CN111789943A - 一种水包油佐剂组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种水包油佐剂组合物，该水包油佐剂组合物包含HLB值为5以下蔗糖酯脂肪酸酯组合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、维生素E和DEAE葡聚糖。本发明的水包油佐剂组合物能快速、高滴度刺激抗原产生抗体，且该高滴度抗体能维持长达三个月。本发明还提供了含有该水包油佐剂组合物和抗原的疫苗组合物。该免疫组合物免疫后产生的副反应小，不含矿物油，没有矿物油的残留。

Description

一种水包油佐剂组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医用配制品领域，涉及免疫佐剂组合物、其制备方法和应用。
背景技术
免疫佐剂(immunologic adjuvant)是制备蛋白类灭活疫苗的重要组成成份，能提高抗原(免疫原)的免疫原性和免疫反应的可持续性，引导机体的免疫系统对抗原产生体液免疫或细胞免疫反应。佐剂的作用主要包括：①免疫调节作用；②抗原提呈作用；③抗原贮存作用；④靶向作用；⑤诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)应答。选择合适的佐剂是提高动物疫苗免疫活性的关键因素。同时为了避免间接对人类的健康产生有害影响考虑，选用佐剂的成分有严格的限制，尽可能少用或者不用注射用白油，不能使用未经安全性试验验证的新成分。
口蹄疫(FMD)为一种对包括家畜(牛、猪、绵羊、山羊等)和多种野生动物的偶蹄类动物传染性极强的病毒疾病。口蹄疫疫苗目前批准使用的是水包油包水的剂型的疫苗，其白油量为50％左右，例如SEPPIC公司的206佐剂，此佐剂制备的口蹄疫疫苗有较好的免疫效果，但存在的问题是抗体产生较慢，不能快速对动物产生保护，另外含有较大量的矿物油也造成其容易发生副反应。
中国专利CN102573900A公开了一种包含有皂苷的佐剂的新疫苗制剂，其公开了如果不加皂苷，单用佐剂联合铝胶，猪的PD50仅为3.59，而国家标准规定的猪口蹄疫疫苗为6PD50，远不能达到标准。可见选择常规的佐剂组分经组合后制备佐剂而生产的口蹄疫疫苗不易达到合格的免疫效果。猪伪狂犬疫苗佐剂组合物组分的选择也存在同样的问题。
DEAE葡聚糖也被作为口蹄疫佐剂使用，但其用量达500mg/头份之多，且抗体维持时间短，因而一直没有被推广，加上当其单独应用时剂量大会产生副作用而影响了其的广泛应用。
因此，现实生产中需要副反应小、抗体产生快，抗体维持时间长的佐剂组合物配制的疫苗。
发明内容
为解决现有技术的缺陷，本发明提供一种水包油佐剂组合物，其特征在于，所述的水包油佐剂组合物包含HLB值为5以下蔗糖酯脂肪酸酯组合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、维生素E和DEAE葡聚糖。
本发明所述的水包油佐剂组合物通过各组分作用后，不仅能保证抗原快速、高滴度地产生免疫反应，且可长时间维持高抗体滴度，能快速有效、长时间地产生保护，且能与不同抗原配合使用，具有抗原广谱性。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物为碳原子为8-28的脂肪酸酯。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯选自蔗糖辛酸酯、蔗糖癸酸酯、蔗糖月桂酸酯、蔗糖肉豆蔻酸酯、蔗糖硬脂酸酯、蔗糖油酸酯、或蔗糖花生四烯酸酯。
作为本发明的一种进一步优选的实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯为日本三菱Ryoto蔗糖酯L195、L595、蔗糖酯s170、蔗糖酯SE-1、蔗糖酯s370、蔗糖酯SE-3，蔗糖酯s570、或蔗糖酯SE-5。
作为本发明的一种进一步优选的实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯选自HLB为1的蔗糖酯的月桂酸组合物、HLB为5的蔗糖酯的月桂酸组合物、HLB为1的蔗糖酯的硬脂酸组合物或HLB为5的蔗糖酯的硬脂酸组合物。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，聚氧乙烯氢化蓖麻油为氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-11、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-20、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-30、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-50、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-60、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-75、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-80、或氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-100。