CN111808787B - 一种提高生孢梭菌芽孢萌发率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品科学技术领域，特别涉及一种提高生孢梭菌芽孢萌发率的方法。将活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液于70℃‑90℃的水浴中处理5‑25min，活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液的pH值为4‑7。本发明提供了一种生孢梭菌芽孢高萌发率的方法，利用该方法诱导生孢梭菌芽孢高效率萌发，以便于研究人员进行低强度条件下灭杀厌氧性梭状芽孢杆菌属研究的进行，从而解决高温灭杀给低酸性罐头食品风味和营养带来的负面影响。

Description

一种提高生孢梭菌芽孢萌发率的方法
技术领域
本发明属于食品科学技术领域，特别涉及一种提高生孢梭菌芽孢萌发率的方法。
背景技术
肉毒梭状芽孢杆菌是低酸性罐头食品中危害最大的微生物之一，属于厌氧性梭状芽孢杆菌属，为革兰氏阳性菌，专性厌氧生长，最常用的杀菌方式是高温高压杀菌。但由于杀菌方法温度高、时间长，不仅会导致食物因产生“蒸煮味”而口感变差，也容易导致营养物质被破坏。随着食品工业的发展，高温高压等杀菌方法正在被改进。同时，找到肉毒梭状芽孢杆菌低强度的杀菌方式是低酸性罐头食品杀菌问题中的关键点和难点。但肉毒梭状芽孢杆菌属于高致病性病原微生物，对研究人员的生命安全存在一定威胁。
生孢梭菌的性质和特征与肉毒梭状芽孢杆菌非常相似，所以常作为实验室中肉毒梭状芽孢杆菌的替代菌进行研究。生孢梭菌是典型的严格厌氧型细菌，为梭状芽孢杆菌属，是不产毒素的蛋白水解型肉毒梭菌B、E和F种的研究替代菌，本身也能引起食品的腐败。生孢梭菌个体生长到一定阶段，受到营养缺乏、环境胁迫等因素的刺激会产生芽孢，芽孢可能呈圆形或是椭圆形，直径大于菌体直径，会使整个菌体呈梭形。芽孢由外壁、芽孢衣、外膜、皮层、细胞壁、内膜和内核等结构组成，如附图1所示。芽孢可以长时间保持休眠状态，但一旦遇到适宜的环境，即芽孢在探测到外界有适宜萌发条件时就会开始萌发，芽孢就能迅速萌发成为具有代谢功能的营养细胞，从而降低对外界刺激的耐受力，它对高温、高静压、干燥、辐射、低温等条件都具有极强的抗逆性。特别是芽孢的热抵抗力很强，干热180℃，5～15min或高压蒸汽121℃，30min，才能被杀死。
基于目前常见的高温高压的灭菌方式会使产品品质大大降低，找到一种低强度的灭菌方法以较大程度的保留食物的风味和营养价值是食品工业的新热点。如果能结合芽孢萌发机理，找到芽孢萌发的最佳条件，使芽孢“先萌发，再杀灭”，将对于低强度杀菌的可行性研究提供更为安全的途径，对低酸性罐头食品的研发有着重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高生孢梭菌芽孢萌发率的方法，利用该方法诱导生孢梭菌芽孢高效率萌发，以便于研究人员进行低强度条件下灭杀厌氧性梭状芽孢杆菌属研究的进行，从而解决高温灭杀给低酸性罐头食品风味和营养带来的负面影响。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种提高生孢梭菌芽孢萌发率的方法，将活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液于70℃-90℃的水浴中处理5-25min，活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液的pH值为4-7。
优选的，所述生孢梭菌芽孢悬浮液的pH值为4-6。
优选的，水浴温度为75-85℃。
优选的，水浴处理时间为15-25min。
最为优选的，将活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液于81℃的水浴中处理21min，活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液的pH值为4.7。
用于进行一定条件下诱导萌发的生孢梭菌悬浮液的浓度并无严格限制。本发明中出于后期计数的便利等，是利用活化后的生孢梭菌菌液多次离心，加入无菌水配置成浓度为108的芽孢悬浮液后进行萌发的。
本发明采用活化好的生孢梭菌悬浮液进行处理，通过研究发现，调整温度、时间、pH值，对于生孢梭菌芽孢萌发率有着显著的影响。而三者的影响中，又以pH值的影响最大，温度次之，处理时间相对影响较其他两个因素小一些。通过三个因素的合理调整，目前可获得79％左右的生孢梭菌芽孢萌发率。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
