CN111801095A - 新型氨基硫醇减少局部缺血-再灌注诱发的细胞死亡 - Google Patents

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Abstract

在包括肾脏移植和心肌梗塞在内的两种临床前模型中，PrC‑210氨基硫醇家族的成员，包括PrC‑211和PrC‑252，在减少局部缺血‑再灌注损伤方面非常有效。PrC‑210具有良好的耐受性，在0.5MTD剂量下功效高达100％，其中当通过口服或IP途径全身施用时，没有明显的啮齿类动物毒性。关于什么可能是局部缺血‑再灌注损伤的最重要方面，在体外PrC‑210浓度为2‑3mM时，在IP或口服PrC‑210处理的啮齿动物中测量的相同PrC‑210浓度，PrC‑210可100％有效地防止直接ROS清除测定中的DNA损伤。在I‑R肾脏损伤的标准小鼠肾脏钳夹/无钳夹模型中，所有三种氨基硫醇均能显著抑制(>80％)未用药物治疗的对照组中所见的肾脏半胱天冬酶水平；PrC‑210及其类似物同样会降低I‑R肾脏小鼠的BUN水平。在小鼠心肌梗塞模型中，当全身施用PrC‑210，同时结扎40分钟并释放前冠状动脉时，观察到心肌死亡显著降低。使用原代新生小鼠心肌细胞进行的补充性体外研究显示，通过同时施用PrC‑210家族氨基硫醇，可高度显著减少过氧化氢诱发的心肌细胞杀伤。PrC‑210家族氨基硫醇能够在多种情况下(包括器官移植和心肌梗塞)抑制局部缺血‑再灌注诱发的细胞和器官毒性作用。

Description

新型氨基硫醇减少局部缺血-再灌注诱发的细胞死亡
技术领域
本文提供了一种技术，其中递送氨基硫醇化合物并使其与暴露于局部缺血事件的细胞接触，这样做，氨基硫醇会显著降低局部缺血-再灌注(I-R)损伤对细胞的严重性。在多种环境下，所施用的氨基硫醇会减少I-R诱发的细胞死亡所涉及的几个步骤，包括抑制半胱天冬酶活化和细胞凋亡，以及清除活性氧物质(ROS)和减少ROS诱发的DNA损伤。
背景技术
Lorenzen等人(Free Rad.Biol.Med.2013年7月)总结了局部缺血-再灌注损伤的普遍重要性，“由局部缺血-再灌注(I/R)损伤引起的组织损伤代表了严重的事件，通常会导致器官功能恶化或者甚至导致器官功能丧失。I/R损伤与血管闭塞引起的短暂组织缺氧以及随后血流恢复后的再灌注期有关。在再灌注期间，通过活性氧和氮物质的爆发和炎症反应等机制使局部缺血引起的初始组织损伤加剧。I/R损伤发生在外科手术、器官移植、心肌梗塞、循环系统休克和中毒性损伤等疾病中。”当在PubMed中搜索“局部缺血-再灌注”检索词条时，可识别出超过21,900条引用，这些示例几乎涵盖了每个器官部位并且包括两项人类临床研究，这些研究测量了与局部缺血-再灌注损伤相关的一些参数，例如心肌梗塞期间和之后的心肌乳酸脱氢酶的血浆水平，以及当将脑动脉钳夹一定时间然后释放再灌注一定时间时大鼠脑组织中脂质过氧化水平。
器官移植提供了I-R诱发的细胞死亡及其后果的重要性的一个实例。在世界范围内，终末期肾衰竭每年导致超过120万人死亡。在美国，每年进行超过17,000例肾脏移植。在过去的几十年中，尽管短期结果有所改善，但长期移植存活率仅略有改善。大部分肾脏移植失败归因于移植肾脏中的I-R损伤(Kloner RA,Circulation.1989；80:1115-27)。肾脏I-R损伤表现为原发性无功能或移植功能延迟。所有肾脏移植中约有三分之一将患有移植功能延迟；在循环死亡后捐献的肾脏中，这种失败率高达50％。移植功能延迟是公认的移植存活率低的危险因素。另外，由于需要等待肾脏功能的恢复，移植功能延迟会导致在即刻移植后环境中资源利用和费用增加。因此，实体器官移植中一个重要的未满足的需求是预防I-R损伤。重要的是，在过去50年中，可以减少I-R损伤的器官保存策略并未发生显著变化。因此，在肾脏移植领域中，迫切需要新的、安全的且有效的方法来抑制对移植肾脏的I-R损伤，最终实现终生移植存活。在肾脏移植中成功抑制I-R损伤可以广泛地应用于其他移植器官，更广泛地，可以应用于所有在外科手术过程中中断血液供应然后重新建立的器官外科手术，包括所有冠状动脉搭桥术、开心脏术和神经外科手术。
引起I-R损伤的完整机制是复杂的且尚未完全了解，但是氧化应激、半胱天冬酶激活、细胞凋亡、ATP耗竭和钙动态不平衡都有助于该机制，并且被广泛认为是I-R损伤的原因(Weight SC,Br J Surg,1996；83:162-70)。在再灌注期，活性氧物质(ROS)的产生会导致DNA突变。细胞凋亡性死亡级联被启动，最终导致细胞死亡。仅在器官移植中，抑制I-R损伤将改善移植手术的结果，并减少所有器官移植中的急性和慢性排斥反应。
像器官移植一样，ROS生成、半胱天冬酶激活和细胞凋亡性死亡级联在心肌梗塞和再灌注中一样普遍，因为它们实际上都是以实验方式或天然地由器官局部缺血/梗塞，然后去除梗塞以使器官能够被含氧血液再灌注而促成的器官毒性模型。
以下是局部缺血-再灌注损伤的一小部分实例(来自各个器官的局部缺血-再灌注损伤的PubMed搜索)，以及预施用或共同施用硫醇如何减轻局部缺血-再灌注损伤对处于危险中的组织的严重性的实例。