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，聚氧乙烯氢化蓖麻油为BASF的Cremophor RH40、Cremophor RH20或Cremophor RH60或其组合。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，其还包含聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
通过在本发明的水包油佐剂组合物中进一步添加聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物，使得产生抗体滴度显著提高，且该高滴度抗体能维持至三个月以上。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，其不含矿物油。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，所述水包油佐剂组合物包括0.25％W/V-10.0％W/V HLB值为5以下的蔗糖酯，0.25％W/V-10.0％W/V维生素E，1-5％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油，0.25-2％w/v DEAE葡聚糖。
HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度范围为0.25％W/V-10.0％W/V，优选1.0％W/V-5％W/V。
HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度可以任意选自0.25％W/V、0.30％W/V、0.35％W/V、0.40％W/V、0.45％W/V、0.50％W/V、0.55％W/V、0.60％W/V、0.65％W/V、0.70％W/V、0.75％W/V、0.80％W/V、0.85％W/V、0.90％W/V、0.95％W/V、1.0％W/V、1.5％W/V、2.0％W/V、2.5％W/V、3.0％W/V、3.5％W/V、4.0％W/V、4.5％W/V、5.0％W/V、5.5％W/V、6.0％W/V、6.5％W/V、7.0％W/V、7.5％W/V、8.0％W/V、8.5％W/V、9.0％W/V、9.5％W/V、10.0％W/V。
维生素E的浓度可以任意选自0.25％W/V、0.30％W/V、0.35％W/V、0.40％W/V、0.45％W/V、0.45％W/V、0.50％W/V、0.55％W/V、0.60％W/V、0.65％W/V、0.70％W/V、0.75％W/V、0.80％W/V、0.85％W/V、0.90％W/V、0.95％W/V、1.0％W/V、1.5％W/V、2.0％W/V、2.5％W/V、3.0％W/V、3.5％W/V、4.0％W/V、4.5％W/V、5.0％W/V、5.5％W/V、6.0％W/V、6.5％W/V、7.0％W/V、7.5％W/V、8.0％W/V、8.5％W/V、9.0％W/V、9.5％W/V、10.0％W/V。
聚氧乙烯氢化蓖麻油浓度可以任意选自1％w/v、1.5％w/v、2％w/v、2.5％w/v、3％w/v、3.5％w/v、4％w/v、4.5％w/v、5％w/v。
DEAE葡聚糖浓度可以任意选自0.25％w/v、0.3％w/v、0.4％w/v、0.5％w/v、0.6％w/v、0.7％w/v、0.8％w/v、0.9％w/v、1.0％w/v、1.1％w/v、1.2％w/v、1.3％w/v、1.4％w/v、1.5％w/v、1.6％w/v、1.7％w/v、1.8％w/v、1.9％w/v、2.0％w/v。
本发明的水包油佐剂组合物中通过选择上述含量范围的5以下的蔗糖酯、维生素E、聚氧乙烯氢化蓖麻油、DEAE葡聚糖，上述组分之间的任意配比均能刺激抗原产生高滴度抗体。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，所述水包油佐剂组合物还包括0.025％W/V-0.1％W/V聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物浓度可以任意选自0.025％W/V、0.03％W/V、0.04％W/V、0.05％W/V、0.06％W/V、0.07％W/V、0.08％W/V、0.09％W/V、0.1％W/V。
