CN111521713A - 一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：模拟人体肺部环境。步骤：取玻璃瓶，加入一定量的肺部模拟液，加入吸附剂Tenax小棒，加入含有多种PAHs的颗粒物，放入摇床中，温度为人体常温，启动摇床，避光培养适当的天数；然后进行分离并处理，进行生物可给性的测定。由于本发明在模拟肺部环境的方法中加入了吸附剂，吸附剂的加入可以持续吸收污染物，使得颗粒物与模拟液之间一直保持着浓度梯度，污染物就会持续的从颗粒物中扩散到组织液中，体现了污染物溶解到组织液中是一个源源不断的吸收的过程，更好的模拟了人体吸收，利用组织液中污染物的过程，更准确的评估了污染物的生物可给性。

Description

一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法

技术领域

本发明涉及一种生物可给性检测方法，具体涉及一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法。

背景技术

人体暴露于环境中污染物的途径主要有三种，即呼吸暴露，膳食暴露和皮肤暴露。其中呼吸暴露是大气污染物进入到人体的主要途径之一。大气的迁移扩散，会使得大气中的各类污染物随之传输到各个地方，进而引起不同的环境污染问题，增加了人体经呼吸的污染物暴露风险，对人体健康产生潜在的危害。

环境中的污染物分为有机污染物和无机污染物两种，例如在空气中含有硫氧化合物，氮氧化合物和碳氧化合物等无机污染物，也会有多环芳烃，二噁英等有机污染物。研究表明，人们若是长期置身于有机污染物浓度较高的环境中，会大幅度增加其患呼吸系统疾病的几率，并且有机污染物可以穿透胎盘，从而影响胎儿的健康，导致胎儿发育不良。因此大气中有机污染物对人体健康的危害是不容忽视的。

大气中有机污染物主要形态为气态与颗粒态。颗粒态有机污染物是指吸附或粘附在大气悬浮颗粒物上的有机污染物。颗粒态有机污染物的含量与颗粒物粒径及性质相关，其在人体呼吸系统里的行为与颗粒物的相似。例如颗粒物的粒径大小不一，不同粒径的颗粒物在人体肺部的沉积效率也不同。大部分粒径大于10μm的颗粒物，在进入人体肺部之前，就会被鼻腔和咽喉截留住；而粒径在5－10μm的颗粒物在进入到咽喉部之后，可以在咽喉部通过物理机制去除；小于5μm的颗粒物则会经过咽喉部到达支气管；而小于2.5μm的颗粒物会通过呼吸进入肺部最深处。细颗粒(≤2.5μm)停留在空气中的时间相对较长，对有毒有害物质的吸附性更强，能在人体内呼吸系统的肺部沉积，沉积效率较高等，逐渐引起广大研究者的关注。

研究表明，颗粒物上的毒害污染物经摄食或呼吸进入人体内，只有部分污染物将被解吸释放到人体的消化液，其中一部分能穿过细胞膜累积在人体器官并进行体内循环，从而产生健康风险。其中释放到消化液中污染物的量被称为生物可给性，而能穿过细胞膜被人体或生物体吸收而在体内循环的部分，称为生物可利用性。因此，采用毒害污染物的总浓度来评估其产生的健康风险，将会高估其风险值。目前多数风险评估方法正逐步由基于毒害污染物在样品基质的总浓度转换成其生物可利用或生物可给态浓度。理想情况下，可通过测定人体血液内毒害污染物的含量评估其生物可利用性，或一定条件下通过活体动物(如老鼠、猪或猴子)实验评估。然而，由于人体样品较难采集、活体动物实验耗费成本高且涉及伦理问题，多数研究者采用可通过体外模拟方法得到的生物可给性来替代生物可利用性进行风险评估。目前建立采用人体肺部模拟液评估颗粒态污染物经呼吸的生物可给性的体外方法都集中在重金属，对于有机污染物的研究甚少。