表1.已发表的文献显示了一些现有硫醇的保护作用
Figure BDA0002612476510000021
Figure BDA0002612476510000031
*N-乙酰半胱氨酸
硫醇化合物氨磷汀、半胱胺和N-乙酰半胱氨酸在某些局部缺血-再灌注器官损伤的动物模型中具有明显的保护作用。在表1中提到的两个案例中(MK Chok；SZ Wu)，全身性氨磷汀施用对半胱天冬酶3表达具有作用并具有抗细胞凋亡作用。
但是，表1中的每种硫醇都有明显的药理缺陷，这些药理缺陷显著地限制了它们的临床应用，并且在氨磷汀/WR-1065的情况下，阻止了其临床应用。例如，氨磷汀在人类中引起严重的恶心/呕吐副作用以及低血压/昏厥副作用。氨磷汀活性代谢产物WR-1065在大鼠中表现出低血压副作用(Ryan，1996)，并且尽管迄今为止尚未发表，但据我们所知，WR-1065还可能诱发与氨磷汀施用密切相关的恶心/呕吐反应。N-乙酰半胱氨酸是一种活性有限的臭味化合物，其主要间接起到GSH前体的作用，因此作用较慢。它会引起严重的不良反应，从恶心到死亡(Sandilands，2009年)。呕吐(Pakravan，2008)和类过敏反应(Kao，2003)屡见不鲜。因此，需要一种新药剂，该新药剂可以被开发成适用的药物产品以保护受试者免受局部缺血-再灌注细胞死亡的影响，并且该新药剂既没有阻止了氨磷汀/WR-1065的临床应用的其恶心呕吐和低血压副作用，又具有较大的临床疗效。
发明内容
发明人在某种程度上通过本文提供的实施例发现，本发明的化合物避免了关于先前氨基硫醇如氨磷汀和WR-1065所描述的许多或全部缺点，这使得本发明的分子从根本上更好地适合于在人类中广泛使用，从而在各种医疗应用环境中提供保护性和治疗性益处。显著地，这包括在肾脏移植中彻底抑制半胱天冬酶/细胞凋亡(实施例3-5)，以及在心肌梗塞中彻底抑制细胞凋亡/细胞死亡(实施例6)。
据发现，本发明的分子可以抑制局部缺血-再灌注损伤(参见实施例3、4、5和6)，而不会引起恶心/呕吐(参见实施例10)和低血压/晕厥(参见实施例11)副作用，这些副作用极大地限制了当前一代的氨基硫醇(即，五碳氨基硫代膦酸酯前药——氨磷汀)的使用。本发明中使用的氨基硫醇的设计概念是：(i)柔性烷基链骨架，其由于一个或多个氨基基团而在pH 7.2下带有正电荷，以实现与细胞中带负电荷的DNA相互作用，并围绕其聚集；以及(ii)存在游离的巯基基团以清除在局部缺血-再灌注期间形成的氧自由基。
在这个新氨基硫醇家族的原始设计(PrC-210作为迄今为止最具特点的原型)中，我们探索了一个方法，其中：(i)系统性地增加氨基硫醇骨架中烷基胺片段的数量以增加药物-DNA亲和力和离子相互作用，造成与这种药物-DNA相互作用增加相关的生长抑制作用增强，以及(ii)在烷基侧链的末端放置或“展示”游离的硫醇ROS清除剂(scavenger)，其将清除剂部分转移至远离DNA骨架的位置或者使清除剂部分在远离DNA骨架的位置“展示”，以便能够在ROS攻击细胞DNA内的dG碱基之前清除ROS(参见图1示意图)。这项工作产生了一个新型氨基硫醇分子家族，包括PrC-210、PrC-211和PrC-252。
Figure BDA0002612476510000041
本文详细描述了原型PrC-210。这些化合物，特别是PrC-210，没有表现出对现有技术化合物如氨磷汀、WR-1065、N-乙酰半胱氨酸或半胱胺所见的缺点。本发明化合物具有高功效并且快速起效。它们既不会引起恶心也不会引起低血压，并且几乎没有臭味。
氨基硫醇化学：
本发明中使用氨基硫醇来抑制半胱天冬酶和细胞凋亡，并清除ROS作为减少I-R损伤的手段，所述氨基硫醇的结构包括以下：
Figure BDA0002612476510000051
其中A＝-CH2NHR’并且B＝-CH2NHR或者A＝-NRR’并且B＝H；并且
其中R和R'独立地选自H、烷基和杂烷基，
条件是，如果B＝H，则R和R’不都是H，
及其药学上可接受的酸加成盐。
烷基优选是指C1-C6烷基，特别是C1-C3烷基，尤其是甲基。杂烷基优选是指C1-C6杂烷基，特别是C1-C3杂烷基，尤其是C1-杂烷基。
优选的化合物是具有下式的化合物，及其药学上可接受的酸加成盐：
Figure BDA0002612476510000052
其中R和R'独立地选自H、烷基和杂烷基。
烷基优选是指C1-C6烷基，特别是C1-C3烷基，尤其是甲基。杂烷基优选是指C1-C6杂烷基，特别是C1-C3杂烷基，尤其是C1-杂烷基。
其他优选的化合物是以下化合物，及其药学上可接受的酸加成盐：
Figure BDA0002612476510000061
其中R和R'独立地选自H、烷基和杂烷基，条件是R和R'不都是H。
烷基优选是指C1-C6烷基，特别是C1-C3烷基，尤其是甲基。杂烷基优选是指C1-C6杂烷基，特别是C1-C3杂烷基，尤其是C1-杂烷基。
特别提及的化合物是PrC-210、PrC-211和PrC-252及其药学上可接受的酸加成盐。特别优选的是PrC-210或其药学上可接受的酸加成盐，例如盐酸盐。
