CN111819201A - Pd1结合剂 - Google Patents

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Abstract

本文提供了与细胞程序性死亡(PD1)特异性结合的抗体分子以及相关核酸分子、载体和宿主细胞。本文还提供了此类抗体分子的医学用途。

Description

PD1结合剂
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年10月29日提交的英国专利申请第1817652.9号、于2018年10月8日提交的英国专利申请第1816372.5号、于2018年7月10日提交的英国专利申请第1811302.7号、于2018年5月1日提交的英国专利申请第1807176.1号和于2018年3月8日提交的英国专利申请第1803745.7号的权益，这些英国专利申请中的每个英国专利申请的公开内容特此通过引用整体并入。
以电子方式提交的文本文件的说明
与本申请一起以电子方式提交的文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：UHEL_001_01WO_SeqList_ST25.txt；记录日期：2019年3月7日；文件大小：113,139字节)。
技术领域
本发明涉及与PD1(也被称为细胞程序性死亡1、PDCD1、CD279、PD-1、SLEB2、PD-l、SLE1)特异性结合的抗体分子及其医学用途。
背景技术
PD1是作为免疫球蛋白超家族的成员并且主要在T细胞上表达但还在祖B细胞上观察到的细胞表面受体。PD1与两种已知的配体PD-L1和PD-L2结合。这些配体与T细胞上的PD1的相互作用下调T细胞炎性活性，从而促进免疫自身耐受。因此，PD1被描述为免疫“检查点”。已经表明，这种检查点活性通过促进对自身抗原具有反应性的淋巴结驻留性T细胞的凋亡(细胞程序性死亡)来使自身免疫风险最小化。重要的是，PD1连接还促进调节性(抗炎性)T细胞的存活。
虽然PD1/PD-L1(2)结合在非疾病状态下对于自身耐受很重要，但其还是肿瘤细胞在免疫监视期间逃避鉴定为“外来”的关键机制。实际上，已经显示PD-L1在若干种癌症中高度表达。因此，靶向PD1并拮抗其功能的单克隆抗体可以通过增强针对具有高PD-L1表达和/或表现出高突变水平的恶性细胞的免疫应答而在治疗癌症方面具有显著的潜在价值。大量临床前证据和最近的临床证据表明，阻断PD1/PD-L1(2)结合可以增强T细胞的抗肿瘤活性并抑制血液恶性肿瘤和实体恶性肿瘤两者的生长。由于还可能在如HIV等慢性疾病中诱导PD1/PD-L1活性，因此抗PD1拮抗性抗体在传染病环境中也可以具有治疗价值。因此，拮抗性抗PD1 mAb有可能充当癌症、免疫性疾病和传染病环境中的免疫治疗剂并且可以扩大目前确立的疗法的有效性。
大多数目前经批准的抗体治疗剂均源自经过免疫的啮齿动物。通过将鼠CDR“移植”到人v基因骨架序列中，那些抗体中的许多抗体已经经历了被称为“人源化”的过程(参见Nelson等人,2010,《自然综述：药物发现(Nat Rev Drug Discov)》9:767-774)。此过程通常不准确，并且导致所得抗体的靶结合亲和力降低。为了恢复原始抗体的结合亲和力，通常在所移植v结构域的可变结构域骨架的关键位置处引入鼠残基(也被称为“回复突变”)。
尽管已经显示，与具有完全鼠v结构域的抗体相比，通过CDR移植和回复突变进行人源化的抗体在临床上诱导的免疫应答率较低，但使用这种基本移植方法进行人源化的抗体仍具有显著的临床开发风险，因为在所移植CDR环中仍然具有潜在的物理不稳定性和免疫原性基序。由于对蛋白质免疫原性的动物测试通常无法预测人的免疫应答，因此针对治疗用途的抗体工程集中于使经过纯化的蛋白质中的预测的人T细胞表位含量、非人种系氨基酸含量和聚集潜力最小化。
因此，理想的人源化激动性抗PD1抗体在v结构域中具有尽可能多的与充分表征的人种系序列的骨架和CDR两者中存在的残基相同的残基。Townsend等人(2015；《美国国家科学院院刊(PNAS)》112:15354-15359)描述了一种用于产生抗体的方法，其中将源自大鼠、兔和小鼠抗体的CDR移植到优选的人骨架中，然后对所述CDR进行被称为“增强型二元取代(Augmented Binary Substitution)”的人种系化方法。尽管所述方法证明了原始抗体互补位中的基本可塑性，但是即使研究者具有高度准确的抗体-抗原共晶体结构数据，也仍然无法可靠地预测任何给定抗体的CDR环中的哪些单独的残基可以转化成人种系，以及以什么组合进行转化。此外，Townsend等人的研究未解决人种系中在去除开发风险基序可能有益的位置处存在的残基之外加入诱变。这是使所述过程本质上效率低下的技术限制，从而需要对起始抗体序列进行修饰的额外阶段。另外，目前无法准确预测单独的v结构域的蛋白质序列的远端位置中或者甚至配偶体v结构域上的什么修饰可以有助于在维持抗原结合亲和力和特异性的同时去除风险基序。
因此，CDR种系化和开发质量优化是一个复杂的多因素问题，因为应优选地维持或改善分子的多种功能性质，在这种情况下包含：靶结合特异性、PD1/PD-L1信号传导拮抗作用、与来自人测试物种和动物测试物种(例如，食蟹猴(cynomolgus monkey)，也被称为食蟹猕猴(crab-eating macaque)，即，食蟹猴(Macaca fascicularis))两者的PD1的亲和力应当尽可能类似，以有助于进行高度准确的临床前安全测试，v结构域生物物理稳定性和/或IgG表达产量对于制造目的应当是最佳的。抗体工程化研究已经表明，关键CDR中甚至单一残基位置的突变都可能对所有这些期望的分子性质具有显著负面影响。
WO2015/085847A1描述了一种被称为“MAb005”的拮抗性鼠抗PD1 IgG分子，并且还描述了MAb005的人源化形式的制备。MAb005的那些人源化形式是使用经典人源化技术产生的，即，通过将Kabat定义的鼠CDR移植到人重链和轻链骨架序列中，其中人骨架残基中的一些人骨架残基可能被回复突变为对应定位的MAb005鼠残基。由于上述原因，WO2015/085847A1中描述的MAb005的这种人源化形式并不理想。
发明内容
本发明提供了多种抗PD1抗体及其医学用途。
根据本发明的一个方面，提供了一种抗体分子或其抗原结合部分，所述抗体分子与人PD1并且任选地还与食蟹猴PD1特异性结合，其中所述抗体分子或抗原结合部分包括具有以下的重链可变区：
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的HCDR1：G-F-T-F-S-S-Y-L或任何氨基酸(例如，A/D/E/F/G/H/I/N/P/Q/S/T/V/W/Y)-M-S(SEQ ID NO:26)；
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的HCDR2：V或V的保守取代-A-T/N-I-S-G-G-G-A/S-E/N-T/K-Y-Y-P/V-D-S-V-K-G(SEQ ID NO:27)；以及
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的HCDR3：Q或任何氨基酸(例如，T/L/M/N)-L或任何氨基酸(例如，G/K/M/Q/S/V)-Y或Y的保守取代(例如，H)-Y或任何氨基酸(例如，A/D/F/G/M-A/D/E/F/I/K/M/S/W)-F或任何氨基酸(例如，A/D/EI/K/M/S/W)-D-Y(SEQ ID NO:28)。
在本发明的各方面中，所述抗体分子或抗原结合部分的所述HCDR1可以不包含序列GFTFSSYMMS(SEQ ID NO:29；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体HCDR1)、TISGGGANTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体HCDR2)和/或所述抗体分子或抗原结合部分的HCDR3可以不包含序列QLYYFDY(SEQ ID NO:31；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体HCDR3)。
所述抗体分子或抗原结合部分可以进一步包括具有以下的轻链可变区：
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的LCDR1：R-A-S-Q-S-I-S或S的保守取代-S或S的保守取代-Y或Y的保守取代-L或L的保守取代-N/T或N或T的保守取代(SEQ ID NO:32)；
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的LCDR2：A/T或A或T的保守取代-A-S或S的保守取代-S-L-Q或任何氨基酸(例如，A/H)-S或任何氨基酸(例如，D、Y)(SEQ ID NO:33)；以及
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的LCDR3：Q-Q-S或任何氨基酸(例如，V)-Y-S-T或任何氨基酸(例如，I)-P-W或任何氨基酸(例如，L)-T(SEQ ID NO:34)。
在本发明的各方面中，所述抗体分子或抗原结合部分的LCDR1可以不包含序列LASQTIGTWLT(SEQ ID NO:35；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体LCDR1)，和/或所述抗体分子或抗原结合部分的LCDR2可以不包含序列TATSLAD(SEQID NO:36；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体LCDR2)，和/或所述抗体分子或抗原结合部分的LCDR3可以不包含序列QQVYSIPWT(SEQ ID NO:37；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体LCDR3)。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述VH区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
(a)所述HCDR1包括氨基酸序列G-F-T-F-S-S-Y-X1-M-S，其中X1是L或任何其它氨基酸(SEQ ID NO:26)；
(b)所述HCDR2包括氨基酸序列X1-A-X2-I-S-G-G-G-X3-X4-X5-Y-Y-X6-D-S-V-K-G，其中X1是V或V的保守取代，X2是T或N，X3是A或S，X4是E或N，X5是T或K，并且X6是P或V(SEQ IDNO:27)；
(c)所述HCDR3包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-D-Y，其中X1是Q或任何其它氨基酸(例如，T、L、M或N)，X2是L或任何其它氨基酸(例如，G、K、M、Q、S或V)，X3是Y或Y的保守取代(例如，H)，X4是Y或任何其它氨基酸(例如，A、D、F、G、M、E、I、K、S或W)，并且X5是F或任何其它氨基酸(例如，A、D、E、I、K、M、S或W)(SEQ ID NO:28)；
(d)所述LCDR1包括氨基酸序列R-A-S-Q-S-I-X1-X2-X3-X4-X5，其中X1是S或S的保守取代，X2是S或S的保守取代，X3是Y或Y的保守取代，X4是L或L的保守取代，并且X5是N或T或N或T的保守取代(SEQ ID NO:32)；
(e)所述LCDR2包括氨基酸序列X1-A-X2-S-L-X3-X4，其中X1是A或T或A或T的保守取代，X2是S或S的保守取代，X3是Q或任何其它氨基酸，并且X4是S或任何其它氨基酸(SEQ IDNO:33)；并且
(f)所述LCDR3包括氨基酸序列Q-Q-X1-Y-S-X2-P-X3-T，其中X1是S或任何其它氨基酸，X2是T或任何其它氨基酸，并且X3是W或任何其它氨基酸(SEQ ID NO:34)。
在一些方面中，本发明提供了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中
(a)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(b)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(c)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYFFDY(SEQ ID NO:45)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(d)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYAFDY(SEQ ID NO:46)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(e)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSETYYVDSVKG(SEQ ID NO:48)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47)的LCDR3；
(f)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQD(SEQ ID NO:50)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(g)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSETYYVDSVKG(SEQ ID NO:48)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47)的LCDR3；
(h)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQD(SEQ ID NO:50)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(i)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSNTYYVDSVKG(SEQ ID NO:51)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISTWLN(SEQ ID NO:52)的LCDR1、AASSLAS(SEQ ID NO:53)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(j)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLHS(SEQ ID NO:54)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；或者
(k)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中
VH区氨基酸序列包括：
(a)SEQ ID NO:38的HCDR1；
(b)SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:51的HCDR2；以及
(c)SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46的HCDR3；并且
VL区氨基酸序列包括：
(a')SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:52的LCDR1；
(b')SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的LCDR2；以及
(a')SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:47的LCDR3。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中
(a)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:1，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:2；
(b)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:3，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:4；
(c)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:5，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:6；
(d)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:7，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:8；
(e)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:9，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:10；或者
(f)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:11，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:12。
根据本发明还提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括与治疗剂连接、融合或缀合的如本文所定义的抗体分子或其抗原结合部分。
在另一方面中，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子对如本文所定义的抗体分子或其抗原结合部分进行编码。
进一步提供了一种载体，所述载体包括本发明的核酸分子。
还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如本文所定义的本发明的核酸分子或载体。
在另外一方面中，提供了一种产生抗PD1抗体和/或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：将本发明的宿主细胞在引起所述抗体和/或其抗原结合部分的表达和/或产生的条件下培养；以及从所述宿主细胞或培养物中分离所述抗体和/或抗原结合部分。
在本发明的另一方面中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体。
进一步提供了一种用于增强受试者的免疫应答的方法，所述方法包括施用有效量的如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的免疫缀合物或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体或如本文所定义的本发明的药物组合物。
在另外一方面中，提供了一种用于治疗或预防受试者的癌症的方法，所述方法包括施用有效量的如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的免疫缀合物或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体或如本文所定义的本发明的药物组合物。
本文进一步提供了如本文所定义的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的免疫缀合物或如本文所定义的核酸分子或如本文所定义的载体或如本文所定义的药物组合物，其用作药剂。本发明还提供了如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的免疫缀合物或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体或如本文所定义的本发明的药物组合物，其用于治疗癌症。
在另一方面中，本发明提供了如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或免疫缀合物或核酸分子或载体以及治疗方法，其用于单独使用、结合第二治疗剂(例如，抗癌剂)依次或同时使用。
在另外一方面中，提供了如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的免疫缀合物或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体或如本文所定义的本发明的药物组合物在制造用于治疗癌症的药剂中的用途。
本发明还提供了一种用于治疗或预防受试者的传染病的方法，所述方法包括施用有效量的如本文所定义的抗体分子或其抗原结合部分或如此处所定义的免疫缀合物或如本文所定义的核酸分子或如本文所定义的载体或如本文所定义的药物组合物。
在所有方面中，所述传染病可以选自由以下组成的组：病毒性疾病、细菌性疾病、真菌性疾病或寄生虫性疾病。在一个实施例中，所述传染病是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。
还提供了如本文所定义的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的免疫缀合物或如本文所定义的核酸分子或如本文所定义的载体或如本文所定义的药物组合物，其用于治疗传染病。
进一步提供了如本文所定义的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的免疫缀合物或如本文所定义的核酸分子或如本文所定义的载体或如本文所定义的药物组合物在制造用于治疗传染病的药剂中的用途。
本发明还提供了一种用于治疗或预防受试者的传染病的方法，所述方法包括施用有效量的如本文所定义的抗体分子或其抗原结合部分或如此处所定义的免疫缀合物或如本文所定义的核酸分子或如本文所定义的载体或如本文所定义的药物组合物。
本发明还提供了一种用于产生与人PD1并且任选地还与食蟹猴PD1特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将来自非人来源的抗PD1 CDR移植到人v结构域骨架中，以产生人源化抗PD1抗体分子或其抗原结合部分；
(2)产生所述人源化抗PD1抗体分子或其抗原结合部分的包括所述CDR中的一种或多种突变的克隆的文库；
(3)针对与人PD1并且任选地还与食蟹猴PD1的结合筛选所述文库；
(4)选择来自筛选步骤(3)的对人PD1并且任选地还对食蟹猴PD1具有结合特异性的克隆；以及
(5)由选自步骤(4)的克隆产生与人PD1并且任选地还与食蟹猴PD1特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分。
所述方法可以包括另外一个步骤：基于在步骤(4)中选择的克隆(例如，基于在步骤(4)中选择的克隆的CDR中的特定位置处的另外的探索性诱变)产生另外的克隆，以增强人源化和/或最小化人T细胞表位含量和/或改善步骤(5)中产生的抗体分子或其抗原结合部分中的制造性质。
附图说明
图1：针对人和食蟹猴PD1-Fc蛋白的文库源性抗PD1 Fab的直接结合ELISA。克隆源自多个噬菌体选择分支，其中在每一轮中，在经过生物素化的人或食蟹猴PD1蛋白上选择噬菌体群体。标准选择编号为R2-R4。“严选-补救法(Hammer-Hug)”轮编号为R2-H和R3-H。在每一轮选择之后，将文库源性克隆(黑色圆圈)筛选为针对人(h)和食蟹猴(c)PD1两者的周质表达性Fab蛋白。每轮的平均值±SD值用灰色条表示。表示为人IgG1 Fab的mAb005 v结构域在每个板上用作阳性对照物(灰色圆圈)。
图2A-图2B：与人和食蟹猴PD1-Fc蛋白结合的经过纯化的单体Fab的直接滴定ELISA。在直接结合ELISA中针对人(图2A)和食蟹猴(图2B)PD1-Fc蛋白(以nM)滴定呈人Fab形式的Mab005和文库源性克隆。
图3A-图3B：CDR残基对种系突变的耐受性的分析。分别针对VL(图3A；SEQ ID NO:110、114和116)和VH(图3B；SEQ ID NO:95、92和106)结构域示出了由64个独特的scFv克隆构成的ELISA阳性群体的CDR中的鼠氨基酸保留频率的绘图。除了HCDR3中，在其它CDR中仅绘制了用于人/鼠残基诱变的那些残基。X轴上的括号中注释的CDR残基与用于移植的人种系(IGKV1-39和IGHV3-7)中存在的CDR残基相同。在两个绘图中，在75％处的灰色虚线表示对人种系替代鼠残基的耐受性的截止值。
图4A-图4B：与人和食蟹猴PD1-Fc蛋白结合的文库源性IgG1无效克隆的直接滴定ELISA。在直接结合ELISA中针对人(图4A)和食蟹猴(图4B)PD1-Fc蛋白(以nM)滴定呈人IgG1无效形式的Mab005和文库源性克隆。
图5A-图5D：与人和食蟹猴PD1-Fc蛋白结合的设计IgG1无效克隆IgG1-01到IgG1-15的直接滴定ELISA。在直接结合ELISA中针对人(图5A、图5B)和食蟹猴(图5C、图5D)PD1-Fc蛋白(以nM)滴定呈人IgG1无效形式的Mab005和设计克隆。
图6A-图6B：Alphascreen中对IgG1无效蛋白的表位竞争分析。使用Alphascreen技术将抗PD1 IgG1无效克隆应用于表位竞争测定中。在此测定中，通过文库源性(图6A)和设计(图6B)IgG在溶液中与Mab005 IgG1无效竞争与人PD1蛋白结合来分析所述文库源性和设计IgG的相对亲和力和其对亲本Mab005表位的保留率。所分析的所有克隆均显示出对与PD1结合的Mab-005的强浓度依赖性中和作用。
图7A-图7C：与人PD1+CHO细胞的流式细胞术结合。检查IgG1-Mab005(人源化)、前导文库源性(图7A)和设计(图7B)IgG在表达人PD1的CHO-K1细胞上的特异性结合。在几乎所有克隆中均观察到针对人PD1的浓度依赖性结合，其中在IgG1-Mab005(人源化)中观察到的结合较弱。克隆IgG1-15是单个例外，显示出比IgG1-Mab005(人源化)更弱的结合(图7C)。
图8A-图8B：与食蟹猴PD1+CHO细胞的结合的流式细胞术测试。检查IgG1-Mab005(人源化)、前导文库源性(图8A)和设计(图8B)IgG在表达食蟹猴PD1的CHO-K1细胞上的特异性结合。在所有克隆中均观察到针对食蟹猴PD1的浓度依赖性结合，所述结合显著强于在IgG1-Mab005(人源化)中观察到的结合。
图9：基于细胞的PD1/PD-L1拮抗作用测定。对呈人IgG1无效形式的前导克隆IgG1-11、IgG1-14、IgG1-06D02和IgG1-16H10在细胞表面处对人PD1功能的拮抗作用的分析表明，所有新型克隆均表现出浓度依赖性拮抗活性，与IgG1-Mab005(人源化)和IgG4纳武单抗(Nivolumab)类似物两者相比，所有新型克隆均具有更高的相对效力。
图10A-图10E：脱靶结合分析芯片阵列测定。在对IgG1-Mab005(人源化)的4975个人受体进行基于阵列的结合筛选后，在芯片上进行结合特异性的确认分析，在所述芯片中排列了对PD1和推定的Mab005脱靶结合蛋白进行编码的质粒并且所述质粒用于转染HEK293细胞。通过筛选共编码的标志物ZS green确认所有质粒的有效转染(图10A)。然后，使用IgG1-Mab005(人源化)(图10B)、同种型IgG1(图10C)、利妥昔单抗(Rituximab)(图10D)和无一级抗体(图10E)一式两份地探测单独的芯片。这些分析证实，只有IgG1-Mab005(人源化)表现出与PD1的结合，但IgG1-Mab005(人源化)还表现出与KDR、FZD5和ULBP2蛋白的意外脱靶结合。
图11A-图11T：脱靶结合分析芯片重排列测定。在芯片上进行结合特异性分析，在所述芯片中排列了对相关靶标进行编码的质粒并且所述质粒用于转染HEK293细胞。通过筛选共编码的标志物ZS green确认所有质粒的转染(图11A)。然后，使用派姆单抗(Pembrolizumab)类似物(图11B)、利妥昔单抗(图11C)、同种型IgG1(图11D)、mVH/mVLMab005-IgG1(图11E)、IgG1-Mab005(人源化)(图11F)以及文库源性和设计前导IgG(图11G-图11T)一式两份地探测单独的芯片。这些分析证实，mVH/mVL Mab005 IgG1(原始鼠杂交瘤v结构域)和IgG1-Mab005(人源化)(人源化v结构域)两者都表现出与PD1的结合，但还表现出与KDR、FZD5和ULBP2蛋白的意外脱靶结合。相比而言，所有前导抗体(图11G-图11T)均未在除了PD1之外的蛋白质上表现出可测量信号(即，结合)。
图12A-图12P：使用瞬时转染的HEK293细胞通过流式细胞术进行的PD1结合分析。对用对人PD1(灰线)或ZS green标志物(黑线)进行编码的质粒瞬时转染的HEK293细胞进行结合特异性分析。然后，使用mVH/mVL Mab005-IgG1、IgG1-Mab005(人源化)、派姆单抗类似物、同种型IgG1和前导抗体(IgG1-06D02、IgG1-12HO4、IgG1-05、IgG1-08)的子集对经转染的细胞进行染色。使用每种抗体以高浓度(5μg/ml)和中等浓度(1μg/ml)进行重复染色。这些分析证实，所有抗体(除了同种型对照IgG1之外)均表现出与PD1的结合，但所有抗体均未在ZS-green转染的细胞上表现出可测量信号。
图13A-图13P：使用瞬时转染的HEK293细胞通过流式细胞术进行的FZD5结合分析。对用对人FZD5(灰线)或ZS green标志物(黑线)进行编码的质粒瞬时转染的HEK293细胞进行结合特异性分析。然后，使用mVH/mVL Mab005-IgG1、IgG1-Mab005(人源化)、派姆单抗类似物、同种型IgG1和前导抗体(IgG1-06D02、IgG1-12HO4、IgG1-05、IgG1-08)的子集对经转染的细胞进行染色。使用每种抗体以高浓度(5μg/ml)和中等浓度(1μg/ml)进行重复染色。这些分析证实，仅表现出与FZD5表达性细胞结合的抗体是mVH/mVL Mab005-IgG1和IgG1-Mab005(人源化)。
图14A-图14P：使用瞬时转染的HEK293细胞通过流式细胞术进行的KDR结合分析。对用对人KDR(灰线)或ZS green标志物(黑线)进行编码的质粒瞬时转染的HEK293细胞进行结合特异性分析。然后，使用mVH/mVL Mab005-IgG1、IgG1-Mab005(人源化)、派姆单抗类似物、同种型IgG1和前导抗体(IgG1-06D02、IgG1-12HO4、IgG1-05、IgG1-08)的子集对经转染的细胞进行染色。使用每种抗体以高浓度(5μg/ml)和中等浓度(1μg/ml)进行重复染色。这些分析证实，仅表现出与KDR表达性细胞结合的抗体是mVH/mVL Mab005-IgG1和IgG1-Mab005(人源化)。
图15A-图15P：使用瞬时转染的HEK293细胞通过流式细胞术进行的ULBP2结合分析。对用对人ULBP2(灰线)或ZS green标志物(黑线)进行编码的质粒瞬时转染的HEK293细胞进行结合特异性分析。然后，使用mVH/mVL Mab005-IgG1、IgG1-Mab005(人源化)、派姆单抗类似物、同种型IgG1和前导抗体(IgG1-06D02、IgG1-12HO4、IgG1-05、IgG1-08)的子集对经转染的细胞进行染色。使用每种抗体以高浓度(5μg/ml)和中等浓度(1μg/ml)进行重复染色。这些分析证实，仅表现出与ULBP2表达性细胞结合的抗体是mVH/mVL Mab005-IgG1和IgG1-Mab005(人源化)。
图16A-图16F：脱靶结合分析ELISA测定。在直接结合ELISA中针对人PD1(图16A)和食蟹猴PD1(图16B)、人VEGFR2(图16C)和恒河猴VEGFR2(图16D)、人FZD5(图16E)和BSA(图16F)蛋白(以μg/ml)滴定呈人IgG1无效形式的IgG1-Mab005(人源化)、mVH/mVL Mab005-IgG1、文库源性克隆和设计克隆。这些分析证实，所有抗PD1抗体均表现出与PD1的结合，但只有IgG1-Mab005(人源化)和mVH/mVL Mab005-IgG1表现出与VEGFR2和FZD5蛋白的可测量脱靶结合。
图17：通过Biacore对VEGFR2与mVH/mVL Mab005-IgG1和IgG1-Mab005(人源化)的结合。在直接结合ELISA中针对抗人IgG1-Fc抗体捕获的mVH/mVL Mab005-IgG1和IgG1-Mab005(人源化)(以nM)滴定人和恒河猴单体VEGFR2-his蛋白。这些分析证实，两种抗PD1抗体均表现出与VEGFR2重组蛋白的结合，但仅在高浓度的可溶性分析物下观察到结合。因此，无法生成可靠的KD值。
图18：基于细胞的VEGFR2激动作用测定。在人VEGFR2信号传导测定中(以nM)滴定呈人IgG1无效形式的mVH/mVL Mab005-IgG1、IgG1-Mab005(人源化)、文库源性克隆和设计克隆。mVH/mVL Mab005-IgG1、IgG1-Mab005(人源化)和阳性对照蛋白(人VEGF-165)全都诱导强浓度依赖性VEGFR2激动作用。前导克隆IgG1-04、IgG1-08、IgG1-06D02和IgG1-12H04未显示出可测量激动作用，即使在浓度高达1μM时也是如此。
图19：IgG的差示扫描量热法(DSC)。呈IgG1无效形式的以下抗体的DSC测定数据：(mAb-1)IgG1-05、(mAb-2)IgG1-08、(mAb-3)IgG1-Mab005(人源化)、(mAb-4)IgG1-06D02和(mAb-5)IgG1-12H04。
图20A-图20B：强制氧化前后，对来自IgG的胰蛋白酶肽的反相色谱法分析。反相色谱图显示，对于呈IgG1无效形式的抗体：IgG1-Mab005(人源化)(图20A)在氧化后表现出多达6种肽变化，而如IgG1-06D02(图20B)等仅具有2种修饰的前导克隆显示出更高的抗氧化性。
具体实施方式
根据本发明的第一方面，提供了一种抗体分子或其抗原结合部分，所述抗体分子与人PD1并且还与食蟹猴PD1特异性结合，其中所述抗体分子或抗原结合部分包括具有以下的重链可变区：
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的HCDR1：G-F-T-F-S-S-Y-L或任何氨基酸(例如，A/D/E/F/G/H/I/N/P/Q/S/T/V/W/Y)-M-S(SEQ ID NO:26)；
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的HCDR2：V或V的保守取代-A-T/N-I-S-G-G-G-A/S-E/N-T/K-Y-Y-P/V-D-S-V-K-G(SEQ ID NO:27)；以及
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的HCDR3：Q或任何氨基酸(例如，T/L/M/N)-L或任何氨基酸(例如，G/K/M/Q/S/V)-Y或Y的保守取代(例如，H)-Y或任何氨基酸(例如，A/D/F/G/M-A/D/E/F/I/K/M/S/W)-F或任何氨基酸(例如，A/D/EI/K/M/S/W)-D-Y(SEQ ID NO:28)。
在一些方面中，本文所提供的抗PD1抗体或抗原结合部分与包括SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21或由其组成的PD1蛋白特异性结合。在一些方面中，本文所提供的抗PD1抗体或抗原结合部分与具有与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的PD1蛋白特异性结合。
