CN111808890A - 利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法 - Google Patents

利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111808890A
CN111808890A CN202010518836.6A CN202010518836A CN111808890A CN 111808890 A CN111808890 A CN 111808890A CN 202010518836 A CN202010518836 A CN 202010518836A CN 111808890 A CN111808890 A CN 111808890A
Authority
CN
China
Prior art keywords
livestock
antibiotics
anaerobic fermentation
microorganisms
inoculum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202010518836.6A
Other languages
English (en)
Inventor
不公告发明人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiaxing Juetuo Technology Co ltd
Original Assignee
Jiaxing Juetuo Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiaxing Juetuo Technology Co ltd filed Critical Jiaxing Juetuo Technology Co ltd
Priority to CN202010518836.6A priority Critical patent/CN111808890A/zh
Publication of CN111808890A publication Critical patent/CN111808890A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/023—Methane
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/59—Biological synthesis; Biological purification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Processing Of Solid Wastes (AREA)

Abstract

本发明提供利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法，属于可再生能源开发利用与环境保护技术领域，包括收集抗生素污染的畜禽粪便和农作物废弃物；将粉碎后的农作物废弃物和经过处理的畜禽粪便按照一定比例混合后，调节含水量至总固体的质量分数为7.2‑8.8％，加入接种物，搅拌均匀，中温厌氧发酵5‑8d后，加入外源添加剂，搅拌均匀，继续中温厌氧发酵25‑35天；该外源添加剂包括复合菌剂和促进剂；该促进剂包括胞苷‑5’‑二磷酸胆碱钠盐和2‑羟基柠檬酸。本发明提供的利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法具有抗生素去除率高、资源化利用率高、周期短、绿色环保的优点。

Description

利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法
技术领域
本发明属于可再生能源开发利用与环境保护技术领域，具体涉及利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法。
背景技术
厌氧发酵又称为厌氧消化或厌氧生物处理，是指在厌氧条件下，发酵原料(畜禽粪便、农作物秸秆、生活垃圾等)在厌氧微生物的共同作用下，通过生物化学反应分解生成CH4和CO2的过程。沼气是一种由CH4、CO2和少量的N2、H2等混合而成的可燃性气体。1m3沼气的热值约为23MJ(标准状况下)，其中1m3 CH4的高位热值为39MJ、低位热值为35.9MJ(标准状况下)，由此可看出，沼气作为一种可再生气体燃料，热值足够高，可以充分应用在生产生活的各个领域当中。目前，我国农业畜牧业目前正处于高速发展、提高水平的关键时期，动物因为养殖数量的大量增长，疾病的发生频率越来越高，病情也越来越复杂，这使得抗生素在防治动物疾病陷入使用频率和数量私自加大的误区。由于我国畜牧业从业人员专业素质参差不齐，很多人为了追求短期高效经济利益，不遵循科学使用方法而过度滥用抗生素，造成了动物体内大量的抗生素不能被利用，食用含有兽用抗生素的肉类后会严重危害身体健康；还有部分抗生素随粪便、尿液排出体外污染土壤和大气环境，抗生素随之走入大众视线。近些年来，很多学者开始研究抗生素对厌氧发酵的作用，发现抗生素对厌氧发酵的抑制作用明显且持续时间较长。