本发明提供了一种生孢梭菌芽孢高萌发率的方法，利用该方法诱导生孢梭菌芽孢高效率萌发，以便于替代危险性较高的肉毒梭状芽孢杆菌，便于研究人员进行低强度条件下灭杀厌氧性梭状芽孢杆菌属研究的进行，从而解决高温灭杀给低酸性罐头食品风味和营养带来的负面影响。
附图说明
图1为芽孢结构示意图；
图2为水浴处理时间为20min、悬浮液pH值为5.0条件下，不同处理温度对芽孢萌发率的影响；
图3为水浴温度80℃、悬浮液pH值为5.0条件下，不同水浴处理时间对芽孢萌发率的影响；
图4为水浴温度85℃、处理时间为20min条件下不同PH值对芽孢萌发率的影响。
具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
以下实施例中所用生孢梭菌，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号CICC 10385，0代菌，包装形式为冻干管；硫乙醇酸盐流体培养基，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；平板计数琼脂，购自北京陆桥技术有限责任公司。
一种提高生孢梭菌芽孢萌发率的方法，步骤如下：
1)菌种活化
在无菌操作台中开启菌种冻干管，加入1mL硫乙醇酸盐流体培养基，将冻干粉菌种溶解，取0.1mL冻干粉菌液转移到装有10mL硫乙醇酸盐流体培养基的玻璃瓶中，用无菌棉塞在玻璃瓶口，将玻璃瓶置于35℃的厌氧盒中培养24小时。
2)菌种继代培养
取0.1mL步骤1)活化后的新鲜培养物加至10mL硫乙醇酸盐培养基中35℃培养24小时，得培养物A；之后取0.1ml培养物A加至10mL硫乙醇酸盐培养基中35℃培养24小时得培养液。
3)芽孢悬浮液的制备
7天后取少量步骤2)的培养液做芽孢染色镜检，发现有大量芽孢存在。取培养液至无菌离心管中，2000r/min，4℃离心10min，取上清液；上清液再于6000r/min，4℃离心10min；取底部沉淀，加入无菌水混匀，重复离心3次，再次加入无菌水混匀，获得芽孢悬浮液，置于4℃冰箱内保存备用。
4)取步骤3)的芽孢悬浮液加至硫乙醇酸盐培养基中，调整培养基中的芽孢浓度为108CFU/mL，以每1.5ml上述浓度的培养基为试验单元。
5)调整实验单元的pH值，之后分别在不同水浴温度下处理一定的时间；
6)将处理前后的芽孢悬浮液进行平板稀释(稀释倍数以便于计数为宜)，每个平板中加入0.1mL的稀释后的处理前后的芽孢悬浮液，在35℃的厌氧盒中进行培养,48h小时后进行计数。
步骤5)的处理条件以及步骤6)获得的萌发率详见下表。
表1
实施例 温度 时间 pH 芽孢萌发率/％
1 85.00 20.00 6.00 65
2 80.00 15.00 6.00 59
3 80.00 25.00 6.00 59
4 75.00 20.00 6.00 61
5 75.00 15.00 5.00 63
6 75.00 25.00 5.00 63
7 80.00 20.00 5.00 78
8 85.00 25.00 5.00 70
9 85.00 15.00 5.00 62
10 75.00 20.00 4.00 66
11 80.00 25.00 4.00 72
12 80.00 15.00 4.00 67
13 85.00 20.00 4.00 73
14 81 21 4.7 79.4

Claims (2)

1.一种提高生孢梭菌芽孢萌发率的方法，其特征在于，将活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液于81℃的水浴中处理21min，活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液的pH值为4.7；其中将生孢梭菌进行菌种活化、继代培养，之后制成悬浮液并加至硫乙醇酸盐培养基中培养后得到所述活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液。
2.一种提高生孢梭菌芽孢萌发率的方法，其特征在于，将活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液于80℃的水浴中处理20min，活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液的pH值为5；其中将生孢梭菌进行菌种活化、继代培养，之后制成悬浮液并加至硫乙醇酸盐培养基中培养后得到所述活化过的生孢梭菌芽孢悬浮液。
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