在本发明的各方面中，所述抗体分子或抗原结合部分的HCDR1可以不包含序列GFTFSSYMMS(SEQ ID NO:29；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体HCDR1)，和/或所述抗体分子或抗原结合部分的HCDR2可以不包含序列TISGGGANTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体HCDR2)，和/或所述抗体分子或抗原结合部分的HCDR3可以不包含序列QLYYFDY(SEQ ID NO:31；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体HCDR3)。
根据本发明的抗体分子或其抗原结合部分可以进一步包括具有以下的轻链可变区：
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的LCDR1：R-A-S-Q-S-I-S或S的保守取代-S或S的保守取代-Y或Y的保守取代-L或L的保守取代-N/T或N或T的保守取代(SEQ ID NO:32)；
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的LCDR2：A/T或A或T的保守取代-A-S或S的保守取代-S-L-Q或任何氨基酸(例如，A/H)-S或任何氨基酸(例如，D、Y)(SEQ ID NO:33)；以及
具有遵循以下顺序的氨基酸序列的LCDR3：Q-Q-S或任何氨基酸(例如，V)-Y-S-T或任何氨基酸(例如，I)-P-W或任何氨基酸(例如，L)-T(SEQ ID NO:34)。
在本发明的各方面中，所述抗体分子或抗原结合部分的LCDR1可以不包含序列LASQTIGTWLT(SEQ ID NO:35；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体LCDR1)，和/或所述抗体分子或抗原结合部分的LCDR2可以不包含序列TATSLAD(SEQID NO:36；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体LCDR2)，和/或所述抗体分子或抗原结合部分的LCDR3可以不包含序列QQVYSIPWT(SEQ ID NO:37；WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的MAb005鼠/人源化抗体LCDR3)。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述VH区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
(a)所述HCDR1包括氨基酸序列G-F-T-F-S-S-Y-X1-M-S，其中X1是L或任何其它氨基酸(例如，A、D、E、F、G、H、I、N、P、Q、S、T、V、W或Y)(SEQ ID NO:26)；
(b)所述HCDR2包括氨基酸序列X1-A-X2-I-S-G-G-G-X3-X4-X5-Y-Y-X6-D-S-V-K-G，其中X1是V或V的保守取代，X2是T或N，X3是A或S，X4是E或N，X5是T或K，并且X6是P或V(SEQ IDNO:27)；
(c)所述HCDR3包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-D-Y，其中X1是Q或任何其它氨基酸(例如，T、L、M或N)，X2是L或任何其它氨基酸(例如，G、K、M、Q、S或V)，X3是Y或Y的保守取代(例如，H)，X4是Y或任何其它氨基酸(例如，A、D、F、G、M、E、I、K、S或W)，并且X5是F或任何其它氨基酸(例如，A、D、E、I、K、M、S或W)(SEQ ID NO:28)；
(d)所述LCDR1包括氨基酸序列R-A-S-Q-S-I-X1-X2-X3-X4-X5，其中X1是S或S的保守取代，X2是S或S的保守取代，X3是Y或Y的保守取代，X4是L或L的保守取代，并且X5是N或T或N或T的保守取代(SEQ ID NO:32)；
(e)所述LCDR2包括氨基酸序列X1-A-X2-S-L-X3-X4，其中X1是A或T或A或T的保守取代，X2是S或S的保守取代，X3是Q或任何其它氨基酸(例如，A或H)，并且X4是S或任何其它氨基酸(例如，D或Y)(SEQ ID NO:33)；并且
(f)所述LCDR3包括氨基酸序列Q-Q-X1-Y-S-X2-P-X3-T，其中X1是S或任何其它氨基酸(例如，V)，X2是T或任何其它氨基酸(例如，I)，并且X3是W或任何其它氨基酸(例如，L)(SEQID NO:34)。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述VH区以从氨基端到羧基端的顺序包括FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4，所述VL区以从氨基端到羧基端的顺序包括FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4，其中HCDR1是SEQ ID NO:26，HCDR2是SEQ ID NO:27，HCDR3是SEQ IDNO:28，LCDR1是SEQ ID NO:32，LCDR2是SEQ ID NO:33并且LCDR3是SEQ ID NO:34，其中重链FR1、FR2、FR3和FR4氨基酸序列是SEQ ID NO:120中的重链FR1、FR2、FR3和FR4氨基酸序列(参见表2)，并且其中轻链FR1、FR2、FR3和FR4氨基酸序列是SEQ ID NO:122中的轻链FR1、FR2、FR3和FR4氨基酸序列(参见表2)。
如本文详述的，本发明的发明人首次成功使用源自WO2015/085847A1、US2016/376367A1中公开的鼠抗PD1抗体MAb005的CDR序列产生了许多经过优化的抗PD1抗体分子。在本发明的实施例中，已经选择了对人PD1以及食蟹猴PD1两者都具有等同的结合特异性和亲和力的这些抗体分子(以有助于进行最准确的灵长类动物毒理学和pk研究)。对如本文所描述的经过优化的抗体分子的进一步细化提高了与PD1的食蟹猴直系同源物的结合、提高了中和PD1/PD-L1信号传导的效力、提高了可变结构域稳定性、提供了高表达产量和/或降低了免疫原性潜力。重要的是，与MAb005相比，这些抗体还通过烧蚀与人受体KDR(也被称为VEGFR2)、FZD5和ULBP2的脱靶结合，显著提高了PD1结合的特异性。
在一些方面中，本发明的优选的经过优化的抗PD1抗体分子在对应的鼠CDR或其它(如骨架)氨基酸位置处不必具有最大数量的人种系取代。如下文实验部分所详述的，发现就抗PD1结合特性和/或其它期望特征而言，“最大程度人源化的”抗体分子不一定是“最大程度优化的”。
在一些实施例中，相对于Mab005抗体(WO2015/085847A1、US2016/376367A1)，本发明的经过优化的抗PD1抗体分子在其与食蟹猴PD1上的功能相同的表位的结合方面有所改善。如下文实验部分中详述的，发现一些经过优化的克隆表现出与单体食蟹猴PD1蛋白结合的Biacore KD值低于32nM(例如，介于2.7nM与15nM之间)并且在食蟹猴PD1表达性CHO细胞的流式细胞术染色中表现出的EC50值低于6.5nM(例如，0.86-2.17nM)。
本发明涵盖对本文所定义的抗体分子或其抗原结合部分的氨基酸序列的修饰。例如，本发明包含抗体分子和其对应的抗原结合部分，所述抗原结合部分包括不会显著影响其性质的功能等同的可变区和CDR，并且还包含活性和/或亲和力增强或降低的变体。例如，可以使氨基酸序列突变以获得对PD1具有期望结合亲和力的抗体。设想了包含长度范围为一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合物的插入物，以及由单个或多个氨基酸残基构成的序列内插入物。末端插入物的实例包含具有N端甲硫氨酰基残基的抗体分子或与表位标签融合的抗体分子。抗体分子的其它插入变体包含与酶或多肽的抗体的N端或C端连接的融合物，所述融合物增加抗体在血液循环中的半衰期。
本发明的抗体分子或抗原结合部分可以包含经过糖基化的多肽和未经糖基化的多肽以及具有其它转译后修饰(例如用不同的糖进行的糖基化、乙酰化和磷酸化)的多肽。可以例如通过添加、去除或替代一个或多个氨基酸残基以形成或去除糖基化位点来使本发明的抗体分子或抗原结合部分突变，以改变这种转译后修饰。
可以例如通过氨基酸取代来修饰本发明的抗体分子或抗原结合部分，以去除抗体中的潜在蛋白水解位点。
在抗体分子或其抗原结合部分中，HCDR1可以具有以下氨基酸序列：G-F-T-F-S-S-Y-A/D/E/F/H/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y-M-S(SEQ ID NO:55)；HCDR2可以具有以下氨基酸序列：V-A-T/N-I-S-G-G-G-S/A-E/N-T/K-Y-Y-V/P-D-S-V-K-G(SEQ ID NO:56)；并且HCDR3可以具有以下氨基酸序列：Q/L/M/N/T-L/G/K/Q/M/S/V-Y/H-Y/A/D/G/F/M-F/A/D/E/I/K/M/S/W/Y-D-Y(SEQ ID NO:57)。
例如，HCDR1可以具有以下氨基酸序列：G-F-T-F-S-S-Y-L/A/S-M-S(SEQ ID NO:58)；HCDR2可以具有以下氨基酸序列：V-A-T-I-S-G-G-G-S/A-E/N-T/K-Y-Y-V-D-S-V-K-G(SEQ ID NO:59)；并且HCDR3可以具有以下氨基酸序列：Q-L/V-Y-Y/G/F/A-F/Y/A-D-Y(SEQID NO:60)。
在抗体分子或其抗原结合部分中，LCDR1可以具有以下氨基酸序列：R-A-S-Q-T/S-I-G/S-T/S-W/Y-L-T/N(SEQ ID NO:61)；LCDR2可以具有以下氨基酸序列：T/A-A-T/S-S-L-A/Q/H-D/S(SEQ ID NO:62)；并且LCDR3可以具有以下氨基酸序列：Q-Q-V/S-Y-S-I/T-P-W/L-T(SEQ ID NO:63)。
例如，LCDR1可以具有以下氨基酸序列：R-A-S-Q-S-I-G/S-T/S-W/Y-L-N(SEQ IDNO:64)；LCDR2可以具有以下氨基酸序列：A-A-S-S-L-Q/H-S(SEQ ID NO:65)；并且LCDR3可以具有以下氨基酸序列：Q-Q-S-Y-S-I/T-P-W-T(SEQ ID NO:66)。
在本发明的特定实施例中，抗体分子或抗原结合部分可以包括：
(a)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSETYYVDSVKG(SEQ ID NO:48；HCDR2)、QLYGFDY(SEQ ID NO:40；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47；LCDR3)[克隆06D02]；或者
(b)氨基酸序列
GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:67；HCDR1)、VATISGGGSNKYYVDSVKG(SEQ ID NO:68；HCDR2)、QLYGFDY(SEQ ID NO:40；HCDR3)、RASQSISTWLN(SEQ ID NO:52；LCDR1)、AATSLAS(SEQ ID NO:69；LCDR2)和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47；LCDR3)[克隆08F04]；
(c)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGAETYYVDSVKG(SEQ ID NO:70；HCDR2)、QLYFFDY(SEQ ID NO:45；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、TASSLQD(SEQ ID NO:71；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆11G05]；
(d)氨基酸序列
GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:67；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYYADY(SEQ ID NO:72；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、TASSLAD(SEQ ID NO:73；LCDR2)和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47；LCDR3)[克隆12E02]；
(e)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49；HCDR2)、QLYGFDY(SEQ ID NO:40；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQD(SEQ ID NO:50；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆12H04]；
(f)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSNTYYVDSVKG(SEQ ID NO:51；HCDR2)、QLYGFDY(SEQ ID NO:40；HCDR3)、RASQSISTWLN(SEQ ID NO:52；LCDR1)、AASSLAS(SEQ ID NO:53；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆12B07]；
(g)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49；HCDR2)、QLYGFDY(SEQ ID NO:40；HCDR3)、RASQSISSYLN(SEQ ID NO:74；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆13G02]；
(h)氨基酸序列
GFTFSSYSMS(SEQ ID NO:75；HCDR1)、VATISGGGAETYYVDSVKG(SEQ ID NO:70；HCDR2)、QLYGFDY(SEQ ID NO:40；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47；LCDR3)[克隆14C07]；
(i)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSNKYYVDSVKG(SEQ ID NO:68；HCDR2)、QLYGFDY(SEQ ID NO:40；HCDR3)、RASQSIGTYLN(SEQ ID NO:76；LCDR1)、AATSLQS(SEQ ID NO:77；LCDR2)和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47；LCDR3)[克隆15C10]；
(j)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49；HCDR2)、QLYAFDY(SEQ ID NO:46；HCDR3)、RASQSIGSYLN(SEQ ID NO:78；LCDR1)、TASSLQS(SEQ ID NO:79；LCDR2)和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47；LCDR3)[克隆16C07]；
(k)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QVYYFDY(SEQ ID NO:44；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLHS(SEQ ID NO:54；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆16H10]；
(l)氨基酸序列
GFTFSSYPMS(SEQ ID NO:80；HCDR1)、VATISGGGSETYYVDSVKG(SEQ ID NO:48；HCDR2)、QLYYYDY(SEQ ID NO:81；HCDR3)、RASQSISTWLN(SEQ ID NO:52；LCDR1)、AASSLQY(SEQ ID NO:82；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆17B11]；
(m)氨基酸序列
GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:67；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYYADY(SEQ ID NO:72；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-01(VL结构域含有JK4序列)]；
(n)氨基酸序列
GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:67；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYYADY(SEQ ID NO:72；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-02(VL结构域含有JK1序列)]；
(o)氨基酸序列
GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:67；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYYADY(SEQ ID NO:72；HCDR3)、RASQSISSYLN(SEQ ID NO:74；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-03(VL结构域含有JK1序列)]；
(p)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QVYYFDY(SEQ ID NO:44；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-04(VL结构域含有JK4序列)]；
(q)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QVYYFDY(SEQ ID NO:44；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-05(VL结构域含有JK1序列)]；
(r)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QVYYFDY(SEQ ID NO:44；HCDR3)、RASQSISSYLN(SEQ ID NO:74；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-06(VL结构域含有JK1序列)]；
(s)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYGFDY(SEQ ID NO:40；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-07(VL结构域含有JK4序列)]；
(t)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYGFDY(SEQ ID NO:40；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-08(VL结构域含有JK1序列)]；
(u)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYGFDY(SEQ ID NO:40；HCDR3)、RASQSISSYLN(SEQ ID NO:74；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-09(VL结构域含有JK1序列)]；
(v)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYFFDY(SEQ ID NO:45；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-10(VL结构域含有JK4序列)]；
(w)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYFFDY(SEQ ID NO:45；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-11(VL结构域含有JK1序列)]；
(x)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYFFDY(SEQ ID NO:45；HCDR3)、RASQSISSYLN(SEQ ID NO:74；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-12(VL结构域含有JK1序列)]；
(y)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYAFDY(SEQ ID NO:46；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-13(VL结构域含有JK4序列)]；
(z)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYAFDY(SEQ ID NO:46；HCDR3)、RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-14(VL结构域含有JK1序列)]；
(z1)氨基酸序列
GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38；HCDR1)、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39；HCDR2)、QLYAFDY(SEQ ID NO:46；HCDR3)、RASQSISSYLN(SEQ ID NO:74；LCDR1)、AASSLQS(SEQ ID NO:42；LCDR2)和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43；LCDR3)[克隆IgG1-15(VL结构域含有JK1序列)]。
在一些方面中，本发明提供了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中
(a)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(b)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(c)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYFFDY(SEQ ID NO:45)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(d)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYAFDY(SEQ ID NO:46)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(e)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSETYYVDSVKG(SEQ ID NO:48)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47)的LCDR3；
(f)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQD(SEQ ID NO:50)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(g)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSETYYVDSVKG(SEQ ID NO:48)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47)的LCDR3；
(h)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQD(SEQ ID NO:50)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(i)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSNTYYVDSVKG(SEQ ID NO:51)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISTWLN(SEQ ID NO:52)的LCDR1、AASSLAS(SEQ ID NO:53)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；
(j)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLHS(SEQ ID NO:54)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；或者
(k)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述VH区包括表17中的VH区氨基酸序列中的任一个VH区氨基酸序列，并且所述VL区包括表17中的VL区氨基酸序列中的任一个VL区氨基酸序列。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中
(a)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:1，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:2；
(b)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:3，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:4；
(c)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:5，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:6；
(d)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:7，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:8；
(e)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:9，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:10；或者
(f)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:11，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:12。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中
(a)VH区氨基酸序列与SEQ ID NO:1至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同，并且VL区氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同；
(b)VH区氨基酸序列与SEQ ID NO:3至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同，并且VL区氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同；
(c)VH区氨基酸序列与SEQ ID NO:5至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同，并且VL区氨基酸序列与SEQ ID NO:6至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同；
(d)VH区氨基酸序列与SEQ ID NO:7至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同，并且VL区氨基酸序列与SEQ ID NO:8至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同；
(e)VH区氨基酸序列与SEQ ID NO:9至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同，并且VL区氨基酸序列与SEQ ID NO:10至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同；或者
(f)VH区氨基酸序列与SEQ ID NO:11至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同，并且VL区氨基酸序列与SEQ ID NO:12至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同。在一些方面中，抗PD1抗体的CDR氨基酸序列与所列举序列中的CDR氨基酸序列100％相同，而FR氨基酸序列与所列举序列中的FR氨基酸序列小于100％相同。
在一些方面中，可以分离如本文所定义的抗体或抗原结合部分。
如本文所定义的抗体分子或抗原结合部分可以与包括本文所公开的CDR组的抗体或其抗原结合部分交叉竞争与PD1结合。在一些实施例中，本发明提供了一种分离的抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分与包括本文所公开的CDR组的抗体或抗原结合部分交叉竞争与PD1结合；并且(a)包括完全种系人骨架氨基酸序列；(b)与人PD1和食蟹猴PD1特异性结合；(c)以低于260ng/ml的EC50拮抗人PD1与人PD-L1的结合；(d)以低于32nM的KD与单体食蟹猴PD1结合；(e)以低于6.5nM的EC50与食蟹猴PD1表达性细胞结合；(f)与食蟹猴PD1和人PD1上的功能相同的表位结合；(g)在LCDR2中包括具有高MHC II类结合亲和力的人种系肽序列；(h)与包括抗体Mab005的可变结构域序列的抗PD1抗体包括的免疫原性肽的数量相比，包括的免疫原性肽的数量减少；(i)与包括抗体Mab005的可变结构域序列的抗PD1抗体表现出的免疫原性相比，表现出的免疫原性降低；(j)包括去免疫的VL区(例如，完全去免疫的VL区)；(k)不表现出与KDR、FZD5、ULBP2和EPHB6中的一个或多个的结合；和/或(l)不使KDR、FZD5、ULBP2和EPHB6中的一个或多个激动或使所述一个或多个最小程度地激动。在一些实施例中，可以通过Biacore分析确定抗体或抗原结合部分的KD值。在一些实施例中，抗体或抗原结合部分的EC50值可以通过PD-1表达性细胞(例如，CHO细胞)的流式细胞术染色来确定。在一些实施例中，可以通过流式细胞术分析确定与KDR、FZD5、ULBP2或EPHB6的结合。
在一些实施例中，抗PD1抗体或抗原结合部分具有低免疫原性。在某些情况下，与包括以下的抗PD1抗体相比，抗体或抗原结合部分表现出的免疫原性降低：GFTFSSYMMS(SEQID NO:29)的HCDR1、TISGGGANTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30)的HCDR2、QLYYFDY(SEQ ID NO:31)的HCDR3、LASQTIGTWLT(SEQ ID NO:35)的LCDR1、TATSLAD(SEQ ID NO:36)的LCDR2和QQVYSIPWT(SEQ ID NO:37)的LCDR3。在一些实例中，可以在计算机中通过鉴定T细胞表位在抗体或部分中(例如，在抗体或部分的可变区中)的位置来确定抗体或抗原结合部分的免疫原性风险。
例如，可以通过使用iTopeTM来鉴定抗体或抗原结合部分中的T细胞表位。iTopeTM可以用于分析与人MHC II类具有杂乱高亲和力结合的肽的VL和VH区序列。杂乱高亲和力MHC II类结合性肽被认为与T细胞表位的存在相关，所述T细胞表位是药物蛋白质的临床免疫原性的高风险指示。iTopeTM软件预测肽的氨基酸侧链与34个人MHC II类等位基因的开放端结合凹槽内的特定结合袋(具体地袋位置；p1、p4、p6、p7和p9)之间的有利相互作用。这些等位基因表示世界上最常见的HLA-DR等位基因，而在任何特定种族群体中最普遍存在的等位基因不占任何权重。所述等位基因中有二十个等位基因含有“开放式”p1构型，并且14个含有“封闭式”构型，其中位置83处的甘氨酸被缬氨酸替代。关键结合残基的位置是通过在计算机中产生与跨越测试蛋白质序列重叠八个氨基酸的9mer肽来实现的。此过程以高准确度成功地区分与MHC II类分子结合或不与其结合的肽。
抗体或抗原结合部分中的T细胞表位可以通过以下来鉴定：使用TCEDTM(T CellEpitope DatabaseTM)来搜索与先前通过对其它蛋白质序列的体外人T细胞表位作图分析来鉴定的T细胞表位的匹配来分析VL和VH区序列。TCEDTM用于在由源自不相关的蛋白质和抗体序列肽构成的大型(>10,000个肽)数据库中搜索任何测试序列。
在一些实施例中，抗PD1抗体或抗原结合部分可以表现出低免疫原性，因为在抗体或部分的序列中，以下肽中的一种或多种肽的数量很低：高亲和力外来(“HAF”-高免疫原性风险)、低亲和力外来(“LAF”-低免疫原性风险)和/或TCED+(先前在TCEDTM数据库中鉴定的表位)。
在一些实施例中，抗PD1抗体或抗原结合部分的序列中可以具有高种系表位(GE)含量。在一些实例中，抗PD1抗体或抗原结合部分的序列中(例如，VL和/或VH区序列中)具有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个(或大于20个)种系表位。种系表位可以被定义为具有高MHC II类结合亲和力的人种系肽序列。由于T细胞耐受性，种系表位9mer肽不太可能具有免疫原性潜力，这已经通过使用广泛的种系肽进行的研究得以验证。重要的是，这种种系v结构域表位(进一步由人抗体恒定区中的类似序列辅助)还竞争在抗原呈递细胞的膜处进行MHC II类占据，从而降低外来肽呈递足以达到T细胞刺激所需的“活化阈值”的风险。因此，高GE含量是抗体治疗剂的临床开发中的一种有益特性，并且可以提供低免疫原性。在一些实例中，抗PD1抗体或抗原结合部分在LCDR2中包括高MHC II类结合亲和力(例如，种系表位)的人种系肽序列。
