BR112020011621B1

BR112020011621B1 - Dispositivo de cultura de células melhorado

Info

Publication number: BR112020011621B1
Application number: BR112020011621-1A
Authority: BR
Inventors: Sandoz Antonin; David Bovard
Original assignee: Philip Morris Products S.A
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2023-11-21
Also published as: RU2020121582A; SG11202005559VA; JP7427589B2; EP3728547A1; CN111836878A; BR112020011621A2; KR20200100685A; JP2021507701A; WO2019121984A1; CA3078869A1; US20200318048A1

Abstract

É descrito um método para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides que compreende o uso de um dispositivo de cultura de células compreendendo: uma câmara de cultura de células compreendendo uma base e paredes laterais que se estendem desde a base para circundar um volume da câmara de cultura de células; uma entrada na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com a câmara; e uma saída na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com o exterior da câmara; em que a base da câmara de cultura de células compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção diz respeito a dispositivos de cultura de células, métodos e usos dos mesmos. Um tipo de célula adequada para uso na presente descrição são as células ou tecidos organotípicos 3D, também conhecidas como esferoides.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] Estudos toxicológicos usando sistemas de cultura de células bidimensionais têm sido usados para examinar os efeitos de um ou mais agentes (por exemplo, fármacos) sobre a sobrevivência celular e a atividade enzimática etc. Embora ser capaz de cultivar células em camadas planas em superfícies de plástico seja simples e permita o estudo de vários aspectos da fisiologia celular e respostas aos estímulos, tais culturas de células não refletem a estrutura e arquitetura reais de um órgão. Em monocamadas bidimensionais, a matriz extracelular, as interações célula-célula e célula-matriz, que são essenciais para a diferenciação, proliferação e funções celulares, são perdidas.

[0003] Os sistemas de cultura tridimensional podem formar um te cido funcional com características semelhantes àquelas observadas in vivo. Em comparação com os sistemas de cultura bidimensionais, a cultura de células tridimensional permite que as células interajam com seus arredores em todas as três dimensões e é mais relevante fisiologica- mente. Tais culturas de células podem mostrar melhorias na viabilidade, proliferação, diferenciação, morfologia, resposta a estímulos, metabolismo de fármacos, expressão gênica e síntese de proteínas e similares. A cultura de células tridimensional pode produzir estruturas específicas tipo tecido e imitar as funções e respostas de tecidos verdadeiros de uma maneira que seja mais relevante fisiologicamente do que as mono- camadas de células bidimensionais tradicionais.

[0004] Diferentes técnicas foram desenvolvidas para a cultura de células bi- e tridimensional. Os métodos de cultura de células tridimensional incluem o uso de placas de gota suspensa, levitação magnética ou estruturas em andaime biomateriais.

[0005] Em um método de preparação de esferoides, as células são semeadas em poços onde são deixadas aglomerando-se na parte inferior do poço. Assim que as células formarem um aglomerado, elas formarão um único ou múltiplos esferoides em cada poço. A partir daqui os esferoides podem ser usados para qualquer finalidade necessária - como em experimentos que avaliam os esferoides, que podem incluir sua viabilidade, sua morfologia ou sua funcionalidade e similares.

[0006] A presente invenção procura fornecer melhorias relaciona das à cultura de células tridimensional.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Os presentes inventores têm estudado a cultura de células tridimensional. Inesperadamente, eles observaram que os esferoides podem ter uma tendência a aglomerar-se e fundir-se no mesmo lugar durante a cultura de células tridimensional para formar um único tecido grande. Isso pode ser problemático, já que quando os esferoides se fundem eles formam um tecido maior. Isso significa que é quase impossível determinar exatamente o número de esferoides presentes neste tecido maior, o que significa que o tecido não pode ser usado para outros experimentos em que é importante saber o número preciso de esferoides. Sem querer ater-se à teoria, os inventores observaram que as células no meio de um esferoide têm menos acesso a nutrientes em comparação com as células localizadas mais para o exterior do esferoide, de modo que as células mais para o meio do esferoide têm uma tendência a morrer. Isso se torna bem problemático quando os esferoides se aglomeram (o que pode ocorrer após 5 horas de cultura de células), já que um maior número de células no esferoide terá menos acesso a nutrientes. Isso também aumenta ainda mais o número de células mortas dentro do esferoide. Isso pode ser problemático por uma série de razões, incluindo: (1) moléculas liberadas das células mortas podem ter um impacto negativo sobre outras células no esferoide; (2) as células mortas não são metabolicamente ativas, de modo que a atividade metabólica do esferoide será reduzida; e (3) muitos ensaios exigem o uso de um único esferoide ou de um número conhecido de esferoides. Os presen-tes inventores procuraram resolver o problema dos esferoides aglomerando-se na cultura de células tridimensional. Eles descobriram surpreendentemente que este problema poderia ser elegantemente resolvido a partir da formação de uma superfície descontínua na base de uma câmara de cultura de células - como um poço de uma placa multipoços - de modo que os esferoides na superfície descontínua da câmara fiquem presos na superfície descontínua. Isso efetivamente reduz a extensão ou impede a aglomeração ou fusão dos esferoides. Vantajosamente, os inventores descobriram que os esferoides podem ser manti-dos como esferoides únicos individualizados de acordo com a presente descrição.

[0008] Em um aspecto da presente invenção, divulga-se um método para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides que compreende o uso de um dispositivo de cultura de células compreendendo: uma câmara de cultura de células compreendendo uma base e paredes laterais que se estendem desde a base para circundar um volume da câmara de cultura de células; uma entrada na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com a câmara; e uma saída na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com o exterior da câmara; em que a base da câmara de cultura de células compreende uma su-perfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides.

[0009] Em uma modalidade da presente invenção, o método com preende (i) fornecer um ou mais esferoides individuais; (ii) transferir os esferoides individuais para a câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células; (iii) incubar os esferoides individuais no dispositivo de cultura de células; e (iv) obter esferoides individuais na superfície descontínua do dispositivo de cultura de células.

[0010] Em uma modalidade da presente invenção, um número co nhecido de esferoides individuais é transferido na etapa (ii) e um número conhecido de esferoides individuais são obtidos na etapa (iv).

[0011] Em uma modalidade da presente invenção, a superfície des contínua compreende uma pluralidade de sulcos em que a profundidade e largura dos sulcos está entre cerca de 200 a cerca de 1000 μm, apropriadamente, entre cerca de 200 a cerca de 600 μm.

[0012] Em uma modalidade da presente invenção, os sulcos for mam uma pluralidade de anéis concêntricos na base da câmara de cultura de células.

[0013] Em uma modalidade da presente invenção, a superfície des contínua compreende uma pluralidade de furos com uma parte inferior fechada e uma parte superior aberta, em que o tamanho dos furos corresponde em profundidade e largura a cerca de 10% maior que o maior diâmetro de um esferoide.

[0014] Em uma modalidade da presente invenção, a câmara de cul tura de células é fabricada a partir de PEEK.

[0015] Em uma modalidade da presente invenção, a câmara de cul tura de células é revestida, apropriadamente, em que o revestimento é um revestimento de polímero de poli(p-xilileno).

[0016] Em uma modalidade da presente invenção, entre cerca de 40 a cerca de 100 esferoides são transferidos para a câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células.

[0017] Em uma modalidade da presente invenção, um fluxo médio é aplicado à câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células, apropriadamente, em que a taxa de fluxo está entre cerca de 10 a cerca de 1000 μL/min.

[0018] Em outro aspecto da presente invenção, divulga-se o uso de um dispositivo de cultura de células para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides, o referido dispositivo de cultura de células compreendendo: uma câmara de cultura de células compreendendo uma base e paredes laterais que se estendem desde a base para circundar um volume da câmara de cultura de células, uma entrada na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com a câmara; e uma saída na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com o exterior da câmara; em que a base da câmara de cultura de células compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides.

[0019] Em outro aspecto da presente invenção, divulga-se uma placa de cultura de células multipoços em que pelo menos um dos poços da placa de cultura de células multipoços e/ou um inserto contido em pelo menos um dos poços da placa de cultura de células multipoços compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides.

[0020] Em outro aspecto da presente invenção, divulga-se um in- serto para uso em uma placa de cultura de células multipoços que compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides.

[0021] Em uma modalidade, a placa e/ou inserto é fabricado a partir de PEEK.

[0022] Em uma modalidade, pelo menos um dos poços e/ou o in- serto é revestido, apropriadamente, em que o revestimento é um revestimento de polímero de poli(p-xilileno).

[0023] Em uma modalidade, o pelo menos um poço e/ou inserto compreende um esferoide único individualizado.

[0024] Em uma modalidade, a base da câmara de cultura de células é substancialmente circular em forma.

[0025] Em uma modalidade, o diâmetro da base dos poços está en tre cerca de 6 mm ± 5% e cerca de 22 mm ± 5%, apropriadamente, em que o diâmetro da base é de cerca de 6 mm ± 5%, cerca de 11 mm ± 5% ou cerca de 16 mm ± 5% ou cerca de 22 mm ± 5%.

[0026] Em uma modalidade, a superfície descontínua compreende uma pluralidade de sulcos nas quais a profundidade e largura dos sulcos corresponde ao maior diâmetro ± 10 % de um esferoide.

[0027] Em uma modalidade, a profundidade e largura da pluralidade de sulcos está entre cerca de 200 a cerca de 1000 μm, apropriadamente, entre cerca de 600 a cerca de 1000 μm.

[0028] Em uma modalidade, os sulcos formam uma pluralidade de anéis concêntricos na base da câmara de cultura de células.

[0029] Em uma modalidade, a superfície descontínua compreende uma pluralidade de furos com uma parte inferior fechada e uma parte superior aberta, em que o tamanho dos furos corresponde em profundidade e largura a cerca de 10% maior que o maior diâmetro de um esfe- roide.

[0030] Em uma modalidade, a câmara de cultura de células com preende o meio de cultura de células para cultivar esferoides.

[0031] Em uma modalidade, a câmara de cultura de células com preende esferoides individuais presos na superfície descontínua da câmara de cultura de células.

[0032] Em uma modalidade, os esferoides são esferoides pulmona res.

[0033] Em uma modalidade, o fluxo de fluido da entrada para a sa ída da câmara de cultura de células, quando o fluido está presente na mesma, está entre cerca de 10 a cerca de 1000 μL/min, apropriadamente, cerca de 1 a cerca de 500 μL/min, apropriadamente, cerca de 40 μL/min.

[0034] Em uma modalidade, a tensão de cisalhamento na câmara de cultura de células é inferior a cerca de 0,1 dina/cm2 - como cerca de 0,08 dina/cm2 ou menos ou cerca de 0,04 dina/cm2

[0035] Em uma modalidade, o dispositivo de cultura de células é uma placa multipoços e cada câmara da placa multipoços é um poço, a referida placa multipoços compreendendo pelo menos dois poços.

[0036] Em uma modalidade, a base de pelo menos um dos poços compreende uma superfície plana que é desprovida de descontinuida- des.

[0037] Em uma modalidade, a pelo menos uma câmara compre ende um inserto posicionado acima da base da câmara, apropriadamente, em que o inserto está localizado na parte superior de uma membrana permeável localizada dentro da câmara para formar uma superfície que é capaz de cultivar uma célula em uma interface de ar/líquido.

[0038] Em uma modalidade, a profundidade do pelo menos uma câ mara compreendendo a superfície plana que é desprovida de desconti- nuidades é diferente da profundidade da pelo menos uma câmara compreendendo a superfície descontínua, apropriadamente, em que a profundidade da pelo menos uma câmara compreendendo a superfície plana que é desprovida de descontinuidades é menor do que a profundidade da pelo menos uma câmara compreendendo a superfície descontínua.

[0039] Em uma modalidade, a câmara de cultura de células com preende o meio de cultura de células para cultivar uma célula em uma interface ar-líquido.

[0040] Em uma modalidade, a câmara de cultura de células com preende células posicionadas na membrana permeável, em que as referidas células são capazes de crescer em uma interface de ar-líquido.

[0041] Em uma modalidade, as células são células pulmonares.

[0042] Em uma modalidade, pelo menos dois poços estão em co municação fluida entre si.

[0043] Apropriadamente, a superfície descontínua é conforme defi nida neste documento.

[0044] Apropriadamente, a superfície descontínua é fornecida à base usando usinagem de controle numérico do computador ou moldagem por injeção.

[0045] Apropriadamente, o dispositivo é uma placa multipoços.

[0046] Apropriadamente, a câmara é um poço.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0047] A Figura 1 é uma seção transversal do poço com uma plu ralidade de sulcos concêntricos para prender esferoides individuais (marcados como “ver detalhe B” na Figura 4). As dimensões estão em milímetros.

[0048] A Figura 2 é uma vista plana do poço com uma pluralidade de sulcos concêntricos para prender esferoides individuais (marcados como “ver detalhe B” na Figura 4). As dimensões estão em milímetros.

[0049] A Figura 3 é uma vista plana do poço que contém um canal microfluídico (marcado como “ver detalhe C” na Figura 4). As dimensões estão em milímetros.

[0050] A Figura 4 é uma vista plana de uma placa multipoços que contém poços com uma pluralidade de sulcos concêntricos para prender esferoides individuais (marcados como “ver detalhe B”) e poços que contêm um inserto (marcados como “ver detalhe C”). Os poços são conectados por um canal de modo que cada um dentre o primeiro poço (“ver detalhe B”) e o segundo poço (“ver detalhe C”) está em comunicação fluida um com o outro. As dimensões estão em milímetros.

