CN111829838B - 一种适用于生物学研究的pm2.5采集和提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于生物学研究的PM2.5采集和提取方法，本发明通过将含有孔径为1.0～2.5μm的特氟龙滤膜用于有效采集和分离环境中的PM2.5，并进一步优化提取方法使其更适用于生物学研究，该PM2.5采集和提取方法可用于大量、低成本富集TRPM2.5或BRPM2.5，并高效回收滤膜上的PM2.5；该方法制备的组分同时含有水相、有机相及不可溶成分，尽可能还原空气中PM2.5的实际成分构成，且不会引入额外的有毒成分，制备成可用于生物学实验的形式，对于研究环境中的PM2.5对生物体的危害有重要的意义。经测算，本发明方法对PM2.5最终回收率在93％‑97％。

Description

一种适用于生物学研究的PM2.5采集和提取方法

技术领域

本发明涉及一种适用于生物学研究的PM2.5采集和提取方法。

背景技术

空气动力学直径在2.5μm以下的颗粒物称为细颗粒物(Particulate matter 2.5,PM2.5)。PM2.5可以到达呼吸系统气体交换区域，与人体健康密切相关。许多对人体具有潜在危害的物质如碳粒、酸、重金属、多环芳烃等都富集在PM2.5中，因此颗粒物对人体健康影响被认为主要是由PM2.5引起的。流行病学研究显示PM2.5暴露与呼吸道感染、心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病、肺癌等的发生发展相关，PM2.5浓度升高可导致全因住院率、死亡率的增加。不同地区PM2.5主要来源可以不同，不同来源PM2.5物理化学特征也不尽相同。在很多城市，环境空气PM2.5主要来自于交通，这些交通相关PM2.5(Traffic-related PM2.5，TRPM2.5)主要来自汽油、柴油燃烧、轮胎摩擦、二次气溶胶等。而在发展中国家农村地区，燃烧生物燃料(包括木材、秸秆、动物粪便等)用于烹饪、取暖、照明是环境空气PM2.5最主要来源，此种来源PM2.5称为生物燃料相关PM2.5(Biomass-related PM2.5，BRPM2.5)。BRPM2.5是农村室内空气污染主要污染物之一，也是多种呼吸道疾病的危险因素。

研究TRPM2.5和BRPM2.5对机体的影响及作用机制，要求PM2.5满足以下几个条件：1.大量：尽可能短时间内富集大量PM2.5；2.可靠：从滤膜上回收得到的PM2.5成分与空气中的尽可能一致；除PM2.5本身的成分，不能引入可能对动物或细胞有毒性作用的其他额外物质；3.高效：回收效率高；4.成本低廉：节省科研经费。因此可大量、可靠、高效、低成本的收集TRPM2.5和BRPM2.5的方法具有实际意义和迫切需求。

目前提取PM2.5的方法存在以下几个不足：

第一，采集滤膜缺陷：虽然已有商品化捕获大气PM2.5的仪器，但配套使用的采集滤膜主要为理化分析设计，不适合用于生物学研究，原因是其多为石英材质或玻璃纤维材质，这些材质已有众多文献报道具有明确的毒性作用，在提取过程中不可避免会有滤膜本身材料大量的脱落或溶解，混入提取物中。这类方法采集到的PM2.5适合用于理化分析，用于生命科学实验时只能采用其中的可溶部分。但PM2.5含有大量不可溶于水或有机溶剂(如二氯甲烷、丙酮等)的成分，如碳粒(可占PM2.5一半以上的质量)，这类不可溶成分同样具有对健康不可忽视的影响。

第二，提取方法缺陷：采集交通相关和生物燃料烟雾的PM2.5在产生上具有各自的特点，与普通环境大气PM2.5相比，其含有更多的有机相，富集后的PM2.5呈粘稠的状态，与采样滤膜结合较紧密，常规采集一般PM2.5的提取方法，既直接将滤膜溶于水或有机溶剂中，使用浸入式超声清洗仪大功能率清洗，这种方法对交通相关和生物燃料烟雾的PM2.5水相、有机相和不溶颗粒物整体的回收效率不高，无法高效可靠回收这两类PM2.5，需要为这两种PM2.5设计更有效的提取方法。