在某些实施例中，与包括抗体Mab005的可变结构域序列(表2)的抗PD1抗体相比，抗PD1抗体或抗原结合部分的存在于重链和轻链可变区两者的骨架中的HAF表位、LAF表位和/或TCED+表位的数量减少。在一些实施例中，抗PD1抗体或抗原结合部分的VL和/或VH区序列中不存在HAF、LAF和/或TCED+表位。
例如，在抗PD1抗体或抗原结合部分中可以通过位置6处的突变L>R来消除存在于Mab005的LCDR-1中的TCED+和HAF肽“VTITCLASQ”(SEQ ID NO:83)，从而将此序列转化为轻链GE“VTITCRASQ”(SEQ ID NO:84)。
在一些实例中，在抗PD1抗体或抗原结合部分中可以通过仅保留位置4处的单个鼠残基W来消除存在于Mab005的LCDR-1中的LAF肽“IGTWLTWYQ”(SEQ ID NO:85)，从而将此序列转化为“ISSWLNWYQ”(SEQ ID NO:86)(表12)。
在一些实施例中，在抗PD1抗体或抗原结合部分中可以通过将LCDR2从鼠序列“TATSLAD”(SEQ ID NO:36)突变为完全种系序列“AASSLQS”(SEQ ID NO:42)来消除Mab005HAF肽“LLIYTATSL”(SEQ ID NO:87)和“LIYTATSLA”(SEQ ID NO:88)和LAF肽“IYTATSLAD”(SEQ ID NO:89)并将其转化为GE序列。
Mab005 FW3/LCDR3区还对LAF肽“YYCQQVYSI”(SEQ ID NO:90)进行编码。在一些实施例中，在抗PD1抗体或抗原结合部分中可以通过位置6处的种系突变V>S来消除此表位。
在Mab005的VH区中，发现肽序列“LYYFDYWGQ”(SEQ ID NO:91)(跨越HCDR3和FW4)是LAF。在一些实施例中，在此肽中的位置3处的突变Y>A允许在抗PD1抗体或抗原结合部分中消除此表位(表4、12)。
术语“交叉竞争(cross-compete或cross-competition)”和“交叉阻断(cross-block、cross-blocked或cross-blocking)”在本文中可互换地用于意指抗体或其部分直接或通过变构调节间接干扰本发明的抗PD1抗体与靶PD1(例如，人PD1)结合的能力。可以使用竞争结合测定来确定抗体或其部分能够干扰另一种抗体与靶标结合的程度，并且因此确定是否可以将其说成是根据本发明进行交叉阻断或交叉竞争。结合竞争测定的一个实例是均相时间分辨荧光(HTRF)。一种特别合适的定量交叉竞争测定使用基于FACS或AlphaScreen的方法来测量经过标记的(例如，经过His标记的、经过生物素化的或经过放射性标记的)抗体或其部分和另一种抗体或其部分在其与靶标结合方面之间的竞争。通常，交叉竞争性抗体或其部分是例如这样的抗体或其部分：在交叉竞争测定中将与靶标结合，使得在测定期间并且在存在第二抗体或其部分的情况下，根据本发明的免疫球蛋白单个可变结构域或多肽的所记录替代高达以给定量存在的潜在交叉阻断性抗体或其片段进行的最大理论替代(例如，需要被交叉阻断的冷(例如，未经标记的)抗体或其片段进行的替代)的100％(例如，在基于FACS的竞争测定中)。优选地，交叉竞争性抗体或其部分的所记录替代介于10％与100％之间或介于50％与100％之间。
如本文所定义的抗PD1抗体分子或抗原结合部分可以是热稳定的。在一些情况下，抗体分子或抗原结合部分的热稳定性可以与鼠抗PD1抗体Mab005或Mab005-IgG1(人源化)的热稳定性基本上相同。在一些情况下，抗体分子或抗原结合部分的热稳定性可以高于鼠抗PD1抗体Mab005或Mab005-IgG1(人源化)的热稳定性。在一些实例中，抗体分子或抗原结合部分的熔融温度(Tm)可以为约90℃到约93℃，并且抗体分子或抗原结合部分可以呈IgG1形式。在一些方面中，抗体分子或抗原结合部分的Tm可以为约90.8℃到约92.2℃，并且抗体分子或抗原结合部分可以呈IgG1形式。在一些方面中，抗原结合部分可以呈Fab形式。抗体分子或其抗原结合部分的熔融温度可以通过差示扫描量热法(DSC)测定来分析。
如本文所定义的抗PD1抗体分子或抗原结合部分可以抗氧化(例如，抗暴露氨基酸残基的氧化)。在一些情况下，与鼠抗PD1抗体Mab005或Mab005-IgG1(人源化)或包括抗体Mab005-IgG1(人源化)的可变结构域序列的抗PD1抗体相比，抗体分子或抗原结合部分经历的暴露氨基酸残基的氧化可以减少。抗体分子或其抗原结合部分的抗氧化性可以通过向抗体分子或抗原结合部分添加氧化试剂(例如，H2O2)并通过反相(RP)和疏水相互作用色谱法(HIC)方法分析由氧化引起的变化来进行分析。
在某些实施例中，抗体分子或其抗原结合部分与PD1特异性结合并且不与膜受体KDR(也被称为VEGFR2)、FZD5(卷曲类受体5)、ULBP2(UL16结合蛋白2)和EPHB6中的一个或多个结合(或特异性结合)。在一些方面中，KDR、FZD5、ULBP2和/或EPHB6是人蛋白。在一些实施例中，KDR是恒河猴蛋白。在一些实施例中，人KDR蛋白包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，恒河猴KDR蛋白包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，人FZD5蛋白包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，人ULBP2蛋白包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列或由其组成。在一个实施例中，抗体分子或其抗原结合部分不与KDR、FZD5、ULBP2和EPHB6中的任一个结合。在一些实施例中，与抗体Mab005或IgG1-Mab005(人源化)表现出的与KDR、FZD5、ULBP2和EPHB6中的一个或多个的结合相比，抗体分子或其抗原结合部分表现出的与所述膜受体的结合降低。在一些情况下，可以通过流式细胞术分析确定抗体或其抗原结合部分与PD1、KDR、FZD5、ULBP2或EPHB6的结合。
在一些实施例中，本文所公开的抗体分子或其抗原结合部分与PD1特异性结合并且不使KDR、FZD5、ULBP2和EPHB6(例如，人KDR、人FZD5、人ULBP2或人EPHB6)中的一个或多个激动或使所述一个或多个最小程度地激动。在一些实施例中，本文所公开的抗体分子或其抗原结合部分与PD1特异性结合并且与抗体Mab005或IgG1-Mab005(人源化)表现出的对KDR、FZD5、ULBP2或EPHB6的激动作用相比，表现出的对KDR、FZD5、ULBP2和EPHB6(例如，人KDR、人FZD5、人ULBP2或人EPHB6)中的一个或多个的激动作用降低。在一些情况下，可以通过KDR(或VEGFR2)、FZD5、ULBP2或EPHB6信号传导报告基因测定来确定抗体分子或其抗原结合部分对KDR、FZD5、ULBP2或EPHB6的激动作用。
如本文所定义的抗体分子或抗原结合部分可以包括去除转译后修饰(PTM)位点(例如，糖基化位点(N连接的或O连接的)、脱氨位点、磷酸化位点或异构化/片段化位点)的一种或多种取代、缺失和/或插入。
已知超过350种PTM。PTM的关键形式包含(K和R残基的)磷酸化、糖基化(N连接的和O连接的)、sumo化(sumoylation)、棕榈酰化、乙酰化、硫酸盐化、豆蔻酰化、异戊烯化和甲基化。用于鉴定负责特定PTM的推定的氨基酸位点的统计方法在本领域中是众所周知的(参见Zhou等人,2016,《自然-实验室指南(Nature Protocols)》1:1318-1321)。设想了例如通过取代、缺失和/或插入来去除此类位点，然后任选地(实验上和/或理论上)测试(a)结合活性和/或(b)PTM的丧失。
例如，已经鉴定了MAb005鼠HCDR2(如本文所定义，即，氨基酸序列VATISGGGANTYYPDSVKG(SEQ ID NO:92))在残基10(N)处具有推定的脱酰胺化位点。设想了例如通过保守或非保守取代(如取代为E、Q、S或D)来去除本发明的HCDR2中的等同位置处的此位点(如例如在表3和4的克隆06D02和其它克隆中)。
类似地，已经鉴定了MAb005鼠HCDR1(如本文所定义，即，氨基酸序列GFTFSSYMMS(SEQ ID NO:29))在残基8(M)处具有推定的氧化位点。设想了例如通过保守或非保守取代(如取代为A/D/E/F/H/I/L/N/P/Q/S/T/V/W/Y)来去除本发明的HCDR1中的等同位置处的此位点(如在存在于表3和4中的克隆06D02和另外的序列中所例示的)。
抗体分子或其抗原结合部分可以是人的、人源化的或嵌合的。
抗体分子或其抗原结合部分可以包括已经插入有CDR的一个或多个人可变结构域骨架支架。例如，VH区、VL区或VH区和VL区两者可以包括一个或多个人骨架区氨基酸序列。
抗体分子或其抗原结合部分可以包括已经插入有对应的HCDR序列的IGHV3-7人种系支架。抗体分子或其抗原结合部分可以包括VH区，所述VH区包括已经插入有一组对应的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的IGHV3-7人种系支架氨基酸序列。
抗体分子或其抗原结合部分可以包括已经插入有对应的LCDR序列的IGKV1-39人种系支架。抗体分子或其抗原结合部分可以包括VL区，所述VL区包括已经插入有一组对应的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的IGKV1-39人种系支架氨基酸序列。
抗体分子或其抗原结合部分可以包括已经插入有对应的HCDR序列的IGHV3-7人种系支架和已经插入有对应的LCDR序列的IGKV1-39人种系支架。抗体分子或其抗原结合部分可以包括VH区和VL区，所述VH区包括已经插入有一组对应的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的IGHV3-7人种系支架氨基酸序列，所述VL区包括已经插入有一组对应的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的IGKV1-39人种系支架氨基酸序列。HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列可以是表4中的克隆中的任一个克隆的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列(其中所有六个CDR序列均来自同一克隆)。
在一些方面中，抗体分子或其抗原结合部分可以包括免疫球蛋白恒定区。在一些实施例中，所述免疫球蛋白恒定区是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。在另外的实施例中，所述免疫球蛋白恒定区是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。所述抗体分子或其抗原结合部分可以包括免疫惰性的恒定区。在一些方面中，抗PD1抗体或其抗原结合部分可以包括免疫球蛋白恒定区，所述免疫球蛋白恒定区包括野生型人IgG1恒定区、包括氨基酸取代L234A、L235A和G237A的人IgG1恒定区或包括氨基酸取代L234A、L235A、G237A和P331S的人IgG1恒定区。在一些方面中，抗PD1抗体或其抗原结合部分可以包括免疫球蛋白恒定区，所述免疫球蛋白恒定区包括野生型人IgG2恒定区或野生型人IgG4恒定区。在一些方面中，抗PD1抗体可以包括免疫球蛋白恒定区，所述免疫球蛋白恒定区包括表18中的氨基酸序列中的任一个氨基酸序列。表18中的Fc区序列开始于CH1结构域。在一些方面中，抗PD1抗体可以包括免疫球蛋白恒定区，所述免疫球蛋白恒定区包括人IgG4、人IgG4(S228P)、人IgG2、人IgG1、人IgG1-3M或人IgG1-4M的Fc区的氨基酸序列。例如，与野生型人IgG4 Fc区相比，人IgG4(S228P)Fc区包括以下取代：S228P。例如，与野生型人IgG1 Fc区相比，人IgG1-3M Fc区包括以下取代：L234A、L235A和G237A，而与野生型人IgG1 Fc区相比，人IgG1-4M Fc区包括以下取代：L234A、L235A、G237A和P331S。在一些方面中，免疫球蛋白分子的恒定区中的氨基酸残基的位置是根据EU命名法进行编号的(Ward等人,1995《免疫疗法(Therap.Immunol.)》,2:77-94)。在一些方面中，免疫球蛋白恒定区可以包括RDELT(SEQ IDNO:93)基序或REEM(SEQ ID NO:94)基序(在表18中加下划线)。在小于RDELT(SEQ ID NO:93)同种异型的人群体中存在REEM(SEQ ID NO:94)同种异型。在一些方面中，抗PD1抗体可以包括免疫球蛋白恒定区，所述免疫球蛋白恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个。在一些方面中，抗PD1抗体可以包括表4中的克隆中的任一个克隆的六个CDR氨基酸序列和表18中的Fc区氨基酸序列中的任一个Fc区氨基酸序列。在一些方面中，抗PD1抗体可以包括免疫球蛋白重链恒定区和免疫球蛋白轻链恒定区，所述免疫球蛋白重链恒定区包括表18中的Fc区氨基酸序列中的任一个Fc区氨基酸序列，所述免疫球蛋白轻链恒定区是κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区、轻链可变(VL)区以及重链恒定区，其中
(a)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(b)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(c)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYFFDY(SEQ ID NO:45)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(d)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYAFDY(SEQ ID NO:46)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(e)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSETYYVDSVKG(SEQ ID NO:48)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(f)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQD(SEQ ID NO:50)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(g)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSETYYVDSVKG(SEQ ID NO:48)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSIPWT(SEQ ID NO:47)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(h)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQD(SEQ ID NO:50)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(i)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSNTYYVDSVKG(SEQ ID NO:51)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISTWLN(SEQ ID NO:52)的LCDR1、AASSLAS(SEQ ID NO:53)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(j)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLHS(SEQ ID NO:54)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；或者
(k)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQ ID NO:43)的LCDR3；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区、轻链可变(VL)区以及重链恒定区，其中
a)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:1或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:2或由其组成；并且所述重链恒定区包括野生型人IgG4恒定区、包括氨基酸取代S228P的人IgG4恒定区、野生型人IgG2恒定区；野生型人IgG1恒定区或包括氨基酸取代L234A、L235A和G237A的人IgG1恒定区；
(b)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:3或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:4或由其组成；并且所述重链恒定区包括野生型人IgG4恒定区、包括氨基酸取代S228P的人IgG4恒定区、野生型人IgG2恒定区；野生型人IgG1恒定区或包括氨基酸取代L234A、L235A和G237A的人IgG1恒定区；
(c)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:5或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:6或由其组成；并且所述重链恒定区包括野生型人IgG4恒定区、包括氨基酸取代S228P的人IgG4恒定区、野生型人IgG2恒定区；野生型人IgG1恒定区或包括氨基酸取代L234A、L235A和G237A的人IgG1恒定区；
(d)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:7或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:8或由其组成；并且所述重链恒定区包括野生型人IgG4恒定区、包括氨基酸取代S228P的人IgG4恒定区、野生型人IgG2恒定区；野生型人IgG1恒定区或包括氨基酸取代L234A、L235A和G237A的人IgG1恒定区；
(e)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:9或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:10或由其组成；并且所述重链恒定区包括野生型人IgG4恒定区、包括氨基酸取代S228P的人IgG4恒定区、野生型人IgG2恒定区；野生型人IgG1恒定区或包括氨基酸取代L234A、L235A和G237A的人IgG1恒定区；或者
(f)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:11或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:12或由其组成；并且所述重链恒定区包括野生型人IgG4恒定区、包括氨基酸取代S228P的人IgG4恒定区、野生型人IgG2恒定区；野生型人IgG1恒定区或包括氨基酸取代L234A、L235A和G237A的人IgG1恒定区。
在一些方面中，本文公开了一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区、轻链可变(VL)区以及重链恒定区，其中
a)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:1或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:2或由其组成；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(b)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:3或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:4或由其组成；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(c)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:5或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:6或由其组成；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(d)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:7或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:8或由其组成；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；
(e)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:9或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:10或由其组成；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个；或者
(f)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:11或由其组成；VL区氨基酸序列包括SEQ IDNO:12或由其组成；并且所述重链恒定区包括SEQ ID NO:13-19中的任一个。
在一些方面中，抗PD1抗体可以是免疫效应子无效的。在一些方面中，抗PD1抗体或其抗原结合部分不诱导免疫效应子功能，并且任选地抑制免疫效应子功能。在一些方面中，抗PD1抗体可以缺乏与人FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb受体的可测量结合，但是维持与人FcγRIIb受体的结合，并且任选地维持与人FcRn受体的结合。FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb是活化性受体的实例。FcγRIIb是抑制性受体的实例。FcRn是再循环性受体的实例。在一些方面中，可以通过
Figure BDA0002667533810000221
分析来测量抗PD1抗体或其抗原结合部分对人Fc受体的结合亲和力。在一些方面中，可以使用均相时间分辨荧光(HTRF)来研究抗PD1抗体与人Fc受体的结合。在HTRF的一个实例中，对作为全套Fcγ受体的人IgG1(野生型)进行标记，然后在滴定竞争中使用具有经过工程化的Fc片段的抗体。在一些方面中，可以将PD1阳性细胞与人白细胞和抗PD1抗体混合，并且可以测量CDC、ADCC和/或ADCP引起的细胞杀伤。在一些方面中，包括人IgG1-3M的Fc区的氨基酸序列(参见表18)的抗PD1抗体是效应子无效的。在一些方面中，包括人IgG1-3M的Fc区的氨基酸序列(参见表18)的抗PD1抗体不是效应子无效的。
抗体分子或其抗原结合部分可以是Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、四聚体抗体、四价抗体、多特异性抗体(例如，二价抗体)、结构域特异性抗体、单结构域抗体、单克隆抗体或融合蛋白。在一个实施例中，抗体可以是与第一抗原和第二抗原特异性结合的双特异性抗体，其中所述第一抗原是PD1并且所述第二抗原不是PD1。在例如Holliger和Hudson(2005,《自然生物技术(Nature Biotechnol.)》23(9):1126-1136)中描述了抗体分子和其构建和使用方法。
在本发明的另一方面中，提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括与治疗剂连接的如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分。
合适的治疗剂的实例包含细胞毒素、放射性同位素、化学治疗剂、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促凋亡剂、细胞生长抑制酶和细胞溶解酶(例如，RNAse)。另外的治疗剂包含治疗性核酸，如对免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂或促凋亡剂进行编码的基因。这些药物描述语不是互相排斥的，并且因此可以使用一个或多个上述术语来描述治疗剂。
在免疫缀合物中使用的合适的治疗剂的实例包含紫杉烷(taxane)、美登素(maytansine)、CC-1065和倍癌霉素(duocarmycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)和其它烯二炔(enediyne)以及澳瑞他汀(auristatin)。其它实例包含抗叶酸类药物(anti-folate)、长春花生物碱(vinca alkaloid)和蒽环类药物(anthracycline)。免疫缀合物中还可以使用植物毒素、其它生物活性蛋白、酶(即，ADEPT)、放射性同位素、光敏剂。另外，可以使用如脂质体或聚合物等二级载剂作为细胞毒性药剂来制备缀合物。合适的细胞毒素包含抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的药剂。代表性细胞毒素包含抗生素、微管蛋白聚合抑制剂、与DNA结合并破坏DNA的烷基化剂以及破坏蛋白质合成或必需细胞蛋白(如蛋白激酶、磷酸酶、拓扑异构酶、酶和周期素)的功能的药剂。
代表性细胞毒素包含但不限于阿霉素(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、表柔比星(epirubicin)、卡柔比星(carubicin)、诺加霉素(nogalamycin)、美诺立尔(menogaril)、吡柔比星(pitarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、阿糖孢苷(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、三氟尿苷(trifluridine)、安西他滨(ancitabine)、依诺他滨(enocitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、去氧氟尿苷(doxifluhdine)、喷司他丁(pentostatin)、溴尿苷(broxuhdine)、卡培他滨(capecitabine)、克拉屈滨(cladhbine)、地西他滨(decitabine)、氟尿苷(floxuhdine)、氟达拉滨(fludarabine)、谷氏菌素(gougerotin)、嘌呤霉素(puromycin)、喃氟啶(tegafur)、噻唑呋林(tiazofuhn)、阿霉素(adhamycin)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、米托蒽醌、博来霉素(bleomycin)、氮芥(mechlorethamine)、泼尼松(prednisone)、丙卡巴嗪(procarbazine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、氟尿嘧啶(flurouracils)、依托泊苷(etoposide)、紫杉醇(taxol)、紫杉醇类似物、铂(如顺铂和卡铂)、丝裂霉素(mitomycin)、噻替哌(thiotepa)、紫杉烷、长春新碱、道诺霉素、表柔比星、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、他莫西芬(tamoxifen)、伊达比星、多拉司他汀(dolastatin)/澳瑞他汀、哈米特林(hemiasterlin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)和美登醇(maytansinoid)。
合适的免疫调节剂包含阻断激素对肿瘤的作用的抗激素类药物和抑制细胞因子产生、下调自身抗原表达或使MHC抗原隐蔽的免疫抑制剂。
还提供了一种核酸分子，所述核酸分子对如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分进行编码。核酸分子可以对本文所描述的抗PD1抗体或其抗原结合部分的(a)VH区氨基酸序列；(b)VL区氨基酸序列；或(c)VH氨基酸序列和VL区氨基酸序列两者进行编码。在一些方面中，可以分离如本文所定义的核酸分子。
进一步提供了一种载体，所述载体包括如本文所定义的本发明的核酸分子。所述载体可以是表达载体。
还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括如本文所定义的本发明的核酸分子或载体。所述宿主细胞可以是重组宿主细胞。
在另外一方面中，提供了一种产生抗PD1抗体和/或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：将本发明的宿主细胞在引起所述抗体和/或其抗原结合部分的表达和/或产生的条件下培养；以及从所述宿主细胞或培养物中分离所述抗体和/或抗原结合部分。
在本发明的另一方面中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体。
进一步提供了一种用于增强受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的免疫缀合物或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体或如本文所定义的本发明的药物组合物。
在另外一方面中，提供了一种用于治疗或预防受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的免疫缀合物或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体或如本文所定义的本发明的药物组合物。在一些情况下，向受试者施用如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的免疫缀合物或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体不会诱导受试者的血管瘤或诱导受试者的最小程度的血管瘤。
例如，所述癌症可以是胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、周围神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤或血液组织癌。
本发明还提供了如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的免疫缀合物或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体或如本文所定义的本发明的药物组合物，其用于治疗癌症。
在另一方面中，本发明提供了如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或免疫缀合物或核酸分子或载体以及治疗方法，其用于单独使用、结合第二治疗剂(例如，抗癌剂)依次或同时使用。
在另外一方面中，提供了如本文所定义的本发明的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的本发明的免疫缀合物或如本文所定义的本发明的核酸分子或如本文所定义的本发明的载体或如本文所定义的本发明的药物组合物在制造用于治疗癌症的药剂中的用途。
本发明还提供了一种用于治疗或预防受试者的传染病或免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所定义的抗体分子或其抗原结合部分或如本文所定义的免疫缀合物或如本文所定义的核酸分子或如本文所定义的载体或如本文所定义的药物组合物。
在一个实施例中，本发明提供了一种包括本文所公开的氨基酸序列的抗PD1抗体或其抗原结合部分，其用于进行治疗。
本发明的药物组合物可以包括药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是进入药物组合物中的化合物或化合物组合，所述化合物或化合物组合不会引起二级反应，并且允许例如促进抗PD1抗体分子的施用、增加其寿命和/或其在体内的功效或增加其在溶液中的溶解度。这些药学上可接受的媒剂是众所周知的，并且将由本领域的技术人员根据抗PD1抗体分子的施用模式进行调整。
在一些实施例中，抗PD1抗体分子可以以冻干形式提供，以在施用前复原。例如，冻干的抗体分子可以在施用于个体之前在无菌水中复原并与盐水混合。
抗PD1抗体分子通常将以药物组合物的形式施用，所述药物组合物除了抗体分子之外还可以包括至少一种组分。因此，药物组合物除了抗PD1抗体分子之外还可以包括药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或本领域的技术人员众所周知的其它材料。此类材料应是无毒的，并且不应干扰抗PD1抗体分子的功效。载剂或其它材料的确切性质将取决于施用途径，施用可以通过推注、输注、注射或任何其它合适的途径进行，如下文所讨论的。
对于例如通过注射进行的肠胃外施用，例如，皮下或静脉内施用，包括抗PD1抗体分子的药物组合物可以采用不含热原且具有合适的pH、等渗性和稳定性的肠胃外可接受的水溶液的形式。本领域的相关技术人员完全能够使用例如等渗媒剂(如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringe's Injection)、乳酸化林格氏注射液)制备合适的溶液。可以根据需要使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂，包含缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；苯扎氯銨；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3'-戊醇；以及间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
根据要治疗的病状，包括抗PD1抗体分子的药物组合物可以单独使用或结合其它治疗同时或依次施用。
如本文所描述的抗PD1抗体分子可以在人或动物体的治疗方法中使用，包含预防性(prophylactic或preventative)治疗(例如，在个体的病状发作之前进行以降低个体发生病状的风险、延缓其发作或在发作后减轻其严重程度的治疗)。治疗方法可以包括向有需要的个体施用抗PD1抗体分子。