[0051] A Figura 5 é uma vista de seção transversal da linha C-C na Figura 4.

[0052] A Figura 6 é uma seção transversal do poço com uma plu ralidade de furos na base do mesmo para alcançar a função de prender esferoides individuais (marcados como “ver detalhe B” na Figura 8).

[0053] A Figura 7 é uma vista plana de um poço individual com uma pluralidade de furos para prender esferoides individuais na base do mesmo, conforme mostrado na Figura 6. As dimensões estão em milímetros.

[0054] A Figura 8 é uma vista plana de uma placa multipoços que contém poços com uma pluralidade de furos para prender esferoides individuais (marcados como “ver detalhe B”) e poços que contêm um inserto (marcados como “ver detalhe C”). Os poços são conectados por um canal de modo que cada um dentre o primeiro poço (“ver detalhe B”) e o segundo poço (“ver detalhe C”) está em comunicação fluida um com o outro. As dimensões estão em milímetros.

[0055] A Figura 9 é uma vista de seção transversal ao longo da linha C-C da Figura 8.

[0056] A Figura 10 mostra os resultados da tensão de cisalhamento calculada para cada um dentre os dois poços diferentes, conforme mostrado na Figura, e os parâmetros usados para calcular a tensão de cisa- lhamento.

[0057] A Figura 11(a) mostra esferoides aglomerados. A Figura 11(b) mostra esferoides não aglomerados em forma individualizada obtidos de acordo com a presente descrição.

[0058] A Figura 12 mostra um gráfico que compara a quantidade de nicotina que resta em uma placa PEEK e uma placa PDMS após 8 horas de incubação a 4 °C.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0059] A prática da presente descrição emprega, a menos de indi cado o contrário, técnicas convencionais de engenharia, microengenha- ria, microbiologia, biologia celular e bioquímica. Tais técnicas são explicadas inteiramente na literatura, tal como, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. CeIMs, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, IB. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994). Os procedimentos que empregam kits e reagentes disponíveis comercialmente serão usados normalmente de acordo com os protocolos definidos pelo fabricante, a menos que indicados de outra forma.

[0060] Os termos técnicos e expressões usados neste, geralmente, são para dar o significado que comumente se lhes aplica na técnica pertinente da biologia molecular, microbiologia, biologia celular e bioquímica. Todas as definições de termos a seguir aplicam-se ao conteúdo completo deste pedido.

[0061] Conforme usado neste documento, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referentes no singular e no plural, se claramente especificado em contrário.

[0062] O termo "e/ou" se refere a (a) ou (b) ou ambos (a) e (b).

[0063] Os termos "compreendendo", "compreende" e "compreen dido", conforme usados neste documento, são sinônimos de "incluindo", "inclui" ou "contendo", "contém", e são inclusivos ou abertos e não excluem membros, elementos ou etapas de método adicionais não citados.

[0064] O termo "consistindo em" significa que componentes adicio nais são excluídos e tem apenas os elementos recitados e nada mais.

[0065] A menção de intervalos numéricos por pontos de extremi dade inclui todos os números e frações subsumidos nos respectivos intervalos, assim como nos pontos de extremidade citados.

[0066] O termo "cerca", conforme usado neste documento, quando se refere a um valor mensurável, como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e similares, destina-se a abranger variações de e a partir do valor especificado, em variações específicas de +/-10% ou menos, preferencialmente +/-5% ou menos, mais preferencialmente +/1% ou menos, e ainda mais preferencialmente +/-0,1% ou menos de e a partir do valor especificado, na medida em que tais variações são apropriadas para executar a descrição. Deve ser compreendido que o valor ao qual o modificador "cerca" se refere é também divulgado, especificamente e preferencialmente.

[0067] Considerando que o termo "um ou mais", tal como um ou mais membros de um grupo de membros, é claro em si, por meio de uma exemplificação adicional, o termo abrange inter alia uma referência a qualquer um dos referidos membros ou quaisquer dois ou mais dos referidos membros, tais como, por exemplo, quaisquer >3, >4, >5, >6 ou >7 etc. dos referidos membros e até todos os referidos membros.

Cultura de células

[0068] A cultura de células geralmente se refere à remoção de cé lulas de um tecido antes do cultivo em um ambiente artificial. As células a serem cultivadas podem ser removidas diretamente de um tecido contendo a célula a ser cultivada e tratada opcionalmente com meios enzi- máticos ou mecânicos antes da cultura. Como alternativa, as células a serem cultivadas podem ser derivadas de uma cepa ou linhagem de célula previamente estabelecida.

[0069] O cultivo in vitro de células fornece o material necessário para estudar vários aspectos de uma célula que inclui a fisiologia; a bioquímica; os efeitos dos agentes, incluindo aerossóis; a triagem e desenvolvimento ou otimização dos agentes; o estudo da eficácia do agente; o estudo da absorção de agentes; triagens de toxicidade; toxi- cologia; descoberta de alvo; farmacocinética; farmacodinâmica; e medicina regenerativa, opcionalmente em tempo real.

[0070] As células são tipicamente cultivadas em um dispositivo de cultura de células compreendendo uma câmara ou recipiente. Exemplos desses dispositivos de cultura de células incluem garrafas, pratos e placas - como placas de microtitulação, ou placas ou microplacas multipo- ços, frascos - como frascos comuns e frascos para cultivo de células multicamadas, vasos e biorreatores. As células na cultura normalmente se fixam e crescem na parte inferior do recipiente imersos em uma cultura de células ou mídia de sustentação adequada. A câmara ou recipiente incluirá portas para direcionar o fluxo de mídia de cultura de células para dentro e para fora da câmara ou recipiente.

[0071] O dispositivo de cultura de células da presente descrição in clui uma câmara de cultura de células composta por uma base e paredes laterais que se estendem desde a base para circundar um volume da câmara de cultura de células. As portas para direcionar o fluxo de meios de cultura de células para dentro e para fora da câmara podem incluir: (1) uma entrada na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células que é adaptada para comunicação fluida com a câmara e; (2) uma saída na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com o exterior da câmara. A câmara de cultura de células compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides, conforme descrito abaixo. Apropriadamente a entrada e a saída estão localizadas acima da superfície descontínua.

Dispositivo de cultura de células

[0072] Em uma modalidade, o dispositivo de cultura de células é uma placa multipoços na forma de uma placa plana compreendendo pelo menos duas câmaras na forma de poços (por exemplo, uma pluralidade ou numerosos poços). Em geral, a placa inteira é retangular e a capacidade do poço pode ser de vários μL a vários mL, conforme necessário.

[0073] Em pelo menos dentre os pelo menos dois poços, a base do poço compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides.

[0074] Uma placa multipoços pode ser fabricada em vários formatos - tal como nos formatos de 24, 48, 96, 384 ou 1536 poços/câmara - e pode ser prontamente selecionada pela pessoa versada na técnica com base no tamanho e escolha do experimento que está destinado a ser realizado. A placa multipoços pode ser uma placa padrão que está comercialmente disponível e muito bem conhecida pelos versados na técnica.

[0075] Apropriadamente, quando a câmara está na forma de um poço, a base dela é substancialmente circular em forma.

[0076] Apropriadamente, o diâmetro da base dos poços está entre cerca de 6 mm ± 5% e cerca de 22 mm ± 5%, apropriadamente, em que o diâmetro da base é de cerca de 6 mm ± 5%, cerca de 11 mm ± 5% ou cerca de 16 mm ± 5% ou cerca de 22 mm ± 5%.

[0077] A placa multipoços também pode ser configurada para con ter pelo menos dois poços dispostos sequencialmente. A placa multipo- ços pode ser configurada para conter pelo menos dois poços dispostos de forma linear.

[0078] Os poços em uma placa multipoços são dispostos em filei ras. Por exemplo, uma placa de 8 poços pode ser configurada em 2 fileiras lineares com 4 poços adjacentes em cada fileira. A título de outro exemplo, uma placa de 24 poços pode ser configurada em 4 fileiras lineares com 6 poços adjacentes em cada fileira. A título de outro exemplo, uma placa de 48 poços pode ser configurada em 6 fileiras lineares com 8 poços adjacentes em cada fileira. A título de outro exemplo, uma placa de 96 poços pode ser configurada em 8 fileiras lineares com 12 poços adjacentes em cada fileira. As placas de cultura de células podem até ser fabricadas ou construídas de modo personalizado, se necessário, para fornecer o número necessário de poços na placa.

[0079] O dispositivo de cultura de células pode ser equipado com uma tampa na parte superior do dispositivo que ajuda a reduzir a evaporação do meio de cultura de células e o risco de contaminação. A tampa, preferencialmente, não é vedada, de modo que o ar possa circular dentro do dispositivo, o que também pode ajudar no cultivo/manu- tenção das células.

[0080] A composição do dispositivo de cultura de células não é par ticularmente limitada, desde que não seja citotóxica e seja adequada para a cultura de células. Pode ser fabricado a partir de uma resina acrílica, um ácido poliglicólico, uma resina tipo estireno, um ácido polilático, uma resina copolimérica tipo acrílico ou estireno, uma resina de policarbonato, uma resina à base de álcool de polivinila, uma resina à base de poliéster, uma resina de copolímero de álcool de etileno ou vinila, uma resina de cloreto de vinila, um elastômero termoplástico, uma resina de silicone, ou qualquer combinação dos mesmos. Pode ser feito a partir de poli-tetrafluoroetileno (PTFE), aço inoxidável (por exemplo, 316L/1.4435), poli(éter-éter-cetona) PEEK, polipropileno ou polissulfona ou uma combinação de um ou mais dos mesmos. Um revestimento - como um revestimento de polímero de poli(p-xilileno) ou poli-2-hema - pode ser aplicado, se necessário.

[0081] Em certas modalidades, o uso de PEEK é particularmente preferencial, visto que tem a vantagem de não ser absorvente em relação a moléculas pequenas - como a nicotina e NNK, conforme descrito abaixo.

[0082] O dispositivo de cultura de células pode ser projetado por CAD (Computer-Aided Design, projeto auxiliado por computador) se necessário ou, se o dispositivo de cultura de células for baseado em uma placa padrão multipoços, então a placa padrão multipoços estará disponível comercialmente. As placas de CAD podem ser produzidas por mi- crousinagem mecânica usando métodos que são bem conhecidos na técnica.

[0083] O dispositivo de cultura de células - como a placa multipoços - contém uma entrada na base ou nas paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com a câmara e uma saída na base ou nas paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com o exterior da câmara, opcionalmente em um poço adjacente. Isso permite o fluxo de fluidos - como o meio de cultura - pelos esferoides e sua exposição ao fluxo de fluidos. Em certas modalidades, isso pode ser alcançado, por exemplo, através da formação de pelo menos um furo em um ou mais dos poços da placa de cultura de células e, em seguida, conectando cada um dos poços através do(s) furo(s) a um canal (por exemplo, um conduíte ou cano). Em uma modalidade, o(s) canal(is) é(são) diretamente usi- nado(s) ou embutido(s) dentro da placa de cultura de células para fornecer a conexão dos pelo menos dois poços. Apropriadamente, o(s) ca- nal(is) percorre(m) sob a câmara de cultura de células. O canal pode conter aberturas em cada extremidade. O canal pode ser um canal mi- crofluídico. Tipicamente, pelo menos uma extremidade da abertura está conectada a uma bomba. Cada extremidade da abertura pode terminar na mesma bomba ou em uma bomba diferente.

[0084] Vários tipos de conector podem ser usados para conectar o canal a uma primeira bomba. Um exemplo é um conector Luer - tal como um conector Luer-lock - ou um conector de tubo simples.

[0085] O canal pode ser configurado para unir em comunicação flu ida uma primeira fileira de poços e uma segunda fileira de poços e opcionalmente uma terceira fileira de poços e assim por diante, conforme necessário. O canal pode ser configurado como uma curva em U para conectar as diferentes fileiras de poços. A curva em U pode ser localizada interna ou externamente ao dispositivo de cultura de células. Quando a alça estiver localizada externamente ao dispositivo de cultura de células, então um conector - como um conector Luer ou um conector Luer-lock ou um conector de tubo simples - pode ser usado para vedar e engatar a curva em U ao dispositivo de cultura de células.

[0086] A tubulação pode ser usada para conectar os diferentes ca nais entre si - como a tubulação de silício ou a tubulação PharMed®.

[0087] Quando o fluido é transportado pelo canal, ele pode ser transportado a partir da bomba e, em seguida, devolvido à bomba, se necessário. O fluido pode ser circulado no sentido horário ou anti-horário através dos poços, conforme necessário. Mais de uma bomba pode ser usada, se necessário.

[0088] Em certas modalidades, o fluxo de fluido da entrada para a saída da câmara de cultura de células, quando o fluido está presente nela, está entre cerca de 10 a cerca de 1000 μL/min, apropriadamente, cerca de 1 a cerca de 500 μL/min, apropriadamente, cerca de 10 a cerca de 500 μL/min, apropriadamente, cerca de 40 μL/min, ou apropriadamente, cerca de 1 a cerca de 60 μL/min. Como será apreciado pelos versados na técnica, quando o fluido fluir por um limite sólido, incorrerá em uma tensão de cisalhamento sobre esse limite, o que pode levar à perturbação das células expostas à tensão de cisalhamento. No contexto da presente descrição, quando o fluido se mover através do dispositivo de cultura de células, uma tensão de cisalhamento será criada. É desejável que a tensão de cisalhamento na câmara de cultura de células seja menor do que cerca de 0,1 dina/cm2 - como cerca de 0,08 dina/cm2 ou menos ou 0,04 dina/cm2 ou menos - visto que isso não causa perturbação das células expostas à tensão de cisalhamento. A tensão de cisalhamento pode ser diferente em diferentes tipos de câmara de cultura de células. Por exemplo, uma câmara de cultura de células com uma superfície descontínua pode ter uma tensão de cisalha- mento de cerca de 0,04 dina/cm2. Por exemplo, uma câmara de cultura de células com uma superfície plana não descontínua pode ter uma tensão de cisalhamento de cerca de 0,08 dina/cm2. Apropriadamente, a tensão de cisalhamento na câmara de cultura de células com uma superfície descontínua é menor do que uma câmara de cultura de células com uma superfície plana e não descontínua.