现有技术如公开号为CN 108503399 A的中国发明专利，公开了一种高效去除畜禽粪便中抗生素的处理方法，包括如下步骤：采集新鲜畜禽粪便，粪便经过冷冻干燥，过筛，测定抗生素含量；将粉碎后的农作物废弃物和经过处理的新鲜畜禽粪便按照一定比例的重量百分比混合后，加入接种物进行厌氧发酵10～20天；厌氧发酵产生的沼气作为生活用气，物料经分离得到沼渣；使用沼渣混入一定比例的农作物废弃物和经过处理的新鲜畜禽粪便，进行高温好氧堆肥10～20天，得到沼渣有机肥。该发明经过厌氧发酵和高温堆肥实现高效去除畜禽粪便中残留的抗生素，并且得到沼气和沼渣有机肥产品等副产品，是对农业废弃物安全、高效的再利用，拓展了农业废弃物的产业链，延长了资源利用节，是对农业循环经济的有力推动。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗生素去除率高、资源化利用率高、周期短、绿色环保的利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法，包括以下步骤：
S1、收集抗生素污染的畜禽粪便和农作物废弃物，将农作物废弃物风干后粉碎；
S2、将粉碎后的农作物废弃物和经过处理的畜禽粪便按照一定比例混合后，调节含水量至总固体的质量分数为7.2-8.8％，加入接种物，搅拌均匀，中温厌氧发酵5-8d后，加入外源添加剂，搅拌均匀，继续中温厌氧发酵25-35天；
上述外源添加剂包括复合菌剂和促进剂；
上述复合菌剂包括假单胞菌、屎肠球菌、鞘氨醇单胞菌、节杆菌、产碱菌；
上述促进剂包括胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸。胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸按一定的比例组合后，能够提高厌氧发酵过程中纤维素酶活性，为抗生素降解菌的生长提供能量，同时能够促进抗生素降解菌分泌胞外聚合物，增强细菌与抗生素之间的静电引力或氢键作用，便于降解菌对抗生素进行生物降解，提高抗生素的生物降解量，进而减少抗生素对厌氧发酵的抑制作用，提高沼气产量。
优选地，上述步骤S2中粉碎的农作物废弃物和畜禽粪便的质量比例为2:3-5。
优选地，上述复合菌剂中假单胞菌、屎肠球菌、鞘氨醇单胞菌、节杆菌、产碱菌的菌数比为5:14:12:16:17。
优选地，上述促进剂中胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸的质量比为2.2-2.8:1。
优选地，上述抗生素包括磺胺类、喹诺酮类、四环素、土霉素、金霉素中的一种或多种。
优选地，上述步骤S2中接种物加入的同时还加入3-羟基犬尿氨酸。3-羟基犬尿氨酸能够降低厌氧发酵初期抗生素对发酵相关微生物代谢活性的影响，能够提高厌氧发酵过程中对挥发性脂肪酸的利用，减少挥发性脂肪酸的积累，加快发酵初期甲烷的产生速度，进而提高总产气量。
优选地，上述3-羟基犬尿氨酸的加入量为接种物的2.8-3.5％(m/m)。
本发明还提供一种利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法在畜禽养殖废弃物无害化处理中的用途。
本发明由于采用了由胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸按照2.2-2.8:1质量比组合制成的促进剂，因而具有如下有益效果：能够提高厌氧发酵过程中纤维素酶活性，为抗生素降解菌的生长提供能量，同时能够促进抗生素降解菌分泌胞外聚合物，增强细菌与抗生素之间的静电引力或氢键作用，便于降解菌对抗生素进行生物降解，提高抗生素的生物降解量，进而减少抗生素对厌氧发酵的抑制作用，提高沼气产量。
本发明由于采用了在发酵初期加入3-羟基犬尿氨酸，因而具有如下有益效果：能够降低厌氧发酵初期抗生素对发酵相关微生物代谢活性的影响，能够提高厌氧发酵过程中对挥发性脂肪酸的利用，减少挥发性脂肪酸的积累，加快发酵初期甲烷的产生速度，进而提高总产气量。
因而，本发明是一种抗生素去除率高、资源化利用率高、周期短、绿色环保的利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法。
附图说明
图1为本发明试验例1中纤维素酶活性的测定结果；
图2为本发明试验例1中胞外多聚物含量的测定结果；
图3为本发明试验例1中沼渣、沼液中抗生素含量的测定结果；
图4为本发明试验例1中抗生素降解率的测定结果；
图5为本发明试验例2中AWCD的测定结果；
图6为本发明试验例2中挥发性脂肪酸的测定结果；
图7为本发明试验例2中甲烷产气速率的测定结果；
图8为本发明试验例2中累积产气量的测定结果。
具体实施方式
除非另外说明，本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以整体援引的方式并入本文中，如同将其全文进行阐述。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。在相抵触的情况下，则以本说明书中的定义为准。