第三，无法有效回收不溶性颗粒物：石英或玻璃纤维因为都是用多层纤维交错制成的滤膜，PM2.5颗粒会被牢固捕获到纤维交错形成的缝隙中，所以在PM2.5提取阶段，超声清洗仪即使使用非常高功率(如1000w)时仍无法很好的回收这些藏在纤维缝隙中的颗粒，严重降低回收率；脱落的纤维与待提取颗粒物混合难以分离，进一步增加不溶性颗粒物回收；同时因为高功率带来的发热问题，高温状态下可能改变提取的PM2.5成分。

为了有效研究PM2.5对生物体的危害，有必要对PM2.5的收集、提取方法进行改进，得到适用于生物学研究的提取方法和材料。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种针对交通相关和生物燃料相关细颗粒物(PM2.5)的采集和提取方法。

一种适用于生物学研究的PM2.5采集和提取方法，包括以下步骤：

(1)将装载有特氟龙滤膜的采样器置于待研究的环境中进行采样；所述滤膜上设有孔径为1.0～2.5μm的孔；

(2)提取滤膜上的成分；

(3)将得到的所述成分，溶于DMSO中，避光、密封，-80℃保存。

现有特氟龙(Polytetrafluoroethylene，PTFE，聚四氟乙烯，又称特氟龙)主要用于材料表面覆膜，减少污染物质粘附。本发明采用PTFE材质滤膜这种滤膜为单层结构，若为无打孔的特氟龙滤膜，采样过程中真空泵无法透过滤膜吸入空气，真空泵负压迅速增大至最大可承受值(25cm H₂O)，滤膜几乎无法捕集PM2.5；本发明通过激光打孔，让其可以用于对环境中的PM2.5进行采集。一般地，0.3μm即可对PM2.5进行捕获，但太小孔径容易堵塞，采样效率低，经试验，优选孔径在1μm～2.5μm进行采集。

提取得到的PM2.5后续用于生物学研究，上述步骤(2)、(3)严格按照无菌操作进行或将提取到的成分进行无菌化处理(如钴60或伽玛射线灭菌等)。

与采用玻璃纤维样品膜不同，由于PTFE膜不存在膜材质脱落及溶于提取溶剂的问题，不会出现滤膜材质脱落导致回收质量异常增大，回收率超过100％的情况，亦不会混入玻璃的多种金属离子，提取后无需过滤颗粒物，不损失不溶性颗粒物成分；且PTFE膜有吸附低的优点，所以在提取过程中既不引入膜本身材质，回收得到更加单纯的PM2.5，也同时让颗粒物从滤膜上脱落效率更高，达到高效回收膜上PM2.5的目的。最后，利用DMSO良好的溶解特性、抑菌性以及稀释成低浓度时对细胞和组织的无毒，用于混合提取到不溶性颗粒物、水相和有机相，保存提取得到的PM2.5，便于后续的实验进行。

作为本发明的优选实施方式，所述滤膜上设有孔径为1.6μm的孔。

作为本发明的优选实施方式，所述滤膜的大小为8×10英寸。

该尺寸的滤膜面积较大，能够高效截留富集空气中的PM2.5，同等时间下富集PM2.5的质量是装配小尺寸滤膜(47mm直径)的小流量采样器 Tactical AirSampler(TAS)的约220倍，降低成本。

作为本发明的优选实施方式，所述滤膜提取时剪成多份。

将滤膜剪成多份便于提取的进行，更高效。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)包括提取滤膜中的水相成分：将采集后的滤膜泡入水中，超声振荡处理后回收溶液，同时对滤膜进行离心，将超声所得溶液和离心所得溶液冷冻干燥，即得PM2.5水相及不可溶成分的混合物。