经检索发现，国家知识产权局于2019年12月03日公开了公开号为CN110531056A的专利文献，一种土壤中六价铬呼吸途径的生物可给性测试方法，包括以下步骤；S1、将土壤样品风干，取出大块卵石及杂质，通过孔径为250μm的尼龙筛；S2、将上述处理后的土壤样品在温度为80℃的烘箱中烘干4h；S3、利用拍击式振筛机将烘干后的土壤样品连续通过40目、100目、140目、200目、270目和400目的筛子，持续振荡10min后最终得到粒径小于38μm的土壤样品，将其保存在塑料自封袋中用于土壤细颗粒样品的进一步分离；S4、利用实验室内的颗粒物再悬浮检测系统，采用PM_2.5和PM₁₀标准旋风式采样器，设置采样流量为16.7L min^-1，空气动力学直径切割粒径分别为10μm和2.5μm，对上述样品进行进一步分离，获得粒径小于10μm和2.5μm的土壤PM₁₀和PM_2.5滤膜样品，并测定滤膜样品上六价铬的浓度ω(s)(mg kg^-1)；S5、提前一天配置好模拟肺液，并在实验前放入烘箱中37℃条件下预热2h，模拟人体环境；S6、用不锈钢剪刀将土壤PM₁₀和PM_2.5滤膜样品剪碎放入50mL离心管中，加入50mL模拟肺液，混合后置于恒温37℃振荡箱中，设置振荡频率为50rpm；S7、振荡1h取出，将浸提液倒入真空抽滤装置中抽滤，滤膜孔径为0.45μm，收集抽滤液并测定抽滤液中六价铬的浓度ω(lb)(mg kg^-1)；S8、测得的抽滤液中六价铬浓度ω(lb)(mg kg^-1)与滤膜上六价铬浓度ω(s)(mg kg^-1)的比值即为六价铬呼吸途径的生物可给性。S5中模拟肺液为一种无机和有机组成的混合溶液，其配置方法如下：选取氯化钠6786mg L^-1、氯化铵535mg L^-1、碳酸氢钠2268mg L^-1、甘氨酸375mg L^-1、二水柠檬酸钠59.3mg L^-1、二水氯化钙29.4mg L^-1、L-半胱氨酸121mg L^-1、磷酸二氢钠144mg L^-1、二乙基三胺五乙酸78.6mg L^-1、烷基苄基二甲基氯化铵50mg L^-1和硫酸27μL，按顺序依次溶解以上溶质，待完全溶解后加入下一种溶质，避免出现沉淀。所述S6中滤膜样品和模拟肺液之间的固液比分别设置在0.40－0.50g mL^-1(PM₁₀颗粒)和0.15－0.20g mL^-1(PM_2.5颗粒)范围内。所述S7中振荡提取时间分别设置在36-72h(PM₁₀颗粒)和24-72h(PM_2.5颗粒)范围内。

由于实验室模拟中固液比不可能无限大，使得颗粒物与模拟液之间不能一直保持着相应的浓度梯度，所以上述专利文献的技术无法更准确的评估污染物的生物可给性。

发明内容

为了克服上述之不足，本发明的目的在于提供一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，该方法能更准确的评估污染物的生物可给性。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于，包括：步骤A、模拟肺部环境：取玻璃瓶，加入一定量的肺部模拟液，加入吸附剂小棒，加入含有PAHs的颗粒物，放入摇床中，温度为人体常温，启动摇床，避光培养适当的天数。

进一步地，还包括：

步骤B、分离并处理：到达培养的天数后，取出玻璃瓶；先将吸附剂小棒从玻璃瓶中取出放入特氟龙离心管中，进行多次超声萃取并多次浓缩后，再经过层析柱净化，加入洗脱溶剂洗脱并浓缩后得到含有PAHs的吸附剂处理液；将玻璃瓶中的组织液滤出，对组织液进行多次液液萃取并多次浓缩后得到含有PAHs的模拟肺液处理液；再将过滤组织液后得到的颗粒物放入特氟龙离心管中，进行超声萃取、浓缩、置换溶剂、再次浓缩、经过无水硫酸钠及层析柱净化后，再经洗脱和浓缩后得到含有PAHs的颗粒物处理液。

步骤C、检测：利用气相色谱质谱联用仪分别对含有PAHs的模拟肺液处理液、含有PAHs的吸附剂处理液、含有PAHs的颗粒物处理液进行检测，得到肺部组织液中PAHs的含量M_Y，吸附剂中PAHs的含量TA，没有释放到肺部组织液中，仍保留在颗粒物上PAHs的含量M_p。

步骤D、生物可给性的测定：将上述检测到的值代入以下公式得到经呼吸的生物可给性(IBAF)

进一步地，步骤A中，所述组织液为人工溶酶体或Gamble溶液；所述的人工溶酶体的pH值为3.5－4.5，模拟的是巨噬细胞吞噬颗粒时的肺部环境；所述的Gamble溶液是加入了肺表面活性剂后的修正Gamble溶液，是pH为7.0－7.4的模拟液，模拟的是肺泡细胞间质液。

