CN111796099A - 制备区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的诊断试剂的应用和试剂盒及其方法和装置 - Google Patents

Abstract

一种制备区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的诊断试剂的应用和试剂盒及其方法和装置,本发明提供的血清代谢标记物组可用于区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌，具有样本制备简单、检测速度快、重复性和诊断灵敏度高的特点，可以作为传统临床诊断的辅助方法，本发明提供的检测试剂盒可用于区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌，加快诊断速度，提高诊断便利性和标准化，发明提供的血清代谢标记物组中的单个用于区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌时，AUC值均大于0.799。三个代谢物组合运用可以实现更好的诊断区分效果，AUC值为0.883，具有较强的临床诊断意义。

Description

制备区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的诊断试剂的 应用和试剂盒及其方法和装置

技术领域

本发明具体涉及分析化学及临床医学技术领域，具体涉及一种制备区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的诊断试剂的应用和试剂盒及其方法和装置。

背景技术

对于男性，前列腺癌是最为常见的肿瘤之一，患病率和死亡率分别位居第二和第五，2018年全球癌症统计数据显示全世界每年新增130万前列腺癌患者，新增死亡人数将达35.9万。临床上对前列腺癌的诊断经常存在过诊或误诊等情况，对其治疗方案的制定极为不利，因此实现对前列腺癌的精准分型诊断对其精准治疗非常关键。

目前临床上前列腺癌诊断方法主要有肛门指诊、前列腺特异性抗原测定、影像学检查以及经直肠超声引导下穿刺活检，但是前三种方法特异性较差，存在较大误诊率。穿刺活检可以获得病灶组织样品进行病理切片检查，可以作为前列腺癌诊断分型的金标准，但是这是一种有创的诊断方法，给患者带来心理压力。开发新型、无创、准确的诊断方法对于前列腺癌的诊疗具有很重要的临床意义。另外，特别是对于前列腺癌不同进展阶段的诊断目前还缺少有效的方法，不利于治疗方案的确定。去势治疗是转移性激素敏感性前列腺癌的首选治疗方式，但经过一段时间的内分泌治疗后，疾病将进展为去势抵抗性前列腺癌。因此，如何简单、快速、准确地区分两者，制定精准的治疗方案，可以更快更好地对患者进行治疗，减少不必要的医疗资源浪费。

代谢组学技术是指运用先进的分析手段尽可能多地测定生物样品中的代谢物，分析这些代谢物在疾病发生发展过程中的变化，从而鉴定与疾病相关的特异性代谢标记物。代谢组学技术作为一种组学诊断技术在前列腺癌研究领域已有尝试和运用。Sreekumar等人在《Nature》杂志上报道利用代谢组学技术鉴定尿液中肌氨酸可以作为前列腺癌的诊断标记物。Giskeødegård等人发现血中精氨酸、酰基肉碱等代谢物能够很好地区分前列腺癌与前列腺增生患者。Schmidt等研究者鉴定出血浆中酰基肉碱、甘油磷脂和鞘脂类代谢物可以用于前列腺癌风险评估。

鉴于此，前列腺癌的发生和发展过程中会引起一系列小分子代谢物的含量变化，换言之，分析前列腺癌患者体液样本中代谢物的变化有利于了解前列腺癌的进展情况，以便辅助诊断区分前列腺癌不同阶段。

发明内容

为了解决现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种制备区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的诊断试剂的应用和试剂盒及其方法和装置，加快诊断速度，辅助传统诊断方法，提高诊断可靠性。

本发明采用的技术解决方案是：一种血清代谢标记物的检测试剂在制备区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的诊断试剂上的应用，所述的血清代谢标记物为丙酮酸、组氨酸和谷氨酰胺中的一种或几种。

所述的血清代谢标记物为丙酮酸、组氨酸和谷氨酰胺中两种或三种。

一种区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的诊断试剂盒，包含所述的活检组织代谢物的化学单体或混合物，作为诊断试剂盒的标准品。所述标准品均为分析纯以上规格。使用标准品可以准确地对代谢标志物进行定性和定量分析，有助于检测标准化，提高重现性。

所述的诊断试剂盒还包代谢物核磁共振分析试剂、样品前处理流程说明书及代谢物氢谱图前处理和数据分析流程说明书。

所述的核磁共振波谱分析所需试剂包括磷酸缓冲液和重水。

一种血清代谢标记物的定性定量分析方法，通过核磁共振波谱仪对所述血清代谢标记物进行定性和定量分析。该方法具有样本制备简单、分析速度快、重现性强、准确度高等特点。

一种用于区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的装置，所述的装置包括样本采集模块、代谢物定性和定量分析模块、评价模块以及结果输出模块，