更优选地，所述水相成分的提取方法为：将采集后的滤膜泡入水中，超声振荡至其变成半透明白色；将超声后的滤膜转移至带吊篮的离心管中，离心并收集离心后的水分；离心后的水分与超声后的水合并置于蒸发皿中，并用保鲜膜密封，置于-80℃冷冻2日；随后在保鲜膜上扎若干小孔，将蒸发皿置于低温真空干燥仪中冷冻干燥至剩下絮状或油状固体物，所述固体物即为冻干后的PM2.5水相和不可溶成分的混合物。

在PM2.5提取过程中引入细胞超声破碎仪，利用细胞破碎仪超声探头具有的良好超声指向性、可灵活操作等特点，在低功率(65w)下即可高效回收滤膜上的可溶和不可溶成分，避免对溶剂的加热作用，同时因为PTFE膜具有良好的韧性，在该功率的超声波近距离振荡下也不会破碎。该方法对于不同大小的滤膜适用性较高，实用性强。

作为本发明的优选实施方式，所述超声振荡处理为：使用超声细胞破碎仪振荡提取，振幅为30-50％，工作10-15s，暂停3-5s，超声探头直径为6mm或以上。

在上述超声工作条件下，滤膜上PM2.5颗粒的分离效率较好；超声操作时用超声探头从滤膜一侧开始往另一侧逐渐缓慢振荡。可避免超声过程中由于超声导致溶剂过热，使得滤膜上的成分产生变化。

作为本发明的优选实施方式，所述离心过程为4℃、10000g离心10min。

通过离心收集滤膜上的水分和已脱落的颗粒物，能够更全面地回收PM2.5成分。

作为本发明的优选实施方式，所述冷冻干燥的条件为-70至-60℃，0.07-0.09mbar。

在上述条件下进行干燥，能有效避免水相中的PM2.5组分发生改变，保证后续实验的真实性。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)包括提取滤膜中的有机相成分：将滤膜浸泡于非极性或弱极性低沸点有机溶剂中，得含PM2.5的有机溶液，去除有机溶液，即得PM2.5有机相成分。

所述非极性或弱极性低沸点有机溶剂包括环己烷、正己烷、二氯甲烷、丙酮等。

作为本发明的优选实施方式，所述含PM2.5的有机溶液的获得方法为：将滤膜浸泡于非极性或弱极性低沸点有机溶剂中，固定在摇床上，4℃振荡不少于1小时，振荡速度不低于300次/分。

本发明还要求保护根据所述方法制备得到的组分。

本发明还要求保护所述组分在研究PM2.5对生物体的危害中的用途，所述用途为非人体、不包含外科手术方法的研究用途。

作为本发明的优选实施方式，所述用途为细胞学实验研究。

本发明通过使用含有激光打孔的PTFE滤膜用于生物学研究PM2.5，并对后续的采集和提取方法进行优化，使其可用于大量、低成本富集TRPM2.5或BRPM2.5，并能够高效回收滤膜上的PM2.5，经测算，本发明提取方法对PM2.5最终回收率在93％-97％，远比现有技术的高效。本发明方法能够有效提取水相、有机相及不可溶成分，尽可能还原空气中PM2.5的实际成分构成，同时不引入额外的有毒成分，制备成可用于生物学实验的形式，对于研究环境中的PM2.5对生物体的危害有重要的意义。

附图说明

图1为本发明水相PM2.5提取时超声振荡过程的示意图。

图2本发明使用的50mL带吊篮离心管。

1、超声细胞破碎仪超声探头；2、收集有PM2.5的PTFE滤膜；3、提取过程中的溶剂；4、离心管盖子；5、离心管吊篮；6、离心管管体；7、离心管吊篮带孔底部。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明方法用于提取采集交通相关PM2.5(Traffic-related ParticulateMatter2.5，TRPM2.5)