进一步地，步骤A中，所述吸附剂小棒中的吸附剂为Tenax，称为吸附剂Tenax小棒，具体制作的步骤为：称取1g Tenax粉末置入圆筒中，圆筒的两端用特氟龙塞子塞紧，圆筒是由1000－2000目的不锈钢网制成，并用不锈钢丝将两端拧紧；颗粒物为加标沉积物，取适量的沉积物，烘干研磨过筛后，获得粒径小于200μm的颗粒物，然后加入多种PAHs的混合标样，搅拌均匀，加标后颗粒物中PAHs浓度为8－12μg g^-1，加标后的颗粒物保存于2－6℃的冰箱中，老化一个月后再使用。

进一步地，所述步骤A中，取250mL玻璃瓶，分别加入200mL组织液，吸附剂Tenax小棒，20mg加标后的颗粒物，放入摇床中，温度为37℃，转速150rpm，培养10d。

进一步地，步骤B中，所述层析柱的制备：选取内径为0.8cm的层析柱，用脱脂棉将层析柱的下端封堵，填入并压实无水硫酸钠，在层析柱内的厚度为0.8－1.2cm，再填入并压实厚度为4.5－5.5cm的活化后的中性硅胶；所述活化后的中性硅胶为80－100目分析纯硅胶，该硅胶和脱脂棉的前处理均是先用滤纸包好，而后利用索式抽提器甲醇抽提48h后,取出放入真空干燥桶真空抽干；使用前，硅胶需在110℃烘箱中干燥活化4h，活化好的硅胶放入密封干燥桶中保存；无水硫酸钠在马弗炉450℃焙烧4h，冷却后取出，放入真空干燥桶中保存留用。

进一步地，步骤B中，含有PAHs的吸附剂处理液的具体处理方法如下：用镊子从玻璃瓶内夹出吸附剂小棒，用超纯水冲洗吸附剂棒表面，洗净表面的颗粒物，冲洗的超纯水合并入剩下的培养组织液中。洗净后的Tenax小棒放入特氟龙离心管中，加入回收率指示物，加入处理好的铜片，加入体积比为1:1的正己烷和丙酮的溶剂25mL，超声萃取三次，每次超声30min；合并三次超声溶剂至浓缩管中，在柔和氮气下浓缩至10mL，加入10mL正己烷置换溶剂后，再次浓缩至10mL，经过无水硫酸钠后接入新的浓缩管中，浓缩至1mL，经过层析柱净化后，加入20mL正己烷洗脱，用新的浓缩管接下洗脱溶剂，再次浓缩后转入细胞瓶中，在柔和的氮气下浓缩到250μL后，转入平底衬管中，定容至100μL后，加入内标，等待仪器分析检测。

进一步地，步骤B中，所述含有PAHs的模拟肺液处理液的具体处理方法如下：当组织液为人工溶酶体时，利用溶剂抽滤器直接通过0.2μm的混合纤维滤膜抽滤，当组织液为Gamble溶液时，需先进行离心处理，离心转速为7500rpm，时间为10min，然后再通过0.2μm混合纤维滤膜进行抽滤；对抽滤出的组织液用特氟龙分液漏斗进行液液萃取，加入40mL二氯甲烷，加入回收率指示物后，摇动5min，然后静置10min，用洗净的浓缩管接下下层溶剂，液液萃取3次，合并3次萃取剂；在柔和的氮气下，浓缩至10mL，加入10mL正己烷置换溶剂；再次浓缩至10mL，经过无水硫酸钠去水后，接入新的浓缩管中；柔和氮气下浓缩到200μL后，转入尖底衬管中，定容至50μL，加入内标，等待进行仪器分析检测。

进一步地，所述步骤B中，所述含有PAHs的颗粒物处理液的具体处理方法如下：将抽滤后的混合纤维滤膜及其截留的颗粒物一同放入特氟龙离心管中，加入体积比为2:2:1的正己烷、二氯甲烷和丙酮的溶剂15mL，加入一定量的回收率指示物和干净的铜片，进行超声萃取30min，取出静置10min后倒入干净的浓缩管中，样品超声3遍；合并3次超声样品，在柔和的氮气下浓缩至10mL，加入10mL正己烷置换溶剂后，再次浓缩至10mL，过无水硫酸钠后用新的浓缩管将溶剂接下；浓缩至1mL后，采用层析柱进行净化，加入20mL正己烷洗脱；洗脱液用新的浓缩管接下并在柔和氮气下，浓缩至250μL转入平底衬管中，定容至100μL，加入内标，等待进行仪器分析检测。