通过在本发明的水包油佐剂组合物中进一步添加上述含量范围的聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物，使得抗体滴度显著增强，且该高滴度抗体能维持至三个月以上。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，所述水包油佐剂组合物包括4％w/v蔗糖酯，5％w/v维生素E，2％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，0.25-2％w/v DEAE葡聚糖。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，所述水包油佐剂组合物包括4％w/v蔗糖酯，5％w/v维生素E，1～2％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，1％w/v DEAE葡聚糖，0.05％w/v聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，所述水包油佐剂组合物包括0.25％W/V-10.0％W/V HLB值为5以下的蔗糖酯，0.25％W/V-10.0％W/V维生素E，1-5％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油，1～2％w/v DEAE葡聚糖。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，所述水包油佐剂组合物包括6％W/V HLB值为5以下的蔗糖酯，8％W/V维生素E，2.5％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油，1～2％w/v DEAE葡聚糖，0.025％W/V-0.1％W/V聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，所述水包油佐剂组合物包括0.25％W/V-10.0％W/V HLB值为5以下的蔗糖酯，0.25％W/V-10.0％W/V维生素E，1-5％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油，1％w/v DEAE葡聚糖。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的水包油佐剂组合物中，所述水包油佐剂组合物包括6％W/V HLB值为5以下的蔗糖酯，8％W/V维生素E，2.5％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油，1％w/v DEAE葡聚糖，0.025％W/V-0.1％W/V聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
本发明还提供了一种所述水包油佐剂组合物的制备方法，所述制备方法采用PIT法(转相乳化法)先将HLB值为5以下蔗糖酯脂肪酸酯组合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、维生素E加热至60℃-80℃，加入预热至60℃-80℃水相，混匀后放冷至室温。
本发明还提供了一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物包含所述的水包油佐剂组合物以及免疫量的抗原；所述抗原为灭活抗原和/或亚单位抗原和/或病毒样粒子抗原，所述水包油佐剂组合物占总体积10％-50％。本发明的疫苗组合物能与多种抗原成分配合，快速、高滴度地刺激抗原产生抗体，且可长时间维持高抗体滴度。
本发明制备的灭活疫苗在注射中不会引起猪注射部位发炎红肿，且具有较好的稳定性，与疫苗联用可获得较好的免疫效力，可实现大规模生产使用。
本发明疫苗组合物中水包油佐剂组合物其体积占比可以任意选自10％V/V、15％V/V、20％V/V、25％V/V、30％V/V、35％V/V、40％V/V、45％V/V、50％V/V。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述抗原为猪口蹄疫病毒抗原、猪伪狂犬病毒抗原中的一种或多种。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述灭活抗原选自口蹄疫抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒抗原、伪狂犬病毒抗原。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述口蹄疫抗原为O/MYA98病毒样粒子抗原，所述O/MYA98病毒样粒子抗原含量为100微克/头份；所述伪狂犬病毒抗原为HN1201株灭活抗原，所述HN1201株灭活抗原含量为灭活前病毒含量为2×106.5TCID50；所述水包油佐剂组合物和抗原比例为体积比1:1。