样本采集模块：采集待测者血清样本；

代谢物定性和定量分析模块：通过核磁共振波谱仪获得血清代谢物氢谱图，通过软件进行手动相位和基线矫正，结合Chenomx NMR suite软件和人类代谢物组数据库对氢谱图中的代谢物信号进行鉴定，获得丙酮酸、组氨酸和谷氨酰胺的峰值信号，将代谢物相对含量值进行对数转化，然后运用主成分分析考察激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者血清代谢模式的差异；

评价模块：通过三个代谢物相对含量定量比较，得到前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的区分结果；

结果输出模块：输出诊断结果。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种制备区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的诊断试剂的应用和试剂盒及其方法和装置，本发明提供的血清代谢标记物组可用于区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌，具有样本制备简单、检测速度快、重复性和诊断灵敏度高的特点，可以作为传统临床诊断的辅助方法，本发明提供的检测试剂盒可用于区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌，加快诊断速度，提高诊断便利性和标准化，发明提供的血清代谢标记物组中的单个用于区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌时，AUC值均大于0.799。三个代谢物组合运用可以实现更好的诊断区分效果，AUC值为0.883，具有较强的临床诊断意义。

附图说明

图1，基于核磁共振氢谱的血清代谢物指纹图谱。

图2，代谢标记物筛选：（A）基于血清代谢物和主成分分析区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌；（B）基于主成分分析权重值筛选重要代谢标记物；（C）基于火山图分析筛选重要代谢标记物。

图3，激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者血清中代谢标记物相对含量变化：（A）丙酮酸；（B）组氨酸；（C）谷氨酰胺。

图4，单个代谢标记物的接受者操作特性曲线分析：（A）丙酮酸；（B）组氨酸；（C）谷氨酰胺。

图5，基于两个或三个代谢标记物组合的接受者操作特性曲线分析。

具体实施方式

下面结合具体实例进一步说明本发明实质性内容，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

实施例一：激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者血清差异代谢特征分析

患者血清样本采集

在志愿者签署知情同意书后，收集来自上海交通大学附属仁济医院的54例激素敏感性前列腺癌患者和83例去势抵抗性前列腺癌患者的血标本。激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者纳入标准参考中国泌尿外科协会2014年版《前列腺癌诊断治疗指南》。全血样本在室温下静置15分钟后，在4℃下以1024g离心10分钟，分离血清样本迅速置于-80℃冰箱保存备用。

分析步骤

血清样本分析前处理

冰冻血清样本在4^oC下解冻后涡旋10 s，移液枪精确吸取200 μL血清样本置于1.5 mL离心管中并加入250 μL磷酸缓冲液（0.2 mM, Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH = 7.4）和50 μL重水（D₂O）。混合血清溶液经10 s涡旋之后，在4℃下以10,000 g离心15分钟，随后吸取500 μL上清液置于核磁管中以备后续代谢物分析。

核磁共振波谱仪分析

血清样本代谢物氢谱图采用600 MHz核磁共振波谱仪（AVANCE III, Bruker BioSpin,Rheinstetten, Germany）在37℃环境下采集。为了减少血清中大分子物质（比如蛋白质和脂质）的影响，采用固定接收增益值（RG value）的CPMG脉冲序列获取基于核磁共振的血清代谢物图谱。主要的获取参数设置包括：采集数据点，256 K；弛豫衰减时间，4 s；谱宽度，12,335.5 Hz；采集时间，2.66 s/scan。

代谢物定性和定量分析

运用Topspin软件将所有血清代谢物氢谱图进行手动相位和基线矫正（Topspin 3.0,Bruker BioSpin, Rheinstetten, Germany），然后结合Chenomx NMR suite软件（v7.0,Chenomx Inc., Edmonton, AB, Canada）和人类代谢物组数据库（Human MetabolomeDatabase）对氢谱图中的代谢物信号进行鉴定，其中丙酮酸（2.35 ppm，单峰），组氨酸（7.05ppm, 7.80 ppm, 单峰）和谷氨酰胺（2.45 ppm，四重峰）。图1展示前列腺血清样本的氢谱图及代谢物鉴定。代谢物相对含量采用代谢物峰面积相对于总峰面积进行计算。