[0089] Para que a análise possa ser usada para a varredura, a parte inferior da câmara ou recipiente ou poço pode ser feito de um material com uma transmissão de luz total de 70% ou de 80% ou de 90% ou mais.

[0090] Em uma modalidade, a placa de cultura de células é uma placa de cultura de células microfluídica que está amplamente disponível na técnica. Por exemplo, uma placa de cultura de células microfluí- dicas M04S está disponível em Cellasic, Califórnia, EUA, e contém 4 poços/câmaras independentes, cada poço/câmara tendo cerca de 2,8 mm de diâmetro com uma altura de 120 mícrons.

[0091] Em um aspecto, o dispositivo de cultura de células da pre sente descrição está na forma de uma placa de cultura de células mul- tipoços. Pelo menos um dos poços da placa de cultura de células multi- poços pode incluir uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides. Como será apreciado pelos versados na técnica, um dispositivo de cultura de células - como uma placa de cultura de células multipoços - pode incluir várias peças componentes que podem ser encaixadas umas às outras para formar o dispositivo completo de cultura de células. Em uso, nem todas essas peças componentes devem estar presentes no dispositivo. Assim, por exemplo, determinadas células para o uso na presente descrição podem ser cultivadas em insertos que podem ser compartimentados nos poços da placa de cultura de células, conforme desejado neste documento abaixo. Assim, em outro aspecto, também é descrita um inserto para uso em um dispositivo de cultura de células - como uma placa de cultura de células multipoços - compreendendo uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides. O dispositivo de cultura de células e/ou a inserção podem ser fabricados a partir de PEEK conforme descrito em detalhes neste documento. O dispositivo de cultura de células e/ou o inserto podem ser revestidos conforme descrito em detalhes neste documento, apropriadamente, em que o revestimento é um revestimento de polímero de poli(p-xilileno). O dispositivo de cultura de células e/ou o inserto podem compreender um esferoide único individualizado, conforme descrito em detalhes neste documento.

Bomba

[0092] Uma ou mais bombas para uso na presente descrição po dem ser uma bomba de deslocamento positivo que é operável para circular fluido - como uma bomba peristáltica. Conforme entendido na técnica, uma bomba peristáltica é uma bomba usada para mover um fluido. O fluido pode ser contido dentro de um canal descrito neste documento - o canal pode ser um tubo flexível que se encaixa dentro de um invólucro de bomba. Alternativamente, se o canal for diretamente usinado (por exemplo, incorporado) na placa, um adaptador pode ser usado para conectar o canal usinado ou incorporado à bomba. Um rotor unido à circunferência externa do mesmo comprime o tubo ou canal flexível. Conforme o rotor gira, a parte do tubo ou canal sob compressão é comprimida fechada para forçar o fluido através do tubo ou canal.

[0093] Em uma modalidade, a(s) bomba(s) compreende(m) um mo tor de passo ou um motor sem escovas que compreende um codificador.

[0094] Cada motor pode ser controlado por um controlador de mo tor, pela operação e pelos sensores dos quais pode ser controlado por um microcontrolador.

Insertos

[0095] Determinadas células para uso na presente descrição po dem ser cultivadas em insertos que podem ser compartimentados nos poços do dispositivo de cultura de células, conforme desejado. As células são tipicamente cultivadas em uma membrana permeável contida no inserto. Em geral, as células serão cultivadas em cima da membrana permeável. O inserto é colocado em um poço ou câmara. Quando o poço ou câmara é preenchida com fluido - como o meio de cultura de células - o fluido passará pela membrana permeável e entrará em contato com as células para que possam ser cultivadas no inserto. Diferentes tipos de células podem ser cultivados no inserto, conforme descrito neste documento. Os insertos estão disponíveis comercialmente. A título de exemplo, podem ser usados insertos de cultura de células permeáveis ThinCertTM (USA Scientific, Flórida, EUA). Estes estão disponíveis em vários tamanhos e acabamentos e podem ser prontamente selecionados pela pessoa versada na técnica para uso na presente descrição. Cada inserto pode ter suspensores de autoposicionamento que eliminam efeitos capilares e maximizam o acesso do pipetador ao poço posicionando o inserto ligeiramente fora do centro. Insertos de cultura de células ThinCertTM são compatíveis com placas multipoços padrão. A título de um exemplo adicional, podem ser usados suportes permeáveis Corning® HTS Transwell® (Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido). Suportes permeáveis Corning® HTS Transwell® têm uma matriz de 24 ou 96 poços com insertos permeáveis conectados por uma bandeja rígida. Conforme descrito neste documento, divulga-se um inserto para uso em uma placa de cultura de células multipoços compreendendo uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides.

Superfície descontínua

[0096] De acordo com a presente descrição, a base da câmara de cultura de células - como a base de um poço em uma placa multipoços - ou o inserto compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides. Entende-se que nem todas as câmaras ou poços ou insertos que possam estar contidos no dispositivo de cultura de células precisam incluir a superfície descontínua, pois nem todas as câmaras ou poços podem ser usados para a cultura de esferoides e um inserto pode não estar presente em todos os poços. Por exemplo, alguns poços podem ser usados para a cultura de outros tipos de células, que não exigem o uso da superfície descontínua ou de um inserto. Por exemplo, alguns poços podem ser usados para a cultura de outros tipos de células, que exijam ou não exijam o uso de um inserto para criar uma interface ar-líquido.

[0097] Apropriadamente, a superfície descontínua prende os esfe- roides para reduzir ou impedir a aglomeração ou fusão dos mesmos. Apropriadamente, a superfície descontínua prende esferoides individuais para reduzir ou impedir a aglomeração ou fusão dos mesmos.

[0098] Em certas modalidades, a superfície descontínua é formada por um ou mais sulcos. Os sulcos podem funcionar para prender os es- feroides para reduzir ou impedir a aglomeração dos mesmos. O tamanho do(s) sulco(s) geralmente corresponderá ao maior diâmetro ± 10% de um esferoide de modo que os esferoides possam ser presos ou mantidos no(s) sulco(s). Apropriadamente, o(s) sulco(s) cobrirá(ão) a maioria da base da câmara de cultura de células ou do inserto, já que a presença de uma superfície plana na base da câmara de cultura de células ou do inserto pode levar à aglomeração de esferoides, o que pode levar à formação de grandes agregados celulares, o que não é desejável. Em certas modalidades, pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% da base da câmara de cultura de células ou do inserto conterá a super-fície descontínua - como o(s) sulco(s).

[0099] Apropriadamente, a profundidade e largura da superfície descontínua - como a pluralidade de sulcos - na base da câmara de cultura de células ou do inserto está entre cerca de 200 μm a cerca de 1000 μm, apropriadamente, entre cerca de 200 μm a cerca de 600 μm. Uma profundidade e largura de cerca de 600 μm a cerca de 1000 μm também é divulgada. A profundidade e largura reais serão determinadas pelo tamanho dos esferoides que se destinam a ser usados na câmara de cultura de células ou no inserto e presos. Assim, por exemplo, alguns esferoides têm um diâmetro máximo de cerca de 600 μm, caso em que a profundidade e largura da superfície descontínua - como a pluralidade de sulcos - será de cerca de 600 μm ± 10%. Em algumas modalidades, é desejável que a profundidade e a largura da superfície descontínua - como a pluralidade de sulcos - seja maior do que o diâmetro máximo do esferoide - como 20%, 30%, 40%, 50% ou 60% ou mais do que o diâmetro máximo do esferoide. Em uma modalidade, o esferoide tem um diâmetro máximo de 600 μm e a superfície descontínua - como a pluralidade de sulcos tem uma altura de cerca de 1 mm e uma largura de cerca de 1 mm ou uma largura de cerca de 2 mm.

[0100] Geralmente, a forma dos sulcos pode ser uma parte inferior de formato plano, uma forma em U, uma forma em V, ou uma forma em V com uma parte inferior plana e similares. Em uma modalidade, os sulcos têm uma forma em V com uma parte inferior plana. Em uma modalidade, a largura máxima da abertura do sulco é de cerca de 2,4 mm, a profundidade do sulco é de cerca de 1 mm e a largura da parte inferior plana na base do sulco é de cerca de 400 μm. O ângulo dos lados opostos do sulco de acordo com esta modalidade é de cerca de 90 graus.

[0101] Voltando-se para a Figura 1, é mostrada um dispositivo de cultura de células 10 compreendendo uma câmara de cultura de células 12 com uma pluralidade de sulcos 16 na base da mesma contendo sulcos em forma de V cada um com uma parte inferior plana. A largura máxima da abertura nos sulcos é de cerca de 2,4 mm, a profundidade dos sulcos é de cerca de 1 mm e a largura da parte inferior plana na base dos sulcos é de cerca de 400 μm. O ângulo dos lados opostos do(s) sulco(s) é de cerca de 90 graus. Embora a pluralidade de sulcos seja ilustrada como tendo a mesma forma, contempla-se que sulcos com diferentes formas podem ser usados. Por exemplo, a base da câmara de cultura de células ou do inserto pode incluir uma pluralidade de sulcos em que a forma de um ou mais dos sulcos é diferente. A base da câmara de cultura de células ou do inserto pode, portanto, compreender uma pluralidade de sulcos contendo dois ou mais de uma parte inferior de forma plana, uma forma em U, uma forma em V, ou uma forma em V com uma parte inferior plana e similares.

[0102] Em certas modalidades, os sulcos formam uma pluralidade de anéis concêntricos na base da câmara de cultura de células ou do inserto. Em uma modalidade, o raio dos anéis concêntricos é de cerca de 1,05 mm, cerca de 3,45 e cerca de 5,85 mm. Voltando-se para a Figura 2, é mostrada a base de uma câmara de cultura de células 12 com uma pluralidade de anéis concêntricos 17 formados pelos sulcos 16, o raio dos anéis concêntricos é de cerca de 1,05 mm, cerca de 3,45 e cerca de 5,85 mm.

[0103] Voltando-se agora para a Figura 4, é mostrado uma vista plana de um dispositivo de cultura de células 10 na forma de uma placa multipoços. O dispositivo de cultura de células 10 contém uma pluralidade de câmaras de cultura de células 12 na forma de poços, os poços contendo uma pluralidade de sulcos concêntricos 17 ou contendo um canal microfluídico 18. Os poços são dispostos linearmente em fileiras. Uma fileira pode ser configurada para conter pelo menos um poço contendo os sulcos concêntricos 17. Uma fileira pode ser configurada para conter pelo menos um poço contendo os sulcos concêntricos 17 e pelo menos um poço contendo um canal microfluídico 18, conforme mostrado na Figura 4.

[0104] Um canal 19 conecta um poço contendo uma pluralidade de sulcos concêntricos 17 e um poço contendo um canal microfluídico 18. Cada poço contém uma entrada e uma saída para a comunicação fluida em cada poço e fora de cada poço. Embora a Figura 4 mostre cada câmara de cultura de células 12 no dispositivo de cultura de células 10 contendo os sulcos concêntricos 17 ou contendo o canal microfluídico 18, aqueles versados na técnica entenderão que não é essencial que cada câmara de cultura de células 12 seja configurada dessa forma e que é possível que uma ou mais das câmaras de cultura de células 12 não contenham os sulcos concêntricos 17 e/ou não contenham o canal microfluídico 18. Algumas das câmaras de cultura de células 12 podem ficar vazias e não serem utilizadas, conforme necessário.

[0105] Em certas modalidades, a superfície descontínua é formada por um ou mais sulcos que são moldados como ondas por toda a base da câmara de cultura de células ou do inserto.

[0106] Em certas modalidades, a superfície descontínua compre ende uma pluralidade de furos. Os furos normalmente têm uma parte inferior fechada e um topo aberto. Os furos funcionam para prender es- feroides individuais para reduzir ou impedir a aglomeração dos mesmos. O tamanho dos furos geralmente corresponderá ao maior diâmetro ± 10% de um esferoide de modo que os esferoides possam ser presos ou mantidos nos furos. A superfície descontínua pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 ou mais furos distribuídos por toda a parte inferior da câmara de cultura de células. A superfície descontínua pode conter de 130 a 160 furos distribuídos através da parte inferior da câmara de cultura de células. A superfície descontínua pode conter de 130 a 150 furos distribuídos através da parte inferior da câmara de cultura de células. A superfície descontínua pode conter de 130 a 140 furos distribuídos através da parte inferior da câmara de cultura de células ou do inserto. Geralmente, a forma dos furos pode incluir uma parte inferior de formato plana, uma forma em U, uma forma em V, ou uma forma em V com uma parte inferior plana e similares. O formato dos furos não é particularmente limitado desde que os furos possam acomodar o maior diâmetro ± 10% de um esferoide a fim prender esferoides individuais. Em certas modalidades, a profundidade e largura dos furos está entre cerca de 200 a cerca de 1000 μm, adequadamente, entre cerca de 600 a cerca de 1000 μm. Em certas modalidades, pelo menos 70%, 80% ou 90% ou mais da base da câmara de cultura de células ou do inserto será ocupada por furos.