在本发明的某些实施例中，疫苗组合物可包括一种或多种其它组分，诸如表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物进一步包括表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物。
本发明还提供了疫苗组合物的制备方法，所述的制备方法为，将抗原溶液和佐剂溶液混匀即可制备成为疫苗组合物。
发明的有益效果
1、用本发明的佐剂制备的口蹄疫疫苗和伪狂犬疫苗，免疫仔猪后产生抗体快，免疫后7天抗体达产生保护作用的抗体水平。
2、免疫后抗体可以维持，对有效抗体持续期维持3个月以上。
3、制备方法采用PIT法制备，设备要求低，操作简单。
4、免疫后产生的副反应小。
5、本发明佐剂不含矿物油，没有矿物油的残留。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
术语“佐剂”是指当连同抗原投与时，使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。佐剂介导的免疫反应增强可通过所属技术领域中已知的任何方法评估，包括(不限于)以下一种或多种方法：(i)与对单独抗原免疫作用起反应所产生的抗体数相比，对佐剂/抗原组合免疫作用起反应所产生的抗体数增加；(ii)识别抗原或佐剂的T细胞数增加；(iii)一种或多种I型细胞因子的含量增加；和(iv)活激发之后，体内(in vivo)的保护作用。与经单独抗原激发的受试者相比，当受试者经抗原与佐剂激发时，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数(例如抗体效价或T细胞产生增加至少10％，则认为免疫反应增强。在本发明的某些实施例中，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％或至少1000％，则免疫反应增强。
如本文所述“HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物”：是指蔗糖与脂肪酸经过酯化反应所得的混合物，蔗糖有8个-OH基团，可以与脂肪酸反应形成不同HLB值的蔗糖脂肪酸酯组合物，本发明所述的脂肪酸酯优选碳原子为8-28的脂肪酸，可以举例，辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、花生四烯酸。HLB值为5以下的蔗糖脂肪酸酯组合物可以举例商品化的，例如日本三菱Ryoto蔗糖酯，可以选择的型号，L195，蔗糖酯的月桂酸组合物，其HLB值为1，L595，蔗糖酯的月桂酸组合物，其HLB值5；蔗糖酯s170，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为1，中国对应的蔗糖酯型号为SE-1，蔗糖酯s370，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为3s，中国对应的蔗糖酯型号为SE-3，蔗糖酯s570，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为5，中国对应的蔗糖酯型号为SE-5。
术语“HLB值(Hydrophile-Lipophile Balance Number)”称亲水疏水平衡值，也称水油度。表面活性剂为具有亲水基团和亲油基团的两亲分子，HLB值是表面活性剂分子中亲水基和亲油基之间的大小和力量平衡程度的量，也称为表面活性剂的亲水亲油平衡值。
聚氧乙烯氢化蓖麻油又称为氢化蓖麻油聚氧乙烯醚、乙氧基化氢化蓖麻油、PEG-n氢化蓖麻油，包括氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-11、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-20、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-30、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-50、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-60、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-75、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-80、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-100；聚氧乙烯氢化蓖麻油可以举例商品化的，例如BASF的Cremophor RH40、Cremophor RH20或Cremophor RH60其组合，其包括了结构相同但不同商品名的类似物。