进一步地，步骤A和B中，所用到的玻璃类的器皿均放入5％的碱液中浸泡12h，自来水将表面碱液冲洗干净后用锡箔纸封好，然后放入120℃烘箱中烘干，烘干后取出放入马弗炉中450℃下焙烧4h，冷却后取出使用；溶剂抽滤器用自来水将表面灰尘等冲洗干净后，用重铬酸钾-浓硫酸洗液浸泡12h后，用自来水将表面残留的重铬酸钾-浓硫酸洗液洗净，甲醇超声3遍，每次超声30min，再用二级水冲洗掉表面的甲醇溶剂；0.2μm混合纤维滤膜，使用前用甲醇超声3次，每次20min，然后用超纯水超声3次，每次20min；所述的特氟龙离心管、特氟龙分液漏斗，使用前均需甲醇润洗三遍，二氯甲烷润洗两遍，最后用下一步使用的溶剂润洗一遍；所述的铜片，泡入5％盐酸中，约30min后，待铜片表面光亮后取出，用蒸馏水冲洗掉表面盐酸后，甲醇超声一次，二氯甲烷超声两次，每次超声10min；所述的镊子，使用前也先用甲醇超声3次，每次10min。

本发明的有益效果在于：

由于本发明在模拟肺部环境的方法中加入了吸附剂，吸附剂的加入可以持续吸收污染物，使得颗粒物与模拟液之间一直保持着浓度梯度，污染物就会持续的从颗粒物中扩散到组织液中，体现了污染物溶解到组织液中是一个源源不断的吸收的过程，更好的模拟了人体吸收，利用组织液中污染物的过程，更准确的评估了污染物的生物可给性，解决了实验室模拟中固液比不可能无限大，无法更准确的评估了污染物的生物可给性的缺陷。

由于本发明所采用的肺部模拟液为人工溶酶体或Gamble溶液，尤其是使用修正后的Gamble溶液，即加入二棕榈酰磷脂酰胆碱作为肺表面活性剂，能更好的模拟了肺泡间质液的环境。

附图说明

图1为本发明中吸附剂Tenax小棒的立体图。

图中：1、圆筒；2、特氟龙塞子；3、不锈钢丝。

具体实施方式

实施例1

一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，包括以下步骤：

模拟肺部环境前准备工作：

⑴所述层析柱的制备：选取内径为0.8cm层析柱，用脱脂棉将层析柱的下端封堵，填入并压实无水硫酸钠，在层析柱内的厚度为0.8－1.2cm，再填入并压实厚度为4.5－5.5cm的活化后的中性硅胶；所述活化后的中性硅胶为80－100目分析纯硅胶，该硅胶和脱脂棉的前处理均是先用滤纸包好，而后利用索式抽提器甲醇抽提48h后,取出放入真空干燥桶真空抽干；使用前，硅胶需在110℃烘箱中干燥活化4h，活化好的硅胶放入密封干燥桶中保存；无水硫酸钠在马弗炉450℃焙烧4h，冷却后取出，放入真空干燥桶中保存留用。

⑵所用到的玻璃类的器皿均放入5％的碱液中浸泡12h，自来水将表面碱液冲洗干净后用锡箔纸封好，然后放入120℃烘箱中烘干，烘干后取出放入马弗炉中450℃下焙烧4h，冷却后取出使用。

⑶溶剂抽滤器用自来水将表面灰尘等冲洗干净后，用重铬酸钾-浓硫酸洗液浸泡12h后，用自来水将表面残留的重铬酸钾-浓硫酸洗液洗净，甲醇超声3遍，每次超声30min；再用二级水冲洗掉表面的甲醇溶剂；0.2μm混合纤维滤膜，使用前用甲醇超声3次，每次20min，然后用超纯水超声3次，每次20min。

⑷所述的特氟龙离心管、特氟龙分液漏斗，使用前均需甲醇润洗三遍，二氯甲烷润洗两遍，最后用下一步使用的溶剂润洗一遍；所述的铜片，泡入5％盐酸中，约30min后，待铜片表面光亮后取出，用蒸馏水冲洗掉表面盐酸后，甲醇超声一次，二氯甲烷超声两次，每次超声10min。

⑸所述的镊子、剪刀等工具，使用前也先用甲醇超声3次，每次10min。

⑹吸附剂Tenax小棒的具体制作的步骤为：称取1g的Tenax粉末置入圆筒1中，圆筒1的两端用特氟龙塞子2塞紧，圆筒1是由1500目的不锈钢网绕制而成并用不锈钢丝3拧紧固定，如图1所示。