[0107] Voltando-se para a Figura 6, é mostrado dispositivo de cul tura de células 20 compreendendo uma câmara de cultura de células (poço) 22 com uma pluralidade de furos 26 na base da mesma. Os furos têm uma parte inferior fechada e uma parte superior aberta. A largura máxima de cada furo é de cerca de 0,8 mm, a profundidade dos sulcos é de cerca de 0,5 mm. O ângulo dos lados opostos dos furos é de cerca de 118 graus. Embora a pluralidade de furos seja ilustrada como tendo a mesma forma, contempla-se que furos com diferentes formas podem ser usados. Por exemplo, a base da câmara de cultura de células ou do inserto pode compreender uma pluralidade de furos em que a forma de um ou mais dos furos é diferente. A base da câmara de cultura de células ou do inserto pode, portanto, compreender uma pluralidade de furos contendo dois ou mais de uma parte inferior de forma plana, uma forma em U, uma forma em V, ou uma forma em V com uma parte inferior plana e similares.

[0108] A Figura 7 ilustra uma vista plana do dispositivo de cultura de células 20 mostrado na Figura 6. O raio da câmara de cultura de células 22 é de cerca de 8 mm. O raio da base da câmara 22 contendo a pluralidade de furos 26 é de cerca de 5,8 mm. O raio de cada furo 26 é de cerca de 0,4 mm.

[0109] Voltando-se agora para a Figura 8, é mostrada uma vista plana de um dispositivo de cultura de células 20 na forma de uma placa multipoços. O dispositivo de cultura de células 21 contém uma pluralidade de poços 22, os poços contendo uma pluralidade de furos 27 ou contendo um canal microfluídico 28. Os poços 22 são dispostos linearmente em fileiras. Uma fileira pode ser configurada para conter pelo menos um poço contendo a pluralidade de furos 27. Uma fileira pode ser configurada para conter pelo menos um poço contendo a pluralidade de furos 27 e pelo menos um poço contendo um canal microfluídico 28. Um canal 29 conecta um poço contendo uma pluralidade de furos 27 e um poço contendo um canal microfluídico 28. Cada poço contém uma entrada e uma saída para a comunicação fluida em cada poço e fora de cada poço.

[0110] Embora a Figura 8 mostre cada câmara de cultura de células 22 na placa de cultura de células 21 contendo os furos 27 ou contendo o canal microfluídico 28, aqueles versados na técnica entenderão que não é essencial que cada câmara de cultura de células 22 seja configurada dessa maneira e que é possível que uma ou mais das câmaras de cultura de células 22 não contenham os furos 27 e/ou não contenham o canal microfluídico 28. Algumas das câmaras de cultura de células 22 podem ficar vazias e não serem utilizadas, conforme necessário.

[0111] A profundidade de uma pluralidade de câmaras de cultura de células, quando usadas de acordo com a presente descrição, não precisa ser igual por todo o dispositivo de cultura de células e é contemplado que as câmaras de cultura de células - bem como os poços da placa multipoços - podem ter diferentes profundidades. Em uma modalidade, a câmara de cultura de células compreendendo a superfície descontínua ou os furos tem uma profundidade que é maior do que a da câmara de cultura de células compreendendo o inserto. O canal que liga as pelo menos duas câmaras de cultura de células pode estar na mesma altura de modo que o canal esteja localizado a distâncias diferentes da base das pelo menos duas câmaras de cultura de células. Esta configuração garante que o fluxo de fluido para a câmara não perturbe ou atrapalhe os esferoides presos na superfície descontínua, garantindo que o fluido ainda possa passar através da membrana permeável do inserto.

[0112] Esta configuração é retratada na Figura 5, onde é mostrado um dispositivo de cultura de células 10 compreendendo uma primeira câmara de cultura de células 12a com uma pluralidade de sulcos 16 na base da mesma e uma segunda câmara de cultura de células 12b com um canal microfluídico 18 nela. A primeira câmara de cultura de células 12a tem uma profundidade maior que a da segunda câmara de cultura de células 12b. A primeira câmara de cultura de células 12a tem uma profundidade de cerca de 20 mm e a segunda câmara de cultura de células 12b tem uma profundidade de cerca de 18,3 mm. O canal 19 está em comunicação fluida com cada uma das câmaras de cultura de células 12a e 12b. O canal 19 está localizado mais longe da base da primeira câmara de cultura de células 12a em comparação com a segunda câmara de cultura de células 12b.

[0113] Uma configuração semelhante também é retratada na Figura 9, onde é mostrado um dispositivo de cultura de células 20 compreendendo uma primeira câmara de cultura de células 22a com uma pluralidade de furos 26 na base da mesma e uma segunda câmara de cultura de células 22b com um canal microfluídico 28 nela. A primeira câmara de cultura de células 22a tem uma profundidade maior que a segunda câmara de cultura de células 22b. A primeira câmara de cultura de células 22a tem uma profundidade de cerca de 20 mm e a segunda câmara de cultura de células 12b tem uma profundidade de cerca de 18,3 mm. O canal 29 está em comunicação fluida com cada uma das câmaras de cultura de células 22a e 22b. O canal 29 está localizado mais longe da base da primeira câmara de cultura de células 22a em comparação com a segunda câmara de cultura de células 22b.

[0114] Esferoides podem ser usados em vários experimentos para avaliar um ou mais dentre sua viabilidade, sua morfologia e sua funcionalidade e similares. Em tais experimentos, pode ser importante garantir que o mesmo número de células (o que também significa o mesmo número de esferoides) seja usado em cada experimento. Sem o uso de uma superfície descontínua de acordo com a presente descrição, vários esferoides podem se fundir para formar um tecido maior. Pode ser difícil determinar exatamente o número de esferoides presentes neste tecido maior, o que significa que o tecido não pode ser usado para outros experimentos. Quando a superfície descontínua é usada, aumenta a distância entre os esferoides e reduz ou impede sua fusão, o que significa que eles podem ser usados para outros experimentos, já que o número de esferoides é conhecido.

[0115] Assim, de acordo com um aspecto da presente descrição, divulga-se um método para reduzir ou impedir a aglomeração de esfe- roides compreendendo o uso de um dispositivo de cultura de células compreendendo: uma câmara de cultura de células compreendendo uma base e paredes laterais que se estendem desde a base para circundar um volume da câmara de cultura de células; uma entrada na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com a câmara; e uma saída na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com o exterior da câmara; em que a base da câmara de cultura de células compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides.

[0116] Em uma modalidade, o método compreende: (i) fornecer um ou mais esferoides individuais; (ii) transferir os esferoides individuais para a câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células; (iii) incubar os esferoides individuais no dispositivo de cultura de células; e (iv) obter esferoides individuais na superfície descontínua do dis positivo de cultura de células.

[0117] Os esferoides individuais que são fornecidos podem ser transferidos de uma entidade - como um poço de uma placa de cultura de células. A entidade pode ser separada da câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células para a qual os esferoides individuais devem ser transferidos. Em outras palavras, a entidade pode ser fisicamente separada da câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células. Após a incubação por um período de tempo, um único esferoide individual ou vários esferoides individuais estão presentes ou são formados em cada poço da placa multipoços. A partir daqui os es- feroides individuais podem ser transferidos para a câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células compreendendo a superfície descontínua descrita neste documento e que é opcionalmente revestida. Vantajosamente, um número conhecido de esferoides individuais pode ser transferido na etapa (ii) e um número conhecido de esferoides individuais pode então ser obtido na etapa (iv). Em uma modalidade, entre cerca de 40 a cerca de 100 esferoides são transferidos para a câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células. O número conhecido de esferoides individuais obtidos na etapa (iv) pode ser incubado por um período de tempo. O número conhecido de esferoides individuais obtidos na etapa (iv) pode ser submetido a uma análise experimental posterior, conforme necessário. Em um exemplo da presente descrição, as células são semeadas em cada poço de uma placa multi- poços com tratamento opcional de baixa fixação e uma parte inferior opcional em forma de U. As células são deixadas aglomerando-se na parte inferior do poço. Assim que as células formarem um aglomerado, elas, por exemplo, dentro de cerca de 3 dias, formarão um esferoide. Após a incubação, um único esferoide ou vários esferoides são formados em cada poço da placa multipoços. O tamanho do esferoide é determinado pelo número de células semeadas em cada poço. A partir daqui os esferoides individuais são transferidos para a câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células compreendendo a superfície descontínua descrita neste documento e que é opcionalmente revestida. Cada esferoide individual é transferido independente-mente da placa multipoços para a câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células. Em uma modalidade, cerca de 40 a 100 esferoides individuais são transferidos para a câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células. Finalmente, o dispositivo de cultura de células é conectado a uma bomba que cria um fluxo médio. Os esferoides individuais de número conhecido podem permanecer neste estado por cerca de 1 a cerca de 28 dias antes de serem usados em outros experimentos.

Fontes celulares

[0118] A presente descrição utiliza várias fontes celulares. Em uma modalidade, a presente descrição exclui a etapa de isolar ou obter uma amostra celular de um sujeito. As células podem ser criopreservadas. As células podem estar na cultura de células tridimensional. As células podem estar sob a forma de tecidos. As células podem estar na forma de esferoides. As células podem estar se dividindo ativamente. As células podem ser cultivadas no dispositivo de cultura de células na presença de meio de cultura de células (por exemplo, compreendendo nutrientes (por exemplo, proteínas, peptídeos, aminoácidos), energia (por exemplo, carboidratos), metais e minerais essenciais (por exemplo, cálcio, magnésio, ferro, fosfatos, sulfatos), agentes tamponantes (por exemplo, fosfatos, acetatos), indicadores de alteração de pH (por exemplo, vermelho de fenol, púrpura de bromocresol), agentes seletivos (por exemplo, produtos químicos, agentes antimicrobianos), etc.). Um único meio de cultura de células pode ser usado para cultivar células dos mesmos ou tipos diferentes. Diferentes meios de cultura de células podem ser usados para cultivar diferentes tipos de células. Já que os meios de cultura de células são circulados de acordo com a presente descrição, então ocorrerá a mistura dos meios diferentes da cultura de células.

[0119] Em algumas modalidades, um ou mais agentes são incluídos no meio de cultura de células ou meios de cultura de células. As células podem ser isoladas de um tecido ou um fluido usando métodos que são bem conhecidos na técnica. As células podem ser diferenciadas de células-tronco - como células-tronco embrionárias ou células-tronco pluri- potentes induzidas ou diretamente diferenciadas de células somáticas. As células podem ser células naturais ou células alteradas (por exemplo, uma célula compreendendo uma ou mais alterações genéticas não naturais). A célula pode ser uma célula da doença ou célula modelo da doença. Por exemplo, a célula pode ser uma célula cancerosa ou uma célula que pode ser induzida a um estado hiperproliferativo (por exemplo, células transformadas).

[0120] Células podem ser ou podem ser derivadas de sujeitos hu manos ou animais ou de células humanas ou animais, incluindo qualquer uma das várias espécies de mamíferos, adequadamente humanas, mas incluindo rato, camundongo, porco, coelho e primatas não humanos e similares. As células e linhagens celulares podem ser obtidas a partir de fontes comerciais. As células podem ser de ou derivadas de qualquer tipo de tecido ou órgão desejado, incluindo, mas não limitado a, glândula adrenal, bexiga, vaso sanguíneo, osso, medula óssea, cérebro, cartilagem, cervical, córnea, endométrio, esôfago, trato gastrointestinal, sistema imunológico (por exemplo, linfócitos T, linfócitos B, leucócitos, macrófagos e células dendríticas), fígado, pulmão, sistema linfático, músculo por exemplo, músculo cardíaco), sistema nervoso, ovário, pâncreas (por exemplo, células de ilhotas), glândula pituitária, próstata, rins, glândula salivar, pele, tendão, testículo e tireoide.

[0121] As células pulmonares - incluindo células epiteliais pulmona res - são um tipo de célula de interesse. As células epiteliais brônquicas e/ou de outras vias aéreas são de uso particular na presente descrição. As células epiteliais brônquicas humanas podem ser coletadas escovando os pulmões doadores durante um procedimento de broncoscopia. Em uma modalidade, as células pulmonares são Células Epiteliais Brônquicas Humanas Normais (NHBE). As células epiteliais de pulmão podem ser cultivadas como uma monocamada de células indiferenciadas ou posteriormente desenvolvidas em um tecido semelhante ao epitélio organotípico do pulmão em uma interface ar-líquido. As células epiteliais pulmonares podem ser obtidas de seres humanos ou animais com diferentes patologias, incluindo indivíduos classificados como fumantes ou não fumantes.