代谢标记物鉴定和筛选

将代谢物相对含量值进行对数（log₁₀）转化，然后运用主成分分析考察激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者血清代谢模式的差异，如图2A所示，两组患者之间存在明显的代谢模式差异。同时通过代谢物权重值（Loading value）筛选对两组患者分类贡献较大的代谢物，如图2B所示，权重值的阈值设为0.4时，筛选出3个重要代谢物，分别为丙酮酸，组氨酸和谷氨酰胺。从火山图分析结果中同样鉴定出以上3个代谢物在两组患者之间相差倍数以及显著性差异都较大。运用上述代谢物的标准品绘制标准曲线对组织样本中的相应代谢物进行定量分析。如图3所示，通过标准品定量检测，与激素敏感性前列腺癌患者相比，上述3个重要代谢物相对含量在去势抵抗性前列腺癌患者中显著降低。因此，上述3个重要代谢物含量在激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者血清中存在显著差异，可以用于诊断区分两者的代谢标记物。

实施例二：基于ROC曲线评价代谢标记物诊断区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者的性能

根据ROC曲线评价标准，曲线下面积值AUC越接近1，说明诊断效果越好。采用ROC曲线进一步验证上述3个潜在代谢标记物用于诊断区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者的性能。如图4所示，丙酮酸、组氨酸及谷氨酰胺单独用于诊断区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者时，ROC曲线下面积（AUC）值均大于0.799，具有较好的临床诊断意义。如图5所示，如果将上述3个代谢标记物进行组合运用，AUC值均大于0.858。由此可见，上述3个代谢标记物中的单个或多个组合对于诊断区分激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者都具有很好的临床诊断意义。

实施例三：诊断试剂盒的制备

基于本发明提供的血清代谢标记物制备诊断试剂盒，用于辅助激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者进行快速区分诊断，该试剂盒包括如下部分：

代谢标记物的标准品，包括丙酮酸、组氨酸和谷氨酰胺，分别封装。

血清代谢物核磁共振分析试剂，包括磷酸缓冲液和重水，分别封装。

血清样品前处理流程说明书。

血清代谢物氢谱图前处理和数据分析流程说明书。

一种用于区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的装置，所述的装置包括样本采集模块、代谢物定性和定量分析模块、评价模块以及结果输出模块，

样本采集模块：采集待测者血清样本；

代谢物定性和定量分析模块：通过核磁共振波谱仪获得血清代谢物氢谱图，通过软件进行手动相位和基线矫正，结合Chenomx NMR suite软件和人类代谢物组数据库对氢谱图中的代谢物信号进行鉴定，获得丙酮酸、组氨酸和谷氨酰胺的峰值信号，将代谢物相对含量值进行对数转化，然后运用主成分分析考察激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者血清代谢模式的差异；

评价模块：通过三个代谢物相对含量定量比较，得到前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的区分结果；

结果输出模块：输出诊断结果。

各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种血清代谢标记物的检测试剂在制备区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的诊断试剂上的应用,其特征在于，所述的血清代谢标记物为丙酮酸、组氨酸和谷氨酰胺中的一种或几种。

2.根据权利要求2所述的应用,其特征在于，所述的血清代谢标记物为丙酮酸、组氨酸和谷氨酰胺中两种或三种。

3.一种基于权利要求1所述的区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的活检组织代谢物的化学单体或混合物，作为诊断试剂盒的标准品。

4.根据权利要求3所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述的诊断试剂盒还包代谢物核磁共振分析试剂、样品前处理流程说明书及代谢物氢谱图前处理和数据分析流程说明书。

5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述的核磁共振波谱分析所需试剂包括磷酸缓冲液和重水。

6.一种权利要求1所述的血清代谢标记物的定性定量分析方法，其特征在于，通过核磁共振波谱仪对权利要求1所述血清代谢标记物进行定性和定量分析。

7.一种用于区分前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的装置，其特征在于，所述的装置包括样本采集模块、代谢物定性和定量分析模块、评价模块以及结果输出模块，

样本采集模块：采集待测者血清样本；

代谢物定性和定量分析模块：通过核磁共振波谱仪获得血清代谢物氢谱图，通过软件进行手动相位和基线矫正，结合Chenomx NMR suite软件和人类代谢物组数据库对氢谱图中的代谢物信号进行鉴定，获得丙酮酸、组氨酸和谷氨酰胺的峰值信号，将代谢物相对含量值进行对数转化，然后运用主成分分析考察激素敏感性和去势抵抗性前列腺癌患者血清代谢模式的差异；

评价模块：通过三个代谢物相对含量定量比较，得到前列腺癌的激素敏感性和去势抵抗性的区分结果；

结果输出模块：输出诊断结果。

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