上述的准备工作完成后，开始本专利的步骤A、模拟肺部环境。

步骤A、模拟肺部环境：取250mL玻璃瓶，分别加入200mL组织液，吸附剂Tenax小棒，20mg加标后的颗粒物，放入摇床中，温度为37℃，转速150rpm，培养10d。

所述组织液为人工溶酶体；所述的人工溶酶体的pH值为3.5－4.5，模拟的是巨噬细胞吞噬颗粒时的肺部环境，具体成分及含量，详见表1；所述颗粒物为加标沉积物，取一定量的东莞采集的东江流域沉积物，烘干研磨过80目筛后，获得粒径小于200μm的颗粒物，然后加入25种PAHs的混合标样，搅拌均匀，加标后颗粒物中PAHs浓度约为10μg g^-1，加标后的颗粒物保存于4℃冰箱中，老化一个月后再使用。

步骤B、分离并处理：到达培养的天数后，取出玻璃瓶；先将吸附剂Tenax小棒从玻璃瓶中取出放入特氟龙离心管中，进行多次超声萃取并多次浓缩后，再经过层析柱净化，加入洗脱溶剂洗脱并浓缩后得到含有PAHs的吸附剂处理液；具体来说，含有PAHs的吸附剂处理液的具体处理方法如下：用镊子从玻璃瓶内夹出吸附剂小棒，用超纯水冲洗吸附剂棒表面，洗净表面的颗粒物，冲洗的超纯水合并入剩下的培养组织液中。洗净后的Tenax小棒放入特氟龙离心管中，加入回收率指示物，加入处理好的铜片，加入体积比为1:1的正己烷和丙酮的溶剂25mL，超声萃取三次，每次超声30min；合并三次超声溶剂至浓缩管中，在柔和氮气下浓缩至10mL，加入10mL正己烷置换溶剂后，再次浓缩至10mL，经过无水硫酸钠后接入新的浓缩管中，浓缩至1mL，经过层析柱净化后，加入20mL正己烷洗脱，用新的浓缩管接下洗脱溶剂，再次浓缩后转入细胞瓶中，在柔和的氮气下浓缩到250μL后，转入平底衬管中，定容至100μL后，加入内标，等待仪器分析检测。

将玻璃瓶中的组织液滤出，对组织液进行多次液液萃取并多次浓缩后得到含有PAHs的模拟肺液处理液；所述含有PAHs的模拟肺液处理液的具体处理方法如下：当组织液为人工溶酶体时，利用溶剂抽滤器直接通过0.2μm的混合纤维滤膜抽滤，对抽滤出的组织液用特氟龙分液漏斗进行液液萃取，加入40mL二氯甲烷，加入回收率指示物后，摇动5min，然后静置10min，用洗净的浓缩管接下下层溶剂，液液萃取3次，合并3次萃取剂；在柔和的氮气下，浓缩至10mL，加入10mL正己烷置换溶剂；再次浓缩至10mL，经过无水硫酸钠去水后，接入新的浓缩管中；柔和氮气下浓缩到200μL后，转入尖底衬管中，定容至50μL，加入内标，等待进行仪器分析检测。

再将过滤组织液后得到的颗粒物放入特氟龙离心管中，进行超声萃取、浓缩、置换溶剂、再次浓缩、经过无水硫酸钠及层析柱净化后，再经洗脱和浓缩后得到含有PAHs的颗粒物处理液。所述含有PAHs的颗粒物处理液的具体处理方法如下：将抽滤后的混合纤维滤膜及其截留的颗粒物一同放入特氟龙离心管中，加入体积比为2:2:1的正己烷、二氯甲烷和丙酮的溶剂15mL，加入一定量的回收率指示物和干净的铜片，进行超声萃取30min，取出静置10min后倒入干净的浓缩管中，样品超声3遍；合并3次超声样品，在柔和的氮气下浓缩至10mL，加入10mL正己烷置换溶剂后，再次浓缩至10mL，过无水硫酸钠后用新的浓缩管将溶剂接下；浓缩至1mL后，采用层析柱进行净化，加入20mL正己烷洗脱；洗脱液用新的浓缩管接下并在柔和氮气下，浓缩到250μL转入平底衬管中，定容至100μL，加入内标，等待进行仪器分析检测。