[0122] As células do fígado são outro tipo de célula de interesse particular. Em uma modalidade, as células utilizadas são hepatócitos. Hepatócitos são células do fígado, que compõem 70-85% da massa ci- toplasmática do fígado. A funcionalidade dos hepatócitos é altamente dependente de sua capacidade de formar um fenótipo polar, que só é estabelecido na cultura tridimensional. Uma fonte de células hepáticas são os hepatócitos primários, que são modelos in vitro amplamente utilizados para investigar inúmeros aspectos da fisiologia e patologia do fígado. A técnica usada para isolar hepatócitos humanos pode ser baseada em uma perfusão de colagenase em duas etapas de um fígado doado. No entanto, essas células não expressam enzimas metabólicas por mais de 5 dias. Outra limitação é a sua curta viabilidade. Estas desvantagens podem ser superadas pelo uso de linhagens alternativas de células hepáticas de longa duração - como linhagens celulares progenitoras hepáticas humanas ou animais. Um exemplo de um exemplo de uma linhagem celular progenitora hepática humana é a linhagem celular HepaRG™ (ThermoFisher Scientific). Células HepaRG™ retêm muitas características dos hepatócitos humanos primários. Elas têm maior expressão gênica metabólica e específica do fígado em comparação com hepatócitos primários e uma expectativa de vida mais longa. A reorganização das células HepaRG™ em esferoides tridimensionais aumenta ainda mais a expectativa de vida e as capacidades metabólicas, sugerindo que os esferoides podem fornecer um modelo hepático alternativo in vitro melhor para testes de toxicidade. Esferoides do fígado também podem ser criados com uma mistura de hepatócitos primários e células estreladas hepáticas ou hepatócitos primários e células-tronco derivadas de tecido adiposo.

[0123] Em uma modalidade, a célula pulmonar é uma célula epitelial pulmonar - como uma célula epitelial bronquial e/ou de outras vias aéreas.

[0124] Em uma modalidade, a célula hepática é um hepatócito, apropriadamente, uma célula HepaRG.

Combinações de células

[0125] O uso de combinações de qualquer uma das células descri tas neste documento é contemplado. O uso de combinações de qual- quer uma das células descritas neste documento no dispositivo de cultura de células ou em um sistema ou dispositivo que compreende o dispositivo de cultura de células é contemplado. Uma combinação exemplar de células é a combinação de células hepáticas e pulmonares. A combinação de uma célula epitelial pulmonar - como uma célula epitelial bronquial e/ou de outras vias aéreas, e uma célula hepática - como uma célula HepaRG™, é contemplada. Células adicionais podem ser usadas em conjunto com esta combinação, se necessário.

[0126] As diferentes células da combinação podem ser cultivadas em poços separados.

Cultura de células tridimensional

[0127] A presente descrição incorpora o uso de "cultura de células tridimensional", que inclui qualquer método que forneça a cultura de uma célula em 3 dimensões, com ou sem o uso de uma matriz ou estrutura em andaime - como a membrana permeável no inserto. Foram desenvolvidos vários métodos diferentes de culturas de células tridimensionais, incluindo culturas esferoides e culturas organotípicas. Células tridimensionais podem ser cultivadas e/ou mantidas no dispositivo de cultura de células descrito neste documento.

[0128] O termo "esferoide" assume o significado, conforme normal mente entendido na técnica, que é de uma única célula que se divide em uma bola de células em 3 dimensões, ou uma agregação de múltiplas células em 3 dimensões, com ou sem o uso de uma matriz ou estrutura em andaime para suporte no crescimento de células tridimensional dentro do esferoide. O esferoide tridimensional pode ser um esfe- roide aderente ou um esferoide cultivado em suspensão.

[0129] Em algumas modalidades, um esferoide contém um único tipo de célula. Em algumas modalidades, um esferoide contém mais de um tipo de célula. Em algumas modalidades, onde mais de um esferoide é cultivado, cada esferoide é do mesmo tipo, enquanto em outras modalidades, dois ou mais tipos diferentes de esferoides são cultivados.

[0130] Esferoides tridimensionais se assemelham mais ao tecido in vivo em termos de sua comunicação celular e desenvolvimento de matrizes extracelulares. Essa matriz ajuda as células a mover-se dentro do esferoide de maneira similar à que as células se moveriam no tecido vivo. Os esferoides são, portanto, modelos muito melhorados para diferenciação, sobrevivência, migração celular, polarização celular, expressão gênica e crescimento.

[0131] Os esferoides podem ser colhidos e estudados usando vá rios métodos bem conhecidos na técnica, incluindo ensaios colorimétri- cos, fluorescência e luminescência medidos com um leitor de placa ou podem ser facilmente observados pela microscopia. Técnicas adicionais incluem western, northern ou southern blot, técnicas histológicas (por exemplo, imuno-histoquímica, hibridização in situ, imunofluorescência) e similares. O uso de métodos de imagiologia óptica - como microscopia de campo brilhante inversa e microscopia de fluorescência, também é contemplado.

[0132] Aplicações do uso de esferoides tridimensionais incluem o estudo da proliferação de células e tecidos in vitro em um ambiente que se aproxima mais do encontrado in vivo, a triagem de compostos ou agentes, ensaios toxicológicos, terapia celular, distribuição celular, distribuição de agentes, substituição bioquímica, produção de moléculas biologicamente ativas, manipulação de tecidos, biomateriais e ensaios clínicos e similares.

[0133] O uso de esferoides na cultura de células tridimensional é analisado em linhas gerais em Expert Opin. Drug Discov. (2015) 10, 519-540.

[0134] Os sistemas de cultura de órgãos tridimensionais, especial- mente aqueles em forma miniaturizada, podem ser utilizados na presente descrição, pois permitem o estudo de como funcionam os órgãos em escala microscópica. A resposta a certos estímulos, a resposta a um ou mais agentes e o comportamento farmacocinético de tais agentes podem ser estudados. Sistemas de cultura de células tridimensionais miniaturizados permitem o estudo combinado de grupos de células ou órgãos. Isso permite que a complexidade da interação entre diferentes tecidos seja reproduzida. A cultura de órgãos tridimensionais pode ser organotípica, o que significa que ela procura reproduzir as principais funções de um sistema de órgãos ou órgãos. Um sistema fluídico mini- aturizado que interliga os poços também é contemplado.

[0135] Em um aspecto, há uma cultura de esferoides em que os es- feroides estão sob a forma de esferoides únicos individualizados após 5 horas de cultura ou após 5 dias de cultura. Em outras palavras, os es- feroides não são aglomerados ou fundidos.

Culturas tridimensionais baseadas no fígado

[0136] O fígado desempenha um papel central na desintoxicação, metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas, bem como a biotrans- formação de substâncias endógenas e exógenas. A funcionalidade hepática está intimamente ligada à montagem de células altamente especializadas, a maioria dos quais são hepatócitos, embutidos em uma complexa estrutura tridimensional composta pelos chamados lóbulos. A biotransformação de compostos geralmente resulta em metabólitos não tóxicos e mais solúveis, no entanto, ocasionalmente, metabólitos mais tóxicos podem ser formados causando hepatotoxicidade.

[0137] Hepatócitos podem ser mantidos em 3 dimensões através de vários métodos, incluindo o uso da cultura em sanduíche, materiais sólidos de estrutura em andaime - como estruturas em andaime de poliestireno, hidrogéis - como o colágeno tipo I, ou automontagem de hepató- citos em esferoides.

[0138] Embora o uso de hepatócitos humanos primários recém-iso- lados possa ser o tipo de célula hepática preferida, sua disponibilidade é limitada. Outras opções de linhagens celulares hepáticas humanas incluem as células HepG2 e Hep2/C3A. Uma fonte celular particularmente adequada é a linhagem celular HepaRG™. Outras fontes de hepatócitos humanos são hepatócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas (hESC) e hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC).

[0139] Em uma modalidade, o esferoide é ou é derivado de uma célula hepática para formar um esferoide hepático tridimensional. Tais esferoides hepáticos podem ser preparados usando vários métodos que são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, ALTEX (2014) 31,441-477 e Toxicol. Sci. (2013) 133, 67-78.

Culturas tridimensionais baseadas nos pulmões

[0140] À medida que a morfologia do trato respiratório muda da parte superior para as vias aéreas inferiores, muitos modelos diferentes de cultura de células foram estabelecidos usando células ou linhagens celulares primárias epiteliais das vias aéreas e são contemplados para uso na presente descrição. A escolha de exatamente qual linhagem de célula ou célula usar dependerá da área de interesse do trato respiratório para um determinado estudo.

[0141] Desde que a superfície do pulmão é exposta ao ar, o modelo celular pode ser cultivado na interface ar-líquido para imitar o pulmão de forma mais realista.

[0142] Em uma modalidade, a cultura tridimensional pulmonar é ou é derivada de uma célula pulmonar para formar um tecido organotípico tridimensional. Tais tecidos pulmonares podem ser preparados usando vários métodos que são conhecidos na técnica, como os descritos em ALTEX (2014) 31, 441-477 e Toxicol. (2013) 133, 67-78.

Triagem

[0143] O dispositivo de cultura de células da presente descrição pode ser usado na amostragem ou triagem, opcionalmente, em tempo real. O efeito de um ou mais agentes nas células contidas no dispositivo de cultura de células ou no dispositivo pode ser determinado, opcionalmente, em tempo real. O dispositivo de cultura de células pode ser usado em, por exemplo, descoberta de agente/fármaco, caracterização de agente/fármaco, testes de eficácia, e testes de toxicidade e similares. Pode ser usado como parte de um dispositivo de amostragem ou triagem. Tais testes incluem, mas não se limitam a, avaliação de efeito farmacológico, avaliação de carcinogenicidade, avaliação característica do agente de geração de imagem médica, avaliação de meia-vida, avaliação de segurança à radiação, testes de genotoxicidade, testes de imu- notoxicidade, testes de reprodução e desenvolvimento, avaliação de interação de fármacos/agentes, avaliação de dose, avaliação de adsor- ção, avaliação de disposição, avaliação do metabolismo, estudos de eliminação e similares. Tipos específicos de células podem ser empregados para testes específicos (por exemplo, hepatócitos para toxicidade hepática, células epiteliais tubulares proximais renais para nefrotoxici- dade, células endoteliais vasculares para toxicidade vascular, células neuronais e gliais para neurotoxicidade, cardiomiócitos para cardiotoxi- cidade).

[0144] Em um aspecto, é descrito um método in vitro para avaliar a resposta de uma célula ou tecido a um agente, o método compreendendo: (i) por em contato uma célula ou tecido contido no dispositivo de cultura de células descrito neste documento com pelo menos um agente; e (ii) medir uma ou mais respostas após o contato com pelo menos um agente; em que uma diferença na uma ou mais respostas antes e depois do contato com pelo menos um agente é indicativa de que o agente modula a resposta da célula ou tecido.

[0145] Em outro aspecto, é descrito um método in vitro para avaliar a resposta de duas ou mais células, tecidos ou órgãos a um agente, o método compreendendo: (i) por em contato pelo menos uma das células, tecidos ou órgãos contidos no dispositivo de cultura de células descrito neste documento com pelo menos um agente; e (ii) medir uma ou mais respostas em uma ou mais células, tecidos ou órgãos após o contato com o pelo menos um agente; em que uma diferença na uma ou mais respostas na uma ou mais células antes e depois do contato com o pelo menos um agente é indicativa de que o agente modula a resposta da pelo menos uma célula, tecido ou órgão.

[0146] Apropriadamente, o efeito ou penetração de pelo menos um agente na célula ou tecido é medido ou determinado. Apropriadamente, a bioativação do pelo menos um agente na célula ou tecido é medida ou determinada. Apropriadamente, o metabolismo de pelo menos um agente pela célula ou tecido é medido ou determinado. Essas etapas podem ser realizadas simultaneamente ou posteriormente entre si.

[0147] O efeito de um ou mais agentes na penetração de um agente - como um aerossol - em uma ou mais células, tecidos ou órgãos e sua posterior bioativação ou metabolismo por outra célula ou tecido pode ser determinado usando vários métodos que são bem conhecidos na técnica.

[0148] Um agente pode ser adicionado ao dispositivo de cultura de células e seu efeito sobre a célula ou tecido cultivado contido nele pode ser monitorado ou determinado. Exemplos dos efeitos que podem ser medidos incluem consumo de oxigênio, produção de dióxido de carbono, viabilidade celular, expressão de uma proteína, atividade enzimá- tica, penetração, função de barreira/permeabilidade, produção de sur- factante, resposta a citocinas, função transportadora, expressão do ci- tocromo P450, secreção de albumina, toxicologia e similares.

[0149] O dispositivo de cultura de células pode ser exposto a um aerossol e seu efeito na célula ou tecido cultivado pode ser monitorado ou determinado. Exemplos dos efeitos que podem ser medidos incluem consumo de oxigênio, produção de dióxido de carbono, viabilidade celular, expressão de uma proteína, atividade enzimática, penetração, função de barreira/permeabilidade, produção de surfactante, resposta a ci- tocinas, função transportadora, expressão do citocromo P450, secreção de albumina, toxicologia e similares.

[0150] Uma pluralidade de ensaios pode ser executada em paralelo com diferentes concentrações do agente para obter uma resposta diferencial às várias concentrações. Como conhecido na técnica, o processo de determinação da concentração eficaz de um agente normalmente usa uma gama de concentrações resultantes de 1:10, ou outra escala de log, diluições. As concentrações podem ser refinadas ainda com uma segunda série de diluições, se necessário. Normalmente, uma dessas concentrações serve como um controle negativo.

