CN111808168A - 一类褐飞虱硫激肽类似物的合成及应用 - Google Patents

一类褐飞虱硫激肽类似物的合成及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类神经肽成熟肽及其类似物的合成方法及其应用，主要通过：克隆褐飞虱硫激肽；分析及预测其成熟肽序列；合成成熟肽以及改造和修饰成熟肽后的类似物；通过显微注射方法将成熟肽及其类似物注射到褐飞虱体内；最后对褐飞虱取食量进行测定。本发明通过测定褐飞虱取食量证明本发明可以显著抑制褐飞虱取食，因此该发明可考虑直接应用于褐飞虱的田间防治，或者为害虫综合防治提供新思路，可为新型杀虫剂作用靶标研发提供帮助。

Description

一类褐飞虱硫激肽类似物的合成及应用
技术领域
本发明应用于害虫防控防控领域，其中特别涉及一类昆虫激肽类似物及其应用。
技术背景
农业害虫是制约农业生产的重要因素，水稻作为我国耕地面积辽阔重要粮食作物，水稻种植面积超过3000万hm2，占我国粮食作物总产量40％以上，但是水稻产区深受水稻害虫危害。褐飞虱属于单食性刺吸式口器害虫，半翅目飞虱科，可通过取食行为直接刺吸水稻汁液造成水稻营养生长受到严重影响，造成水稻严重减产，此外其还能传播水稻病毒：水稻草状矮缩病毒和水稻齿叶矮缩病毒，进一步损害农业生产。
神经肽广泛存在于节肢动物和脊椎动物的神经系统中，到目前为止不论是基于其结构还是功能神经肽都是多样性最为丰富的信号物质。在无脊椎动物中，神经肽通常被认为是一种神经调节物质，对于某些神经肽，同一分子既可作为辅递质，又可作为神经调节剂和神经激素。在这里介绍一个很典型的例子那就是胆囊收缩素(CCK)，其在哺乳动物中是由肠道内分泌细胞和大脑神经元产出，在胃酸分泌，胆囊收缩，胰酶分泌，肠道蠕动，饱腹感以及多种功能中作为一种神经调质或辅递质在中枢和周围神经系统扮演重要角色。
昆虫硫激肽(SKs)在无脊椎动物中分布广泛，现有研究表明在双翅目、半翅目等昆虫中均有分布。其首次在蜚蠊(Leucophaea maderae)头部提取物中分离得到，并且可以促进离体的蜚蠊后肠收缩。随后硫激肽也在多种昆虫中被鉴定到包括果蝇、美洲大蠊东亚飞蝗等。硫激肽与胆囊收缩素同源，可以调节饱腹感、食物的摄取、攻击性、多动性和肠道功能以及果蝇性唤起和性行为。对昆虫硫激肽的功能报道主要集中在对昆虫取食和消化的调节作用：如将果蝇前脑胰岛素细胞中的硫激肽基因沉默后，能够显著提高果蝇幼虫和成虫的取食量，而且其区分食物质量的优劣的能力也受到影响，造成区分困难的结果，在东亚飞蝗、德国小蠊、赤拟谷盗中硫激肽被明确为取食抑制剂，通过硫激肽及其类似物等能够观察到取食量明显降低。
近年来由于我国在防治褐飞虱时大量滥用化学药剂，致使褐飞虱对多种主要防治药剂产生较高的抗性如吡虫啉、噻虫啉等。所以生产上亟需开发出新型作用机理的杀虫剂用于田间防治。国内外研究学者尝试将昆虫神经肽及其受体作为研究对象以求研制出新型杀虫剂，其中以Ronald J.Nachman为代表的科学家以研究制备昆虫神经肽类似物为目标，为新型农药的开发提供新思路。他通过尝试以昆虫激肽(Insect kinins)核心五肽为先导，对其进行修饰与改造，得到了具有良好的抗酶解活性和较好的生物活性：选择性地、可逆地干扰果蝇的马氏管液体分泌；棉铃虫幼虫体重减少；蚜虫死亡率增加；诱导蚊子产生趋避行为等。此外硫激肽类似物已经被证明可有效地抑制赤拟谷盗的取食量，所以在此以褐飞虱制备硫激肽类似物申报专利，为其作为潜在的杀虫剂投入研发和生产提供新思路以供参考。
发明内容
发明目的 为了减少化学药剂的使用，减缓褐飞虱对杀虫剂的抗药性的上升速度，为开发具有独特杀虫机理且对非靶标生物和环境友好的杀虫剂提供新的思路。
技术方案 以室内连续饲养多年的褐飞虱为研究对象，经过基因克隆技术克隆得到褐飞虱硫激肽NSK基因序列，将褐飞虱硫激肽氨基酸序列进行信号肽预测，并合成两种非硫激化硫激肽(NSK I：SDDYGHMRF；NSK II：GEADDKFDDYGHMRF)及两种硫激化硫激肽(sNSKI：SDD(sY)GHMRF；sNSK II：GEADDKFDD(sY)GHMRF)。通过显微注射的方法将硫激肽类似物注射到褐飞虱体内，通过取食实验判断硫激肽类似物的生物活性。
有益效果 本发明通过设计合成不同的硫激肽类似物，并通过显微注射的方法证明了硫激肽类似物具有良好的生物活性，具有显著的抑制褐飞虱取食的效果。本发明具有良好的生物稳定性较褐飞虱自身合成的多肽更加稳定，易于保存。因此本专利对于褐飞虱拒食剂的开发和应用有重要意义；为有害生物综合治理提供新的思路。
附图说明
图1是NSK基因编码的两种成熟肽图。
图2是注射硫激肽成熟肽及其类似物对褐飞虱取食量的影响图。
技术方案
以下所述的试验操作便于更好的理解本发明，但不限定本发明。下述内容中所用试验材料与方法，如无特殊说明，均为常规材料和方法。
1.褐飞虱硫激肽基因克隆及类似物合成