当以范围、优选范围或一系列上限优选值和下限优选值给出数量、浓度或其他数值或参数时，应理解其具体公开了由任何较大的范围限制或优选值和任何较小的范围限制或优选值的任何一对数值所形成的所有范围，而无论这些范围是否分别被公开。例如，当描述“1至5”的范围时，所描述的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。除非另有说明，在本文描述数值范围之处，所述的范围意图包括范围端值和范围内的所有整数和分数。
另外，在本发明的要素或组分之前的词语“一”和“一种”意图表示对于该要素或组分的出现(即发生)次数没有限制性。因此，“一”或“一种”应理解为包括一种或至少一种，除非明确表示数量为单数，否则单数形式的所述要素或组分也包括复数的情况。
本发明的实施方式，包括在发明内容部分中所述本发明的实施方式以及本文下述的任何其他的实施方式，均可任意地进行组合。
以下详述本发明。
提供一种利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法，包括以下步骤：
S1、收集抗生素污染的畜禽粪便和农作物废弃物，将农作物废弃物风干后粉碎；
S2、将粉碎后的农作物废弃物和经过处理的畜禽粪便按照一定比例混合后，调节含水量至总固体的质量分数为7.2-8.8％，加入接种物，搅拌均匀，中温厌氧发酵5-8d后，加入外源添加剂，搅拌均匀，继续中温厌氧发酵25-35天；
上述外源添加剂包括复合菌剂和促进剂；
上述复合菌剂包括假单胞菌、屎肠球菌、鞘氨醇单胞菌、节杆菌、产碱菌；
上述促进剂包括胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸。更为优选地，上述复合菌剂的加入量为120-300g/kg，上述促进剂的加入量为4.3-5.8mg/kg。胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸按2.2-2.8:1的比例组合后，能够提高厌氧发酵过程中纤维素酶活性，为抗生素降解菌的生长提供能量，同时能够促进抗生素降解菌分泌胞外聚合物，增强细菌与抗生素之间的静电引力或氢键作用，便于降解菌对抗生素进行生物降解，提高抗生素的生物降解量，进而减少抗生素对厌氧发酵的抑制作用，提高沼气产量。
优选地，上述步骤S2中粉碎的农作物废弃物和畜禽粪便的质量比例为2:3-5。
优选地，上述步骤S2中接种物为沼液。
更为优选地，上述沼液的加入量为20％-30％(m/m)。
优选地，上述复合菌剂中假单胞菌、屎肠球菌、鞘氨醇单胞菌、节杆菌、产碱菌的菌数比为5:14:12:16:17。
优选地，上述促进剂中胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸的质量比为2.2-2.8:1。
优选地，上述抗生素包括磺胺类、喹诺酮类、四环素、土霉素、金霉素中的一种或多种，更为优选地，上述抗生素为磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星、土霉素中的一种或多种。
优选地，上述步骤S2中接种物的加入同时还加入3-羟基犬尿氨酸。3-羟基犬尿氨酸能够降低厌氧发酵初期抗生素对发酵相关微生物代谢活性的影响，能够提高厌氧发酵过程中对挥发性脂肪酸的利用，减少挥发性脂肪酸的积累，加快发酵初期甲烷的产生速度，进而提高总产气量。
优选地，上述3-羟基犬尿氨酸的加入量为接种物的0.28-0.35％(m/m)。
本发明还提供一种利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法在畜禽养殖废弃物无害化处理中的用途。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
1、一种复合菌剂的制备方法，包括：假单胞菌、屎肠球菌、鞘氨醇单胞菌、节杆菌、产碱菌，
菌株来源：屎肠球菌(Enterococcus Faecium)DTC7，保藏编号为：CCTCC NO:M2017665；假单胞菌(Pseudomonas sp.)，保藏编号为：ACCC 11715；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)，保藏编号为：ACCC 11703；节杆菌(Arthrobacter sp.)，保藏编号为CGMCC 15055；产碱菌(Alcaligenes sp.)，保藏编号为CGMCC 15053。
分别将上述菌株的单菌落接种到50mL的液体LB培养基中活化培养，30℃，180rpm，培养24小时，将活化培养好的菌种接种500mL液体LB培养基到进行扩大培养，30℃，180rpm，培养至菌含量达到≧1010个/mL；扩大培养结束后，将分别扩大培养得到的单菌种的发酵菌液经脱水干燥，获得上述5种菌种的菌体干粉；将5种菌株的菌体干粉均匀混合，得到多菌体复合菌粉；该多菌体复合菌粉中，各活体菌数的比例如下：假单胞菌：屎肠球菌：鞘氨醇单胞菌：节杆菌：产碱菌＝5:14:12:16:17。
2、一种利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法，包括以下步骤：