施用通常地以“治疗有效量”进行，所述治疗有效量足以显示对患者的益处。这种益处可以是至少改善至少一种症状。实际施用量以及施用率和施用时程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病状、病症的原因、组合物的递送部位、施用方法、施用时间安排以及执业医师已知的其它因素。治疗处方(例如，关于剂量等的决定)由全科医生和其它医师负责，并且可以取决于症状的严重程度和/或所治疗疾病的进展。抗体分子的适当剂量在本领域中是众所周知的(Ledermann J.A.等人,1991,《国际癌症杂志(Int.J.Cancer)》47:659-664；Bagshawe K.D.等人,1991,《抗体、免疫缀合物和放射性药物(Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals)》4:915-922)。可以使用在本文中或在《医师案头参考(Physician's Desk Reference)》(2003)中指示的针对所施用药剂的类型的具体剂量。抗体分子的治疗有效量或合适剂量可以通过在动物模型中比较其体外活性和体内活性来确定。用于将小鼠和其它试验动物中的有效剂量外推至人的方法是已知的。确切剂量将取决于许多因素，包含抗体是用于预防还是用于治疗、要治疗区域的大小和位置、抗体的确切性质(例如，完整抗体、片段)以及与抗体连接的任何可检测标记物或其它分子的性质。
对于全身性应用，典型的抗体剂量范围为100μg到1g，并且对于局部应用，典型的抗体剂量范围为1μg到1mg。可以在开始时施用较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。通常，抗体将是完整抗体，例如，IgG1或IgG4同种型。这是用于成年患者的单次治疗的剂量，所述剂量可以针对儿童和婴儿按比例调整，并且还可以针对其它抗体形式与分子量成比例地调整。根据医生的判断，可以以每天一次、每周两次、每周一次或每月一次的间隔重复治疗。个体的治疗时间表可以取决于抗体组合物的药代动力学和药效学性质、施用途径和所治疗病状的性质。
治疗可以是周期性的，并且施用之间的时段可以是约两周或更长时间，例如，约三周或更长时间、约四周或更长时间、约每月或更长时间一次、约五周或更长时间或约六周或更长时间。例如，可以每两周到四周或每四周到八周进行治疗。可以在外科手术之前和/或之后给予治疗，和/或可以在外科手术治疗或有创手术的解剖部位处直接施用或施加治疗。上文描述了合适的调配物和施用途径。
在一些实施例中，本文所描述的抗PD1抗体分子可以以皮下注射剂的形式施用。例如对于长期预防/治疗，可以使用自动注射器施用皮下注射剂。
在一些实施例中，抗PD1抗体分子的治疗效果可以持续若干个半衰期，这取决于剂量。例如，抗PD1抗体分子的单个剂量的治疗效果可以在个体中持续1个月或更长时间、2个月或更长时间、3个月或更长时间、4个月或更长时间、5个月或更长时间或6个月或更长时间。
本发明还提供了一种用于产生与人PD1并且任选地还与食蟹猴PD1特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将来自非人来源的抗PD1 CDR移植到人v结构域骨架中，以产生人源化抗PD1抗体分子或其抗原结合部分；
(2)产生所述人源化抗PD1抗体分子或其抗原结合部分的包括所述CDR中的一种或多种突变的克隆的文库；
(3)针对与人PD1并且任选地还与食蟹猴PD1的结合筛选所述文库；
(4)选择来自筛选步骤(3)的对人PD1并且任选地还对食蟹猴PD1具有结合特异性的克隆；以及
(5)由选自步骤(4)的克隆产生与人PD1并且任选地还与食蟹猴PD1特异性结合的抗体分子或其抗原结合部分。
所述方法可以包括另外一个步骤：基于在步骤(4)中选择的克隆(例如，基于在步骤(4)中选择的克隆的CDR中的特定位置处的另外的探索性诱变)产生另外的克隆，以增强人源化和/或最小化人T细胞表位含量和/或改善步骤(5)中产生的抗体分子或其抗原结合部分中的制造性质。
适用于上述方法的细化如下文实例1所述。
如本文所使用的，术语“PD1”是指保留PD1的至少部分生物活性的细胞程序性死亡蛋白1及其变体。如本文所使用的，PD1包含天然序列PD1的所有物种，包含人、大鼠、小鼠和鸡。术语“PD1”用于包含人PD1的变体、亚型和物种同源物。本发明的抗体可以与来自除了人之外的物种的PD1，特别是来自食蟹猴(cynomolgus monkey或Macaca fascicularis)的PD1交叉反应。表19中提供了人和食蟹猴PD1氨基酸序列的实例。在某些实施例中，抗体可以对人PD1具有完全特异性，并且可以不表现出非人交叉反应性。
如本文所使用的，在本发明的抗体或“抗PD1拮抗剂抗体”(可互换地称为“抗PD1抗体”)的上下文中使用的“拮抗剂”是指能够结合PD1并抑制PD1生物活性和/或由PD1信号传导介导的一个或多个下游途径的抗体。抗PD1拮抗剂抗体涵盖可以(包含显著地)阻断、拮抗、抑制或降低PD1生物活性(包含由PD1信号传导(如受体结合和/或诱发对PD1的细胞应答)介导的下游途径)的抗体。出于本发明的目的，将明确理解的是，术语“抗PD1拮抗剂抗体”涵盖PD1本身和PD1生物活性(包含但不限于其抑制活化T细胞的抗肿瘤细胞活性的能力)或活性或生物活性的后果在任何有意义的程度上都基本上无效、减少或中和的所有术语、标题、功能状态和特性。
如果抗体相比于其与其它受体结合以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间结合，则所述抗体与PD1“特异性结合”、“特异性相互作用”、“优先结合”、“结合”或“相互作用”。
“抗体分子”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点来与靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)特异性结合的免疫球蛋白分子。如本文所使用的，术语“抗体分子”不仅涵盖完整的多克隆抗体或单克隆抗体，而且还涵盖任何抗原结合片段(例如，“抗原结合部分”)或其单链、包括抗体的融合蛋白以及包括抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型，包含例如但不限于scFv、单结构域抗体(例如，鲨鱼抗体和骆驼抗体)、大抗体、微型抗体、胞内抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、v-NAR和双-scFv。
“抗体分子”涵盖任何类的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要属于任何特定类。根据重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白归为不同类。存在五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类中的几类可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
如本文所使用的，术语抗体分子的“抗原结合部分”是指完整抗体的保留与PD1特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。抗体分子的抗原结合功能可以由完整抗体的片段执行。涵盖在抗体分子的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包含Fab；Fab'；F(ab')2；由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单结构域抗体(dAb)片段和分离的互补决定区(CDR)。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但通常将人IgG重链Fc区定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸到其羧基端。Fc区中的残基的编号为如Kabat中的EU索引的编号。免疫球蛋白的Fc区通常包括两个恒定结构域CH2和CH3。如本领域中已知的，Fc区可以以二聚体形式或单体形式存在。
抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区中的任一者或两者。如本领域中已知的，重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(也被称为高变区)连接的四个骨架区(FR)组成，有助于形成抗体的抗原结合位点。当选择位于CDR侧翼的FR时，例如，当人源化或优化抗体时，来自含有同一规范类的CDR序列的抗体的FR是优选的。
本申请中使用的CDR定义组合了在本领域中已经创建的许多不同的、经常是冲突的方案中使用的结构域，所述方案基于免疫球蛋白库分析和在分离方面和抗体与抗原的共晶体方面对抗体进行的结构分析的组合(参见Swindells等人的评论,2016,abYsis：整合的抗体序列和结构管理、分析和预测(abYsis:Integrated Antibody Sequence andStructure-Management,Analysis,and Prediction)《分子生物学期刊(J Mol Biol)》[PMID:27561707；电子公开2016年8月22日])。本文所使用的CDR定义(“统一”定义)结合了所有此类现有洞悉的经验教训，并包含对潜在介导靶结合互补性的完整残基景观(landscape)进行采样所需的所有适当环位置。
表1示出了如本文所定义的MAb005鼠抗PD1抗体CDR的氨基酸序列(“统一”方案)与用于定义相同CDR的众所周知的替代性系统的比较。
术语“Mab005-IgG1(人源化)”是指包括表2中标记为PD1-VH1的可变重区序列和标记为PD1-VL1的可变轻区序列以及人IgG1恒定区的抗PD1抗体。
如本文所使用的术语“保守取代”是指将一个氨基酸用不会显著有害地改变功能活性的另一氨基酸替代。“保守取代”的优选实例是将一个氨基酸用在以下BLOSUM 62取代矩阵中的值≥0的另一氨基酸替代(参见Henikoff和Henikoff,1992,《美国国家科学院院刊》89:10915-10919)：
Figure BDA0002667533810000281
术语“单克隆抗体”(Mab)是指源自单个拷贝或克隆(包含例如任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体或其抗原结合部分，而不是用于产生单克隆抗体的方法。优选地，本发明的单克隆抗体存在于同质或基本上同质的群体中。
“人源化”抗体分子是指作为含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合亚序列)的非人(例如，鼠)抗体分子或其抗原结合部分的某种形式。人源化抗体可以是来自接受者的CDR的残基被来自如小鼠、大鼠或兔等具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)的CDR的残基替代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。
“人抗体或完全人抗体”是指源自携带人抗体基因的转基因小鼠或人细胞的抗体分子或其抗原结合部分。
术语“嵌合抗体”旨在指代可变区序列源自一个物种并且恒定区序列源自另一个物种的抗体分子或其抗原结合部分，如可变区序列源自小鼠抗体并且恒定区序列源自人抗体的抗体分子。
“抗体-药物缀合物”和“免疫缀合物”是指与PD1结合和/或与细胞毒素剂、细胞抑制剂和/或治疗剂缀合的抗体分子或其抗原结合部分，包含抗体衍生物。
本发明的抗体分子或其抗原结合部分可以使用本领域众所周知的技术来产生，例如，重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或此类技术的组合或本领域中熟知的其它技术。
术语“分离的分子”(其中分子是例如多肽、多核苷酸或抗体)是这样的分子，所述分子由于其衍生起源或来源而：(1)与在所述分子的天然状态下伴随所述分子的天然缔合的组分不缔合，(2)基本上不含来自同一物种的其它分子，(3)由来自不同物种的细胞表达或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成的或在不同于天然来源细胞的细胞系统中表达的分子将与其天然缔合的组分“分离”。还可以通过使用本领域中众所周知的纯化技术进行的分离使分子基本不含天然缔合的组分。分子纯度或同质性可以通过本领域中众所周知的多种手段来测定。例如，可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳并且使用本领域中众所周知的技术将凝胶染色以使多肽可视化，从而测定多肽样品的纯度。为了某些目的，可以通过使用HPLC或本领域众所周知的其它纯化手段来提供更高分辨率。
术语“表位”是指分子的能够由抗体分子或其抗原结合部分识别并在抗体分子的抗原结合区中的一个或多个抗原结合区处结合的部分。表位可以由一级、二级或三级蛋白质结构的限定区组成，并且包含由抗体的抗原结合区或其抗原结合部分识别的靶标的二级结构单元或结构域的组合。表位可以同样由如氨基酸或糖侧链等分子的限定的化学活性表面分组组成，并且具有特异性三维结构特征以及特异性电荷特性。如本文所使用的术语“抗原表位”定义为多肽的抗体分子可以特异性结合(如通过本领域中众所周知的任何方法所测定的，例如通过常规免疫测定、抗体竞争性结合测定或通过x射线晶体学或相关的结构测定方法(例如，NMR)测定的)的一部分。
术语“结合亲和力”或“KD”是指特定抗原-抗体相互作用的解离速率。KD是解离速率(也被称为“脱离速率(off-rate)(koff)”)与缔合速率或“结合速率(on-rate)(kon)”之比。因此，KD等于koff/kon，并表示为摩尔浓度(M)。因此，KD越小，结合亲和力越强。因此，与1nM的KD相比，1μM的KD指示弱结合亲和力。可以使用本领域中既定的方法来确定抗体的KD值。一种用于确定抗体的KD的方法是使用表面等离子体共振(SPR)，通常使用生物传感器系统，如
Figure BDA0002667533810000291
系统来确定。
术语“效力”是生物活性的量度，并且可以被指定为IC50或有效抑制在如本文所描述的PD1活性测定中测量的50％活性的抗体或抗体药物缀合物相对于抗原PD1的浓度。
如本文所使用的短语“有效量”或“治疗有效量”是指实现期望治疗结果所需的量(按剂量，针对时间段以及针对施用方式)。有效量至少是对受试者赋予治疗益处所需的活性剂的最小量，但小于毒性量。
本文中关于本发明的抗体分子的生物活性所使用的术语“抑制”或“中和”意指抗体基本上拮抗、禁止、阻止、抑制、减慢、破坏、消除、停止、减少或逆转例如被抑制的疾病的进展或严重程度的能力，包含但不限于抗体分子相对于PD1的生物活性或结合相互作用。
“宿主细胞”包含可以是或已经是用于掺入多核苷酸插入的一个或多个载体的接受者的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包含单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或故意的突变，后代(在形态学上或基因组DNA互补物上)可能不一定与原始亲本细胞完全相同。宿主细胞包含用本发明的一种或多种多核苷酸体内转染的细胞。
如本文所使用的，“载体”意指能够在宿主细胞中递送并且优选地表达一个或多个所关注的基因或序列的构建体。载体的实例包含但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，如生产细胞。
除非另有指示，否则本文所使用的术语“治疗”意指逆转此类术语所适用的病症或病状或此类病症或病状的一种或多种症状、使其缓解、抑制其进展、延迟其进展、延迟其发作或使其得到预防。除非另有指示，否则本文所使用的术语“治疗”是指如上文所定义的治疗动作。术语“治疗”还包含受试者的辅助和新辅助治疗。为避免疑义，本文中对“治疗”的提及包含对治愈性、缓解性和预防性治疗的提及。为避免疑义，本文中对“治疗”的多次提及还包含对治愈性、缓解性和预防性治疗的多次提及。
应理解的是，当在本文中无论何处用语言“包括”来描述实施例时，还提供了根据“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的在其它方面类似实施例。
在根据马库什(Markush)组或其它替代方案分组来描述本发明的方面或实施例的情况下，本发明不仅涵盖整体列出的整个组，而且还涵盖所述组的单独的每个成员和主组的所有可能子组，也涵盖缺少组成员中的一或多个组成员的主组。本发明还设想明确地排除所要求保护的发明中的组成员中的任何组成员中的一或多个组成员。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。贯穿本说明书和权利要求书，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。除非上下文另外要求，否则单数术语应包含复数含义，并且复数术语应包含单数含义。术语“例如(e.g.或for example)”之后的任何一或多个实例并不意味着穷举或限制。
除非另有指示，否则本发明的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。
现在将参考附图描述本发明的特定非限制性实施例。
实例1：产生经过优化的抗PD1治疗性抗体
介绍
在此实例中，成功产生一组经过优化的激动性抗PD1抗体。这些抗PD1抗体良好表达、生物物理上稳定、高度可溶并且与优选的人种系具有最高的同一性。
材料和方法
PD1文库产生和选择
通过大规模寡核苷酸合成和PCR来组装PD1 Fab库。然后，将经过扩增的Fab库通过限制-连接克隆到噬菌粒载体中，转化到大肠杆菌TG-1细胞中，并且基本上如先前详细描述的那样拯救噬菌体库(Finlay等人,2011,《分子生物学方法(Methods Mol Biol.)》681:383-401)。
通过以下来进行噬菌体选择：用经过生物素化的PD1靶蛋白(人或食蟹猴)涂覆链霉亲和素磁性微珠，将珠粒用PBS洗涤三次并重悬于pH为7.4的PBS加上5％脱脂乳蛋白中。在第1轮选择中，将这些珠粒以100nM靶蛋白涂覆，之后在随后的三轮中降低抗原浓度。在每一轮中，在重新感染到TG1细胞中之前，使用胰蛋白酶洗脱噬菌体。
周质提取物产生(小规模)
在单独的大肠杆菌克隆中产生可溶性Fab。用异丙基1-硫-β-D-吡喃半乳糖苷诱导对数生长期的大肠杆菌TG1细胞。通过冷冻/解冻循环产生含有可溶性Fab的周质提取物：将细菌细胞团粒在-20℃下冷冻过夜，然后在室温下解冻，并重悬于pH为7.4的PBS中。在室温下振荡并离心后收集含有可溶性Fab的上清液。
Fab产生和纯化
选择一组抗PD1 Fab用于大规模产生。如上所述那样制备大肠杆菌TG1培养物(500ml)并诱导可溶性Fab表达。如上所述那样通过冷冻/解冻循环提取含有可溶性Fab的周质提取物。在室温下进行头部对头部旋转(head-over-head rotation)1小时、离心并通过0.22μm膜过滤之后，收集含有可溶性Fab的上清液。通过使用His-Trap HP亲和力柱(用于通过相关His标签进行纯化)的两步纯化程序来纯化可溶性Fab，然后在改进的蛋白质A或CaptureSelectTMIgG-CH1亲和力矩阵柱上进行纯化。
IgG表达和纯化
将对前导组抗PD1抗体的重链和轻链可变结构域连同Mab005变体和派姆单抗类似物进行编码的哺乳动物密码子优化的合成基因克隆到分别包括效应子功能无效的人IgG1(“IgG1无效”；在下部铰链中含有消除正常的免疫球蛋白ADCC、ADCP和CDC功能的L234A、L235A、G237A突变的人IgG1)和人Cκ结构域的哺乳动物表达载体中。将含重链和轻链载体共转染到哺乳动物表达系统中，然后对IgG进行基于蛋白质A的纯化，在变性和非变性SDS-PAGE上进行定量和QC。
Fab和IgG的直接结合ELISA
初始地，通过结合ELISA评估前导组与重组蛋白的结合和交叉反应性。将人PD1人Fc标记的重组蛋白和食蟹猴PD1人Fc标记的重组蛋白以1μg/ml涂覆到MaxiSorpTM平底96孔板的表面上。以两倍连续稀释从500nM到0.98nM滴定经过纯化的Fab或IgG样品，并允许其与经过涂覆的抗原结合。使用小鼠抗c-myc抗体，然后使用与辣根过氧化物酶缀合的驴抗小鼠IgG来检测Fab。使用与辣根过氧化物酶缀合的小鼠抗人IgG来检测IgG。用3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液(TMB)使结合信号可视化，并在450nm下测量吸光度。
IgG1无效抗体的Alphascreen表位竞争测定
在384孔白色微量滴定板(葛莱娜(Greiner))中以25μl的最终体积进行AlphaScreen测定(珀金埃尔默(Perkin Elmer))。反应缓冲液含有pH为7.3的1x PBS(Oxoid，目录号BR0014G)和0.05％(v/v)
Figure BDA0002667533810000311
20(西格玛(Sigma)，目录号P9416)。以三倍连续稀释以500nM的最终浓度开始滴定经过纯化的IgG样品，并在室温下与最终浓度为0.6nM的经过生物素化的人PD1-His/AviTag一起温育20分钟。以0.3nM添加亲本IgG并且以20μg/ml(最终浓度)添加抗人IgG1受体珠，并将混合物在室温下温育1小时。随后以20μg/ml(最终浓度)添加链霉亲和素供体珠，并在室温下温育30分钟。在EnVision多标签读板器(珀金埃尔默)中测量光的发射，并使用EnVision管理器软件进行分析。将值报告为每秒计数(CPS)，并针对串扰进行校正。在GraphPad Prism软件(加利福尼亚州拉贺亚市的GraphPad软件(GraphPad Software,La Jolla,CA))中使用MFI值和4个参数来计算EC50值。
IgG在溶液中对单体人和食蟹猴PD1的亲和力的Biacore分析
在Biacore 3000(GE)上用含抗原溶液通过SPR确定经过纯化的IgG的亲和力(KD)。针对两个通道，按照向导说明，使用胺偶联在pH为4.5的乙酸盐缓冲液中将小鼠抗人抗体(CH1特异性)固定在CM5传感器芯片上，达到2000RU的水平。一个通道用于背景信号校正。使用pH为7.4的标准运行缓冲液HBS-EP。通过以20微升/分钟单次注射pH为1.5的10μl 10mM甘氨酸进行再生。以30微升/分钟以50nM注射IgG样品，持续2分钟，然后是60秒的解离速率。以30微升/分钟以两倍连续稀释从100nM到3.1nM注射单体抗原(经过His标记的人PD1或经过His标记的食蟹猴PD1)，持续2分钟，然后是300秒的解离速率。使用Biacore 3000评估(BIA评估)软件分析获得的传感图。通过相对于1:1Langmuir结合模型同时拟合缔合相和解离相来计算KD。
IgG的流式细胞术
在FAC中测试经过纯化的IgG与在CHO-K1稳定细胞系和CHO-K1野生型细胞上表达的人和食蟹猴PD1的结合。以三倍连续稀释从500nM到0.98nM滴定IgG样品。用与FITC缀合的小鼠抗人IgG检测IgG的结合。通过在流式细胞仪(AttuneTM NxT声波聚焦细胞仪，英杰公司(Invitrogen)/赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))的BL-1通道检测器中检查每样品10000个细胞的平均荧光强度(MFI)来分析结果。
基于细胞的PD1/PD-L1激动作用测定
将基于细胞的PD1/PD-L1阻断生物测定(普洛麦格公司(Promega))用于测量抗体在阻断PD1/PD-L1相互作用方面的效力。在测定前一天，将PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞解冻并转移到细胞回收培养基(90％Ham's F12/10％FBS)中。将细胞悬浮液以100μl每孔分配到两个96孔白色平底测定板的内部60个孔中的每个孔中。将细胞回收培养基添加到外部孔中的每个外部孔中，并将测定板在37℃/5％CO2下温育过夜。在测定当天，将样品IgG在测定缓冲液(99％RPMI 1640/1％FBS)中从300nM到0.04nM稀释4倍，并以40μl每稀释添加到含有PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞的测定板中。阳性抑制对照物包含人PD1抗体AF1086(R&D系统(R&Dsystems))、呈IgG1无效形式的mAb005和呈IgG1无效形式的派姆单抗mab类似物。包含无关IgG作为阴性抑制对照物。然后，将PD1效应细胞在测定缓冲液(99％RPMI 1640/1％FBS)中解冻，并将细胞悬浮液添加到含有PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞和IgG滴定样品的测定板的孔中。将测定板在37℃/5％CO2温育箱中温育六小时，允许平衡到环境温度，持续5-10分钟，然后添加80μl Bio-GloTM试剂(普洛麦格公司)。将测定板在环境温度下温育另外5-30分钟，并且随后在10分钟、20分钟和30分钟时测量发光信号。
抗体v结构域T细胞表位含量：计算机分析
使用基于鉴定T细胞表位在治疗性抗体和蛋白质中的位置的计算机技术(Abzena有限公司(Abzena,Ltd.))来评估抗体v结构域中的潜在免疫原性。使用iTopeTM来分析与人MHC II类具有杂乱高亲和力结合的肽的关键前导的VL和VH区序列。杂乱高亲和力MHC II类结合性肽被认为与T细胞表位的存在相关，所述T细胞表位是药物蛋白质的临床免疫原性的高风险指示。iTopeTM软件预测肽的氨基酸侧链与34个人MHC II类等位基因的开放端结合凹槽内的特定结合袋(具体地袋位置；p1、p4、p6、p7和p9)之间的有利相互作用。这些等位基因表示世界上最常见的HLA-DR等位基因，而在任何特定种族群体中最普遍存在的等位基因不占任何权重。所述等位基因中有二十个等位基因含有“开放式”p1构型，并且14个含有“封闭式”构型，其中位置83处的甘氨酸被缬氨酸替代。关键结合残基的位置是通过在计算机中产生与跨越测试蛋白质序列重叠八个氨基酸的9mer肽来实现的。此过程以高准确度成功地区分与MHC II类分子结合或不与其结合的肽。
此外，使用TCEDTM(T Cell Epitope DatabaseTM)来搜索与先前通过其它蛋白质序列的体外人T细胞表位作图分析鉴定的T细胞表位的匹配来分析所述序列。TCEDTM用于在由源自不相关的蛋白质和抗体序列肽构成的大型(>10,000个肽)数据库中搜索任何测试序列。
抗体v结构域特异性测试：人受体阵列分析
在Retrogenix有限公司(Retrogenix Ltd.)进行人细胞膜受体蛋白质组学阵列。一级筛选：针对与表达4975个人质膜蛋白的固定HEK293细胞/载玻片的结合单独筛选5μg/ml IgG1-Mab005(人源化)抗体(14个载玻片组，每个载玻片组n＝2个载玻片)。所有转染效率均超过最小阈值。使用AF647荧光二级抗人IgG1抗体来检测抗体结合。通过在ImageQuant上分析荧光(AF647和ZsGreen1)来鉴定一级命中(重复的点)。对所有命中进行编码的载体进行测序以确认其正确身份。确认/特异性筛选：将对所有命中进行编码的载体，加上对MS4A1(CD20)和EGFR进行编码的对照载体一式两份地点样在新载玻片上，并用于像之前一样逆转染人HEK293细胞。所有转染效率均超过最小阈值。用5μg/ml的每种测试抗体、5μg/ml的阴性对照抗体、1μg/ml的利妥昔单抗生物仿制药(阳性对照物)、同种型IgG1(Ab00102人IgG1抗荧光素)或无测试分子(仅二级；阴性对照物)处理相同的固定载玻片(每次处理n＝2个载玻片)。如上分析载玻片。流式细胞术确认筛选：将对仅ZsGreen1或ZsGreen1和PD1、FZD5、KDR或ULBP2进行编码的表达载体转染到人HEK293细胞中。将每种活转染子与1mg/ml和5mg/ml的测试抗体中的每种抗体和同型对照抗体一起温育。将细胞洗涤，并与如在细胞微阵列筛选中使用的抗体的相同的AF647抗人IgG Fc检测抗体一起温育。将细胞再次洗涤，并使用Accuri流式细胞仪(BD)通过流式细胞术进行分析。使用7AAD活/死染料排除死细胞，并选择ZsGreen1阳性细胞(即，经转染的细胞)进行分析。
DSC分析
使用运行版本1.22软件的MicroCal PEAQ-DSC(英国马尔文的马尔文仪器公司(Malvern Instruments,Malvern,UK))对测试物品的Tm进行分析。将样品以200℃/小时的速率在20到110℃的范围内加热。基于蛋白质浓度对热数据进行归一化。根据加热扫描数据确定蛋白质的Tm。
强制氧化分析
为了对完整IgG进行强制氧化分析：将PBS缓冲液中的IgG1无效样品在室温下用0.5％H2O2处理2小时，并且然后在Dionex Ultimate 3000RS HPLC系统(英国赫默尔亨普斯特德的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Hemel Hempstead,UK))上进行RP分析(完整抗体和亚基、胰蛋白酶肽)之前，在-80℃下储存。为了还原完整抗体，添加DTT到最终浓度为0.33M，并将样品在室温下温育1小时，并立即通过RP进行分析。使用连接到Dionex Ultimate 3000RS HPLC系统(英国赫默尔亨普斯特德的赛默飞世尔科技公司)的PLRP-S 1000，5μm，2.1mm×50mm柱(英国斯托克波特的安捷伦科技公司(AgilentTechnologies,Stockport,UK))进行色谱分离。方法由以下组成：在24分钟内从80％缓冲液A(0.02％TFA，含7.5％乙腈的H2O)到50％缓冲液B(0.02％TFA，含7.5％H2O的乙腈)的线性梯度。在整个分析中，流速为0.5毫升/分钟，并且温度维持在70℃。通过在280nm下的UV吸收进行检测。
为了对经过消化的IgG进行强制氧化分析：使用SMART DigestTM试剂盒(英国赫默尔亨普斯特德的赛默飞世尔科技公司)按照制造商的方案用胰蛋白酶消化天然和经过氧化IgG1无效样品。立即通过RP分析所得胰蛋白酶肽。使用连接到Dionex Ultimate3000RSHPLC系统(英国赫默尔亨普斯特德的赛默飞世尔科技公司)的Acquity UPLC CSH C18柱(
Figure BDA0002667533810000331
1.7μm，2.1mm×150mm)(英国埃尔斯特里的沃特世(Waters,Elstree,UK)进行色谱分离。方法由以下组成：4分钟内从95％缓冲液A(0.1％FA的H2O)到15％缓冲液B(含0.085％FA的75％乙腈)的线性梯度，然后是22分钟内从15％缓冲液B到60％缓冲液B的线性梯度。在整个分析中，流速为0.2毫升/分钟，并且温度维持在40℃。通过在280nm下的UV吸收进行检测。
对于HIC分析，使用连接到Dionex Ultimate 3000RS HPLC系统(英国赫默尔亨普斯特德的赛默飞世尔科技公司)的TSKgel Butyl-NPR 4.6mm×35mm HIC柱(英国雷丁的TOSOH生物科技公司(TOSOH Bioscience Ltd.,Reading,UK))进行色谱分离。方法由以下组成：9分钟内从60％缓冲液A(pH为7.0的100mM磷酸钠，2M硫酸铵)到90％缓冲液B(pH为7.0的100mM磷酸钠)的线性梯度。流速为1.2毫升/分钟。通过在280nm下的UV吸收进行检测。
结果和讨论
CDR移植到优选的人种系v基因上
初始地，使用CDR移植将激动性鼠抗PD1 IgG MAb005(mVH/mVL；参见WO2015/085847A1和表2)的CDR引入到人种系免疫球蛋白v结构域骨架序列支架中。为了使工程努力偏向于具有最佳的药物样性质的最终领先的治疗性IgG化合物，选择将亲本抗体的CDR移植到“优选的”种系支架IGHV3-7和IGKV1-39上，已知所述种系支架具有良好的溶解性和药物开发特性并在经过表达的人抗体库中高频率使用。
在表2中概述了这些支架和所移植CDR的定义。在表2中还示出了鼠抗PD1抗体的重链和轻链序列。尽管此CDR移植过程是众所周知的，但是预测给定的一组人v结构域序列是否将充当非人CDR移植的合适受体骨架仍然是个问题。使用不合适的骨架可能导致靶结合功能丧失、蛋白质稳定性问题或者甚至最终IgG的表达受损。因此，后来将IGHV3-7/IGKV1-39移植物作为CDR诱变和选择经过改进的克隆的模板。
文库产生和筛选
将经过CDR移植的IGHV3-7/IGKV1-39 v结构域序列组合成Fab噬菌体展示形式，并通过寡核苷酸合成和组装产生诱变文库盒。将最终的Fab文库连接到噬菌体展示载体中，并通过电穿孔转化到大肠杆菌中，以产生1.3×109个独立的克隆。通过对96个克隆进行测序来验证文库构建质量。此测序数据表明，已经以约50％的频率对每个变化位置处的鼠或人种系残基进行编码的位置进行了有效采样。使用辅助噬菌体M13拯救文库，并在多个独立的分支中选择经过生物素化的人和食蟹猴PD1-Fc蛋白。
选择后筛选(图1)和DNA测序表明，存在64个独特的人和食蟹猴PD1结合性Fab克隆，所述人和食蟹猴PD1结合性Fab克隆在ELISA中表现出与人和食蟹猴PD1的强结合并且在Alphascreen测定中对IgG1-Mab005(人源化)与人和食蟹猴PD1的结合的抑制作用>50％。在这64个克隆中，骨架序列保持完全种系，而在所有CDR中还观察到突变(表3)。基于CDR种系化水平相对于与人和食蟹猴PD1-Fc两者的结合的ELISA信号对前导克隆进行排名。然后，将来自此排名的前12个克隆的v结构域亚克隆到IgG表达载体中，以进行如下的进一步测试(表4)。还将所述前12个克隆以Fab蛋白的形式从大肠杆菌表达，对其进行纯化以实现同质性，对其进行定量，并将其在直接ELISA结合分析中应用于人PD1-Fc和食蟹猴PD1-Fc(图2A&B，表5)。出乎意料的是，对食蟹猴PD1蛋白上的Fab蛋白的滴定表明，与Mab005(人源化)Fab的结合EC50值相比，若干个文库源性克隆的结合EC50值显著提高(表5)。这使所有文库源性克隆的EC50值均约等于在人PD1结合中观察到的EC50值，而Mab005(人源化)Fab的食蟹猴结合显著低于人。实际上，Mab005(人源化)Fab在食蟹猴PD1上的结合足够弱，以至于其未实现结合信号饱和，即使在应用最高浓度(500nM)时也是如此，这意味着无法计算此蛋白质的食蟹猴PD1 EC50值(表5)。由于这些值是使用经过证明的单体Fab蛋白产生的，因此所述值反映了若干个克隆中食蟹猴蛋白的1:1结合改善。
虽然在直接源自文库选择的前导克隆的所有CDR中都观察到了种系化突变，但仍然可能的是，序列分析可能将进一步的克隆设计成具有最大程度人源化。因此，将具有针对人和食蟹猴蛋白质的结合信号的64个序列独特的命中用于分析此功能表征群体的CDR中鼠氨基酸的保留频率。将位置氨基酸保留频率表示为在VL结构域和VH结构域中存在的百分比(分别地，图3A和B)。在一系列组合设计中，将RF<75％的鼠残基视为可能不是靶结合互补位所必需的并且可能对种系化开放的位置(表4)。在VH结构域中(不包含CDR-H3)，CDR-H1和H2中的9个鼠残基中只有4个表现出高于75％的保留频率，并且在任何功能性克隆中均未发现存在于CDR-H1中的唯一鼠残基(M)，因为其频率值为0％(图3B)。在VL结构域中，源自Mab005序列的13个鼠CDR残基中只有2个以>75％的频率保留(图3A)。此分析强有力地表明，可以使整个CDR-L2序列与IGKV1-39具有种系同一性。重要的是，存在于Mab005的CDR-L3中并且几乎100％保留(图3A)的色氨酸(W)残基位于在轻链剪接期间通过J段供给的位置中，并且由于在起始文库中使用人JK4序列而仅被视为非人。此观察结果允许将一系列设计克隆中的轻链重新设计成包含人JK1序列而不是JK4，因为人JK1在此位置处天然地含有一个W残基，从而使所得轻链序列在CDR-L2和L3中是完全种系的(表4)。