使用我们先前描述的途径合成上述分子以及这些分子的类似物(US7,314,959；Copp,RR等人,Synthesis and Growth Regulatory Activity of a Prototype Member ofa New Family of Aminothiol Radioprotectors.Bioorganic Medic.Chem.Letters 21:7426-7430,2011)。
关于为什么本发明中使用的化合物，尤其是PrC-210氨基硫醇，比目前可用的其他硫醇或氨基硫醇更适合减少I-R损伤，简要概述包括：
1.在经历了30分钟(肾脏)或40分钟(心脏)的I-R损伤的小鼠肾脏和小鼠心脏中，本发明化合物，尤其是PrC-210及其PrC-211和PrC-252类似物，能非常有效地抑制与细胞凋亡相关的半胱天冬酶水平(实施例3-6)。
2.PrC-210是一种非常有效的体外ROS清除剂(参见实施例1和2)。
3.在体外(Eppendorf管；实施例1和2)和原代小鼠心肌细胞(实施例7)环境中，PrC-210都是有效的ROS清除剂。在～3mM的浓度下，PrC-210可以将DNA损伤(pUC19 DNA损伤，参见图2)抑制90％；3mM是我们在接受了0.5MTD剂量的PrC-210(即，252μg/gm b.w.)的小鼠中测得的相同的PrC-210硫醇血液浓度(实施例15)，0.5MTD剂量的PrC-210使小鼠抵抗100％致死剂量的辐射而100％存活；这些小鼠的死亡主要是继发于电离辐射形成的细胞ROS引起的。
4.PrC-210被设计为包含一个烷基侧链，该烷基侧链在距离与PrC-210烷基-胺骨架离子缔合的DNA骨架至少3个键长的位置处展示一个巯基基团。我们假定，将巯基转移到DNA骨架周围的环境中将能够在ROS攻击DNA骨架内的dG碱基之前实现更有效的ROS清除。
5.与氨磷汀不同，PrC-210分子不会诱发低血压反应。这意味着PrC-210可用于门诊环境中无人监护的患者。同样，这意味着PrC-210可用于重症监护环境(如心肌梗塞、中风或冠状动脉搭桥手术)中的患者，而不会显著增加所需的患者监护。相信这也适用于本发明中使用的其他化合物。
6.与氨磷汀不同，PrC-210分子不会引起任何恶心或呕吐反应。这意味着PrC-210可用于门诊环境中无人监护的患者。同样，这意味着PrC-210可用于重症监护环境(如心肌梗塞、中风或冠状动脉搭桥手术)中的患者，而不会显著增加所需的患者监护。再次相信这也适用于本发明中使用的其他化合物。
7.本发明的化合物没有令人讨厌的臭味。PrC-210基本上没有硫磺臭味(参见实施例12)。这与硫醇类N-乙酰半胱氨酸和半胱胺不同，这两者在抑制局部缺血-再灌注损伤方面均具有很少或中等的功效，但由于与它们在临床相关剂量下的使用相关的普遍气味，它们在临床上仍无法在人类中使用。
8.氨磷汀需要通过磷酸酶进行酶促活化步骤才能变成游离的硫醇，并且这具有与之相关的时间依赖性药代动力学。N-乙酰半胱氨酸(NAC)通过增加内源性硫醇——谷胱甘肽的生物合成来实现其大部分保护功效，因此存在与NAC抑制局部缺血-再灌注损伤相关的更长时间(几小时到一天)的时间依赖性元素。与这些化合物相反，本发明化合物是速效的。当它们进入血液、器官保存溶液或施用它们的任何部位时的瞬间，它们就会有活性。在心肌梗塞、中风或其他心血管和/或血管事件/病况期间，将具有功能活性的速效化合物递送到循环系统中(其中在梗塞周围递送一些，并在梗塞溶解后进行大剂量递送)，在减轻与梗塞相关的器官损伤方面可能非常有用。
为了保护移植器官免受在与移植相关的血液停止和启动过程中遇到的I-R损伤，可以以一种或多种重叠方式施用本发明中使用的化合物(例如PrC-210)以保护器官。它的主要用途是作为器官保存溶液的添加剂。通常，这将涉及用添加有本发明中使用的化合物(例如PrC-210)的溶液冲洗供体器官。用于冲洗供体器官的溶液可以是常用的器官保存溶液之一，其中添加了本发明中使用的化合物，例如PrC-210。实施例14提供了常用的器官保存溶液“UW溶液”的组成；其他保存溶液是本领域已知的。也可以用添加了本发明中使用的一种或多种化合物(例如PrC-210)的任何其他合适的溶液冲洗供体器官。例如，可以用含白蛋白和肝素的乳酸林格氏溶液(Lactated Ringer's solution)冲洗供体器官。将基于本发明中使用的化合物的半衰期来选择化合物的合适浓度，并且其将适应不同的器官(肾脏、心脏、肺等)、储存温度，并且重要的是，将适应植入器官接受者之前在4℃器官储存的持续时间。例如，根据PrC-210在pH 7.2下3.5小时的半衰期，氨基硫醇的添加范围可能在5-100mM之间。用添加型保存溶液(augmented preservation solution)“冲洗”供体器官可以采取几种形式，最通常地，外科医生简单地冲洗被移除的器官，直到器官流出物“清澈”为止。这也可能涉及一旦捐献者被宣布死亡后，则用添加型保存溶液全身替换整个捐献者的血容量，器官保持原位。后一种方法能够冲洗并捐赠来自同一供体的多个器官。