S1、收集猪粪和风干粉碎的秸秆，猪粪的理化性质为：总固体含量为24.3％(m/m)，挥发性固体79.9％(m/m)，总有机碳34.6％(m/m)，总氮2.01％(m/m)；稻秸的理化性质为：总固体含量为91.8％(m/m)，挥发性固体76.8％(m/m)，总有机碳51.2％(m/m)，总氮0.65％(m/m)。
S2、将400g猪粪和200g粉碎的稻秸添加到发酵罐中，加水调节发酵罐的总固体质量分数为8.6％，将80mg/kg恩诺沙星溶液、80mg/kg磺胺二甲嘧啶溶液、80mg/kg土霉素溶液与发酵料液充分均匀混合，接种沼液816g，沼液的理化性质为：总固体含量为17.8％(m/m)，挥发性固体50.9％(m/m)，总有机碳41.3％(m/m)，总氮0.31％(m/m)，搅拌混匀后，将发酵罐密封，在避光处35℃厌氧发酵5d，后加入392g上述制备的复合菌剂，并加入15.7mg促进剂(11.3mg胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和4.4mg 2-羟基柠檬酸)，搅拌均匀，35℃避光厌氧发酵35d。
实施例2：
厌氧发酵5d后加入15.7mg促进剂，促进剂中包括10.1mg胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和5.6mg2-羟基柠檬酸，其余部分和实施例1完全一致。
实施例3：
厌氧发酵5d后加入15.7mg促进剂，促进剂中包括12mg胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和3.7mg2-羟基柠檬酸，其余部分和实施例1完全一致。
实施例4：
厌氧发酵5d后加入16.6mg促进剂，促进剂中包括12mg胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和4.6mg2-羟基柠檬酸，其余部分和实施例1完全一致。
实施例5：
厌氧发酵5d后加入14mg促进剂，促进剂中包括10.1mg胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和3.9mg2-羟基柠檬酸，其余部分和实施例1完全一致。
实施例6：
厌氧发酵5d后未加入促进剂，其余部分和实施例1完全一致。
实施例7：
接种沼液时还加入3-羟基犬尿氨酸2.53g，其余部分和实施例1完全一致。
实施例8：
接种沼液时还加入3-羟基犬尿氨酸2.53g，其余部分和实施例6完全一致。
试验例1：
1.1纤维素酶活性测定：本试验纤维素酶活性采用比色法进行测定。所用试剂包括1％羧甲基纤维素溶液、甲苯、pH5.5磷酸盐缓冲液、3,5-二硝基水杨酸溶液、葡萄糖标准溶液，并绘制标准曲线。取发酵5、10、20、40d的发酵样品进行测定，纤维素酶活性以72h后1mL样品生成葡萄糖的质量表示(mg·g-1·d-1)。纤维素酶活性的测定结果见图1。
1.2胞外聚合物(EPS)含量的检测：分别取上述活化后的假单胞菌、屎肠球菌、鞘氨醇单胞菌、节杆菌、产碱菌菌株培养液10mL接种至500mL LB液体培养基中培养，30℃，180rpm，培养48小时，以加入1.73mg胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和0.67mg 2-羟基柠檬酸的作为A组，以加入1.54mg胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和0.86mg 2-羟基柠檬酸的作为B组，以加入1.83mg胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和0.57mg 2-羟基柠檬酸的作为C组，以加入1.83mg胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和0.7mg 2-羟基柠檬酸的作为D组，以加入1.54mg胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和0.59mg 2-羟基柠檬酸的作为E组，设置未加胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸的空白组。取细菌培养液，4℃，10000×g离心10min，取沉淀，用超纯水悬浮，60℃温水浴30min，4℃，10000×g离心10min，取上清，用0.45μm的膜过滤，进行检测，细菌胞外多聚物主要包括蛋白质和多糖，所以本文中主要检测胞外多聚物中蛋白质和多糖的含量。用Bradford的方法检测蛋白质的含量，用苯酚-硫酸法检测多糖的含量。以多糖和蛋白质的含量之和表示胞外多聚物的含量。胞外多聚物含量的测定结果见图2。