对仅含有RF>75％的那些鼠残基的设计赋予前缀“MH”(MH＝最大程度人源化)。还创建另一个设计v结构域集合(“TTP”＝总理论上可能的)，所述集合组合了在群体中在VL和VH结构域两者中观察到的人源化程度最高的CDR。总共产生5个设计VH结构域和3个设计VL结构域：VH结构域MH-AA-VH、MH-LV-VH、MH-LG-VH、MH-LF-VH、MH-LA-VH采样变体序列在CDR-H1和H3中，而MH-VL、MH-JK1-VL、TTP-JK1-VL采样CDR-L1中的变体以及JK4>JK1交换。实际上，TTP-JK1-VL中的W>Y和JK4>JK1突变使此序列跨整个v结构域是完全人种系的。将这些构建体以矩阵方式共转染，以创建总共15种最终设计IgG(表4)。通过基因合成产生MH和TTP克隆并且将其(连同上文概述的12个文库源性克隆以及阳性对照物IgG1-Mab005(人源化))克隆到人表达载体中以便以IgG1无效形式产生。所有IgG均容易表达且易于从哺乳动物细胞的瞬时转染纯化。
前导IgG特异性和效力特性
然后，以直接滴定ELISA形式测试上文所描述的经过纯化的IgG与人和食蟹猴PD1-Fc的结合。此分析表明，若干个文库源性克隆的人和食蟹猴PD1结合曲线以及EC50值与IgG1-Mab005(人源化)的人和食蟹猴PD1结合曲线以及EC50值类似(在2倍以内)或相对于后者有所改善(图4A&B，表6)。值得注意的一个例外是克隆IgG1-14C07，所述克隆表现出与PD1的两个直系同源物的结合差，从而使得无法确定此克隆的EC50值。类似地，大多数设计IgG的EC50值与IgG1-Mab005(人源化)的EC50值类似(3倍以内)或相对于后者有所提高(图5A-D，表7)。然而，克隆IgG1-01、IgG1-02和IgG1-03表现出与PD1的一个或两个直系同源物的结合差，从而表明，当组合使用时，这些克隆中存在的CDR-H1和H3突变对于结合来说是破坏性的。由于直接结合性IgG的ELISA EC50值受亲合力而非真正的1:1结合亲和力的强烈影响，因此转而进行灵敏度更高的溶液相表位竞争和Biacore结合亲和力测定，如下所述。
建立Alphascreen测定，以测试IgG和IgG1-Mab005(人源化)在与经过生物素化的单体人PD1结合方面的表位竞争。在此测定中，通过IC50值更有效地区分表现最好的文库源性和设计IgG(表8)。虽然相比IgG1-Mab005(人源化)，许多克隆对Mab005表位表现出相当或提高的竞争(图6A和6B)，但若干克隆表现出的表位竞争受损(比Mab005低2倍以上)，包含：IgG1-15C10、IgG1-13G02、IgG1-08F04、IgG1-16C07、IgG1-12H11、IgG1-12E02、IgG1-14C07、IgG1-01、IgG1-02、IgG1-03、IgG1-06、IgG1-09、IgG1-12和IgG1-15(表8)。值得注意的是，此测定中表现最差的设计IgG包含先前在ELISA测定中显示食蟹猴直系同源物交叉反应性差的设计IgG，以及含有CDR-L1种系化突变W>Y的所有克隆。
对所有IgG与溶液相单体人和食蟹猴PD1蛋白的结合亲和力进行Biacore分析。在所有情况下，均获得了具有低Chi2值的准确的1:1结合亲和力(表9)。这些分析表明，在Fab和IgG ELISA和Alphascreen测定中始终产生最高EC50和IC50值的文库源性克隆显示出与人和食蟹猴PD1的最高亲和力结合。重要的是，与IgG1-Mab005(人源化)相比，文库源性克隆IgG1-06D02、IgG1-12B07、IgG1-12H04和IgG1-16H10以及设计克隆IgG1-04、IgG1-05、IgG1-08、IgG1-10、IgG1-11、IgG1-13和IgG1-14全都表现出对人和食蟹猴PD1两者的结合亲和力得到提高。重要的是，这些亲和力的提高使这些克隆的人/食蟹猴亲和力出乎意料地归一化为3倍以内(所有KD值<4.9nM)，而IgG1-Mab005(人源化)相反表现出8倍的差异(人KD-4.0nM，食蟹猴KD-32.0nM)。人与食蟹猴靶直系同源物之间小于3倍的亲和力差异在临床前药物开发分析中高度有益，因为它们可以允许对例如猴安全性、PK和PD建模实验进行显著更好的设计和解释。与两个PD1直系同源物的结合的这种相对归一化使这些前导克隆与IgG1-派姆单抗类似物的结合高度类似，所述IgG1-派姆单抗类似物表现出2.7的亲和力差异。另外，对克隆IgG1-14和IgG1-15的亲和力的比较证实了IgG1-14的CDR-L1中单个“鼠”W残基的影响(表4)，因为在IgG1-15中此单个残基突变为Y导致针对人和食蟹猴PD1两者的KD损失约10倍(表9)。此发现突出显示很难“先验地”决定哪些CDR残基可以或不可以转化为人种系同一性，因为通常假设W>Y突变是相对保守的取代。
在细胞膜处的前导IgG结合特异性的流式细胞术分析
通过流式细胞术分析PD1抗体在细胞表面处的浓度依赖性结合。对用人或食蟹猴PD1稳定转染的CHO细胞进行初始分析。这些分析表明，前导文库源性(图7A)和设计克隆(图7B、7C)表现出与膜呈递的人PD1的浓度依赖性结合，其中效力与IgG1-Mab005(人源化)的效力相同或相对于后者有所提高(表10)。重要的是，再次观察到CDR-L1“W”残基的影响，因为IgG1-14对人PD1表现出的结合强于IgG1-15对人PD1表现出的结合(图7C)。对食蟹猴PD1CHO细胞进行的分析进一步证实，与IgG1-Mab005(人源化)相比，若干个文库源性(图8A)和设计前导(图8B)表现出与食蟹猴PD1的结合显著提高(表10)。在未经转染的CHO细胞上，未观察到任何克隆的结合信号，即使在最高浓度下也是如此。
PD1-PDL1阻断测定中的前导IgG分析
在基于细胞的PD1/PD-L1阻断报告基因测定中，所有所测试的克隆均表现出对PD1的浓度依赖性拮抗作用。重要的是，与IgG1-Mab005(人源化)相比，多个克隆(包含IgG1-06D02、IgG1-12H04、IgG1-16H10、IgG1-05、IgG1-08、IgG1-11和IgG1-14)在PD1阻断方面表现出的效力得到提高(表11)。另外，与IgG1-Mab005(人源化)和IgG4纳武单抗类似物相比，克隆IgG1-06D02和IgG1-16H10在所述测定中表现出的最大信号增加(图9)。
抗体v结构域T细胞表位分析
将基于鉴定T细胞表位在治疗性抗体和蛋白质中的位置的计算机技术(Abzena有限公司)用于评估Mab005和前导抗体v结构域两者的免疫原性。用重叠的9mer肽(其中每个肽与最后一个肽重叠8个残基)分析v-结构域序列，针对34种MHC II类同种异型中的每一种对所述肽进行测试。基于潜在的“拟合”以及与MHC II类分子的相互作用对每个9mer进行评分。通过软件计算的肽得分介于0与1之间。突出显示产生高平均结合得分(在iTopeTM评分功能中，>0.55)的肽，并且如果>50％的MHC II类结合性肽(即，34个等位基因中的17个)具有高结合亲和力(得分>0.6)，则此类肽被定义为是被视为有高风险含有CD4+T细胞表位的“高亲和力”MHC II类结合性肽。低亲和力MHC II类结合性肽与大量(>50％)等位基因结合，其中结合得分>0.55(但并不是多数>0.6)。使用TCEDTM对序列进行进一步分析。将序列用于通过BLAST搜索来查询TCEDTM，以便鉴定来自在Abzena有限公司进行的先前体外T细胞表位作图研究中刺激T细胞应答的无关蛋白质/抗体的肽(T细胞表位)之间的任何高序列同源性。
将肽分为以下四类：高亲和力外来(“HAF”-高免疫原性风险)、低亲和力外来(“LAF”-低免疫原性风险)、TCED+(先前在TCED数据库中鉴定的表位)和种系表位(“GE”-具有高MHC II类结合亲和力的人种系肽序列)。由于T细胞耐受性，种系表位9mer肽不太可能具有免疫原性潜力，这已经通过使用广泛的种系肽进行的研究得以验证。重要的是，这种种系v结构域表位(进一步由人抗体恒定区中的类似序列辅助)还竞争在抗原呈递细胞的膜处进行MHC II类占据，从而降低外来肽呈递足以达到T细胞刺激所需的“活化阈值”的风险。因此，高GE含量是抗体治疗剂的临床开发中的一种有益特性。
如表12所示，与IgG1-Mab005(人源化)相比，关键前导v结构域表现出肽表位含量的显著有益变化(表12)。由于IgG1-Mab005(人源化)和所有前导的v结构域骨架区(即，CDR序列外部)的序列均是种系的(表2)，因此预测的免疫原性的所有改善都归因于CDR残基的种系化(表4、12)。实际上，在若干个克隆中，发现VL结构域是完全去免疫的。还发现GE表位含量在前导克隆的VL区中显著增加(在所有前导中从1增加到≥3)，并且从所有前导中的VL结构域中消除TCED+表位(表12)。重要的是，通过前导克隆的VL CDR中存在的种系化突变消除多个HAF和LAF表位。例如，在所有前导克隆中通过位置6处的突变L>R消除存在于IgG1-Mab005(人源化)的LCDR-1中的TCED+和HAF肽“VTITCLASQ”(SEQ ID NO:83)，从而将此序列转化为轻链GE“VTITCRASQ”(SEQ ID NO:84)。类似地，在所有前导克隆中通过仅保留位置4处的单个鼠残基W消除存在于IgG1-Mab005(人源化)的LCDR-1中的LAF肽“IGTWLTWYQ”(SEQID NO:85)，从而将此序列转化为“ISSWLNWYQ”(SEQ ID NO:86)(表12)。在克隆06D02、IgG1-05、IgG1-08、IgG1-11和IgG1-14中通过将LCDR-2从鼠序列“TATSLAD”(SEQ ID NO:36)突变为完全种系序列“AASSLQS”(SEQ ID NO:42)消除IgG1-Mab005(人源化)HAF肽“LLIYTATSL”(SEQ ID NO:87)和“LIYTATSLA”(SEQ ID NO:88)以及LAF肽“IYTATSLAD”(SEQ ID NO:89)并将其转化为GE序列。IgG1-Mab005(人源化)FW3/LCDR3区还对LAF肽“YYCQQVYSI”(SEQ IDNO:90)进行编码。在所有前导中，通过位置6处的种系化突变V>S消除此表位。在IgG1-Mab005(人源化)的VH区中，发现肽序列“LYYFDYWGQ”(SEQ ID NO:91)(跨越HCDR3和FW4)是LAF。在此肽中的位置3处的突变Y>A允许消除克隆IgG1-14中的此表位(表4、12)。
抗体结合特异性分析
在早期临床试验中，已经报道，Mab005的人源化形式诱导人类患者的异常毒性，如血管瘤，在其它抗PD1或抗PD-L1治疗剂中未发现所述异常毒性。这些报告表明，人源化Mab005可能具有独特的“脱靶”结合特性，在其它抗PD1抗体中未发现所述特性。血管瘤是一种由一系列多余的血管形成的良性肿瘤，通常在皮肤中产生，但其还可能在肝脏和其它器官中产生。假设Mab005可以与未鉴定且不可预测的与血管发育或组织分化相关的受体结合。为了检查这种可能性，将基于使用表达4975种独特的人膜受体的细胞的高密度阵列的体外技术(Retrogenix有限公司)用于筛选IgG1-Mab005(人源化)的脱靶结合特异性。此受体阵列结合筛选确认，IgG1-Mab005(人源化)表现出与膜表达的PD1的强结合，而且具有4种潜在的脱靶结合特异性：FZD5(卷曲类受体5)、ULBP2(UL16结合蛋白2)、EphB6和KDR(还被称为VEGFR2)。已知血管瘤在患者体内随着血管生物学相关受体(如VEGFR2)的突变而自发产生，并且据报道，其是使用血管靶向抗体(如雷莫芦单抗(ramucirumab)(抗-VEGFR2))进行癌症疗法的副作用。另外，因为FZD5是与血管发育相关的Wnt途径信号传导受体，所以调节这两种受体的中的任一受体的功能都有可能调节血管生物学。另外，因为ULBP2是天然杀伤细胞活化受体NKG2D的已知配体，所以在用抗PD1进行的癌症疗法期间与此蛋白质的结合的后果是未知的。
为了证实这些脱靶结合事件，将对这些受体和对照物进行编码的质粒提交以进行DNA测序。这些分析证实，经过编码的蛋白质确实是正确的序列。然后，将对照受体和潜在的靶受体的质粒样品重新排列在新芯片上，以便一式两份地进行重复分析。通过扫描芯片上的ZS green证实了所有重新排列的质粒对表达的有效诱导，所述ZS green以内部对照标志物的形式共编码在所有表达质粒上。此分析表明，在点样了质粒的所有位置中存在可清楚检测的ZS表达(图10A)。另外，然后使用以相同方式点样的载玻片重新探测用IgG1-Mab005(人源化)(图10B)、同种型IgG1(阴性对照物，图10C)、利妥昔单抗(IgG1阳性对照物，图10D)转染的细胞以及未应用一级抗体探针的芯片(图10E)。这些分析表明，IgG1-Mab005(人源化)在用PD1、FZD5、ULBP2和KDR转染的细胞上再次表现出高于背景(在两个芯片上)的可测量结合，但未与FcγR1a(由于IgG1无效同种型)或任何其它点(包含EphB6)结合(图10B)。如预期的那样，利妥昔单抗表现出与CD20和FcγR1a的结合(由于IgG1同种型)，未观察到与PD1、FZD5、ULBP2、EphB6和KDR的结合(图10D)。在用同种型对照抗体(图10C)和无一级抗体(图10E)探测的芯片中，只有预期的对照蛋白质显示出任何信号。对照芯片的这种纯粹表现证实，PD1、FZD5、ULBP2和KDR上的IgG1-Mab005(人源化)结合信号是特异性的。
为了研究这种脱靶结合活性的起源以及在这项研究中产生的文库源性和设计IgG中是否保留了这种脱靶结合活性，进行了进一步的芯片结合分析(图11A-T)。如上所述，再次检查重新排列的质粒的转染质量，并且证实了对ZS green表达的诱导(图11A)。另外的对照抗体；派姆单抗类似物(图11B)和利妥昔单抗(图11C)两者都仅与其相应的同源靶标结合，并且同种型对照IgG1未显示出结合(图11D)。使用mVH/mVL Mab005-IgG1和IgG1-Mab005(人源化)(分别地，图11E和F)进行的初步分析表明，在用mVH/mVL Mab005-IgG1探测的芯片中也存在先前仅在IgG1-Mab005(人源化)(图10B)中观察到的脱靶结合信号。此发现证实，IgG1-Mab005(人源化)的脱靶结合反应性直接源自原始鼠杂交瘤并且不是人源化过程期间诱导多反应性的结果。因此，在CDR中直接具有IgG1-Mab005(人源化)的脱靶结合活性，因为当将鼠CDR移植到人种系骨架上时，所述脱靶结合活性得到保留。
然后，还使用前导文库源性和设计抗体来探测此同一芯片组。令人惊讶的是，抗体IgG1-06D02(图11G)、IgG1-11G05(图11H)、IgG1-12H04(图11I)、IgG1-16H10(图11J)、IgG1-04(图11K)、IgG1-05(图11L)、IgG1-06(图11M)、IgG1-08(图11N)、IgG1-11(图11O)、IgG1-13(图11P)、IgG1-14(图11Q)、IgG1-15(图11R)、IgG1-12B07(图11S)和IgG1-10(图11T)在重复分析中的任何重复分析中均未显示出与除了PD1之外的任何其它靶标的任何可测量结合。此发现表明，前导抗体仅保留了与PD1的高度特异性且有效的结合，并且已烧蚀了在IgG1-Mab005(人源化)中观察到的脱靶反应性。
为了最终通过正交的高灵敏度测定证实这些发现，仅使用KDR、ULBP2、FZD5和ZSgreen(阴性对照物)的经过序列验证的质粒进行人细胞系HEK293的瞬时转染。然后，使用mVH/mVL Mab005-IgG1、IgG1-Mab005(人源化)、派姆单抗类似物、同种型IgG1和前导抗体(IgG1-06D02、IgG1-12HO4、IgG1-05、IgG1-08)的子集对经转染的细胞进行染色。使用每种抗体以高浓度(5μg/ml)和中等浓度(1μg/ml)对受体转染和ZS green转染的细胞两者进行重复染色(以测量背景结合)。在以5μg/ml和1μg/ml两者对PD1转染的细胞进行染色时(图12A-12P)，除了同种型对照物之外，所有所测试的抗体均显示出对PD1转染细胞的预期强特异性染色，但未显示出对ZS green转染的细胞的预期强特异性染色。相比之下，FZ5(图13A-13P)、KDR(图14A-14P)和ULBP2(图15A-15P)转染的细胞的染色与图11的芯片数据完全相关，其中仅mVH/mVL Mab005-IgG1和IgG1-Mab005(人源化)在5μg/ml和1μg/ml两者下在所有3个靶标上表现出强结合信号。抗体IgG1-06D02、IgG1-12HO4、IgG1-05、IgG1-08、派姆单抗类似物和同种型IgG1在任一浓度下均未表现出与FZ5、KDR或ULBP2转染的细胞中的任何细胞的高于背景的任何可测量结合。在另外的高灵敏度ELISA测定中，还发现这些抗体与人和食蟹猴PD1结合(图16A、B)，但未与人或恒河猴VEGFR2(图16C、D)、人FZD5(图16E)或BSA蛋白(图16F)的重组胞外域结合。这些发现完全证实，在诱变和重选过程中获得的CDR序列出乎意料地烧蚀了受体KDR、FZD5和ULBP2的脱靶结合，所述受体可能是与IgG1-Mab005(人源化)相关的临床毒性的主要驱动因子。
最后，尝试使用上文所描述的用于PD1亲和力评估的条件，通过Biacore估计mVH/mVL Mab005-IgG1和IgG1-Mab005(人源化)对VEGFR2的亲和力。针对mVH/mVL Mab005-IgG1和IgG1-Mab005(人源化)滴定人和恒河猴单体VEGFR2-his蛋白。两种抗体均再次表现出与VEGFR2重组蛋白的结合，但仅在非常高浓度的可溶性分析物下才观察到结合信号(图17)。因此，只可以产生拟合值差(Chi2>6.6)的复杂曲线，并且无法准确地得出可靠的KD值。这表明，两种抗体对人或恒河猴VEGFR2的亲和力均很低，可能在μM范围内。
VEGFR2活化分析
为了研究IgG1-Mab005(人源化)中的VEGFR2反应性是否能够使受体活化，使用人VEGFR2报告基因测定来检查在天然VEGF应答元件NFAT(普洛麦格公司)的控制下对荧光素酶表达的诱导。在此测定中，IgG1-Mab005(人源化)和mVH/mVL Mab005-IgG1两者均表现出VEGFR2信号传导的强浓度依赖性活化(在nM范围内)，其中IgG1-Mab005(人源化)比mVH/mVLMab005-IgG1更有效(图18)。然而，IgG1-Mab005(人源化)的活化效力显著低于重组人VEGF-163的活化效力(图18)。重要的是，还在此测定中分析了克隆MAB04、MAB08、06D02和12H04中的每个克隆，并且所述克隆未表现出可观察的活化信号，即使在浓度高达1μM时也是如此。实际上，前导IgG克隆在最大浓度下的信号低于在同型对照IgG1中观察到的信号(图18)。
IgG稳定性分析
将差示扫描量热法(DSC)用于测量蛋白质的作为总体分子结构稳定性的指示的热稳定性。所有所测试的IgG1无效蛋白与DSC分析完全相容，从而呈现相当的样品均质性和协同性(图19)。表13中指示了测得的每种抗体的热转变中点(Tm)。所有五种IgG均显示出类似的72.2℃到72.4℃的CH2结构域Tm1值，从而表明所有样品均具有高完整性。然而，出乎意料的是，所有前导IgG(IgG1-05、IgG1-08、IgG1-06D02和IgG1-12H04)在其Fab结构域中均表现出极高的稳定性，其中Tm2值的范围为90.8℃到92.2℃(表13)。相比之下，Mab005-IgG1(人源化)的稳定性显著更低，Fab Tm值为83.8℃(表13)。前导抗体的Fab稳定性相比Mab005-IgG1(人源化)的Fab稳定性的显著增加是出乎意料的，因为所有抗体的可变结构域骨架区和抗体恒定区的序列相同，并且因此所有提高仅由CDR序列的差异介导。
暴露氨基酸残基(如色氨酸和甲硫氨酸)的氧化是mAb的常见降解途径。重要的是，抗体的CDR中的关键侧链的氧化还可能通过降低靶结合亲和力而潜在地影响其生物活性。氧化是蛋白质储存中通常会随着时间的推移发生的过程，因此实时分析氧化风险的标准实验室方法是在蛋白质中添加氧化试剂。在这项研究中，通过在室温下用含0.5％H2O2的PBS处理2小时来对IgG应用强制氧化。由于氧化可以例如通过增加氧化形式的极性来改变抗体的总体疏水性，因此通过反相(RP)和疏水相互作用色谱法(HIC)方法来分析强制氧化诱导的潜在变化。
在RP分析中，无论是在IgG完整(表14)还是IgG减少(表15)的形式下，在克隆IgG1-05、IgG1-08、IgG1-06D02和IgG1-12H04中的任何克隆中均未观察到保留时间的变化，从而表明未发生侧链的显著氧化。相比之下，在用H2O2处理Mab005-IgG1(人源化)之后，观察到完整IgG(表14)的柱保留时间减少约0.6分钟，并且在轻链减少(表15)的情况下柱保留时间减少0.8分钟，从而表明确切地在抗体轻链中发生暴露氨基酸的氧化。在H2O2处理之前和之后对胰蛋白酶肽指纹的RP分析还表明，除了Mab005-IgG1(人源化)之外，所有IgG的侧链氧化变化最小。对于Mab005-IgG1(人源化)，在强制氧化后失去或减少5个肽，随后出现6个另外的肽(图20A)。相比之下，克隆IgG1-05、IgG1-08、IgG1-06D02和IgG1-12H04显示出显著较少的肽的伴随性损失。例如，在H2O2处理后，IgG1-06D02仅表现出两个胰蛋白酶肽的损失，并且出现两个另外的峰(图20B)。
H2O2处理还导致所有5个测试物品在HIC上的保留时间减少，从而表明暴露氨基酸的轻微氧化(表16)。再次，观察到Mab005-IgG1(人源化)在HIC上的保留降低最多(1.1分钟)，而对于克隆IgG1-05、IgG1-08、IgG1-06D02和IgG1-12H04而言，降低仅0.2-0.3分钟。总之，这些发现表明，与Mab005-IgG1(人源化)相比，前导克隆IgG1-05、IgG1-08、IgG1-06D02和IgG1-12H04的物理稳定性和氧化挑战抗性出乎意料地得到提高。
本文概述的组合分析表明，令人惊讶的是，对这些抗体的CDR中的种系和非种系氨基酸两者进行深度采样允许同时优化多个最终分子中的靶结合特异性、免疫原性风险、效力、生物物理稳定性和化学稳定性风险。
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表1.此处所定义的鼠抗PD1 CDR氨基酸序列(“统一”方案)与替代性定义的比较。
Figure BDA0002667533810000391
Figure BDA0002667533810000401
表2.MAB005鼠抗PD1 v结构域(mVH/mVL)和人种系CDR移植物(VH1/VL1)的氨基酸序列。
Figure BDA0002667533810000402
1用于基于IMGT系统进行移植的人种系定义。2CDR残基以粗体加下划线表示。如上所述，本稿件中使用的“统一”CDR定义是相比于经典Kabat定义的扩展定义。上文的每个序列按以下顺序示出骨架区(FR)和CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
表3.来自显示与人和食蟹猴PD1蛋白结合的Fab克隆的独特CDR。
Figure BDA0002667533810000403
Figure BDA0002667533810000411
Figure BDA0002667533810000421
表4.独特的文库源性和设计PD1拮抗性IgG的CDR序列。
Figure BDA0002667533810000422
Figure BDA0002667533810000431
Figure BDA0002667533810000441
Figure BDA0002667533810000451
表5.独特的文库源性抗PD1 Fab的ELISA EC50值。
Figure BDA0002667533810000452
Figure BDA0002667533810000461
表6.独特的文库源性抗PD1 IgG1无效序列的ELISA EC50值。
Figure BDA0002667533810000462
表7.独特的设计抗PD1 IgG1无效序列的ELISA EC50值。
Figure BDA0002667533810000463
表8.抗PD1 IgG1无效序列的Alphascreen IC50值。
Figure BDA0002667533810000464
Figure BDA0002667533810000471
表9.与人和食蟹猴单体PD1结合的IgG1无效的Biacore亲和力值。
Figure BDA0002667533810000472
表10.与人和食蟹猴PD1-CHO细胞结合的IgG1无效的EC50值。
Figure BDA0002667533810000481
表11.人PD1/PD-L1的IgG1无效阻断的EC50值。
Figure BDA0002667533810000482
表12.通过iTOPETM和TCEDTM预测的v结构域中的人T细胞表位含量。
Figure BDA0002667533810000483
表13.通过DSC进行的IgG热稳定性分析——-TM值以摄氏度为单位。
Figure BDA0002667533810000484
表14.完整IgG的反相色谱法保留时间——用0.5％H2O2进行强制氧化之前(0分钟)和120分钟之后
Figure BDA0002667533810000491
表15.减少的IgG的轻链和重链的反相色谱法保留时间——用0.5％H2O2进行强制氧化之前(0分钟)和120分钟之后
Figure BDA0002667533810000492
表16.IgG的疏水相互作用色谱法保留时间——用0.5％H2O2进行强制氧化之前(0分钟)和120分钟之后
Figure BDA0002667533810000493
表17.抗体可变区氨基酸序列的实例。
抗体IgG1-08重链可变(VH)区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYLMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1)
抗体IgG1-08轻链可变(VL)区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:2)
抗体IgG1-05重链可变(VH)区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYLMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQVYYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:3)
抗体IgG1-05轻链可变(VL)区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:4)
抗体IgG1-11重链可变(VH)区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYLMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYFFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:5)
抗体IgG1-11轻链可变(VL)区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:6)
抗体IgG1-14重链可变(VH)区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYLMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYAFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7)
抗体IgG1-14轻链可变(VL)区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:8)
抗体06D02重链可变(VH)区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYLMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGSETYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)
抗体06D02轻链可变(VL)区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:10)
抗体12H04重链可变(VH)区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYLMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGAEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:11)
抗体12H04轻链可变(VL)区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)
表18.抗体Fc区氨基酸序列的实例。
人IgG4野生型
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:13)
人IgG4(S228P)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:14)
人IgG1野生型
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:15)
人IgG1-3M
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:16)
人IgG2野生型
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:17)
人IgG1野生型“REEM”同种异型
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:18)
人IgG1-3M“REEM”同种异型
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:19)
表19.膜蛋白氨基酸序列的实例。
人PD1序列
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(SEQ IDNO:20)
食蟹猴PD1序列
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL(SEQ IDNO:21)
人KDR(VEGFR2)序列
MQSKVLLAVALWLCVETRAASVGLPSVSLDLPRLSIQKDILTIKANTTLQITCRGQRDLDWLWPNNQSGSEQRVEVTECSDGLFCKTLTIPKVIGNDTGAYKCFYRETDLASVIYVYVQDYRSPFIASVSDQHGVVYITENKNKTVVIPCLGSISNLNVSLCARYPEKRFVPDGNRISWDSKKGFTIPSYMISYAGMVFCEAKINDESYQSIMYIVVVVGYRIYDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPQIGEKSLISPVDSYQYGTTQTLTCTVYAIPPPHHIHWYWQLEEECANEPSQAVSVTNPYPCEEWRSVEDFQGGNKIEVNKNQFALIEGKNKTVSTLVIQAANVSALYKCEAVNKVGRGERVISFHVTRGPEITLQPDMQPTEQESVSLWCTADRSTFENLTWYKLGPQPLPIHVGELPTPVCKNLDTLWKLNATMFSNSTNDILIMELKNASLQDQGDYVCLAQDRKTKKRHCVVRQLTVLERVAPTITGNLENQTTSIGESIEVSCTASGNPPPQIMWFKDNETLVEDSGIVLKDGNRNLTIRRVRKEDEGLYTCQACSVLGCAKVEAFFIIEGAQEKTNLEIIILVGTAVIAMFFWLLLVIILRTVKRANGGELKTGYLSIVMDPDELPLDEHCERLPYDASKWEFPRDRLKLGKPLGRGAFGQVIEADAFGIDKTATCRTVAVKMLKEGATHSEHRALMSELKILIHIGHHLNVVNLLGACTKPGGPLMVIVEFCKFGNLSTYLRSKRNEFVPYKTKGARFRQGKDYVGAIPVDLKRRLDSITSSQSSASSGFVEEKSLSDVEEEEAPEDLYKDFLTLEHLICYSFQVAKGMEFLASRKCIHRDLAARNILLSEKNVVKICDFGLARDIYKDPDYVRKGDARLPLKWMAPETIFDRVYTIQSDVWSFGVLLWEIFSLGASPYPGVKIDEEFCRRLKEGTRMRAPDYTTPEMYQTMLDCWHGEPSQRPTFSELVEHLGNLLQANAQQDGKDYIVLPISETLSMEEDSGLSLPTSPVSCMEEEEVCDPKFHYDNTAGISQYLQNSKRKSRPVSVKTFEDIPLEEPEVKVIPDDNQTDSGMVLASEELKTLEDRTKLSPSFGGMVPSKSRESVASEGSNQTSGYQSGYHSDDTDTTVYSSEEAELLKLIEIGVQTGSTAQILQPDSGTTLSSPPV(SEQID NO:22)
食蟹猴KDR(VEGFR2)序列
MASKVLLAVALWLCVETRAASVGLPSVSLDLPRLSIQKDILTIKANTTLQITCRGQRDLDWLWPNNQSGSEQRVEVTECSDGLFCKTLTIPKVIGNDTGAYKCFYRETDLASVIYVYVQDYRSPFIASVSDQHGVVYITENKNKTVVIPCLGSISNLNVSLCARYPEKRFVPDGNRISWDSKKGFTIPSYMISYAGMVFCEAKINDESYQSIMYIVVVVGYRIYDVVLSPSHGVELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPVKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTVKVGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPQIGEKSLISPVDSYQYGTTQTLTCTVYAIPPPHHIHWYWQLEEECPNEPSQAVSVTNPYPCEEWRSVEDFQGGNKIEVNKNQFALIEGKNKTVSTLVIQAANVSALYKCEAVNKVGRGERVISFHVTRGPEITLQPDLQPTEQESVSLWCTADKSTFENLTWYKLGPQPLPVHVGELPTPVCKNLDTLWKLNATIFSNSTNDILIMELKNASLQDQGDYVCVAQDRKTKKRHCVVRQLTVLERVAPMITGNLENQTTSIGETIEVSCTASGNPPPQIMWFKDNETLVEDSGIVLKDGNRNLTIRRVRKEDEGLYTCQACSVLGCAKVEAFFIIEGAQEKTNLEIIILVGTAVIAMFFWLLLVIILRTVKRANGGELKTGYLSIVMDPDELPLDEHCERLPYDASKWEFPRDRLKLGKPLGRGAFGQVIEADAFGIDKTATCRTVAVKMLKEGATHSEHRALMSELKILIHIGHHLNVVNLLGACTKPGGPLMVIVEFCKFGNLSTYLRSKRNEFVPYKTKGARFRQGKDYVGAIPVDLKRRLDSITSSQSSASSGFVEEKSLSDVEEEEAPEDLYKDFLTLEHLICYSFQVAKGMEFLASRKCIHRDLAARNILLSEKNVVKICDFGLARDIYKDPDYVRKGDARLPLKWMAPETIFDRVYTIQSDVWSFGVLLWEIFSLGASPYPGVKIDEEFCRRLKEGTRMRAPDYTTPEMYQTMLDCWHGEPSQRPTFSELVEHLGNLLQANAQQDGKDYIVLPISETLSMEEDSGLSLPTSPVSCMEEEEVCDPKFHYDNTAGISQYLQNSKRKSRPVSVKTFEDIPLEEPEVKVIPDDNQTDSGMVLASEELKTLEDRTKLAPSFSGMVSSKSRESVASEGSNQTSGYQSGYHSDDTDTTVYSSEEAELLKLIEIGVQTGSTAQILQPDSGTTLSSPPV(SEQID NO:23)