Agente

[0151] O agente pode ser qualquer composto de interesse e inclui pequenos compostos orgânicos, polipeptídeos, peptídeos, carboidratos de maior peso molecular, polinucleotídeos, ácidos graxos e lipídios, na- nopartículas, aerossol ou um ou mais componentes de um aerossol e similares, um fármaco, uma toxina, um patógeno, um antígeno, um anticorpo e uma molécula pequena e similares. Os agentes podem ser tri- ados individualmente ou em conjuntos ou bibliotecas combinatórias dos compostos. Os agentes podem ser obtidos a partir de uma grande variedade de fontes incluindo bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Podem ser usadas bibliotecas de compostos naturais na forma de extratos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais. Bibliotecas e compostos produzidos natural ou sinteticamente que são modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais podem ser usados para produzir bibliotecas combinatórias. Os agentes farmacoló- gicos conhecidos podem ser sujeitos a modificações químicas direcionadas ou aleatórias, como acilação, alquilação, esterificação, acidifica- ção para produzir análogos estruturais para a triagem. Ao fazer uma triagem usando uma biblioteca combinatória, uma grande biblioteca de agentes quimicamente semelhantes ou diversos pode ser triada. Na triagem combinatória, o número de acertos descobertos é proporcional ao número de agentes testados. Um grande número de compostos, que pode atingir milhares de compostos testados por dia, pode ser triado, em que a automação laboratorial e a robótica podem ser aplicadas. Muitos exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados na técnica. Um composto orgânico pequeno inclui um composto de peso molecular menor do que cerca de 5.000 Dáltons, geralmente menor do que cerca de 2.500, geralmente menor do que cerca de 2.000, mais geralmente menor do que cerca de 1.500, apropriadamente cerca de 100 a cerca de 1.000 Dáltons. Os compostos orgânicos pequenos podem ser compostos orgânicos biológicos ou sintéticos. Os átomos presentes no composto orgânico pequeno estão geralmente no grupo composto por carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio e podem incluir halogênios, boro, fósforo, selênio e enxofre se em uma forma farmacêutica aceitável. Geralmente, oxigênio, nitrogênio, enxofre ou fósforo, se presentes, estão ligados a carbono ou um ou mais uns dos outros ou ao hidrogênio para formar vários grupos funcionais, como, por exemplo, ácidos carboxílicos, álcoois, tióis, carboxamidas, carbamatos, ésteres de ácido carboxílico, amidas, éteres, tioéteres, tioésteres, fosfatos, fosfonatos, olefinas, cetonas, aminas, aldeídos e si-milares. Os pequenos compostos orgânicos, conforme o termo é usado neste documento, também incluem pequenos peptídeos, pequenos oli- gonucleotídeos, pequenos polissacarídeos, ácidos graxos, lipídios, e similares com um peso molecular menor do que cerca de 5.000 Dáltons.

[0152] Exemplos de agentes farmacêuticos são descritos em The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), nona edição. O agente pode ser uma toxina.

[0153] Os agentes na solução e nas amostras sólidas que podem ser dissolvidos em um solvente apropriado podem ser testados. Os agentes em forma gasosa também podem ser testados pela exposição de amostras ao gás por um período de tempo. Amostras de interesse incluem amostras ambientais, amostras biológicas, amostras de fabricação, bibliotecas de compostos e compostos de ocorrência sintética ou natural.

[0154] Os polipeptídeos que têm um peso molecular de pelo menos cerca de 5.000 Dáltons, mais geralmente, pelo menos cerca de 10.000 Dáltons, podem ser triados. Os polipeptídeos de teste terão geralmente cerca de 5.000 a cerca de 5.000.000 Dáltons ou mais de peso molecular, mais geralmente de cerca de 20.000 a cerca de 1.000.000 Dáltons de peso molecular. Uma grande variedade de polipeptídeos pode ser considerada, como uma família de polipeptídeos com características estruturais similares, polipeptídeos com funções biológicas particulares, polipeptídeos relacionados a microrganismos específicos, particular-mente microrganismos que causam doenças. Tais polipeptídeos incluem citocinas ou interleucinas, enzimas, protaminas, histonas, albuminas, imunoglobulinas, escleropolipeptídeos, fosfopolipeptídeos, mu- copolipeptídeos, cromopolipeptídeos, lipopolipeptídeos, nucleopolipep- tídeos, glicopolipeptídeos, receptores de células T, proteoglicanos, so- matotropina, prolactina, insulina, pepsina, polipeptídeos encontrados no plasma humano, fatores de coagulação do sangue, fatores de tipagem do sangue, hormônios peptídicos e polipeptídicos, antígenos de câncer, antígenos específicos do tecido, marcadores nutricionais e peptídeos sintéticos, que podem ser glicados ou não.

[0155] Os polinucleotídeos podem ser triados. O polinucleotídeo de teste pode ser um composto natural ou um composto sintético. Os poli- nucleotídeos incluem oligonucleotídeos e são compostos por nucleotí- deos naturais, como ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos e seus derivados, embora miméticos nucleotídicos não naturais, como nucleo- sídeos modificados em 2', ácidos nucleicos peptídicos e fosfonatos de nucleosídeo oligomérico também sejam contemplados. Os polinucleotí- deos de maior peso molecular podem ter cerca de 20 a cerca de 5.000.000 ou mais nucleotídeos.

[0156] Uma ou mais variáveis que podem ser medidas incluem ele mentos quantificáveis de células, material subcelular, componentes subcelulares ou produtos celulares, particularmente elementos que podem ser medidos com precisão em um sistema ou dispositivo de ensaio de alto rendimento. Um dado pode ser uma característica, condição, estado ou função de qualquer célula, componente celular ou produto celular incluindo viabilidade, respiração, metabolismo, determinante da superfície celular, receptor, proteína ou modificação conformacional ou pós-traducional desta, lipídio, carboidrato, molécula orgânica ou inorgânica, DNA, RNA e similares ou uma porção derivada de tal componente celular. Embora as variáveis possam fornecer uma leitura quantitativa, em alguns casos pode ser obtido um resultado semiquantitativo ou qualitativo. As variáveis de leitura podem incluir um valor único, um valor médio ou um valor mediano ou uma variação do mesmo, por exemplo.

[0157] Vários métodos podem ser usados para medir as variáveis para determinar a resposta da célula, tecido ou órgão a um agente. Para medir a quantidade de um agente que está presente, um método é marcar o agente com uma fração detectável, que pode ser fluorescente, lu- minescente, radioativa, enzimaticamente ativa e similares. As frações fluorescentes e luminescentes estão disponíveis para marcar uma bio- molécula, estrutura ou tipo de célula. As frações imunofluorescentes podem ser direcionados a ligar não apenas proteínas específicas, mas também conformações específicas, produtos de clivagem ou modificações de sítio tal como fosforilação. Peptídeos e proteínas individuais podem ser projetados para autofluorescência. Podem ser usadas técnicas de imunoensaio - como imuno-histoquímica, rádio-imunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e técnicas não enzi- máticas relacionadas. Estas técnicas utilizam anticorpos específicos como moléculas repórter que são particularmente úteis devido a seu grau de especificidade elevado para se unir a um único alvo molecular. O ELISA baseado em células ou métodos não enzimáticos ou baseados em fluorescência relacionados permitem a medição dos parâmetros da superfície celular.

[0158] Os resultados dos ensaios de triagem podem ser compara dos aos resultados obtidos dos compostos de referência, curvas de concentração, controles e similares. O agente pode ser um aerossol - tal como fumaça ou um aerossol derivado da fumaça.

Aerossol

[0159] As modalidades da invenção podem ser usadas para estudar o efeito de um aerossol nas células, órgãos ou tecidos ou a penetração de um aerossol nas células, órgãos ou tecidos, quando contido no dispositivo de cultura de células da presente descrição. O aerossol pode ser derivado ou gerado por um dispositivo formador de aerossol. Artigos fumígenos e artigos para fumar são tipos de dispositivos formadores de aerossol. Exemplos de artigos fumígenos ou artigos para fumar incluem, mas não estão limitados a cigarros, cigarrilhas e charutos. Em certos dispositivos formadores de aerossol, ao invés de combustão, uma com-posição de tabaco ou outro material formador de aerossol é aquecido por um ou mais elementos de aquecimento elétrico para produzir um aerossol. Em outro tipo de dispositivo formador de aerossol, um aerossol é produzido pela transferência de calor de um elemento combustível ou de uma fonte de calor, para um material formador de aerossol fisicamente separado, que pode estar localizado dentro, ao redor ou a jusante da fonte de calor. Tipicamente, em artigos para fumar aquecidos, um aerossol é gerado pela transferência de calor de uma fonte de calor para um substrato ou material formador de aerossol fisicamente separado, que pode estar localizado dentro, ao redor ou a jusante da fonte de calor. Durante o ato de fumar, os compostos voláteis são liberados do material formador de aerossol pela transferência de calor da fonte de calor e arrastados no ar tragado através do artigo para fumar. Conforme os compostos liberados esfriam, eles se condensam para formar um aerossol que é inalado pelo usuário. Conforme usado neste documento, o termo "material formador de aerossol" é usado para descrever um material capaz de liberar, mediante aquecimento de compostos voláteis, que pode formar um aerossol. O material formador de aerossol pode ser à base de plantas. Exemplos de materiais de formação de aerossol incluem, mas não estão limitados a composições de tabaco, tabacos, extrato de tabaco, tabaco cortado, material de preenchimento cortado, tabaco curado, tabaco expandido, tabaco homogeneizado, tabaco recons-tituído e tabacos para cachimbo. O material formador de aerossol pode compreender, alternativamente, um material que não seja à base nem contenha plantas.

[0160] O aerossol pode estar na forma de fumaça. Conforme usado neste documento, o termo "fumaça" é usado para descrever um tipo de aerossol que é produzido da combustão, tal como cigarros, ou pela combustão de um material formador de aerossol. A fumaça inclui vários agentes, que podem ser fornecidos como compostos individuais para estudo, se necessário. Exemplos de tais agentes incluem matérias par- ticuladas secas sem nicotina, monóxido de carbono, formaldeído, ace- taldeído, acetona, acroleína, propionaldeído, crotonaldeído, metil-etil cetona, butiraldeído, benzo[a]pireno, fenol, m-cresol, o-cresol, p-cresol, catecol, resorcinol, hidroquinona, 1,3-butadieno, isopreno, acrilonitrila, benzeno, tolueno, piridina, quinolina, estireno, N'-nitrosonornicotina (NNN), N’-nitrosoanatabina (NAT), N’-nitrosoanabasina (NAB), 4-(meti- lnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK), 1-aminonaftaleno, 2-ami- nonaftaleno, 3-aminobifenila, 4-aminobifenila, óxidos de nitrogênio (NOx), ácido cianídrico, amônia, arsênico, cádmio, cromo, chumbo, níquel, selênio e mercúrio.

[0161] O dispositivo de cultura de células descrito neste documento pode ser exposto, por vários períodos, à fumaça. A fumaça pode ser distribuída usando um módulo de exposição Vitrocell® (ver Chem Cent J .(2014) 8(1):62). Um número definido de tragadas por cigarro e um número definido de tragadas por minuto de exposição podem ser usados e o número de cigarros variado para se ajustar às concentrações de exposição. Os cigarros de referência - tais como os cigarros de referência 3R4F, podem ser usados como fonte da fumaça e fumados no robô para fumar em conformidade básica com o regime de tabagismo da In-ternational Organization for Standardization (ISO 2000).

Fabricação

[0162] O dispositivo de cultura de células pode ser feito usando vá rios métodos de fabricação. Por exemplo, o dispositivo pode ser montado usando peças moldadas por injeção ou fabricados como uma única peça componente. A superfície descontínua pode ser preparada ou aplicada usando usinagem de controle numérico do computador ou moldagem por injeção. Embora não seja necessário, para clareza óptica, é vantajoso manter uma espessura não maior do que 2 mm. As peças separadas podem ser montadas por vários métodos, incluindo, mas não se limitando a: colagem adesivo ou solvente, vedação ou soldagem a calor, compressão, soldagem ultrassônica, soldagem a laser e/ou qualquer outro método comumente utilizado para a geração de vedações entre as peças.

PEEK

[0163] Conforme descrito neste documento, o dispositivo de cultura de células pode ser fabricado a partir de PEEK, pois tem a vantagem de não ser absorvente para pequenas moléculas. A absorção de PEEK em relação à nicotina e NNK, por exemplo, foi testada e constatou-se que as moléculas não foram capturadas por este material. Isso pode ser importante, pois o uso de PEEK não prenderá pequenas moléculas hidro- fóbicas. Portanto, tais dispositivos de cultura de células são particularmente adequados para o teste de efeitos medicamentosos nas células ou tecidos alojados dentro do dispositivo ou outros dispositivos sem qualquer risco de a concentração de fármacos (ou concentração de seus metabólitos) ser alterada pelo material. Por conseguinte, divulga- se um dispositivo de cultura de células ou um inserto para uso no dispositivo de cultura de células compreendendo ou consistindo em PEEK.

[0164] Assim, divulga-se também um dispositivo de cultura de célu las fabricado (exclusivamente) a partir de PEEK.

[0165] Divulga-se ainda uma placa de cultura de células compreen dendo ou consistindo em PEEK.

[0166] Divulga-se também uma placa de cultura de células fabri cada (exclusivamente) a partir de PEEK.

[0167] Divulga-se ainda um poço de uma placa de cultura de células compreendendo ou consistindo em PEEK.

[0168] Divulga-se também um poço de uma placa de cultura de cé lulas fabricado (exclusivamente) a partir de PEEK.

[0169] Divulga-se ainda um inserto compreendendo ou consistindo em PEEK.

[0170] Divulga-se também um inserto fabricado (exclusivamente) a partir de PEEK.

[0171] Divulga-se ainda uma placa de cultura de células multipoços compreendendo ou consistindo em PEEK.

[0172] Divulga-se também uma placa de cultura de células multipo- ços fabricada (exclusivamente) a partir de PEEK.

[0173] Apropriadamente, o dispositivo de cultura de células, a placa de cultura de células ou a placa de cultura de células multipoços ou o inserto compreende uma ou mais moléculas hidrofóbicas pequenas - como um ou mais agentes hidrofóbicos pequenos. Em uma modalidade, o agente compreende ou consiste em um alcaloide do tabaco.