步骤C、检测：利用岛津气相色谱质谱联用仪(GCMS-2010Plus)分别对含有PAHs的模拟肺液处理液、含有PAHs的吸附剂处理液、含有PAHs的颗粒物处理液进行检测，得到肺部组织液中PAHs的含量M_Y，吸附剂中PAHs的含量TA，没有释放到肺部组织液中，仍保留在颗粒物上PAHs的含量M_p。

毛细管色谱柱型号为HP-5MS，柱长30m，内径为0.25mm，厚度为0.25μm，用于目标物的分离。柱箱升温程序如下：初始温度为60℃，保持1min，接着以20℃min-¹的速率升到200℃，保持时间为3min，再以15℃min-¹的速率升到250℃，保持时间为4min，最后以25℃min-¹的速率升到300℃，并且保持15min。进样口采用恒温进样，整个进样过程中，进样口保持恒温250℃不变。进样方式为自动进样，含有PAHs的颗粒物处理液、含有PAHs的吸附剂处理液的进样体积都为1μL，含有PAHs的模拟肺液处理液的进样体积为2μL。离子源为电子轰击源，电离电压是70eV，温度为250℃；使用超高纯度的氦气作为载气，载气流量为1mL min-¹；扫描模式为全扫。

步骤D、生物可给性的测定：将上述检测到的值代入以下公式得到生物可给性(IBAF)

表1 Gamble溶液(MGS)和人工溶酶体液(ALF)的成分含量(mg L^-1)

实施例2

一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，本实施例中，与实施例1的区别点在于，组织液使用了所述的Gamble溶液，另外，颗粒物与组织液分离，将玻璃瓶中的组织液滤出时，对于Gamble溶液，需先进行离心处理，离心转速为7500rpm，时间为10min，然后再利用溶剂抽滤器通过0.2μm混合纤维滤膜进行抽滤。除了上述区别点外，本实施例2与实施例1的的方法和步骤相同。

所述的Gamble溶液是加入了肺表面活性剂后的修正Gamble溶液，是pH为7.0－7.4的模拟液，模拟的是肺泡细胞间质液；具体组织液成分如表1中所示，为了防止化合物析出，在配制Gamble溶液时要严格按上述表1的顺序加入化合物。二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)应先用小烧杯加入100mL超纯水，放置于60℃水浴锅中先加热溶解后再加入配制组织液。

本专利中，在建立颗粒PAHs体外模拟经呼吸的生物可给性的方法中，PAHs在整个模拟体系中有三个去向：(1)停留在组织液中；(2)进入组织液后被吸附剂吸附；(3)停留在颗粒物中没有扩散进组织液的部分。测得的这三个部分的质量相加的总和除以同时称取的颗粒物直接萃取测得的PAHs原始总质量的比率为PAHs质量回收率。

为了验证本发明的技术效果以及获知最佳的培养时间，利用本专利的上述方法和步骤进行多组实验：模拟肺部环境时，将实验分为两组：第一组中进行8份实验，取用8个250mL玻璃瓶，分别加入200mL组织液，吸附剂Tenax小棒，20mg加标后的颗粒物。放入摇床中，温度为37℃，转速150rpm，避光将8份实验分别培养0.5天、1天、2天、3天、5天、7天、10天和14天。第二组中，也取用8个250mL玻璃瓶，按相同步骤培养一批不加入吸附剂Tenax的样品，培养10天。

经过上述的实验结果可知，在相同条件下，选择Tenax作为吸附剂，在两种组织液中都得到了同样的结论，即加入吸附剂后，污染物的生物可给性明显提高，尤其是高环PAHs。没有加入吸附剂时，在Gamble溶液中，可以检测到2环和3环的PAHs，4环及以上的PAHs浓度非常低，几乎检测不到。在人工溶酶体中，可以比较清楚的检测到2环和3环PAHs，部分4环的PAHs也能检测到，但5环及以上的PAHs浓度是非常低的，低于检测限。由于实验室模拟中固液比不可能无限大，吸附剂的加入可以持续吸收污染物，使得颗粒物与模拟液之间一直保持着浓度梯度，更准确的评估了污染物的生物可给性。

