻保存的小瓶，并将细胞接种在多孔板的每个孔中(每孔约1000至50,000个细胞)。在该实验中，板的孔覆盖有超低附着涂层，并且孔具有U形底部以确保接种在单个孔中的细胞不会附着到壁上。使细胞在孔的底部团聚。约3天后，取决于所使用的孔的选择，它们将在多孔板的每个孔中形成单个球状体或多个球状体。

放置有肝球状体的细胞培养装置的细胞培养室具有本文所述的不连续表面，该不连续表面在该实施例中被涂覆。每个球状体均从多孔板独立地转移到细胞培养室中。每个隔室转移约40至100个球状体。将细胞培养装置连接至产生培养基流的泵。在我们将球状体用于其他实验之前，这些球状体可以在细胞培养装置中保留1至28天。

在以下编号段落中阐述了本公开的其他方面：

1.一种用于培养细胞的细胞培养装置，包括：

细胞培养室，所述细胞培养室包括底部和从所述底部延伸以包围所述细胞培养室的体积的侧壁，

所述细胞培养室的所述底部或所述侧壁中的适于流体连通到所述室中的入口；以及

所述细胞培养室的所述底部或所述侧壁中的适于流体连通到所述室外的出口；

其中所述细胞培养室的所述底部包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

2.根据段落1所述的细胞培养装置，其中所述细胞培养室的所述底部为大致圆形形状，适当地，其中所述底部的直径在约6mm±5％至约22mm±5％之间，适当地，其中所述底部的直径为约6mm±5％、约11mm±5％、约16mm±5％或约22mm±5％。

3.根据段落1或段落2所述的细胞培养装置，其中所述不连续表面包括多个凹槽，其中所述凹槽的深度和宽度对应于球状体的最大直径±10％。

4.根据段落3所述的细胞培养装置，其中所述多个凹槽的深度和宽度在约200至约1000μm之间，适当地，在约600至约1000μm之间。

5.根据段落3或段落4所述的细胞培养装置，其中所述凹槽在所述细胞培养室的所述底部上形成多个同心环。

6.根据段落1或段落2所述的细胞培养装置，其中所述不连续表面包括具有封闭的底部和开放的顶部的多个孔洞，所述孔洞的尺寸在深度和宽度上对应于比球状体的最大直径大约10％。

7.根据前述段落中任一项所述的细胞培养装置，其中所述细胞培养室包括用于培养球状体的细胞培养基。

8.根据前述段落中任一项所述的细胞培养装置，其中所述细胞培养室包括捕获在所述细胞培养室的所述不连续表面中的单独的球状体。

9.根据段落8所述的细胞培养装置，其中所述球状体是肺球状体。

10.根据前述段落中任一项所述的细胞培养装置，其中当所述细胞培养室中存在流体时，从所述细胞培养室的所述入口到所述出口的流体流量在约10至约1000μL/min之间，适当地，约1至约500μL/min，适当地，为约40μL/min。

11.根据段落10所述的细胞培养装置，其中所述细胞培养室中的剪切应力小于0.1达因/cm²。

12.根据前述段落中任一项所述的细胞培养装置，其中所述细胞培养装置是多孔板，并且所述多孔板的每个室是孔，所述多孔板包括至少两个孔。

13.根据前述段落中任一项所述的细胞培养装置，其中所述室中的至少一个的所述底部包括连续的平坦表面。

14.根据段落13所述的细胞培养装置，其中所述至少一个室包括定位在所述室的所述底部上方的插入物，适当地，其中所述插入物位于所述室内部的可渗透膜的顶部，以形成能够在空气/液体界面处培养细胞的表面。

15.根据段落13或14所述的细胞培养装置，其中包括所述连续的平坦表面的所述至少一个室的深度与包括所述不连续表面的所述至少一个室的深度不同，适当地，其中包括所述连续的平坦表面的所述至少一个室的深度小于包括所述不连续表面的所述至少一个室的深度。

16.根据段落13至15中任一项所述的细胞培养装置，其中所述细胞培养室包括用于在空气-液体界面处培养细胞的细胞培养基。

17.根据段落16所述的细胞培养装置，其中所述细胞培养室包括用于在空气-液体界面处培养细胞的细胞培养基。

18.根据段落17所述的细胞培养装置，其中所述细胞是肺细胞。

19.根据段落12至18中任一项所述的细胞培养装置，其中所述至少两个孔彼此流体连通。

20.一种培养细胞的方法，包括：

(i)提供根据段落1至19中任一项所述的细胞培养装置；

(ii)使所述细胞培养装置与细胞培养基和至少一种细胞类型接触；以及

(iii)培养所述细胞。

21.一种制备用于培养球状体的细胞培养装置的方法，包括：

(i)提供细胞培养室，所述细胞培养室包括：(a)基部和从所述基部延伸以包围所述细胞培养室的体积的侧壁；(b)所述细胞培养室的所述底部或所述侧壁中的适于流体连通到所述室中的入口；以及(c)所述细胞培养室的所述底部或所述侧壁中的适于流体连通到所述室外的出口；以及