1.采样

地点：繁忙公路旁。

设备与材料：大流量采样器(Tisch TE-6070，USA)，装配PM2.5切割头，流量为1.13m³/min。PTFE滤膜(8×10inch)，孔径1.6μm，有效采样面积为406cm²。

滤膜预处理：每张滤膜分别编号，在恒温恒湿(温度25℃，湿度45％)的环境中平衡24h后称重(Mettler-Toledo MX5微量天平，Columbus，OH，灵敏度±0.1μg)。

采样步骤：记录采样前后时间、采样器时间读数、采样流速、温度、湿度、气压。装载滤膜的采样器距离公路旁4m以内，高度3m，周围无明显障碍物阻隔。交通流量高峰时段(8时至21时)采样，每天采样后更换新滤膜；采集后的滤膜封口袋密封，防止滤膜进水结冰，-80℃避光保存。采样完成后置于恒温恒湿(25℃，湿度45％)环境中平衡24h，称重，记录采样前后滤膜重量变化。

每天采样时间段内降水时间超过3h或(和)风速超过6m/s时不采样。滤膜在运输、存放过程中，均采用锡箔纸加密封盒子遮光密封。

2.水相和不可溶成分的提取：

1)已灭菌的洁净结晶皿(直径180mm)中装入250mL去离子水；从冰箱里取出已收集PM2.5的滤膜，用剪刀剪成4份(约5*6.3cm)，剪后的滤膜浸泡入结晶皿水中。

2)超声细胞破碎仪(VCX 130，sonics，美国，搭配直径6mm超声探头)调整AMPL为50％，工作15s，暂停5s；用超声探头从滤膜一侧开始往另一侧逐渐缓慢振荡(洗脱过程中探头不直接接触滤膜，如图1所示)，震落膜上粘附的颗粒物；经此洗脱过程，滤膜从灰色或黑色变成半透明白色。

3)将洗脱后的滤膜放到另一个无菌洁净结晶皿中保存。

4)重复步骤1)到3)，将多张滤膜上的颗粒物洗脱到结晶皿水里；依据每张膜上粘附颗粒物数量的多寡，每250mL去离子水可用于洗脱约3～5张滤膜上的颗粒物。

5)将所有洗脱有颗粒物的去离子水统一转移一个无菌洁净大玻璃瓶中，混合均匀。

6)将步骤3)中的滤膜全部转移至带吊篮的50mL离心管吊篮中，在4℃、10000g的条件下离心10min，回收膜上水分。

7)将步骤6)中离心回收得到的水与步骤5)中的混合物混合。

8)将步骤7)中的水分装到直径28mm的无菌洁净蒸发皿中，皿中液体高度不超过1cm；将蒸发皿用两层保鲜膜密封盖好，放进-80℃冰箱中冷冻2日。

9)取出冷冻后的蒸发皿，用针头在保鲜膜上扎出足够数量的小孔；将蒸发皿放进低温真空干燥仪(Christ，USA)中低温干燥至液体消失，剩下絮状(交通尾气相关PM2.5)或油状(生物燃料PM2.5)固体物质时即可终止冻干，低温真空干燥仪设置参数为-60℃，真空0.07mbar。