在器官植入之前，还可以用添加型保存溶液、缓冲液、血液或血液替代物通过泵连续循环通过离体器官的来维持该器官。
因为在植入前供体器官通常储存5-8小时或更长时间，所以在器官的储存过程中，大部分本发明中使用的化合物可以转化为无活性形式。例如，在PrC-210的情况下，在器官植入和已知的与新植入的器官有关的在血流重新建立时发生的ROS爆发之前，1-2半衰期或更多的PrC-210会转化为其非活性二硫键形式。由于这个原因，可以在将器官手术植入到接受患者体内之前的几分钟，对器官施用“负荷剂量(loading dose)”。根据器官及其内部循环，本发明中使用的化合物在负荷剂量液体中的浓度可以在5至500mM之间变化。外科医生可以使用50-100cc的注射器冲洗器官，并简单地将添加型溶液推入到器官的主动脉中。等待几分钟后，在即将植入之前，单独用盐水或乳酸林格氏溶液冲洗第二次，即可实现用本发明中使用的化合物“负荷”器官的实质细胞中，同时大大减少了植入后分布到器官接受者全身血液中的这种化合物的量。
因为在本领域中已知，新移植的器官中存在持续的炎症以及相关的ROS、半胱天冬酶和细胞凋亡的产生，所以在器官移植手术完成后18个小时–4天向患者全身性地施用本发明中使用的化合物(例如PrC-210)是有益的。从动物研究中我们知道，在防止了器官细胞死亡的啮齿动物中，PrC-210的血液浓度为1-3mM。因此，用于移植后器官接受者的本发明中使用的化合物的血液浓度目标应在0.5-5mM范围内。可以通过静脉内施用或口服施用向患者施用本发明中使用的化合物。对于PrC-210，这两种途径在动物研究中均有效(Soref,C,IntJ Rad Onc Biol Phys 82:e701-e707,2012)。
以前的工作显示，当PrC-210作为干燥的结晶材料存储在抽空空气的小瓶中时，其以其硫醇形式稳定数年。当溶于pH 6的水中时，在室温下两周内PrC-210没有明显转化为其二硫键形式。在pH 7.2时，PrC-210硫醇的半衰期为3.5小时。在这种情况下，适合将本发明中使用的化合物(如PrC-210)以晶体或冻干粉末的形式保存在用惰性气体(如氮气)吹扫过的小瓶中，然后用盐水将其重新溶解，然后添加至保存溶液或IV袋中。本发明中使用的化合物在惰性气体吹扫过的瓶子(例如氮气吹扫过的瓶子)中的胶囊形式是稳定存储分子的另一种方法，然后向患者口服施用该胶囊，或将胶囊溶解在一定体积的保存溶液或缓冲液中，然后冲洗并保存离体器官。
对于大多数心脏外科手术来说，首先将血流转移到机械心肺机，然后用冷藏的心脏停搏液冲洗心脏，其中溶液的离子含量旨在防止离体心脏自发跳动。标准的心脏停搏液的配方示于实施例13中。然后在例如冠状动脉搭桥术或瓣膜修复手术期间手术操作离体的、无跳动的心脏。添加了本发明中使用的化合物(例如PrC210)的心脏停搏液可以保护心脏实质细胞免受以下事件的影响：ROS和相关半胱天冬酶和细胞凋亡的爆发，已知这会在含氧血流恢复到心脏后，例如在冠状动脉搭桥手术后，立即发生在心脏中。添加型心脏停搏液可以包含5-500mM的本发明中使用的化合物，例如PrC-210。将本发明中使用的化合物(例如PrC-210)另外慢性静脉内施用(18小时至4天)于心脏手术后患者也是实用的选择。
存在无数其他的不包括外科手术干预的局部缺血-再灌注损伤情况，其中全身性施用(通常通过IV)本发明中使用的化合物(例如PrC-210)会降低I-R损伤的严重性。因为，由于在新再灌注的组织中产生了大剂量的ROS，血液传播的化合物将提供对所产生的ROS的实时清除(参见实施例2)，从而大大减少IR损伤后组织环境中相关半胱天冬酶和细胞凋亡的产生。这些非手术的IR损伤情况的两个实例包括：i)心脏病和通过血管成形术或冠状动脉搭桥术释放心肌梗塞(有关于此的小鼠模型重现，以及与PrC-210全身施用相关的心脏细胞死亡的显著减少，参见实施例6)，以及ii)中风及其导管或药理学解决方案。在这些前述实施方案中，一些全身施用的化合物将通过循环梗阻或在循环梗阻周围“泄漏”；这将使得i)化合物能够清除局部缺血组织内的反应性分子(例如一氧化二氮)，以及ii)化合物能够清除在重新建立流向先前局部缺血组织的血流后形成的大剂量ROS。在这些非手术性IR损伤环境中，该化合物很可能以足够高的浓度作为急性静脉内输注给药，以在几秒/分钟的时间内达到1-20mM化合物的治疗性全身血液水平。
在所有PrC-210及其相关类似物配方中，氨基硫醇以有机酸盐(通常为HCl)的形式合成(Copp,R Bio Med Chem Lett 21:7426-7430,2011)，并且它几乎可以以高达数摩尔的浓度立即溶解在水溶液中。
基于本文包含的教导，本发明的另外的实施方案对本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
图1显示了由PrC-210赋予的针对细胞的局部缺血-再灌注损伤的建议保护机制之一的示意图。
图2显示了PrC-210相对于12种常见的“抗氧化剂”在加入到反应中时剂量依赖性地抑制羟基自由基(·OH)诱导pUC19质粒DNA产生切口的效力。