颗粒态PAHs经呼吸的生物可给性与培养时间有密切的关联，在两种组织液中，PAHs的生物可给性随时间的变化规律是一致的，即颗粒态PAHs的生物可给性随培养时间的延长而升高，升高的速度由快到慢，最后逐渐达到一个短期平衡。但是每种PAHs在不同的模拟肺部组织液中达到稳态所需要的时间不同。在人工溶酶体中，2环PAHs在经过2d的培养后就达到了稳态；经过3－7d的培养时间后，3环PAHs也逐渐达到了稳定的状态；而4、5和6环PAHs则在培养7－10d才达到稳态。在Gamble溶液中，经过7d的培养后，低环PAHs基本都达到了稳态。而高环PAHs则在7－10d之间才逐渐达到稳态。为了确定达到短期平衡的培养时间，对两种组织液中PAHs经过10d和14d培养后的生物可给性的结果利用SPSS分别进行独立样本的t检验。结果表明，10d和14d的培养中，PAHs的生物可给性基本都没有显著性差异(p>0.05)。在对比7d和10d的培养结果显示，大部分PAHs的生物可给性结果没有显著性差异。因此，在经10d的短期培养后，PAHs达到了溶解最大浓度的平衡点，选择10d作为培养的固定时间是合适的。在上述的体外模拟方法的实验中，得到的PAHs质量回收率为99±24％。以10d作为培养时间得到的数据显示，PAHs在整个实验中的回收率较高，在人工溶酶体中的回收率为92％－112％，而在Gamble溶液中为75％－99％。

此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于，包括：

步骤A、模拟肺部环境：取玻璃瓶，加入一定量的肺部模拟液，加入吸附剂小棒，加入含有PAHs的颗粒物，放入摇床中，温度为人体常温，启动摇床，避光培养适当的天数。

2.根据权利要求1所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于，还包括：

步骤B、分离并处理：到达培养的天数后，取出玻璃瓶；先将吸附剂小棒从玻璃瓶中取出放入特氟龙离心管中，进行多次超声萃取并多次浓缩后，再经过层析柱净化，加入洗脱溶剂洗脱并浓缩后得到含有PAHs的吸附剂处理液；将玻璃瓶中的组织液滤出，对组织液进行多次液液萃取并多次浓缩后得到含有PAHs的模拟肺液处理液；再将过滤组织液后得到的颗粒物放入特氟龙离心管中，进行超声萃取、浓缩、置换溶剂、再次浓缩、经过无水硫酸钠及层析柱净化后，再经洗脱和浓缩后得到含有PAHs的颗粒物处理液。

步骤C、检测：利用气相色谱质谱联用仪分别对含有PAHs的模拟肺液处理液、含有PAHs的吸附剂处理液、含有PAHs的颗粒物处理液进行检测，得到肺部组织液中PAHs的含量M_Y，吸附剂中PAHs的含量TA，没有释放到肺部组织液中，仍保留在颗粒物上PAHs的含量M_P；

步骤D、生物可给性的测定：将上述检测到的值代入以下公式得到经呼吸的生物可给性(IBAF)：

3.根据权利要求2所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：步骤A中，所述组织液为人工溶酶体或Gamble溶液；所述的人工溶酶体的pH值为3.5－4.5，模拟的是巨噬细胞吞噬颗粒时的肺部环境；所述的Gamble溶液是加入了肺表面活性剂后的修正Gamble溶液，是pH为7.0－7.4的模拟液，模拟的是肺泡细胞间质液。

4.根据权利要求3所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：步骤A中，所述吸附剂小棒中的吸附剂为Tenax，称为吸附剂Tenax小棒，具体制作的步骤为：称取1g Tenax粉末置入圆筒中，圆筒的两端用特氟龙塞子塞紧，圆筒是由1000－2000目的不锈钢网制成，并用不锈钢丝将两端拧紧；颗粒物为加标沉积物，取适量的沉积物，烘干研磨过筛后，获得粒径小于200μm的颗粒物，然后加入多种PAHs的混合标样，搅拌均匀，加标后颗粒物中PAHs浓度为8－12μg g^-1，加标后的颗粒物保存于2－6℃的冰箱中，老化一个月后再使用。

5.根据权利要求4所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：所述步骤A中，取250mL玻璃瓶，分别加入200mL组织液，吸附剂Tenax小棒，20mg加标后的颗粒物，放入摇床中，温度为37℃，转速150rpm，培养10d。

6.根据权利要求5所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：步骤B中，所述层析柱的制备：选取内径为0.8cm的层析柱，用脱脂棉将层析柱的下端封堵，填入并压实无水硫酸钠，在层析柱内的厚度为0.8－1.2cm，再填入并压实厚度为4.5－5.5cm的活化后的中性硅胶；所述活化后的中性硅胶为80－100目分析纯硅胶，该硅胶和脱脂棉的前处理均是先用滤纸包好，而后利用索式抽提器甲醇抽提48h后，取出放入真空干燥桶真空抽干；使用前，硅胶需在110℃烘箱中干燥活化4h，活化好的硅胶放入密封干燥桶中保存；无水硫酸钠在马弗炉450℃焙烧4h，冷却后取出，放入真空干燥桶中保存留用。