10)标记、称量已灭菌的洁净安瓿瓶重量；取出步骤9)的蒸发皿，使用一次性无菌刮勺迅速将皿中的固体物质收集到准备好的安瓿瓶中。

11)称重、计算安瓿瓶增加的重量，即为冻干后PM2.5水相和不可溶成分的质量。

12)将安瓿瓶塞上橡胶盖，并用密封胶条密封，避光避潮，-80℃保存。

3.有机相成分的提取：

13)已灭菌的洁净锥形瓶(容积150ml)中装入50mL二氯甲烷；将步骤6)中的滤膜剪成2*6.3cm的条形，放进准备好的锥形瓶中。

14)将锥形瓶固定于摇床上，4℃振荡1小时，转速不低于300次/分。

15)标记、称量已灭菌的洁净安瓿瓶重量；将步骤14)中溶解有颗粒物的二氯甲烷分装到各安瓿瓶中。

16)将步骤15)中装有溶解物的安瓿瓶在37℃下用氮吹仪促进二氯甲烷挥发；称量已挥发二氯甲烷的安瓿瓶，并计算增加的重量，即为PM2.5有机相质量。

4.合并水相成分、不可溶成分和有机相成分

混合上述步骤获得的的水相成分、不可溶成分及有机相PM2.5成分，计算其总质量，并将其充分溶解于DMSO中，使溶液中PM2.5的终浓度为100mg/mL；塞上橡胶盖，并用密封胶条密封，避光避潮，-80℃保存。

实施例2

本发明方法用于提取采集生物燃料相关PM2.5(Biofuel-related ParticulateMatter，BRPM2.5)

采样方法为：装载滤膜的采样器距离炉灶1m距离，高1-1.5m，厨房风速低于3m/s；点火至杉木燃烧旺盛(烟雾不明显)时开始收集，为避免煮饭时的油烟气溶胶干扰，采样时仅煮水，结束时停止收集。每张滤膜的采样时间由采样器负压决定，当采样器负压大于25cmH2O时说明滤膜已满载，停止采样。采样后的滤膜封口袋密封，防止滤膜进水结冰，-80℃避光保存。BRPM2.5采样完成后置于恒温恒湿(25℃，湿度45％)环境中平衡24h，称重，记录采样前后滤膜重量变化。

本实施例中采集的滤膜保存、后续提取步骤与实施例1相同。

实施例3

分别对玻璃纤维滤膜和特氟龙滤膜(孔径为1.6μm)通过相同的方法，在同样的环境下同时采集的交通相关和生物燃料烟雾PM2.5(每个环境条件下，每种膜进行6个重复)，结果如下表1。

表1不同滤膜材料的提取结果

由上表可得，玻璃纤维膜采集的交通相关PM2.5提取率是65.3％±10.1％；特氟龙膜采集的交通相关PM2.5提取率是97.6％±1.2％；玻璃纤维膜采集的生物燃料烟雾PM2.5提取率是76.1％±7.8％；特氟龙膜采集的生物燃料烟雾PM2.5提取率是97.2％±1.4％。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种适用于生物学研究的PM2.5采集和提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将装载有特氟龙滤膜的采样器置于待研究的环境中进行采样；所述滤膜上设有孔径为1.6 μm的孔；

（2）提取滤膜上的成分；

（3）将得到的成分溶于DMSO中，避光、密封，-80℃保存；

所述步骤（2）包括提取滤膜中的水相成分：将采样后的滤膜泡入水中，超声振荡处理后回收溶液，同时对滤膜进行离心，将超声所得溶液和离心所得溶液冷冻干燥，即得PM2.5水相和不可溶成分的混合物；

所述超声振荡处理为：使用超声细胞破碎仪振荡提取，振幅为30-50%，工作10-15s，暂停3-5s，超声探头直径为6mm或以上；

所述步骤（2）包括提取滤膜中的有机相成分：将提取水相成分后的滤膜浸泡于非极性或弱极性低沸点有机溶剂中，得含PM2.5的有机溶液，去除有机溶剂，即得PM2.5有机相成分。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷冻干燥的条件为-70至-60℃，0.07-0.09mbar。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含PM2.5的非极性或弱极性低沸点有机溶剂溶液的获得方法为：将滤膜浸泡于非极性或弱极性低沸点有机溶剂中，固定在摇床上，4℃振荡不少于1小时，振荡速度不低于300次/分。

4.如权利要求1~3任一项所述方法制备得到的组分。

5.如权利要求4所述组分在研究PM2.5对生物体的危害中的用途，所述用途为非人体、不包含外科手术方法的研究用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述用途为细胞学实验研究。