图3显示了在产生·OH损伤前短至30秒向反应混合物中加入PrC-210可完全预防·OH诱导的pUC19质粒损伤。
图4显示了PrC-210对小鼠肾脏I-R损伤后24小时的肾脏半胱天冬酶和肾脏功能的影响。(A)实验设计；所有组均进行了30分钟的左侧(LT)缺血(钳夹)和右侧(RT)肾脏切除术，然后进行24小时的再灌注。在LT肾脏钳夹前20分钟，以单次腹膜内(IP)注射施用氨基硫醇(PrC-210、PrC-211或PrC-252)。在24小时收集血清和LT肾脏。(B)如实施例3中所述测量肾脏组织上清液半胱天冬酶活性。首先建立了60分钟内半胱天冬酶测定条件的线性。(C)在钳夹后24小时收集的血清上测定BUN水平。
图5显示了钳夹后24小时左侧肾脏半胱天冬酶活性的剂量依赖性PrC-210抑制。在钳夹前20分钟以单次IP注射施用PrC-210剂量，并在24小时后测量半胱天冬酶活性。PrC-210剂量表示为先前在野生型小鼠上确定的IP最大耐受剂量(MTD，即504ug/g体重(b.w.))的分数。
图6显示了每种指示的氨基硫醇(及其结构)在I-R损害肾脏30分钟后24小时降低肾脏半胱天冬酶水平的能力。在开始钳夹左侧肾脏30分钟之前20分钟，以单次腹膜内注射向小鼠施用0.24MTD剂量的每种氨基硫醇。24小时后收集肾脏，并测定半胱天冬酶活性。
图7显示了小鼠的心肌死亡显著减少，该小鼠接受了全身剂量的PrC-210，10分钟后，在该小鼠心肌梗塞局部缺血-再灌注模型中进行了左侧冠状动脉结扎和释放(40分钟后)。对心脏进行冠状动脉结扎-释放I-R损害后24小时，对心脏中的活组织进行染色。
图8显示了通过向肌细胞组织培养基中同时添加PrC-210显著减少了过氧化氢(H2O2)诱导的心肌细胞死亡。
图9显示了PrC-210显著抑制X-射线辐射的人血液淋巴细胞中的γ-H2AX灶(foci)(即ROS诱发的DNA双链断裂)。向人全血样品中添加指定浓度(0至23mM)的PrC-210，2小时后，对全血样品进行100mGy辐射。
图10(左图)显示，氨磷汀在雪貂模型中诱发恶心和呕吐反应。(右图)显示，PrC-210在雪貂模型中不会诱发恶心和呕吐反应。
图11显示，PrC-210不会引起低血压副作用。左上图显示了施用氨磷汀后记录的血压。左下图显示了施用PrC-210后记录的血压。
图12显示了在通过(A)单次腹膜内注射或(B)单次口服管饲递送到小鼠胃中而施用分子后的不同时间活性PrC-210硫醇形式的小鼠血浆水平。
实施例
实施例1
在开发本文提供的技术的实施方案的过程中，进行了实验证明，可以在琼脂糖凝胶上分离pUC19质粒以显示超螺旋形式(Supercoil)和带切口的(Nicked)形式(图2，图A)。如结果所示，当超螺旋质粒DNA主链中的一个或多个键被在x射线辐射过程中产生的活性氧(ROS)对质粒DNA的化学攻击破坏时，超螺旋质粒DNA变成带切口的形式，并且可以在电泳过程中在琼脂糖凝胶上与超螺旋质粒DNA分离。在该实施例中，在x射线辐射期间产生的ROS简单地模仿了在标准局部缺血和再灌注循环期间形成的相同ROS物质。裸质粒DNA上的ROS攻击造成了松弛的质粒形式，其在凝胶上迁移的速度更慢。在该实施例中，在x射线辐射之前15分钟，将指定的小分子单独添加到质粒试管中，以确定它们针对在x射线辐射期间产生的大量ROS赋予了何种保护(如果有的话)。将测试分子添加到pUC19质粒孵育物中15分钟后，试管在30分钟内接受90Gy辐射。(A)然后将孵育物的等分试样电泳，并对溴化乙锭染色的凝胶进行定量成像。使用Image J软件量化较低条带(超螺旋)带和较高条带(带切口的)的强度。(B)使用Graphpad Prism软件绘制条带强度。(C)显示了一些测试分子的结构。在培养物中加入PrC-210、WR-1065或半胱胺各自赋予了对ROS诱发的质粒DNA损伤的剂量依赖性抑制。
实施例2
这些实验示出了将质粒DNA暴露于60秒脉冲的·OH生成器(H2O2+紫外光；Floyd等人,J Biochem Biophys Methods 1984；10:221-235)之后，pUC19质粒DNA的超螺旋形式和有缺口的/·OH损伤形式的琼脂糖凝胶分离(图3)。将超螺旋DNA与水(泳道a、b)或20mMPrC-210(泳道c-h)孵育指定时间，然后将其暴露于·OH生成器中1分钟。对各反应的等分试样进行电泳，用EtBr染色并数字成像。完成了三个重复的反应和凝胶，并使用Image J软件对条带强度进行定量。指定了用于比较泳道a与g中超螺旋条带强度的P值。在·OH损伤前仅30秒添加PrC-210即可完全抑制ROS DNA损伤。
实施例3