取褐飞虱雌雄成虫各10头加入0.5ml TRIzol reagent(Invitrogen)，用研磨仪研磨120s将其充分破碎，按照RNA抽提试剂盒说明书来提取总RNA，所提取的RNA进行纯度和浓度测定(紫外分光光度计Thermmo Nanodrop 1000)，然后直接用于反转录或者置于-70℃冰箱备用。总RNA提取后，按照百泰克M-MLV反转录试剂盒说明定量到1ug进行反转录，合成的cDNA模板直接用于后续的PCR扩增或者置于-20℃冰箱保存备用。
在果蝇基因组数据库Flybase获取已经报道的黑腹果蝇硫激肽基因蛋白序列，然后将获得的蛋白序列与NCBI中褐飞虱基因组数据库(Genbank accession numbers：AOSB00000000)以及本实验所测褐飞虱转录组数据库进行Tblastn比对分析获得了褐飞虱硫激肽基因序列片段。利用Seqman软件对获得的片段进行分析。然后用Blsstx分析，分别得到编码褐飞虱硫激肽的碱基序列，用EditSeq软件中的ORF find工具获取编码硫激肽的完整的开放阅读框。最后利用NCBI在线引物设计工具设计引物来扩增获得序列。
全长克隆
NSK-comp-F GAACTCTGGAAGATCAGGCCA
NSK-comp-R CTCTACACCTAGCGACATTTGG
使用Vazyme公司的高保真酶2×Phanta Master Mix进行PCR扩增。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行验证，对于长度正确的条带进行切胶，使用OMEGA公司的胶回收试剂盒按照说明进行回收。将回收得到的目的基因连到pMDTM19-T vectors上，然后将连接目的基因的T载体转化到DH5α感受态细胞中，加入LB培养液37℃摇床培养1h；转化后细胞培养后均匀涂布在含有LB培养基的平板上，37℃倒置培养16h后挑斑，挑取白斑作为PCR模板进行菌落PCR，通过琼脂糖凝胶验证目的基因与T载体的连接效果；将菌落PCR验证连接正确的菌液进行测序。
从实验空所测褐飞虱脑转录组以及网上公布的褐飞虱基因组信息数据库中，通过PCR克隆获取了编码褐飞虱nsk基因的全长序列。该基因位于scaffold123上，仅有一个外显子，其通过翻译后修饰形成两种成熟肽，NSK I和NSK II(图1)。
根据已得到的褐飞虱成熟肽序列，由南京金斯瑞生物公司合成硫激肽成熟肽及其类似物。
Figure BSA0000214571310000031
Figure BSA0000214571310000041
2.注射褐飞虱硫激肽类似物及褐飞虱取食量测定
为了保证所有受试昆虫在正式试验前都达到同样的饥饿状态，我们统一将待做取食实验的褐飞虱提前饥饿处理24h。选取5龄若虫做取食实验，首先用CO2将其麻醉约30s，进而用细毛刷将其排列在琼脂糖平板中的凹槽内，腹部向上；注射点选择在褐飞虱侧胸中足与后足之间柔软部位或者胸部与腹部的连接处。注射所用仪器为美国WPI公司的Micro 4TM注射泵、冷光源和体视显微镜。每只分别注射50nl采用褐飞虱生理盐水(155mM NaCl，6.5mMKCl，1.6mM NaH2PO4，3mM NaHCO3，7.7mM MgCl2，2.9mM CaCl2；control group)配置的40pmol各种形式的褐飞虱硫激肽成熟肽及其类似物，对照注射相同体积的生理盐水。每种多肽和对照组均注射100头，将注射后的褐飞虱接15只一组放入取食管中取食液体饲料24h，并放置只含有液体饲料的空白对照，以测定挥发损失，统计取食前后液体饲料重量或体积的差异，用饲料挥发量来矫正测定结果，并以此计算药物干扰对褐飞虱取食的影响。
通过观察和统计分析褐飞虱的取食量，结果表明：同对照组相比(注射PBS)相比，注射硫激肽可显著降低褐飞虱取食量(图2)。与注射同体积PBS对照相比，注射NSK1、NSK2使褐飞虱24小时取食量降低50％，注射sNSK1、sNSK2使褐飞虱24小时取食量分别降低60％和75％(下表)。
PBS nsNlSK1 sNlSK1 nsNlSK2 sNlSK2
97.1246 57.82748 36.74121 61.875 19.41748
114.377 65.49521 34.82428 56.25 2.427184
88.49841 25.23961 46.32588 42.1875 24.27184
84.375 37.69968 58.25243
108.75 26.69903

Claims (4)

1.一类昆虫激肽类似物，其特征在于，所述激肽为多肽，包括褐飞虱NSK成熟肽：两种非硫激化硫激肽，两种硫激化硫激肽。
2.一类昆虫激肽类似物，其特征在于，所述类似物的序列为
NSK I SDDYGHMRF NSK II GEADDKFDDYGHMRF sNSK I SDD(sY)GHMRF sNSK II GEADDKFDD(sY)GHMRF
3.如权利要求1所述昆虫激肽类似物在害虫防治中的应用，其特征在于，所属害虫为褐飞虱。
4.如权利要求1所述昆虫激肽类似物作用方式，其特征在于，抑制害虫取食。
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