1.3抗生素的检测：对厌氧发酵第1d、5d、15d、25d、35d、40d的发酵物进行多点取样法取样，样品首先固液分离，提取和净化方法为：①沼液经0.45μm玻璃纤维滤膜过滤，取2.0mL加入10μL内标以及0.4g EDTA，并立即储存在4℃。用甲酸调节提取液至pH2.5，过经过活化的HLB固相萃取柱，控制流速为5mL/min。之后用超纯水冲洗HLB柱，抽真以去除柱中残留水分，然后将HLB柱在氮气保护下干燥10min。最后以2mL甲醇洗脱3次，收集洗脱液，并在室温下用氮气吹至近干，用乙腈-0.2％甲酸(1:9,v/v)混合液定容至1mL，涡旋振荡2min，18000rpm离心10min，取上清液待分析；②沼渣置于-40℃冷冻一周后，使用冷冻干燥仪进行干燥。研磨干燥沼渣，过250μm孔径尼龙筛，置于-40℃存放。准确称取5g研磨样品于50mL离心管中，加入10μL内标物质，并加入0.4g EDTA以及混合提取液(磷酸盐缓冲液(pH＝3)-乙腈,1:1，v/v)30mL，涡旋振荡2min，超声提取20min，4℃下8000rpm离心8min，收集上层提取液。反复提取2次后，合并提取液并混匀。用旋转蒸发仪旋蒸(220Pa,50℃)提取液，直至剩余30mL以下，用蒸馏水稀释到200mL，用甲酸调至pH2.5，之后过0.45μm玻璃纤维微孔滤膜。提取液用SAX-HLB串联固相萃取柱净化与富集，过柱完成后去除SAX柱，其余处理过程与液体方法相同。
1.3.1恩诺沙星的检测：样品预处理过程中所用内标物质为恩诺沙星标准品，利用高效液相色谱法测定厌氧发酵不同时期的恩诺沙星浓度。HPLC测定条件：检测器Agilentl200高效液相色谱仪，流动相为：乙腈：005mol/L磷酸溶液(v/v＝18:85)；流速：1mL/min；柱温：35℃；色谱柱：Symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。
1.3.2磺胺二甲嘧啶的检测：样品预处理过程中所用内标物质为磺胺二甲嘧啶标准品，利用液质联用法测定厌氧发酵不同时期的磺胺二甲嘧啶浓度。利用ACQUITYTM超高效液相色谱仪Quattro Premier XE质谱仪，配MassLynx V.4.1软件Waters Acquity和UPLCBEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)，质谱条件：电喷雾离子源，离子源温度120℃，脱溶剂温度380℃，脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂气流速500L/h，锥孔气流速50L/h，碰撞气为高纯氩气，采用多反应监测模式检测，ESI-MS/MS选择性反应正离子源检测，进样量5μL。HPLC测定条件：柱温35℃，流动相为乙腈(A)和0.2％(v/v)甲酸(B)，0.4mL/min。
1.3.3土霉素的检测：样品预处理过程中所用内标物质为土霉素标准品，利用高效液相色谱法测定厌氧发酵不同时期的土霉素浓度。HPLC测定条件：色谱条件为：戴安P680型高效液相色谱仪；C18色谱柱(XTerra RP18；5μm,4.6×250mm；Waters)；流动相为：乙腈：0.01MNaH2PO4溶液(V:V＝22:78)；流速：0.8mL·min-1；进样量：20μL；柱温：35℃。沼渣、沼液中抗生素含量的测定结果见图3。抗生素的降解率的测定结果见图4。
由图1可以看出，与实施例2、实施例3、实施例6相比，实施例1、实施例4、实施例5发酵液中的纤维素酶活性明显较高，且实施例2、实施例3、实施例6发酵液中的纤维素酶活性无明显差别，与实施例8相比，实施例7发酵液中的纤维素酶活性明显较高；由图2可以看出，A组、D组、E组中各菌的胞外聚合物含量均明显大于B组、C组、空白组，且B组、C组、空白组中各菌的胞外聚合物含量无明显差别；由图3可以看出，实施例1、实施例4、实施例5发酵后的沼液和沼渣中各抗生素的残留量均明显低于实施例2、实施例3、实施例6，且实施例2、实施例3、实施例6发酵后的沼液和沼渣中各抗生素的残留量的无明显差别，由图4可以看出，实施例1、实施例4、实施例5发酵后抗生素的去除率明显大于实施例2、实施例3、实施例6，且实施例2、实施例3、实施例6发酵后抗生素的去除率无明显差别，这说明，胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸按2.2-2.8:1的质量比例组合后，能够提高厌氧发酵过程中纤维素酶活性，为抗生素降解菌的生长提供能量，同时能够促进抗生素降解菌分泌胞外聚合物，增强细菌与抗生素之间的静电引力或氢键作用，便于降解菌对抗生素进行生物降解，提高抗生素的生物降解量。
试验例2：
2.1微生物代谢活性的测定：(1)接种液制备：使用厌氧发酵第5d的发酵液样品进行分析。将装有配好的0.85％NaCl溶液三角瓶及实验过程中所需要的培养皿、BIOLOG枪头及三角瓶放入高温灭菌锅中进行1小时灭菌。用移液枪吸取5mL发酵液置于45mL 0.85％NaCl无菌溶液的三角瓶中，在摇床中震荡30min(200r/min)混匀。在超净工作台上，采用10倍稀释法，用0.85％NaCl无菌溶液将其稀释至浓度为10-3。(2)接种；将BIOLOG-ECO生态板预热至25℃，用八通道移液器将备好的微生物悬浮液接种在BIOLOG-ECO生态板中，每孔150μL，在板侧面写好时间和样品编号。(3)培养：将接种的ECO生态板放入密闭的玻璃干燥器中，点燃干燥器中的蜡烛，使其燃烧耗尽干燥器中的氧气，人工创造厌氧发酵环境，将干燥器放置在室温下连续培养240h，每天在相同时间用微平板读数器在590nm处读数一次。(4)计算：微生物代谢强度用颜色平均变化率(AWCD)来表示。
AWCD＝∑(Ci-R)/n