如本文所述，所述“DEAE葡聚糖”是指葡聚糖修饰乙二胺乙基修饰，分子量为50000到5×106。优选的，所述DEAE葡聚糖的分子量为500000-1.5×106。其使用量为每剂量10mg至每剂量300mg、每剂量10mg至每剂量100mg、每剂量50mg至每剂量200mg、每剂量10mg至每剂量200mg、每剂量50mg至每剂量100mg。
如本文所述，“聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物”包括但不限于聚肌苷酸:聚胞苷酸、“PICKCa”、聚肌胞钠盐(CAS 42424-50-0)、壳寡糖-卡那霉素-聚肌胞钠盐复合物。其中PICKCa用语是一般性地指称由PIC、卡那霉素和钙所构成的组合物。“聚I：C”或“PIC”等用语是指含有聚核糖肌苷和聚核糖胞苷核酸的组合物，亦分别称作为聚肌苷酸-聚胞苷酸。聚肌胞钠盐CAS 42424-50-0又称壳寡糖-卡那霉素-聚肌胞钠盐复合物。使用量通常为每剂量约1微克至约5000微克。其使用量亦可为每剂量约1微克至约4000微克、每剂量约1微克至约3000微克、每剂量约1微克至约2000微克及每剂量约1微克至约1000微克。其使用量亦可为每剂量约5微克至约750微克、每剂量约5微克至约500微克、每剂量约5微克至约200微克、每剂量约5微克至约100微克、每剂量约15微克至约100微克及每剂量约30微克至约75微克。
术语“疫苗组合物”是可用于在接受者中诱发保护性免疫的组合物。因此，在受试者已接种抗原之后，疫苗可阻止、延缓或减轻暴露给相同或相关抗原的受试者的疾病发展严重程度(相对于未接种疫苗的受试者)。通过疫苗所提供的保护性免疫可以是体液(抗体介导)免疫或细胞免疫，或两者均能产生。
术语“抗原”是指当引入受试者中时，可由宿主的免疫系统识别并且能够诱发免疫反应和产生保护性免疫的药剂。抗原包括(不限于)在病原体的表面或受感染细胞的表面或肿瘤细胞的表面上天然表达的“表面抗原”。抗原可诱发保护性免疫的疾病病原体和/或病状的非限制性实例为猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒。
在某些实施例中，抗原是猪伪狂犬病毒抗原。
在某些实施例中，抗原是口蹄疫蛋白。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、DEAE葡聚糖溶液的制备
称取DEAE葡聚糖(分子量5×105)5.0g，加入注射用水100ml，搅拌使DEAE葡聚糖全部溶解，含量为5％w/v。
实施例2聚肌苷酸:聚胞苷酸水溶液
聚肌苷酸:聚胞苷酸(杭州美亚药业有限公司)0.5g加入到100ml水中，搅拌使其溶解，0.22微米滤膜过滤后备用，含量为0.5％w/v。
实施例3、本发明佐剂配制的口蹄疫疫苗的免疫效果试验
按照表1制备水包油佐剂组合物，制备方法为蔗糖酯(日本三菱RyotoL195)、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40和维生素E(维生素E醋酸酯，德国巴斯夫)搅拌均匀，加热至75℃左右，加入50g加热至75℃的PH为7.0的PBS水溶液，用在搅拌状态下放冷至室温，加入实施例1制备的DEAE葡聚糖溶液，用PH为7.0的PBS水溶液调整至100ml与口蹄疫病毒样粒子抗原(O/MYA98株，由VP0、VP1、VP3蛋白组装而成，公开于CN104404074A)按照体积比1:1(抗原量为100微克/剂量)，制备成疫苗组合物，同时用seppic公司的双相206佐剂为对比疫苗。
表1水包油佐剂组合物的处方(水包油佐剂组合物总体积100ml)
Figure BDA0002020404260000101
挑选28日龄抗体阴性的仔猪68头，分为16组，试验组和对照组每组5头，对比例组每组3头，按照表3分组注射对应疫苗，2ml/头，注射后第一个月每周用液相阻断ELISA(液相阻断ELISA试剂盒，兰州兽医研究所，抗体效价大于1:180判断为阳性)测定抗体效价，然后3个月测定一次。详细结果见表3(表2给出的是各组所有猪抗体的平均值)。
表2口蹄疫疫苗的免疫效果
Figure BDA0002020404260000111
试验结果表明：本发明的佐剂试剂B～H佐剂相对于双相佐剂206而言，产生抗体较快，抗体滴度超过或远超过双相佐剂206；佐剂A在免疫后第21天能产生高滴度的抗体，在免疫后第28天抗体水平超过同期双相佐剂206，高滴度抗体持续时期也更长。