(ii)向所述细胞培养室的所述底部添加适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

22.根据段落21所述的方法，其中所述不连续表面如段落3至6中任一项所述定义。

23.根据段落21或段落22所述的方法，其中使用计算机数控加工或注射成型将所述不连续表面提供到所述底部。

24.一种细胞培养室，包括具有不连续表面的底部，其中所述不连续表面包括捕获在其中的单独的单个球状体。

25.根据段落24所述的细胞培养室，其中所述不连续表面如段落3至6中任一项所述定义。

26.一种细胞培养装置，包括根据段落24或段落25所述的细胞培养室。

27.根据段落1至19和26中任一项所述的细胞培养装置，其中所述装置是多孔板。

28.根据段落24或段落25所述的细胞培养室，其中所述室是孔。

29.根据段落1至19、26和27中任一项所述的细胞培养装置或根据段落24、25或28中任一项所述的细胞培养室用于培养球状体或用于将球状体保持为单独的单种形式的用途。

30.一种球状体的培养物，其中所述球状体在培养5小时或5天后呈单独的单个球状体的形式。

在本文中引用的或描述的任何出版物都提供了在本申请的提交日期之前公开的有关信息。本文中的陈述不应解释为承认发明人丧失先于这样的公开的资格。在上面的说明书中提及的所有出版物都通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种修改和变化对于所属领域的技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合特定优选实施例来描述本发明，但应理解，如所要求的本发明不应不恰当地限于此类特定实施例。实际上，工程、细胞生物学和分子生物学或有关领域的技术人员显而易见的用于实现本发明的所描述模式的不同改进意图在以下权利要求书的范围内。

Claims (15)

1.一种减少或防止球状体团聚的方法，包括使用细胞培养装置，所述细胞培养装置包括：

细胞培养室，所述细胞培养室包括底部和从所述底部延伸以包围所述细胞培养室的体积的侧壁；

所述细胞培养室的所述底部或所述侧壁中的适于流体连通到所述室中的入口；以及

所述细胞培养室的所述底部或所述侧壁中的适于流体连通到所述室外的出口；

其中所述细胞培养室的所述底部包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

2.根据权利要求1所述的方法，包括：

(i)提供一个或多个单独的球状体；

(ii)将所述一个或多个单独的球状体转移到所述细胞培养装置的所述细胞培养室中；

(iii)在所述细胞培养装置中温育所述一个或多个单独的球状体；以及

(iv)在所述细胞培养装置的所述不连续表面上获取所述一个或多个单独的球状体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(ii)中转移已知数量的单独的球状体，并且在步骤(iv)中获取已知数量的单独的球状体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述不连续表面包括多个凹槽，其中所述凹槽的深度和宽度在约200至约1000μm之间，适当地，在约200至约600μm之间。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述凹槽在所述细胞培养室的所述底部上形成多个同心环。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述不连续表面包括具有封闭的底部和开放的顶部的多个孔洞，所述孔洞的尺寸在深度和宽度上对应于比球状体的最大直径大约10％。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养室由PEEK制造。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养室被适当地涂覆，其中涂层是聚(对二甲苯)聚合物的涂层。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将约40至约100个球状体转移到所述细胞培养装置的所述细胞培养室中。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将培养基流适当地施加到所述细胞培养装置的所述细胞培养室中，其中流速在约10至约1000μL/min之间。

11.细胞培养装置用于减少或防止球状体团聚的用途，所述细胞培养装置包括：

细胞培养室，所述细胞培养室包括底部和从所述底部延伸以包围所述细胞培养室的体积的侧壁，

所述细胞培养室的所述底部或所述侧壁中的适于流体连通到所述室中的入口；以及

所述细胞培养室的所述底部或所述侧壁中的适于流体连通到所述室外的出口；

其中所述细胞培养室的所述底部包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

12.一种多孔细胞培养板，其中所述多孔细胞培养板的所述孔中的至少一个和/或包含在所述多孔细胞培养板的所述孔中的至少一个中的插入物包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

13.一种在多孔细胞培养板中使用的插入物，包括适于减少或防止球状体团聚的不连续表面。

14.根据权利要求12所述的多孔细胞培养板或根据权利要求13所述的插入物，其中所述板和/或所述插入物由PEEK制造；或者

其中所述孔中的至少一个或所述插入物被适当地涂覆，其中涂层是聚(对二甲苯)聚合物的涂层。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的多孔细胞培养板或插入物，其中所述至少一个孔或所述插入物包括单独的单个球状体。

Images