式中：Ci-第i个非对照孔的吸光度值，R-对照孔的吸光度值(Ci-R﹤0的孔，计算中记为0，即:Ci-R≧0)，n-培养基碳源种类数量。AWCD的测定结果见图5。
2.2挥发性脂肪酸的测定：厌氧发酵基质搅拌混匀后立即采集作为第0天的样品，随后分别在第3、5天分别采集10毫升样品，将发酵样品转移到离心管中，以5000rpm离心15分钟。单独保存上清液用于挥发性脂肪酸(VFAs)的测定。挥发性脂肪酸(VFA)：采用气相色谱仪，FID检测器，程序升温，Stabil-Wax-DA毛细管柱(30.0mm×0.53mm,1.0μm)，高纯N2为载气，总流量30mL/min，柱流量10mL/min，柱温为60℃。进样口温度为150℃，检测器温度为230℃，进样量1.0μL。挥发性脂肪酸的测定结果见图6。
2.3甲烷产气速率的测定：测定气体甲烷含量采用气相色谱仪(TCD检测器)，柱箱温度150℃，检测器温度100℃，载气为高纯氢。从厌氧发酵启动的第2d起，每天定时测量并记录甲烷日产气量。甲烷产气速率的测定结果见图7。
由图5可以看出，实施例7厌氧发酵第5d的发酵液的AWCD明显大于实施例1，实施例8厌氧发酵第5d的发酵液的AWCD明显大于实施例6；由图6可以看出，实施例7厌氧发酵液中挥发性脂肪酸明显小于实施例1，实施例8厌氧发酵液中挥发性脂肪酸明显小于实施例6；由图7可以看出，在厌氧发酵初期，发酵环境不适宜微生物进行生命活动，实施例7发酵5-12d内甲烷产气速率明显大于实施例1，实施例8发酵5-12d内甲烷产气速率明显大于实施例6，这说明，3-羟基犬尿氨酸能够降低厌氧发酵初期抗生素对发酵相关微生物代谢活性的影响，能够提高厌氧发酵过程中对挥发性脂肪酸的利用，减少挥发性脂肪酸的积累，加快发酵初期甲烷的产生速度。
试验例3：
沼气含量的测定：利用排水集气法收集沼气，排出的水的体积即为产生沼气气体的体积，从厌氧发酵启动的第2d起，每天定时测量并记录产气速率，并计算累积产气量。累积产气量的测定结果见图8。
由图8可以看出，与实施例2、实施例3、实施例6相比，实施例1、实施例4、实施例5累积产气量明显较高，且实施例2、实施例3、实施例6累积产气量无明显差别，与实施例8相比，实施例7发酵液中的累积产气量明显较高，这说明，胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸按2.2-2.8:1的质量比例组合后，能够提高抗生素的生物降解量，进而降低抗生素对厌氧发酵的抑制作用，提高沼气产量。
另由图8可以看出，实施例7累积产气量明显大于实施例1，实施例8累积产气量明显大于实施例6，这说明，3-羟基犬尿氨酸能够加快发酵初期甲烷的产生速度，进而提高总产气量。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (8)

1.一种利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、收集抗生素污染的畜禽粪便和农作物废弃物，将农作物废弃物风干后粉碎；
S2、将粉碎后的农作物废弃物和经过处理的畜禽粪便按照一定比例混合后，调节含水量至总固体的质量分数为7.2-8.8％，加入接种物，搅拌均匀，中温厌氧发酵5-8d后，加入外源添加剂，搅拌均匀，继续中温厌氧发酵25-35天；
所述外源添加剂包括复合菌剂和促进剂；
所述复合菌剂包括假单胞菌、屎肠球菌、鞘氨醇单胞菌、节杆菌、产碱菌；
所述促进剂包括胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述农作物废弃物和畜禽粪便的质量比例为2:3-5，优选质量比例为1:2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述假单胞菌、屎肠球菌、鞘氨醇单胞菌、节杆菌、产碱菌的菌数比为5:14:12:16:17。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述胞苷-5’-二磷酸胆碱钠盐和2-羟基柠檬酸的质量比为2.2-2.8:1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抗生素包括磺胺类、喹诺酮类、四环素、土霉素、金霉素中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：加入所述接种物的同时加入3-羟基犬尿氨酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述3-羟基犬尿氨酸的加入量为接种物的2.8-3.5％(m/m)。
8.权利要求1-7任一项中所述的一种利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法在畜禽养殖废弃物无害化处理中的用途。