人FZD5序列
MARPDPSAPPSLLLLLLAQLVGRAAAASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATTAPPRPFPAKPTLPGPPGAPASGGECPAGGPFVCKCREPFVPILKESHPLYNKVRTGQVPNCAVPCYQPSFSADERTFATFWIGLWSVLCFISTSTTVATFLIDMERFRYPERPIIFLSACYLCVSLGFLVRLVVGHASVACSREHNHIHYETTGPALCTIVFLLVYFFGMASSIWWVILSLTWFLAAGMKWGNEAIAGYAQYFHLAAWLIPSVKSITALALSSVDGDPVAGICYVGNQNLNSLRGFVLGPLVLYLLVGTLFLLAGFVSLFRIRSVIKQGGTKTDKLEKLMIRIGIFTLLYTVPASIVVACYLYEQHYRESWEAALTCACPGHDTGQPRAKPEYWVLMLKYFMCLVVGITSGVWIWSGKTVESWRRFTSRCCCRPRRGHKSGGAMAAGDYPEASAALTGRTGPPGPAATYHKQVSLSHV(SEQ ID NO:24)
人ULBP2序列
MAAAAATKILLCLPLLLLLSGWSRAGRADPHSLCYDITVIPKFRPGPRWCAVQGQVDEKTFLHYDCGNKTVTPVSPLGKKLNVTTAWKAQNPVLREVVDILTEQLRDIQLENYTPKEPLTLQARMSCEQKAEGHSSGSWQFSFDGQIFLLFDSEKRMWTTVHPGARKMKEKWENDKVVAMSFHYFSMGDCIGWLEDFLMGMDSTLEPSAGAPLAMSSGTTQLRATATTLILCCLLIILPCFILPGI(SEQ ID NO:25)
序列表
<110> ULTRAHUMAN EIGHT有限公司（ULTRAHUMAN EIGHT LIMITED）
<120> PD1结合剂
<130> UHEL-001/01WO 332951-2006
<150> GB 1817652.9
<151> 2018-10-29
<150> GB 1816372.5
<151> 2018-10-08
<150> GB 1811302.7
<151> 2018-07-10
<150> GB 1807176.1
<151> 2018-05-01
<150> GB 1803745.7
<151> 2018-03-08
<160> 182
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体IgG1-08重链可变（VH）区
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体IgG1-08轻链可变（VL）区
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体IgG1-05重链可变（VH）区
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体IgG1-05轻链可变（VL）区
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体IgG1-11重链可变（VH）区
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体IgG1-11轻链可变（VL）区
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体IgG1-14重链可变（VH）区
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体IgG1-14轻链可变（VL）区
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体06D02重链可变（VH）区
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体06D02轻链可变（VL）区
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体12H04重链可变（VH）区
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体12H04轻链可变（VL）区
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 14
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 15
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 16
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 17
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 18
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 19
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 20
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 21
<211> 288
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 21
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Leu Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Ala Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Gln Gly Thr Ile Glu Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Ala Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Leu Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Pro Arg Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 22
<211> 1356
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu
1 5 10 15
Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro
20 25 30
Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr
35 40 45
Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro
50 55 60
Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser
65 70 75 80
Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn
85 90 95
Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser
100 105 110
Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser
115 120 125
Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys
130 135 140
Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser
145 150 155 160
Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg
165 170 175
Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile
180 185 190
Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser
195 200 205
Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr
210 215 220
Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu
225 230 235 240
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
245 250 255
Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu
260 265 270
Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
275 280 285
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
290 295 300
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met
325 330 335
Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala
340 345 350
Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly
355 360 365
Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr
370 375 380
Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu
385 390 395 400
Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val
405 410 415
Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val
420 425 430
Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr
435 440 445
Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu
450 455 460
Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr
465 470 475 480
Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys
485 490 495
Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys
500 505 510
Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr
515 520 525
Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser
530 535 540
Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln
545 550 555 560
Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser
565 570 575
Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro
580 585 590
Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr
595 600 605
Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile
610 615 620
Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr
625 630 635 640
Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val
645 650 655
Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn
660 665 670
Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys
675 680 685
Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn
690 695 700
Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg
705 710 715 720
Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr
725 730 735
Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe
740 745 750
Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu
755 760 765
Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile
770 775 780
Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly
785 790 795 800
Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His
805 810 815
Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp
820 825 830
Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val
835 840 845
Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr
850 855 860
Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg
865 870 875 880
Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu
885 890 895
Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu
900 905 910
Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu
915 920 925
Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg
930 935 940
Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys
945 950 955 960
Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly
965 970 975
Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro
980 985 990
Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr
995 1000 1005
Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys
1010 1015 1020
Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu
1025 1030 1035
Lys Asn Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile
1040 1045 1050
Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro
1055 1060 1065
Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr
1070 1075 1080
Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile
1085 1090 1095
Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu
1100 1105 1110
Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro
1115 1120 1125
Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp
1130 1135 1140
His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Ser Glu Leu Val Glu
1145 1150 1155
His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys
1160 1165 1170
Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu Ser Met Glu Glu
1175 1180 1185
Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met Glu
1190 1195 1200
Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala
1205 1210 1215
Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro
1220 1225 1230
Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu
1235 1240 1245
Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val
1250 1255 1260
Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu
1265 1270 1275
Ser Pro Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser
1280 1285 1290
Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly
1295 1300 1305
Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu
1310 1315 1320
Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser
1325 1330 1335
Thr Ala Gln Ile Leu Gln Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser
1340 1345 1350
Pro Pro Val
1355
<210> 23
<211> 1356
<212> PRT
<213> 普通猕猴（Macaca mulatta）
<400> 23
Met Ala Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu
1 5 10 15
Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro
20 25 30
Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr
35 40 45
Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro
50 55 60
Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser
65 70 75 80
Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn
85 90 95
Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser
100 105 110
Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser
115 120 125
Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys
130 135 140
Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser
145 150 155 160
Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg
165 170 175
Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile
180 185 190
Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser
195 200 205
Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr
210 215 220
Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Val Glu Leu Ser Val Gly Glu
225 230 235 240
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
245 250 255
Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu
260 265 270
Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
275 280 285
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
290 295 300
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met
325 330 335
Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Val
340 345 350
Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly
355 360 365
Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Val Lys Val Gly His Val Leu Thr
370 375 380
Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu
385 390 395 400
Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val
405 410 415
Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val
420 425 430
Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr
435 440 445
Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu
450 455 460
Glu Cys Pro Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr
465 470 475 480
Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys
485 490 495
Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys
500 505 510
Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr
515 520 525
Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser
530 535 540
Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Leu Gln
545 550 555 560
Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Lys Ser
565 570 575
Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro
580 585 590
Val His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr
595 600 605
Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Ile Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile
610 615 620
Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr
625 630 635 640
Val Cys Val Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val
645 650 655
Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Met Ile Thr Gly Asn
660 665 670
Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Thr Ile Glu Val Ser Cys
675 680 685
Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn
690 695 700
Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg
705 710 715 720
Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr
725 730 735
Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe
740 745 750
Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu
755 760 765
Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile
770 775 780
Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly
785 790 795 800
Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His
805 810 815
Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp
820 825 830
Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val
835 840 845
Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr
850 855 860
Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg
865 870 875 880
Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu
885 890 895
Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu
900 905 910
Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu
915 920 925
Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg
930 935 940
Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys
945 950 955 960
Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly
965 970 975
Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro
980 985 990
Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr
995 1000 1005
Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys
1010 1015 1020
Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu
1025 1030 1035
Lys Asn Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile
1040 1045 1050
Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro
1055 1060 1065
Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr
1070 1075 1080
Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile
1085 1090 1095
Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu
1100 1105 1110
Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro
1115 1120 1125
Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp
1130 1135 1140
His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Ser Glu Leu Val Glu
1145 1150 1155
His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys
1160 1165 1170
Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu Ser Met Glu Glu
1175 1180 1185
Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met Glu
1190 1195 1200
Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala
1205 1210 1215
Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro
1220 1225 1230
Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu
1235 1240 1245
Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val
1250 1255 1260
Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu
1265 1270 1275
Ala Pro Ser Phe Ser Gly Met Val Ser Ser Lys Ser Arg Glu Ser
1280 1285 1290
Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly
1295 1300 1305
Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu
1310 1315 1320
Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser
1325 1330 1335
Thr Ala Gln Ile Leu Gln Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser
1340 1345 1350
Pro Pro Val
1355
<210> 24
<211> 585
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
Met Ala Arg Pro Asp Pro Ser Ala Pro Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ala Gln Leu Val Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ser Lys Ala Pro Val