[0174] Em uma modalidade, o agente compreende a estrutura da Fórmula 1: ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma ou misturas da mesma; ou, mais apropriadamente, a estrutura da Fórmula 2: ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma ou misturas da mesma; em que: z é 0 ou 1; R1 representa H ou C1 -C7 alquila; R2 representa H, =O ou C1-C7 alquila; R3 representa H, halo ou C1 -C7 alquila; e a linha pontilhada representa (a) ligações simples; (b) uma ligação dupla carbono/carbono ou carbono/nitrogênio e as demais ligações simples; ou (c) duas ligações duplas conjugadas selecionadas independentemente de uma ligação dupla carbono/nitrogênio e uma ligação dupla car- bono/carbono e as demais ligações simples.

[0175] Apropriadamente, o agente da Fórmula 2 é: ou ou um sal farmaceuticamente aceitável deste ou suas misturas.

[0176] Apropriadamente, o agente da Fórmula 2 é: ou ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma ou misturas da mesma.

[0177] Mais apropriadamente, o agente da Fórmula 1 ou Fórmula 2 é um alcaloide do tabaco.

[0178] Mais apropriadamente, o agente da Fórmula 1 ou Fórmula 2 é nicotina, anabasina, nornicotina, anatabina, cotinina, miosina ou um sal farmaceuticamente aceitável das mesmas ou misturas das mesmas.

[0179] Um "alcaloide do tabaco" se refere a um alcaloide que é ou é derivado de uma planta de tabaco e pode incluir um alcaloide de tabaco sintético. "Planta de tabaco" se refere a uma planta pertencente ao gênero Nicotiana, incluindo N. rustica e N. tabacum (por exemplo, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 e Petico). Outras espécies incluem N. acaulis, N. acuminata, N. africana, N. alata, N. ameghinoi, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. azambujae, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goods- peedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. oc- cidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. set- chellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. sua- veolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, e N. x sanderae. Apropriadamente, a planta de tabaco é N. tabacum.

[0180] 'C1 -C7 alquil' se refere a grupos de hidrocarbonetos satura dos de cadeia linear ou ramificada, geralmente com 1 a 7 átomos de carbono; mais apropriadamente C1 -C6 alquila; mais apropriadamente C1 -C3 alquila. Exemplos de grupos alquil incluem metila, etila, n-propila, i-propila, n-butila, s-butila, i-butila, t-butila, pent-1-ila, pent-2-ila, pent-3- ila, 3-metilbut-1-ila, 3-metilbut-2-ila, 2-metilbut-2-ila, 2,2,2-trimetilet-1- ila, n-hexila, n-heptila e similares. Apropriadamente, o grupo alquila é metila.

[0181] "Halo" se refere a F, Cl, Br ou I. Apropriadamente, o halo é Cl.

[0182] Em outra modalidade, o agente é uma nitrosamina específica de tabaco (TSNA), que é um produto químico formado pela nitrosação de aminas secundárias e terciárias de alcaloides do tabaco, incluindo nicotina, nornicotina, anatabina e anabasina. TSNAs são encontradas em tabaco e produtos de tabaco. Apropriadamente, a TSNA é N-nitro- sonicotina (NNN), 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK), N-nitrosoanabasina (NAB), N-nitrosoanatabina (NAT), 4-(metilnitrosa- mino)4-(3-piridil)butanal (NNA), 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-buta- nol (NNAL), 4-(metilnitrosamino)4-(3-piridil)-1-butanol (iso-NNAL) ou ácido 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)-1-butírico (iso-NNAC) ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos ou misturas dos mesmos. Mais apropriadamente, a TSNA é 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-bu- tanona (NNK) ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

[0183] Apropriadamente, o solvente orgânico é selecionado entre hidrocarbonetos alifáticos (por exemplo, n-pentano, n-hexano, n-hep- tano, n-octano); hidrocarbonetos aromáticos (por exemplo, benzeno, to- lueno, xilenos); álcoois alifáticos (por exemplo, metanol, etanol, propan- 1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, 2-metil-propan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil- propan-2-ol, pentan-1-ol, 3-metil-butan-1-ol, hexan-1-ol, 2-metóxi-eta- nol, 2-etóxi-etanol, 2-butóxi-etanol, 2-(2-metóxi-etóxi)-etanol, 2-(2-etóxi- etóxi)-etanol, 2-(2-butóxi-etóxi)-etanol); éteres com a condição de que o éter não seja tetra-hidrofurano (por exemplo, éter dietílico, éter di-iso- propílico, éter dibutílico, 1,2-dimetóxi-etano, 1,2-dietóxi-etano, 1-metóxi- 2-(2-metóxi-etóxi)-etano, 1-etóxi-2-(2-etóxi-etóxi)-etano, 1,4-dioxano); cetonas (por exemplo, acetona, metil etil cetona); ésteres (acetato de metila, acetato de etila); solventes contendo nitrogênio (por exemplo, formamida, N,N-dimetilformamida, acetonitrila, N-metil-pirrolidona, piri- dina, quinolina, nitrobenzeno); solventes contendo enxofre com a condição de que o solvente contendo enxofre não sejam dimetilssulfóxido (por exemplo, dissulfeto de carbono, tetra-hidro-tiofeno-1,1-dióxido); e solventes contendo fósforo (por exemplo, triamida hexametilfosfórica).

[0184] Em uma modalidade, o solvente orgânico é um hidrocarbo- neto alifático saturado (por exemplo, n-pentano, n-hexano, n-heptano, n-octano).

[0185] Em uma modalidade, o solvente orgânico é um hidrocarbo- neto aromático (por exemplo, benzeno, tolueno, xilenos).

[0186] Em uma modalidade, o solvente orgânico é um álcool alifá- tico (por exemplo, metanol, etanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, 2-metil-propan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-2-ol, pentan-1-ol, 3-me- til-butan-1-ol, hexan-1-ol, 2-metóxi-etanol, 2-etóxi-etanol, 2-butóxi-eta- nol, 2-(2-metóxi-etóxi)-etanol, 2-(2-etóxi-etóxi)-etanol, 2-(2-butóxi- etóxi)-etanol).

[0187] Em uma modalidade, o solvente orgânico é um éter com a condição de que o éter não seja tetra-hidrofurano (por exemplo, éter dietílico, éter di-isopropílico, éter dibutílico, 1,2-dimetóxi-etano, 1,2-die- tóxi-etano, 1-metóxi-2-(2-metóxi-etóxi)-etano, 1-etóxi-2-(2-etóxi-etóxi)- etano, 1,4-dioxano).

[0188] Em uma modalidade, o solvente orgânico é uma cetona (por exemplo, acetona, metil etil cetona).

[0189] Em uma modalidade, o solvente orgânico é um éter (acetato de metila, acetato de etila).

[0190] Em uma modalidade, o solvente orgânico é um solvente con tendo nitrogênio (por exemplo, formamida, N,N-dimetilformamida, ace- tonitrila, N-metil-pirrolidona, piridina, quinolina, nitrobenzeno).

[0191] Em uma modalidade, o solvente orgânico é um solvente con tendo enxofre com a condição de que o solvente contendo enxofre não seja dimetilsulfóxido (por exemplo, dissulfeto de carbono, tetra-hidro-ti- ofeno-1,1,-dióxido).

[0192] Em uma modalidade, o solvente orgânico é um solvente con tendo fósforo (por exemplo, triamida hexametilfosfórica).

[0193] Em uma modalidade, o solvente orgânico não é éter de pe tróleo.

[0194] Em uma modalidade, o solvente orgânico não é tolueno.

[0195] Em uma modalidade, o solvente orgânico não é acetona.

[0196] Em uma modalidade, o solvente orgânico não é etanol. Em uma modalidade, o agente é nicotina ou NNK ou uma combinação desta.

[0197] Apropriadamente, os métodos discutidos acima compreen dem a etapa adicional de pôr a célula no dispositivo de cultura de células em contato com uma ou mais moléculas hidrofóbicas pequenas ou solventes orgânicos conforme discutido acima.

[0198] Apropriadamente, o dispositivo de cultura de células pode in cluir uma célula contida em um meio de cultura de células e, opcionalmente, uma ou mais moléculas hidrofóbicas pequenas ou solventes orgânicos conforme discutido acima.

[0199] Divulga-se também um método para determinar o efeito (por exemplo, a resposta à exposição) de mais ou mais agentes em uma célula compreendendo: (i) por uma célula em contato com o dispositivo de cultura de células descrito neste documento - como uma placa de cultura de células ou uma placa de cultura de células multipoços ou um inserto - compreendendo ou consistindo em PEEK; (ii) expor a célula a uma ou mais moléculas hidrofóbicas pequenas ou solventes orgânicos conforme discutido acima; e (iii) determinar o efeito dos agentes na célula.

[0200] Divulga-se ainda um método para determinar o efeito (por exemplo, a resposta à exposição) de um ou mais agentes em uma célula compreendendo: (i) por uma célula em contato com o dispositivo de cultura de células descrito neste documento - como uma placa de cultura de células ou uma placa de cultura de células multipoços ou um inserto - fabricado (exclusivamente) a partir de PEEK; (ii) expor a célula a uma ou mais moléculas hidrofóbicas pequenas ou solventes orgânicos conforme discutido acima; e (iii) determinar o efeito das moléculas hidrofó- bicas pequenas ou solventes orgânicos conforme discutido acima sobre a célula.

[0201] Divulga-se também um método para reduzir ou inibir a ab sorção de uma ou mais moléculas hidrofóbicas pequenas ou solventes orgânicos, conforme discutido acima, no dispositivo de cultura de células descrito neste documento compreendendo pôr o agente em contato com um dispositivo de cultura de células compreendendo ou consistindo em PEEK. A invenção é descrita adicionalmente no Exemplo abaixo, que é fornecido para descrever a invenção em maiores detalhes. Este exemplo, que estabelece um modo preferencial atualmente previsto para a realização da invenção, destina-se a ilustrar e não a limitar a invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1

[0202] Para evitar a aglomeração de esferoides, o poço projetado para os esferoides do fígado foi adaptado para conter sulcos concêntricos na parte inferior do poço. O objetivo desses sulcos é criar uma separação espacial entre os tecidos para evitar que eles se aglomerem ou se fundam. Para demonstrar a função dos sulcos, 40 esferoides, cada um composto por cerca de 25.000 células, foram colocados em um poço com sulcos ou em um poço com uma superfície plana (ou seja, sem sulcos). Após 5 dias, os esferoides presentes no poço, com uma superfície plana, começaram a aglomerar-se (vide Figura 11A), formando agregados. Isso não foi observado no poço com os sulcos (vide Figura 11B). O tecido mostrado na Figura 11A (3 esferoides aglomerados ou fundidos para formar uma única unidade) não pôde ser usado para outros experimentos normalmente realizados nos esferoides - como medição do teor de ATP, uma vez que a aglomeração ou fusão de vários esferoides prejudica o resultado obtido. O tecido cultivado na Figura 11B não se aglomerou nem se fundiu e foi usado para outros experimentos.

Exemplo 2

[0203] Vários materiais usados para fabricar um dispositivo de cul tura de células foram testados. Um material usado para o dispositivo de cultura de células, PEEK, é um polímero plástico forte que é resistente ao desgaste. PEEK é vantajosa no teste de fármacos porque é não absorvente, ao contrário, por exemplo, do comumente usado poli(dimetil- siloxano) (PDMS), que é conhecido por reter moléculas hidrofóbicas pequenas, como nicotina. Constatou-se que PEEK não retém nicotina ou NNK, outra pequena molécula hidrofóbica. Portanto, o dispositivo de cultura de células é adequado para o teste de efeitos medicamentosos nos tecidos alojados dentro do dispositivo de cultura de células sem risco de a concentração de fármacos (ou concentração de seus metabólitos) ser alterada pelo material.

[0204] A biocompatibilidade do dispositivo de cultura de células PEEK é testada com modelos organotípicos de pulmão e fígado.

[0205] O modelo de pulmão é composto por células epiteliais brôn- quicas humanas normais (NHBE) semeadas em uma inserto Transwell™ e cultivadas ainda na interface ar-líquido para garantir a diferenciação das células em células calciformes e ciliadas. Ao usar estes tecidos, podemos demonstrar que os tecidos pulmonares podem sobreviver por 4 semanas em uma placa de PEEK, conforme demonstrado por: • Presença de células ciliadas e calciformes em uma propor ção similar à observada nos tecidos de controle (do mesmo lote) mantidas em placas de policarbonato de 24 poços durante o mesmo período. • Uma morfologia intacta. A análise histológica dos tecidos mantidos na placa e aqueles mantidos na placa de 24 poços por 4 semanas confirmou morfologias similares. A espessura epitelial, o estado de diferenciação e a proporção de células calciformes, basais e ciliadas foram similares entre os tecidos mantidos nessas duas condições. • Teor de ATP estável. A ATP é usada em vários processos em células e todas as células metabolicamente ativas contêm ATP, o que torna as medições do teor de ATP um bom indicador da saúde do tecido. Os tecidos mantidos na placa por 4 semanas tiveram um teor de ATP (ca. 10% menos ATP) em comparação com os tecidos de controle. • Batimento ativo de cílios. As células ciliadas não estavam apenas presentes na mesma proporção que nos tecidos de controle, mas também ainda estavam batendo ativamente com uma frequência similar à observada nos tecidos de controle. • Uma maior resistência elétrica transepitelial (TEER). A TEER mede a integridade de junções firmes em tecidos epiteliais e, portanto, é um forte indicador de integridade de barreira. Os tecidos mantidos na placa de PEEK tinham valores 50% mais elevados de TEER do que os tecidos de controle. • Uma capacidade metabólica retida. A indutibilidade do cito- cromo P450 (CYP), uma indicação da capacidade metabólica, foi testada pela exposição dos tecidos aos indutores enzimáticos específicos de CYP. Após 48 horas de indução, constatou-se que a atividade de CYP1A1 aumentou 100 vezes demonstrando a capacidade metabólica retida dos tecidos mantidos no interior da placa.