7.根据权利要求6所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：所述步骤B中，含有PAHs的吸附剂处理液的具体处理方法如下：用镊子从玻璃瓶内夹出吸附剂小棒，用超纯水冲洗吸附剂棒表面，洗净表面的颗粒物，冲洗的超纯水合并入剩下的培养组织液中。洗净后的Tenax小棒放入特氟龙离心管中，加入回收率指示物，加入处理好的铜片，加入体积比为1:1的正己烷和丙酮的溶剂25mL，超声萃取三次，每次超声30min；合并三次超声溶剂至浓缩管中，在柔和氮气下浓缩至10mL，加入10mL正己烷置换溶剂后，再次浓缩至10mL，经过无水硫酸钠后接入新的浓缩管中，浓缩至1mL，经过层析柱净化后，加入20mL正己烷洗脱，用新的浓缩管接下洗脱溶剂，再次浓缩后转入细胞瓶中，在柔和的氮气下浓缩到250μL后，转入平底衬管中，定容至100μL后，加入内标，等待仪器分析检测。

8.根据权利要求7所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：所述步骤B中，所述含有PAHs的模拟肺液处理液的具体处理方法如下：当组织液为人工溶酶体时，利用溶剂抽滤器直接通过0.2μm的混合纤维滤膜抽滤，当组织液为Gamble溶液时，需先进行离心处理，离心转速为7500rpm，时间为10min，然后再通过0.2μm混合纤维滤膜进行抽滤；对抽滤出的组织液用特氟龙分液漏斗进行液液萃取，加入40mL二氯甲烷，加入回收率指示物后，摇动5min，然后静置10min，用洗净的浓缩管接下下层溶剂，液液萃取3次，合并3次萃取剂；在柔和的氮气下，浓缩至10mL，加入10mL正己烷置换溶剂；再次浓缩至10mL，经过无水硫酸钠去水后，接入新的浓缩管中；柔和氮气下浓缩到200μL，转入尖底衬管中，定容至50μL，加入内标，等待进行仪器分析检测。

9.根据权利要求8所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：所述步骤B中，所述含有PAHs的颗粒物处理液的具体处理方法如下：将抽滤后的混合纤维滤膜及其截留的颗粒物一同放入特氟龙离心管中，加入体积比为2:2:1的正己烷、二氯甲烷和丙酮的溶剂15mL，加入一定量的回收率指示物和干净的铜片，进行超声萃取30min，取出静置10min后倒入干净的浓缩管中，样品超声3遍；合并3次超声样品，在柔和的氮气下浓缩至10mL，加入10mL正己烷置换溶剂后，再次浓缩至10mL，过无水硫酸钠后用新的浓缩管将溶剂接下；浓缩至1mL后，采用层析柱进行净化，加入20mL正己烷洗脱；洗脱液用新的浓缩管接下并在柔和氮气下，浓缩至250μL转入平底衬管中，定容至100μL，加入内标，等待进行仪器分析检测。

10.根据权利要求9所述的体外模拟污染物经呼吸的生物可给性检测方法，其特征在于：所述步骤A和B中，所用到的玻璃类的器皿均放入5％的碱液中浸泡12h，自来水将表面碱液冲洗干净后用锡箔纸封好，然后放入120℃烘箱中烘干，烘干后取出放入马弗炉中450℃下焙烧4h，冷却后取出使用；溶剂抽滤器用自来水将表面灰尘等冲洗干净后，用重铬酸钾-浓硫酸洗液浸泡12h后，用自来水将表面残留的重铬酸钾-浓硫酸洗液洗净，甲醇超声3遍，每次超声30min，再用二级水冲洗掉表面的甲醇溶剂；0.2μm混合纤维滤膜，使用前用甲醇超声3次，每次20min，然后用超纯水超声3次，每次20min；所述的特氟龙离心管、特氟龙分液漏斗，使用前均需甲醇润洗三遍，二氯甲烷润洗两遍，最后用下一步使用的溶剂润洗一遍；所述的铜片，泡入5％盐酸中，约30min后，待铜片表面光亮后取出，用蒸馏水冲洗掉表面盐酸后，甲醇超声一次，二氯甲烷超声两次，每次超声10min；所述的镊子，使用前也先用甲醇超声3次，每次10min。

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