20 25 30
Cys Gln Glu Ile Thr Val Pro Met Cys Arg Gly Ile Gly Tyr Asn Leu
35 40 45
Thr His Met Pro Asn Gln Phe Asn His Asp Thr Gln Asp Glu Ala Gly
50 55 60
Leu Glu Val His Gln Phe Trp Pro Leu Val Glu Ile Gln Cys Ser Pro
65 70 75 80
Asp Leu Arg Phe Phe Leu Cys Ser Met Tyr Thr Pro Ile Cys Leu Pro
85 90 95
Asp Tyr His Lys Pro Leu Pro Pro Cys Arg Ser Val Cys Glu Arg Ala
100 105 110
Lys Ala Gly Cys Ser Pro Leu Met Arg Gln Tyr Gly Phe Ala Trp Pro
115 120 125
Glu Arg Met Ser Cys Asp Arg Leu Pro Val Leu Gly Arg Asp Ala Glu
130 135 140
Val Leu Cys Met Asp Tyr Asn Arg Ser Glu Ala Thr Thr Ala Pro Pro
145 150 155 160
Arg Pro Phe Pro Ala Lys Pro Thr Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro
165 170 175
Ala Ser Gly Gly Glu Cys Pro Ala Gly Gly Pro Phe Val Cys Lys Cys
180 185 190
Arg Glu Pro Phe Val Pro Ile Leu Lys Glu Ser His Pro Leu Tyr Asn
195 200 205
Lys Val Arg Thr Gly Gln Val Pro Asn Cys Ala Val Pro Cys Tyr Gln
210 215 220
Pro Ser Phe Ser Ala Asp Glu Arg Thr Phe Ala Thr Phe Trp Ile Gly
225 230 235 240
Leu Trp Ser Val Leu Cys Phe Ile Ser Thr Ser Thr Thr Val Ala Thr
245 250 255
Phe Leu Ile Asp Met Glu Arg Phe Arg Tyr Pro Glu Arg Pro Ile Ile
260 265 270
Phe Leu Ser Ala Cys Tyr Leu Cys Val Ser Leu Gly Phe Leu Val Arg
275 280 285
Leu Val Val Gly His Ala Ser Val Ala Cys Ser Arg Glu His Asn His
290 295 300
Ile His Tyr Glu Thr Thr Gly Pro Ala Leu Cys Thr Ile Val Phe Leu
305 310 315 320
Leu Val Tyr Phe Phe Gly Met Ala Ser Ser Ile Trp Trp Val Ile Leu
325 330 335
Ser Leu Thr Trp Phe Leu Ala Ala Gly Met Lys Trp Gly Asn Glu Ala
340 345 350
Ile Ala Gly Tyr Ala Gln Tyr Phe His Leu Ala Ala Trp Leu Ile Pro
355 360 365
Ser Val Lys Ser Ile Thr Ala Leu Ala Leu Ser Ser Val Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Val Ala Gly Ile Cys Tyr Val Gly Asn Gln Asn Leu Asn Ser Leu
385 390 395 400
Arg Gly Phe Val Leu Gly Pro Leu Val Leu Tyr Leu Leu Val Gly Thr
405 410 415
Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Val Ser Leu Phe Arg Ile Arg Ser Val
420 425 430
Ile Lys Gln Gly Gly Thr Lys Thr Asp Lys Leu Glu Lys Leu Met Ile
435 440 445
Arg Ile Gly Ile Phe Thr Leu Leu Tyr Thr Val Pro Ala Ser Ile Val
450 455 460
Val Ala Cys Tyr Leu Tyr Glu Gln His Tyr Arg Glu Ser Trp Glu Ala
465 470 475 480
Ala Leu Thr Cys Ala Cys Pro Gly His Asp Thr Gly Gln Pro Arg Ala
485 490 495
Lys Pro Glu Tyr Trp Val Leu Met Leu Lys Tyr Phe Met Cys Leu Val
500 505 510
Val Gly Ile Thr Ser Gly Val Trp Ile Trp Ser Gly Lys Thr Val Glu
515 520 525
Ser Trp Arg Arg Phe Thr Ser Arg Cys Cys Cys Arg Pro Arg Arg Gly
530 535 540
His Lys Ser Gly Gly Ala Met Ala Ala Gly Asp Tyr Pro Glu Ala Ser
545 550 555 560
Ala Ala Leu Thr Gly Arg Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Ala Thr Tyr
565 570 575
His Lys Gln Val Ser Leu Ser His Val
580 585
<210> 25
<211> 246
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
Met Ala Ala Ala Ala Ala Thr Lys Ile Leu Leu Cys Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ser Gly Trp Ser Arg Ala Gly Arg Ala Asp Pro His Ser
20 25 30
Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg
35 40 45
Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp Glu Lys Thr Phe Leu His Tyr
50 55 60
Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro Val Ser Pro Leu Gly Lys Lys
65 70 75 80
Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala Gln Asn Pro Val Leu Arg Glu
85 90 95
Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu Arg Asp Ile Gln Leu Glu Asn
100 105 110
Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu
115 120 125
Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly Ser Trp Gln Phe Ser Phe Asp
130 135 140
Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser Glu Lys Arg Met Trp Thr Thr
145 150 155 160
Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys
165 170 175
Val Val Ala Met Ser Phe His Tyr Phe Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly
180 185 190
Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser
195 200 205
Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser Ser Gly Thr Thr Gln Leu Arg Ala
210 215 220
Thr Ala Thr Thr Leu Ile Leu Cys Cys Leu Leu Ile Ile Leu Pro Cys
225 230 235 240
Phe Ile Leu Pro Gly Ile
245
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Leu或任何其它氨基酸
<400> 26
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Xaa Met Ser
1 5 10
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Val或Val的保守取代
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Thr或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是Glu或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是Thr或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是Pro或Val
<400> 27
Xaa Ala Xaa Ile Ser Gly Gly Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Gln或任何其它氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Leu或任何其它氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Tyr或Tyr的保守取代
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Tyr或任何其它氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Phe或任何其它氨基酸
<400> 28
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr
1 5
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MAb005鼠/人源化抗体HCDR1
<400> 29
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Met Met Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MAb005鼠/人源化抗体HCDR2
<400> 30
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MAb005鼠/人源化抗体HCDR3
<400> 31
Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Ser或Ser的保守取代
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Ser或Ser的保守取代
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Tyr或Tyr的保守取代
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是Leu或Leu的保守取代
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是Asn或Thr或Asn或Thr的保守取代
<400> 32
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Ala或Thr或Ala或Thr的保守取代
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Ser或Ser的保守取代
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Gln或任何其它氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Ser或任何其它氨基酸
<400> 33
Xaa Ala Xaa Ser Leu Xaa Xaa
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Ser或任何其它氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> XXaa是Tyr或任何其它氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Trp或任何其它氨基酸
<400> 34
Gln Gln Xaa Tyr Ser Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MAb005鼠/人源化抗体LCDR1
<400> 35
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Thr
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MAb005鼠/人源化抗体LCDR2
<400> 36
Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> MAb005鼠/人源化抗体LCDR3
<400> 37
Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 38
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Leu Met Ser
1 5 10
<210> 39
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 39
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 40
Gln Leu Tyr Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<400> 41
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Asn
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 42
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR3
<400> 43
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 44
Gln Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 45
Gln Leu Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 46
Gln Leu Tyr Ala Phe Asp Tyr
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR3
<400> 47
Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 48
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 48
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 49
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 49
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 50
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Asp
1 5
<210> 51
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 51
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<400> 52
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp Leu Asn
1 5 10
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 53
Ala Ala Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 54
Ala Ala Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr
<400> 55
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Xaa Met Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Thr或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Ser或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是Glu或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是Thr或Lys
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa是Val或Pro
<400> 56
Val Ala Xaa Ile Ser Gly Gly Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Gln、Leu、Met、Asn或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Leu、Gly、Lys、Gln、Met、Ser或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Tyr或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Tyr、Ala、Asp、Gly、Phe或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Phe、Ala、Asp、Glu、Ile、Lys、Met、Ser、Trp或Tyr
<400> 57
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr
1 5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Leu、Ala或Ser
<400> 58
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Xaa Met Ser
1 5 10
<210> 59
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Ser或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是Glu或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是Thr或Lys
<400> 59
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是Tyr、Gly、Phe或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Phe、Tyr或Ala
<400> 60
Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Asp Tyr
1 5
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是Thr或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Gly或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Thr或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Trp或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是Thr或Asn
<400> 61
Arg Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Leu Xaa
1 5 10
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Thr或Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Thr或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Ala、Gln或His
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Asp或Ser
<400> 62
Xaa Ala Xaa Ser Leu Xaa Xaa
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Val或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Ile或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Trp或Leu
<400> 63
Gln Gln Xaa Tyr Ser Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是Gly或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是Thr或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是Trp或Tyr
<400> 64
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa Leu Asn
1 5 10
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Gln或His
<400> 65
Ala Ala Ser Ser Leu Xaa Ser
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是Ile或Thr
<400> 66
Gln Gln Ser Tyr Ser Xaa Pro Trp Thr
1 5
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 67
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 68
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 68
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 69
Ala Ala Thr Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 70
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 70
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 71
Thr Ala Ser Ser Leu Gln Asp
1 5
<210> 72
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 72
Gln Leu Tyr Tyr Ala Asp Tyr
1 5
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 73
Thr Ala Ser Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<400> 74
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 75
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Ser
1 5 10
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<400> 76
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 77
Ala Ala Thr Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<400> 78
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 79
Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 80
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Pro Met Ser
1 5 10
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 81
Gln Leu Tyr Tyr Tyr Asp Tyr
1 5
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 82
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Tyr
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TCED+和HAF肽
<400> 83
Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 经过转化的TCED+和HAF肽
<400> 84
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LAF肽
<400> 85
Ile Gly Thr Trp Leu Thr Trp Tyr Gln
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 经过转化的LAF肽
<400> 86
Ile Ser Ser Trp Leu Asn Trp Tyr Gln
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HAF肽
<400> 87
Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Thr Ser Leu
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HAF肽
<400> 88
Leu Ile Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LAF肽
<400> 89
Ile Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LAF肽
<400> 90
Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LAF肽
<400> 91
Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
1 5
<210> 92
<211> 19
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 92
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 93
Arg Asp Glu Leu Thr
1 5
<210> 94
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 94
Arg Glu Glu Met
1
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 95
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Met Met Ser
1 5 10
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 96
Ser Tyr Met Met Ser
1 5
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 97
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 98
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Met
1 5
<210> 99
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 99
Ser Ser Tyr Met Met Ser
1 5
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 100
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 101
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 101
Ser Gly Gly Gly Ala Asn
1 5
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 102
Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr
1 5
<210> 103
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 103
Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 104
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 105
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 106
Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 107
Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 108
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 108
Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp
1 5
<210> 109
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 109
Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp
1 5
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 110
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Thr
1 5 10
<210> 111
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 111
Gln Thr Ile Gly Thr Trp
1 5
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 112
Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 113
Gly Thr Trp Leu Thr Trp Tyr
1 5
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 114
Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 115
Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 116
Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 117
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 117
Val Tyr Ser Ile Pro Trp
1 5
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 118
Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp
1 5
<210> 119
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 119
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Met Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 120