[0206] Como um modelo de fígado, são usados esferoides compos tos por células HepaRG™. Os primeiros resultados obtidos com estes esferoides do fígado após 4 semanas de cultura dentro da placa de PEEK demonstram: • Uma secreção estável de albumina dentro do meio circu lante. Albumina é um marcador chave da função hepática. Dentro da placa de PEEK, a albumina mostrou-se estável por 4 semanas com uma concentração de albumina semelhante à observada nos tecidos de controle. • Uma capacidade metabólica retida. A indutibilidade do cito- cromo P450 (CYP), uma indicação da capacidade metabólica, foi testada pela exposição dos tecidos aos indutores enzimáticos específicos de CYP. Após 48 horas de indução, constatou-se que a atividade de CYP1A1 é similar à atividade observada nos tecidos de controle

[0207] PEEK tem a vantagem de não ser absorvente em relação a pequenas moléculas. A absorção de PEEK em relação à nicotina e NNK foi testada, e constatou-se que as moléculas não foram capturadas pelo material. Isso é importante, pois os materiais usados para placas disponíveis comercialmente, como o PDMS, são conhecidos por prender pequenas moléculas hidrofóbicas. A Figura 12 mostra os resultados de um gráfico comparando a quantidade de nicotina restante em uma placa de PEEK e em uma placa de PDMS após 8 horas de incubação a 4°C. Como pode ser observado, cerca de 100% da nicotina permaneceu na placa de PEEK em comparação com cerca de 35% na placa de PDMS. Assim, os materiais usados para placas comercialmente disponíveis usando PDMS irão capturar moléculas hidrofóbicas pequenas.

Exemplo 3

[0208] As células HepaRG® são fornecidas em frascos criopreser- vados contendo cerca de 10 milhões de células. O primeiro passo para preparar esferoides é descongelar os frascos criopreservados e semear as células (cerca de 1000 a 50.000 células por poço) em cada poço de uma placa multipoços. Neste experimento, os poços da placa são cobertos com um revestimento de fixação ultrabaixa e os poços têm um fundo em forma de U para garantir que as células semeadas em um único poço não se fixem às paredes. As células são deixadas aglomerando-se na parte inferior do poço. Após cerca de 3 dias, elas formarão um único esferoide ou vários esferoides em cada poço da placa multi- poços, dependendo da escolha do poço que for usado.

[0209] A câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células em que os esferoides hepáticos são colocados tem a superfície descontínua descrita neste documento, que, neste exemplo, é revestida. Cada esferoide é transferido independentemente da placa multipo- ços para a câmara de cultura de células. Cerca de 40 a 100 esferoides são transferidos por compartimento. O dispositivo de cultura de células é conectado a uma bomba que cria um fluxo médio. Os esferoides podem permanecer entre 1 a 28 dias no dispositivo de cultura de células antes de usá-los para outros experimentos.

[0210] Aspectos adicionais da presente descrição são estabeleci dos nos parágrafos numerados a seguir: 1. Um dispositivo de cultura de células para cultivar células, compreendendo: uma câmara de cultura de células que compreende uma base e paredes laterais que se estendem desde a base para incluir um volume da câmara de cultura de células, uma entrada na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com a câmara; e uma tomada nas paredes base ou lateral da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com o exterior da câmara; em que a base da câmara de cultura de células compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides. 2. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 1, em que a base da câmara de cultura de células é substancialmente circular em forma, apropriadamente, em que o diâmetro da base está entre cerca de 6 mm ± 5% e cerca de 22 mm ± 5%, apropriadamente, em que o diâmetro da base é de cerca de 6 mm ± 5%, cerca de 11 mm ± 5%, cerca de 16 mm ± 5% ou cerca de 22 mm ± 5%. 3. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 1 ou parágrafo 2, em que a superfície descontínua compreende uma pluralidade de sulcos na qual a profundidade e largura dos sulcos corresponde ao maior diâmetro ± 10 % de um esferoide. 4. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 3, em que a profundidade e largura da pluralidade de sulcos está entre cerca de 200 a cerca de 1000 μm, apropriadamente, entre cerca de 600 a cerca de 1000 μm. 5. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 3 ou parágrafo 4, no qual os sulcos formam uma pluralidade de anéis concêntricos na base da câmara de cultura de células. 6. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 1 ou parágrafo 2, em que a superfície descontínua compreende uma pluralidade de furos com uma parte inferior fechada e uma parte superior aberta, em que o tamanho dos furos corresponde em profundidade e largura a cerca de 10% maior do que o maior diâmetro de um esferoide. 7. O dispositivo de cultura de células de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, em que a câmara de cultura de células compreende meio de cultura de células para cultura de esferoides. 8. O dispositivo de cultura de células de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, em que a câmara de cultura de células compreende esferoides individuais presos na superfície descontínua da câmara de cultura de células. 9. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 8, em que os esferoides são esferoides pulmonares. 10. O dispositivo de cultura de células de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o fluxo de fluido da entrada para a saída da câmara de cultura de células, quando o fluido está presente, está entre cerca de 10 a cerca de 1000 μL/min, apropriadamente, cerca de 1 a cerca de 500 μL/min, apropriadamente, cerca de 40 μL/min. 11. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 10, em que a tensão de cisalhamento na câmara de cultura de células é inferior a 0,1 dinas/cm2. 12. O dispositivo de cultura de células de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o dispositivo de cultura de células é uma placa multipoços e cada câmara da placa multipoços é um poço, a referida placa multipoços compreendendo pelo menos dois poços. 13. O dispositivo de cultura de células de acordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, em que a base de pelo menos uma das câmaras compreende uma superfície plana que é desprovida de des- continuidades. 14. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 13, em que a pelo menos uma câmara compreende um inserto posicionado acima da base da câmara, apropriadamente, em que o in- serto está localizado na parte superior de uma membrana permeável localizada dentro da câmara para formar uma superfície que é capaz de cultivar uma célula em uma interface de ar/líquido. 15. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 13 ou 14, a profundidade da pelo menos uma câmara compreendendo a superfície plana que é desprovida de descontinuidades é diferente da profundidade da pelo menos uma câmara compreendendo a superfície descontínua, apropriadamente, em que a profundidade da pelo menos uma câmara compreendendo a superfície plana que é desprovida de descontinuidades é menor do que a profundidade da pelo menos uma câmara compreendendo a superfície descontínua. 16. O dispositivo de cultura de células de acordo com qualquer um dos parágrafos 13 a 15, em que a câmara de cultura de células compreende o meio de cultura de células para a cultura de uma célula em uma interface ar-líquido. 17. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 16, em que a câmara de cultura de células compreende células posicionadas na membrana permeável, as referidas células sendo capazes de crescer em uma interface ar-líquido. 18. O dispositivo de cultura de células de acordo com o pará grafo 17, em que as células são células pulmonares. 19. O dispositivo de cultura de células de acordo com qualquer um dos parágrafos 12 a 18, em que pelo menos dois poços estão em comunicação fluida entre si. 20. Um método de cultivo de uma célula compreendendo: (i) fornecer o dispositivo de cultura de células de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 19; (ii) pôr o dispositivo de cultura de células em contato com meio de cultura de células e pelo menos um tipo de célula; e (iii) cultivar a célula. 21. Um método de preparação de um dispositivo de cultura de células para cultivar esferoides, compreendendo: (i) fornecer uma câmara de cultura de células compreendendo: (a) uma base e paredes laterais que se estendem desde a base para circundar um volume da câmara de cultura de células; (b) uma entrada na base ou nas paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com a câmara; e (c) uma saída na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com o exterior da câmara; e (ii) adicionar uma superfície descontínua à base da câmara de cultura de células, em que a superfície descontínua é adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides. 22. O método de acordo com o parágrafo 21, em que a superfície descontínua é conforme definido em qualquer um dos parágrafos 3 a 6. 23. O método de acordo com o parágrafo 21 ou parágrafo 22, em que a superfície descontínua é fornecida à base usando usinagem de controle numérico do computador ou moldagem por injeção. 24. Uma câmara de cultura de células compreendendo uma base com uma superfície descontínua, em que a superfície descontínua compreende esferoides individuais individualizados presos nela. 25. A câmara de cultura de células de acordo com o parágrafo 24, em que a superfície descontínua é definida em qualquer um dos parágrafos 3 a 6. 26. Um dispositivo de cultura de células que compreende a câ mara de cultura de células de acordo com o parágrafo 24 ou o parágrafo 25. 27. O dispositivo de cultura de células de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 19 e 26, em que o dispositivo é uma placa multi- poços. 28. A câmara de cultura de células de acordo com o parágrafo 24 ou parágrafo 25, em que a câmara é um poço. 29. Uso do dispositivo de cultura de células de acordo com qual quer um dos parágrafos 1 a 19, 26 e 27 ou da câmara de cultura de células de acordo com qualquer um dos parágrafos 24, 25 ou 28 para cultivar um esferoide ou para manter esferoides em uma forma individualizada. 30. Uma cultura de esferoides, em que os esferoides estão sob a forma de esferoides individuais individualizados após 5 horas ou 5 dias de cultura.

[0211] Qualquer publicação citada ou descrita neste documento for nece informações relevantes reveladas antes da data de depósito do presente pedido. Afirmações neste documento não devem ser interpretadas como admissão de que os inventores não se encontram no direito de antedatar tais divulgações. Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são incorporadas a este documento à guisa de referência. Diversas modificações e variações da invenção se tornarão aparentes a indivíduos versados na técnica sem que se incorra em afastamento do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sida descrita em conexão com modalidades preferenciais específicas, deve-se compreender que a invenção, tal como reivindicada, não deve ser excessivamente limitada a tais modalidades. Com efeito, várias modificações dos modos descritos para desempenhar-se a invenção que são óbvias aos versados em engenharia, biologia celular e biologia molecular ou campos relacionados são destinadas a estar dentro dos limites do escopo das seguintes reivindicações.

Claims

1. Método para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoi- des caracterizado pelo fato de que compreende o uso de um dispositivo de cultura de células compreendendo: uma câmara de cultura de células compreendendo uma base e paredes laterais que se estendem desde a base para circundar um volume da câmara de cultura de células; uma entrada na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com a câmara; e uma saída na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com o exterior da câmara; em que a base da câmara de cultura de células compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) fornecer um ou mais esferoides individuais; (ii) transferir o esferoide individual para a câmara de cul tura de células do dispositivo de cultura de células; (iii) incubar os esferoides individuais no dispositivo de cultura de células; e (iv) obter um esferoide(s) individual(is) na superfície descontínua do dispositivo de cultura de células.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que um número conhecido de esferoides individuais é transferido na etapa (ii) e um número conhecido de esferoides individuais são obtidos na etapa (iv).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a superfície descontínua compreende uma pluralidade de sulcos em que a profundidade e largura das ranhuras está entre cerca de 200 a cerca de 1000 μm, apropriadamente, entre cerca de 200 a cerca de 600 μm.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os sulcos formam uma pluralidade de anéis concêntricos na base da câmara de cultura de células.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a superfície descontínua compreende uma pluralidade de furos com uma parte inferior fechada e uma parte superior aberta, em que o tamanho dos furos corresponde em profundidade e largura a cerca de 10% maior do que o maior diâmetro de um esferoide.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a câmara de cultura de células é fabricada a partir de PEEK.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a câmara de cultura de células é revestida, apropriadamente, em que o revestimento é um revestimento de polímero de poli(p-ixilileno).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que entre 40 a cerca de 100 esferoides são transferidos para a câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que um fluxo médio é aplicado à câmara de cultura de células do dispositivo de cultura de células, apropriadamente, em que a taxa de fluxo está entre cerca de 10 a cerca de 1000 μL/min.

11. Uso de um dispositivo de cultura de células para reduzir ou prevenir a aglomeração de esferoides, o referido dispositivo de cultura de células caracterizado pelo fato de que compreende: uma câmara de cultura de células que compreende uma base e paredes laterais que se estendem desde a base para circundar um volume da câmara de cultura de células, uma entrada na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com a câmara; e uma saída na base ou paredes laterais da câmara de cultura de células adaptada para comunicação fluida com o exterior da câmara; em que a base da câmara de cultura de células compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou impedir a aglomeração de esferoides.

12. Placa de cultura de células multipoços caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos poços da placa de cultura de células multipoços e/ou um inserto contido em pelo menos um dos poços da placa de cultura de células multipoços compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou prevenir a aglomeração de esferoides.

13. Inserto para uso em uma placa de cultura de células mul- tipoços caracterizado pelo fato de que compreende uma superfície descontínua adaptada para reduzir ou prevenir a aglomeração de esferoi- des.

14. Placa de cultura de células multipoços, de acordo com a reivindicação 12, ou o inserto, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a placa e/ou o inserto é fabricado a partir de PEEK; ou em que pelo menos um dentre os poços ou o inserto é revestido, apropriadamente, em que o revestimento é um revestimento de polímero de poli(p-xilileno).

15. Placa de cultura de células multipoços ou o inserto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um poço ou o inserto compreende um esferoide único individualizado.