进行了实验证明(图4)，单次IP注射PrC-210(0.24MTD＝0.116mg/g体重)导致在对肾脏进行I-R损伤后24小时肾脏半胱天冬酶的水平降低84％，并类似地降低血清尿素氮(BUN)水平。(A)实验设计；所有组均进行了30分钟的左侧(LT)局部缺血(钳夹)和右侧(RT)肾切除术，然后进行24小时的再灌注。在LT肾脏钳夹前20分钟以单次腹膜内注射的形式施用PrC-210。在24小时收集血清和LT肾脏。(B)如下测量肾脏上清液半胱天冬酶活性：使用Apo-ONE荧光底物(Promega，Madison，WI)测定肾脏匀浆上清液中的半胱天冬酶3和7活性。简而言之，将解冻的肾脏与8倍过量的裂解缓冲液(含有50mM Na HEPES，pH 7.4，100mMNaCl，1mM EDTA，10mM DTT，10％甘油)混合，并在4℃下用不锈钢叶片均质机(5,000rpm)均化30秒。然后将肾脏匀浆在Eppendorf 5418微量离心机中于4℃以16,000x g离心20分钟。将所得上清液立即冷冻并保存在–70℃。使用牛血清白蛋白标准液通过Bradford方法测量上清液蛋白。如下进行半胱天冬酶测定：用上述裂解缓冲液将38μg的上清液蛋白稀释至总体积为50ul，与黑色96孔板的孔中与50μL的Apo-ONE底物混合以启动60分钟反应。将板在37℃以200rpm振荡60分钟。使用BMG Clariostar荧光板读数器在499nm的激发波长和521nm的发射波长下测量DEVD半胱天冬酶底物肽的裂解。每个实验均包含半胱天冬酶标准品。(C)测定在钳夹后24小时收集的血清中的BUN水平，作为I-R损伤后24小时内肾脏健康的功能指标。
实施例4
进行了实验证明(图5)，以三种剂量范围(分别为0.105MTD、0.152MTD、0.230MTD＝0.053、0.077、0.116mg/gm体重)单次IP注射PrC-210会导致在对肾脏进行I-R损伤后24小时测量到PrC-210剂量依赖性肾脏半胱天冬酶降低。
实施例5
进行了实验证明(图6)，以其各自的0.24MTD剂量(PrC-210MTD＝504ug/gm体重；PrC-211MTD＝500ug/gm体重；PrC-252MTD＝287ug/gm体重)单次IP注射PrC-210、PrC-211或PrC-252会导致对肾脏进行I-R损伤后24小时，肾脏半胱天冬酶水平显著降低。
实施例6
进行了实验证明，对故意结扎左冠状动脉的小鼠进行两次IP注射PrC-210(0.252mg/g体重，30分钟后0.05mg/g体重)(参见图7)导致在释放40分钟的动脉结扎后24小时被染色为死组织的总心肌百分比平均降低36％。PrC-210注射小鼠中由手术诱发的“梗塞”(40分钟动脉结扎)引起的心肌组织死亡程度明显低于注射生理盐水(作为对照)的小鼠中的心肌组织死亡程度(P＝0.0143)。
实施例7
进行了实验证明，向含有来自3日龄小鼠的原代新生心肌细胞(30,000个细胞/96孔)的培养孔中的组织培养基中添加PrC-210(2.3mM)显著降低通过向细胞中添加增加浓度的H2O2诱发的心肌细胞死亡(见图8)。在该实施例中，在添加H2O2前15分钟或30秒向培养基中添加PrC-210显示出相同的结果，其中消除了约80％的H2O2诱发的细胞死亡。
实施例8
这些实验表明，PrC-210高度显著抑制x-射线辐射的人血液淋巴细胞中γ-H2AX灶的形成(指示DNA双链断裂)(图9)。向人全血样品中添加指定浓度(0至23mM)的PrC-210，2小时后，对样品进行100mGy辐射。插图：人淋巴细胞中γ-H2AX灶(绿色)的免疫染色；细胞核用4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色；在未接受药物(100mGy)或接受23mM PrC-210(100mGy+PrC-210)后2小时，用100mGy x-射线对全血样品进行辐射。
实施例9
进行了实验证明(表2)，当大鼠在辐射前30分钟接受单次IP注射或四次局部应用指定氨基硫醇，然后在其背上皮肤的指定矩形区域(1.5x 3.0cm)处接受17.2Gy的单次x-射线剂量时，放射性皮肤炎会减轻。药物应用和辐射后13天，对辐射后皮肤区域内x-射线诱发的放射性皮肤炎的严重性进行评分。向大鼠经皮局部施用或腹膜内施用这些氨基硫醇ROS清除剂分子100％抑制辐射大鼠皮肤期间由x-射线产生的ROS引起的放射性皮肤炎。
表2
外用(或腹膜内(IP))氨基硫醇预防放射性皮炎
Figure BDA0002612476510000161
a对大鼠背部的1.5cm x 3.0cm矩形进行17.3Gy辐射剂量之后13天，没有任何结痂物质的被辐照皮肤的百分比
b(乙醇：丙二醇：水)
实施例10
进行了实验证明，当雪貂(其具有与人类相同的恶心/呕吐反应)接受了小鼠0.5MTD剂量的氨磷汀的皮下雪貂相当剂量时，所有四只雪貂(此处示出了062和089的数据)均明显发作恶心和呕吐(图10，左图)。这复制了接受了小鼠0.5MTD剂量的氨磷汀的人类相当剂量的氨磷汀的人类病例中报告的恶心/呕吐的高发率。
图10的右图显示，当10只雪貂接受了小鼠0.5MTD剂量的PrC-210的皮下雪貂相当剂量时，这10只雪貂(此处示出了123和A43的数据)均未发生任何可分辨的恶心或呕吐反应。
作为阳性对照，在氨磷汀或PrC-210攻击剂量后休息两周，所有雪貂都接受了单次攻击剂量的洛哌丁(loperamide)(一种已知的雌激素)，14只雪貂中的每只都表现出强烈的恶心和呕吐反应。这些数据在图10中以插图显示。