CN202010518836.6A 2020-06-09 2020-06-09 利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法 Withdrawn CN111808890A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010518836.6A CN111808890A (zh) 2020-06-09 2020-06-09 利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010518836.6A CN111808890A (zh) 2020-06-09 2020-06-09 利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111808890A true CN111808890A (zh) 2020-10-23

Family

ID=72845655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010518836.6A Withdrawn CN111808890A (zh) 2020-06-09 2020-06-09 利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111808890A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117362079A (zh) * 2023-11-08 2024-01-09 宁夏沃滴滴水肥科技有限公司 一种含抗生素的生物液态肥生产工艺

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117362079A (zh) * 2023-11-08 2024-01-09 宁夏沃滴滴水肥科技有限公司 一种含抗生素的生物液态肥生产工艺

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dao et al. Enhanced microalgae growth through stimulated secretion of indole acetic acid by symbiotic bacteria
CN109439570B (zh) 一株解磷假单胞菌及其应用
CN109402015B (zh) 一株热噬淀粉芽孢杆菌及其应用
Schatzmayr et al. Investigation of different yeast strains for the detoxification of ochratoxin A
CN109022327B (zh) 一种微生物混合菌剂的制备方法及在高温堆肥中的应用
Kumar et al. A note on stimulation of biogas production from cattle dung by addition of charcoal
CN110564640B (zh) 一株用于降解黄曲霉毒素b1的暹罗芽孢杆菌wf2019菌株及其应用
CN107435031B (zh) 一种生活垃圾降解复合菌及其应用
CN110981563B (zh) 一种抗生素菌渣的处理方法及其应用
CN111808890A (zh) 利用微生物高效降解畜禽养殖废弃物中抗生素的方法
CN113046262B (zh) 寡养单胞菌Stenotrophomonas-CAULIU-1及其应用
CN118126869A (zh) 枯草芽孢杆菌bs-22株及其应用
Rath et al. Microbial activity during composting and plant growth impact: a review
CN114807109B (zh) 一种基于有机物梯级转化人粪便pplc的高效堆肥菌剂及其制备方法与应用
CN113621537B (zh) 用于降解苯乙酸的新菌株bd-1及其应用
CN114921356B (zh) 家用型厨余垃圾好氧堆肥复合微生物菌剂及其制备方法
CN112813010B (zh) 芽孢杆菌Bacillus-CAULIU-1及其应用
CN110042063B (zh) 一种粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)菌株YZC3及其应用
CN111154679B (zh) 一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法
CN114149944A (zh) 末端高效吸附恶臭气体的微生物组合、强化定殖及应用
CN101514332B (zh) 一种提高微生物菌种繁殖速度的方法
CN110684684A (zh) 一株耐高温生防链霉菌及其应用
CN112662602B (zh) 一种有机固废高温好氧生物减量菌种及其应用
CN116676212B (zh) 一株Brevibacillus aydinogluensis PMBT001及其应用
CN116574644B (zh) 一株Parageobacillus toebii PMBT002及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20201023

WW01 Invention patent application withdrawn after publication