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD1-VH1 IGHV3-7
<400> 120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 121
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 121
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 122
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PD1-VL1 IGKV1-39
<400> 122
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<400> 123
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp Leu Thr
1 5 10
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<400> 124
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Trp Leu Asn
1 5 10
<210> 125
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<400> 125
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Thr
1 5 10
<210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<400> 126
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp Leu Thr
1 5 10
<210> 127
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR1
<400> 127
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 128
Ala Ala Ser Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 129
Ala Ala Thr Ser Leu Gln Asp
1 5
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 130
Thr Ala Thr Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR2
<400> 131
Thr Ala Thr Ser Leu Gln Asp
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR3
<400> 132
Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Leu Thr
1 5
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR3
<400> 133
Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Leu Thr
1 5
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性LCDR3
<400> 134
Gln Gln Val Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 135
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser
1 5 10
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 136
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Glu Met Ser
1 5 10
<210> 137
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 137
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Phe Met Ser
1 5 10
<210> 138
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 138
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 139
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 139
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr His Met Ser
1 5 10
<210> 140
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 140
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ile Met Ser
1 5 10
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 141
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Met Ser
1 5 10
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 142
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gln Met Ser
1 5 10
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 143
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser
1 5 10
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 144
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Ser
1 5 10
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 145
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser
1 5 10
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR1
<400> 146
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 147
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 147
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ala Glu Lys Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 148
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 148
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ala Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 149
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 149
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ala Glu Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 150
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 150
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ala Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 151
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 151
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Lys Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 152
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 152
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 153
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 153
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 154
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 154
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 155
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 155
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 156
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 156
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 157
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 157
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 158
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 158
Val Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 159
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 159
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Glu Lys Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 160
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 160
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Glu Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 161
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 161
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 162
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 162
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Glu Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 163
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 163
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 164
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR2
<400> 164
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Lys Tyr Tyr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 165
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 165
Leu Leu Tyr Tyr Glu Asp Tyr
1 5
<210> 166
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 166
Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Tyr
1 5
<210> 167
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 167
Asn Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 168
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 168
Gln Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 169
Gln Lys Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 170
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 170
Gln Leu His Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 171
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 171
Gln Leu Tyr Asp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 172
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 172
Gln Leu Tyr Met Phe Asp Tyr
1 5
<210> 173
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 173
Gln Leu Tyr Tyr Glu Asp Tyr
1 5
<210> 174
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 174
Gln Leu Tyr Tyr Ile Asp Tyr
1 5
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 175
Gln Leu Tyr Tyr Lys Asp Tyr
1 5
<210> 176
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 176
Gln Leu Tyr Tyr Met Asp Tyr
1 5
<210> 177
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 177
Gln Leu Tyr Tyr Ser Asp Tyr
1 5
<210> 178
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 178
Gln Leu Tyr Tyr Trp Asp Tyr
1 5
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 179
Gln Met Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 180
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 180
Gln Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 181
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 181
Gln Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 182
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗PD1抗体分子或抗原结合性HCDR3
<400> 182
Thr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5

Claims (41)

1.一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中
(a)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQID NO:43)的LCDR3；
(b)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQID NO:43)的LCDR3；
(c)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYFFDY(SEQ ID NO:45)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQID NO:43)的LCDR3；
(d)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QLYAFDY(SEQ ID NO:46)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQID NO:43)的LCDR3；
(e)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSETYYVDSVKG(SEQ ID NO:48)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSIPWT(SEQID NO:47)的LCDR3；
(f)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQD(SEQ ID NO:50)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQID NO:43)的LCDR3；
(g)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSETYYVDSVKG(SEQ ID NO:48)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSIPWT(SEQID NO:47)的LCDR3；
(h)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGAEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:49)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQD(SEQ ID NO:50)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQID NO:43)的LCDR3；
(i)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSNTYYVDSVKG(SEQ ID NO:51)的HCDR2和QLYGFDY(SEQ ID NO:40)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISTWLN(SEQ ID NO:52)的LCDR1、AASSLAS(SEQ ID NO:53)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQID NO:43)的LCDR3；
(j)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLHS(SEQ ID NO:54)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQID NO:43)的LCDR3；或者
(k)VH区氨基酸序列包括GFTFSSYLMS(SEQ ID NO:38)的HCDR1、VATISGGGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO:39)的HCDR2和QVYYFDY(SEQ ID NO:44)的HCDR3；并且VL区氨基酸序列包括RASQSISSWLN(SEQ ID NO:41)的LCDR1、AASSLQS(SEQ ID NO:42)的LCDR2和QQSYSTPWT(SEQID NO:43)的LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合部分，其中
(a)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:1，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:2；
(b)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:3，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:4；
(c)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:5，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:6；
(d)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:7，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:8；
(e)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:9，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:10；或者
(f)VH区氨基酸序列包括SEQ ID NO:11，并且VL区氨基酸序列包括SEQ ID NO:12。
3.一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包括重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述VH区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
(a)所述HCDR1包括氨基酸序列G-F-T-F-S-S-Y-X1-M-S，其中X1是L或任何其它氨基酸(SEQ ID NO:26)；
(b)所述HCDR2包括氨基酸序列X1-A-X2-I-S-G-G-G-X3-X4-X5-Y-Y-X6-D-S-V-K-G，其中X1是V或V的保守取代，X2是T或N，X3是A或S，X4是E或N，X5是T或K，并且X6是P或V(SEQ ID NO:27)；
(c)所述HCDR3包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-D-Y，其中X1是Q或任何其它氨基酸(例如，T、L、M或N)，X2是L或任何其它氨基酸(例如，G、K、M、Q、S或V)，X3是Y或Y的保守取代(例如，H)，X4是Y或任何其它氨基酸(例如，A、D、F、G、M、E、I、K、S或W)，并且X5是F或任何其它氨基酸(例如，A、D、E、I、K、M、S或W)(SEQ ID NO:28)；
(d)所述LCDR1包括氨基酸序列R-A-S-Q-S-I-X1-X2-X3-X4-X5，其中X1是S或S的保守取代，X2是S或S的保守取代，X3是Y或Y的保守取代，X4是L或L的保守取代，并且X5是N或T或N或T的保守取代(SEQ ID NO:32)；
(e)所述LCDR2包括氨基酸序列X1-A-X2-S-L-X3-X4，其中X1是A或T或A或T的保守取代，X2是S或S的保守取代，X3是Q或任何其它氨基酸，并且X4是S或任何其它氨基酸(SEQ ID NO:33)；并且
(f)所述LCDR3包括氨基酸序列Q-Q-X1-Y-S-X2-P-X3-T，其中X1是S或任何其它氨基酸，X2是T或任何其它氨基酸，并且X3是W或任何其它氨基酸(SEQ ID NO:34)。
4.一种抗PD1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分与根据权利要求1到3中任一项所述的抗体或抗原结合部分交叉竞争与PD1结合，并且
(a)包括完全种系人骨架氨基酸序列；
(b)与人PD1和食蟹猴PD1特异性结合；
(c)以低于260ng/ml的EC50拮抗人PD1与人PD-L1的结合；
(d)以低于32nM的KD与单体食蟹猴PD1结合；
(e)以低于6.5nM的EC50与食蟹猴PD1表达性细胞结合；
(f)与食蟹猴PD1和人PD1上的功能相同的表位结合；
(g)在LCDR2中包括具有高MHC II类结合亲和力的人种系肽序列；
(h)与包括抗体Mab005的可变结构域序列的抗PD1抗体包括的免疫原性肽的数量相比，包括的免疫原性肽的数量减少；
(i)与包括抗体Mab005的可变结构域序列的抗PD1抗体表现出的免疫原性相比，表现出的免疫原性降低；
(j)包括去免疫的VL区；
(k)不表现出与KDR、FZD5、ULBP2和EPHB6中的一个或多个的结合；
(l)不使KDR、FZD5、ULBP2和EPHB6中的一个或多个激动或使所述一个或多个最小程度地激动。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体是人的、人源化的或嵌合的。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述VH区、所述VL区或所述VH区和所述VL区两者包括一个或多个人骨架区氨基酸序列。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述VH区、所述VL区或所述VH区和所述VL区两者包括已经插入有所述CDR的人可变区骨架支架氨基酸序列。
8.根据权利要求1或3所述的抗体或抗原结合部分，其中所述VH区包括已经插入有HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的IGHV3-7人种系支架氨基酸序列。
9.根据权利要求1、3和8中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述VL区包括已经插入有LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的IGKV1-39人种系支架氨基酸序列。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体包括免疫球蛋白恒定区。
11.根据权利要求10所述的抗体或抗原结合部分，其中所述免疫球蛋白恒定区是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY。
12.根据权利要求11所述的抗体或抗原结合部分，其中所述免疫球蛋白恒定区是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。
13.根据权利要求10所述的抗体或抗原结合部分，其中所述免疫球蛋白恒定区是免疫惰性的。
14.根据权利要求10所述的抗体或抗原结合部分，其中所述免疫球蛋白恒定区是野生型人IgG4恒定区、包括氨基酸取代S228P的人IgG4恒定区、野生型人IgG1恒定区、包括氨基酸取代L234A、L235A和G237A的人IgG1恒定区或野生型人IgG2恒定区。
15.根据权利要求13所述的抗体或抗原结合部分，其中所述免疫球蛋白恒定区包括SEQID NO:13-19中的任一个。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、scFv、单结构域抗体(dAb)、大抗体、微型抗体、胞内抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、v-NAR或双-scFv。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体是单克隆的。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体是四聚体抗体、四价抗体或多特异性抗体。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体是与第一抗原和第二抗原特异性结合的双特异性抗体，其中所述第一抗原是PD1并且所述第二抗原不是PD1。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分与(a)人PD1或(b)人PD1和食蟹猴PD1特异性结合。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分呈IgG1形式，并且其中所述抗原结合部分的熔融温度(Tm)为约90℃到约93℃。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中与包括人源化抗体Mab005的可变结构域序列的抗PD1抗体相比，所述抗体或抗原结合部分经历的暴露氨基酸残基的氧化减少。
23.一种免疫缀合物，其包括与治疗剂连接的根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或抗原结合部分。
24.根据权利要求23所述的免疫缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒素、放射性同位素、化学治疗剂、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促凋亡剂、细胞生长抑制酶、细胞溶解酶、治疗性核酸、抗血管生成剂、抗增殖剂或促凋亡剂。
25.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或抗原结合部分或根据权利要求23或24所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
26.一种核酸分子，其对根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或抗原结合部分的以下进行编码：
(a)VH区氨基酸序列；
(b)VL区氨基酸序列；或者
(c)VH氨基酸序列和VL区氨基酸序列两者。
27.一种表达载体，其包括根据权利要求26所述的核酸分子。
28.一种重组宿主细胞，其包括根据权利要求26所述的核酸分子或根据权利要求27所述的表达载体。
29.一种产生抗PD1抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：
将包括根据权利要求27所述的表达载体的重组宿主细胞在使所述核酸分子得到表达的条件下培养，由此产生所述抗体或抗原结合部分；以及
从所述宿主细胞或培养物中分离所述抗体或抗原结合部分。
30.一种用于增强受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或抗原结合部分、根据权利要求23或24所述的免疫缀合物或根据权利要求25所述的药物组合物。
31.一种治疗或预防受试者的癌症、传染病或免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或抗原结合部分、根据权利要求23或24所述的免疫缀合物或根据权利要求25所述的药物组合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、周围神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤或血液组织癌。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述传染病是病毒性的、细菌性的、真菌性的或寄生虫性的。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述传染病是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。
35.根据权利要求30到34中任一项所述的方法，其中所述抗体分子、所述抗原结合部分、所述免疫缀合物或所述药物组合物的施用不会诱导受试者的血管瘤或诱导受试者的最小程度的血管瘤。
36.根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或抗原结合部分、根据权利要求23或24所述的免疫缀合物或根据权利要求25所述的药物组合物，其用于治疗癌症、传染病或免疫性疾病。
37.根据权利要求36所述的供使用的抗体或抗原结合部分、免疫缀合物或药物组合物，其中所述癌症是胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、周围神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤或血液组织癌。
38.根据权利要求36所述的供使用的抗体或抗原结合部分、免疫缀合物或药物组合物，其中所述传染病是病毒性的、细菌性的、真菌性的或寄生虫性的。
39.根据权利要求36所述的供使用的抗体或抗原结合部分、免疫缀合物或药物组合物，其中所述传染病是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。
40.根据权利要求36所述的供使用的抗体或抗原结合部分、免疫缀合物或药物组合物，其中在治疗癌症、传染病或免疫性疾病中使用所述抗体或抗原结合部分、所述免疫缀合物或所述药物组合物不会诱导血管瘤或诱导最小程度的血管瘤。
41.根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或抗原结合部分、根据权利要求23或24所述的免疫缀合物或根据权利要求25所述的药物组合物，其用作药剂。
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