实施例11
进行了实验证明，当大鼠(其插有动脉插管以测量血压)接受了小鼠0.5MTD剂量的氨磷汀的大鼠相当单次IP剂量时，会立即发生不可逆的血压下降，而攻击剂量的IP肾上腺素对血压没有可分辨的影响(图11)。记录期间大鼠的慢性低血压与可分辨的眼表型/毒性有关。
接受了小鼠0.5MTD剂量的PrC-210的大鼠相当单次IP剂量的插有插管的大鼠未显示血压降低，而攻击剂量的IP肾上腺素导致血压显著升高。
实施例12
进行了实验证明，PrC-210缺乏与常规硫醇化合物有关的有害臭味(即硫磺臭味)。使测试受试者暴露于包含大约单次人类剂量的PrC-210所预期的上限的PrC-210的溶液，以及2-巯基乙醇(2-ME)的稀释系列。通过比较PrC-210与2-ME稀释液的气味，每个受试者为PrC-210指定一个“气味评分”；气味评分表示2-ME稀释液的硫磺硫醇气味最接近单次人类剂量的PrC-210的硫磺硫醇气味。一名受试者指定的气味评分为8，另一名受试者指定的气味评分为7，对应于2-ME的1：18,750和1：93,750稀释。这些结果表明，浓度约为单次最大人类剂量的PrC-210的硫醇臭味比2-ME低56,250倍(例如93,750–18,750＝75,000；75,000÷2＝37,500；37,500+18,750＝56,250)。将2-ME稀释56,250倍几乎没有异味。
表3。
Figure BDA0002612476510000181
A即，2-ME(2-巯基乙醇)小瓶的“硫醇臭味”得分与PrC-210小瓶的“硫醇臭味”得分相同，其中PrC-210小瓶包含被计算为单次人类PrC-210剂量可能的上限。
实施例13
通常使用Cardioplegia Solution来冲洗人的心脏，并且在此过程中使心脏停止跳动，然后对不搏动的心脏进行外科手术(例如冠状动脉搭桥术或瓣膜修复手术)，该Cardioplegia Solution的一个示例包括(每升溶液)：
-110mmol钠
-16mmol镁
-160mmol氯
-16mmol钾
-1.2mmol钙
-足够的碳酸氢钠达到pH值7.4-7.8
实施例14
器官保存溶液的一个示例——这里的“Belzer UW Cold Storage Solution”，威斯康星大学发明——通常在4℃下使用用于在移植到器官接受者体内之前冲洗并维持从器官供体中取出的器官，其包括：
Belzer
Figure BDA0002612476510000193
Cold Storage Solution
Figure BDA0002612476510000192
实施例15
进行了实验证明(图12)，当小鼠接受单次IP注射的0.5MTD IP PrC-210剂量(252ug/gm体重)或单次口服灌胃剂量的0.5MTD口服PrC-210剂量(900ug/g体重)时，以后可以长期测量到活性形式PrC-210硫醇的明显血浆水平。血浆浓度为1-3mM的PrC-210硫醇与完全抑制辐射诱发的死亡有关，否则经溶媒处理并接受辐射的小鼠100％会发生辐射诱发的死亡。
本发明项
1、一种减少或预防受局部缺血事件影响的细胞中局部缺血-再灌注细胞死亡的方法
包括使所述细胞与具有以下结构的化合物接触
Figure BDA0002612476510000201
其中A＝-CH2NHR’并且B＝-CH2NHR或者A＝-NRR’并且B＝H；并且
其中R和R'独立地选自H、烷基和杂烷基，
条件是，如果B＝H，则R和R’不都是H。
2、根据项1所述的方法，其中所述化合物是具有以下结构的化合物：
Figure BDA0002612476510000202
其中R和R'独立地选自H、烷基和杂烷基。
3、根据项1所述的方法，其中所述化合物包含根据以下的结构：
Figure BDA0002612476510000203
其中R和R′独立地选自H、烷基和杂烷基，条件是R和R′不都是H。
4、根据项1所述的方法，其中所述化合物选自PrC-210、PrC-211和PrC-252：
Figure BDA0002612476510000211
5、根据项1所述的方法，其中通过减少或预防细胞凋亡来减少或预防细胞死亡。
6、根据项1所述的方法，其中与未与所述化合物接触的细胞相比，在与所述化合物接触的细胞中半胱天冬酶活性降低。
7、根据前述项中任一项所述的方法，其还包括清除活性氧物质。
8、根据前述项中任一项所述的方法，其还保护细胞的DNA免受活性氧物质的影响。
9、根据项1所述的方法，其中所述细胞是移植器官的一部分。
10、根据项9所述的方法，其中在植入到接受者之前使所述细胞与所述化合物接触。
11、根据项9所述的方法，其中所述化合物是器官保存溶液或用于冲洗器官的溶液的一部分。
12、根据项9所述的方法，其中在器官去除之前和期间将所述化合物施用于供体。
13、根据项1所述的方法，其中向受试者全身施用所述化合物会减少或预防所述受试者中的局部缺血-再灌注细胞死亡。
14、根据项13所述的方法，其中所述化合物保护所述受试者免受局部缺血-再灌注器官毒性作用的影响。
15、根据项13所述的方法，其中所述化合物预防再灌注之前和期间的局部缺血-再灌注细胞死亡。
16、根据项13所述的方法，其中所述受试者是移植接受者。
17、根据项13所述的方法，其中所述受试者患有心脏病或处于患心脏病的风险中。
18、根据项13所述的方法，其中所述受试者患有中风或处于患中风的风险中。
19、根据项13所述的方法，其中在局部缺血-再灌注事件之前、期间或之后的有效时间全身施用有效量的所述化合物。
20、根据前述项中任一项所述的方法，其中所述化合物是酸加成盐的形式。
21、根据项1所述的方法，其中所述细胞是作为心脏外科手术的一部分用心脏停搏液灌注的心脏的一部分。
22、根据项1所述的方法，其中将所述化合物添加到用于保护器官免受IR损伤的任何冲洗溶液中。
23、一种器官灌注溶液，其中如项1所定义的化合物以约1至约100毫摩尔的浓度存在。
24、项1中所定义的化合物的单位剂量，其在抽空空气的小瓶中构成所述化合物的酸盐的结晶或冻干粉末形式，所述小瓶具有可穿透的隔膜，所述隔膜使得能够实现液体重构以添加至器官保存溶液、心脏停搏液或IV袋中，以使所述化合物的最终浓度达到1-100mM。
25、一种心脏停搏液，其中如项1所定义的化合物以约1至约100毫摩尔的浓度存在。
26、如项1所定义的化合物的干燥片剂或胶囊剂形式，其能够口服递送给患者以达到0.5-5mM的血浆浓度。
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Claims (17)

1.一种减少或预防受局部缺血事件影响的细胞中局部缺血-再灌注细胞死亡的方法
包括使所述细胞与具有以下结构的化合物或其药学上可接受的酸加成盐接触
Figure FDA0002612476500000011
其中A＝-CH2NHR’并且B＝-CH2NHR或者A＝-NRR’并且B＝H；并且
其中R和R'独立地选自H、烷基和杂烷基，
条件是，如果B＝H，则R和R’不都是H，
其中所述方法在人体外实施。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物选自PrC-210、PrC-211和PrC-252或其药学上可接受的酸加成盐：
Figure FDA0002612476500000012
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过减少或预防细胞凋亡来减少或预防细胞死亡。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中与未与所述化合物接触的细胞相比，在与所述化合物接触的细胞中半胱天冬酶活性降低。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是移植器官的一部分。
6.根据权利要求5所述的方法，其中在植入到接受者之前使所述细胞与所述化合物接触。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中所述化合物是器官保存溶液或用于冲洗器官的溶液的一部分。
8.具有以下结构的化合物用于制备用于减少或预防受局部缺血事件影响的细胞中局部缺血-再灌注细胞死亡的治疗药物或预防药物的用途
Figure FDA0002612476500000021
其中A＝-CH2NHR’并且B＝-CH2NHR或者A＝-NRR’并且B＝H；并且
其中R和R'独立地选自H、烷基和杂烷基，
条件是，如果B＝H，则R和R’不都是H。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述化合物选自PrC-210、PrC-211和PrC-252或其药学上可接受的酸加成盐：
Figure FDA0002612476500000022
10.根据权利要求8或9中任一项所述的方法，其中在局部缺血-再灌注事件之前、期间或之后的有效时间全身施用有效量的所述化合物。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的用途，其中向受试者全身施用所述化合物会减少或预防所述受试者中的局部缺血-再灌注细胞死亡。
12.根据权利要求8至10中任一项所述的用途，其中所述化合物保护所述受试者免受局部缺血-再灌注器官毒性作用的影响。
13.根据权利要求8至10中任一项所述的用途，其中所述化合物预防再灌注之前和期间的局部缺血-再灌注细胞死亡。
14.根据权利要求8至10中任一项所述的用途，其中所述受试者是移植接受者。
15.根据权利要求8至10中任一项所述的用途，其中所述受试者患有心脏病或处于患心脏病的风险中。
16.根据权利要求8至10中任一项所述的用途，其中所述受试者患有中风或处于患中风的风险中。
17.根据权利要求8至10中任一项所述的用途，其中所述细胞是作为心脏外科手术的一部分用心脏停搏液灌注的心脏的一部分。
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