试验例I其组成中没有DEAE葡聚糖，抗体产生的较慢，下降得也较快；C～H佐剂制备的疫苗免疫后一周就能产生保护作用，而对比例1～3基本没有佐剂的效果，对比例4和对比例5产生抗体很快，但抗体下降也快。
本发明的佐剂中进一步加入聚肌苷酸:聚胞苷酸后效果得到显著增强，增强的效果可长时期持续(可至免疫后三个月)。
实施例4、本发明佐剂制备的口蹄疫疫苗的免疫效果试验
按照表3制备水包油佐剂组合物，制备方法为蔗糖酯(日本三菱RyotoL195)、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40和维生素E(维生素E醋酸酯，德国巴斯夫)搅拌均匀，加热至75℃左右，加入50g加热至75℃的PH为7.0的PBS水溶液，用在搅拌状态下放冷至室温，加入实施例1制备的DEAE葡聚糖溶液，用PH为7.0的PBS水溶液调整至100ml与口蹄疫病毒样粒子抗原(O/MYA98)按照体积比1:1(抗原量为100微克/剂量)，制备成疫苗组合物。
表3水包油佐剂组合物的处方
Figure BDA0002020404260000121
挑选28日龄抗体阴性的仔猪24头，分为8组，每组3头，按照表3分组注射对应疫苗，2ml/头，注射后第一个月每周用液相阻断ELISA(液相阻断ELISA试剂盒，兰州兽医研究所，抗体效价大于1:180判断为阳性)测定抗体效价，然后3个月测定一次。详细结果见表4(表4给出的是各组所有猪抗体的平均值)。
表4口蹄疫疫苗的免疫效果
Figure BDA0002020404260000131
试验结果表明，不同配比不同的水包油佐剂组合物均能免疫一周就能产生保护作用，而且发明的佐剂中进一步加入聚肌苷酸:聚胞苷酸后效果得到显著增强，增强的效果可长时期持续(可至免疫后三个月)。当本发明DEAE葡聚糖溶液(ml)用量在20ml(水包油佐剂组合物总体积100ml)甚至更高时，可使免疫后7天的抗体滴度达到阳性。
实验例5本发明的佐剂对伪狂犬疫苗组合物的制备和免疫试验
选用猪伪狂犬病毒HN1201株按照专利CN104004774制备抗原，按照实施例4表2的水包油佐剂组合物以体积比1:1，制备成疫苗组合物(猪伪狂犬病毒灭活前病毒含量为2×106.5TCID50)，同时用seppic公司的双相206佐剂相同抗原制备对比疫苗。
将21日龄PRV抗体阴性仔猪35头随机分成7组，5头/组，按照表5注射实施例3表1中佐剂制备的疫苗，免疫猪伪狂犬病病毒疫苗2ml/头。对照组接种DMEM培养基2ml/头。每周参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定各组的中和抗体效价(试验结果见表5)。
表5猪伪狂犬疫苗的制备以及中和抗体的测定
Figure BDA0002020404260000141
中和抗体测定结果显示，本发明的水包油佐剂组合物制备的疫苗，免疫后能较早产生中和抗体，第二周已经基本接近中和抗体的最高值。疫苗VI、疫苗VII虽然也能产生中和抗体，但中和抗体维持的时间较短，疫苗IV与206佐剂制备的疫苗V产生中和抗体较慢，不利于快速对猪只产生保护。
实施例6本发明的佐剂对伪狂犬疫苗组合物的制备和免疫试验
选用猪伪狂犬病毒HN1201株按照专利CN104004774制备抗原，按照实施例4表3的水包油佐剂组合物以体积比1:1，制备成疫苗组合物(猪伪狂犬病毒灭活前病毒含量为2×106.5TCID50)，同时用seppic公司的双相206佐剂相同抗原制备对比疫苗。
将21日龄PRV抗体阴性仔猪24头随机分成8组，3头/组，按照表6注射实施疫苗，免疫猪伪狂犬病病毒疫苗2ml/头。对照组接种DMEM培养基2ml/头。参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定各组的中和抗体效价(试验结果见表6)
表6猪伪狂犬疫苗的制备以及中和抗体的测定
Figure BDA0002020404260000151
中和抗体测定结果显示，不同配比的水包油佐剂组合物制备的疫苗，免疫后能较早产生中和抗体，免疫三个月依然有很高的抗体滴度。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种水包油佐剂组合物，其特征在于，所述的水包油佐剂组合物包含HLB值为5以下蔗糖酯脂肪酸酯组合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油、维生素E和DEAE葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的水包油佐剂组合物，其特征在于，其还包含聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的水包油佐剂组合物，其特征在于，其不含矿物油。
4.根据权利要求3所述的水包油佐剂组合物，其特征在于，所述水包油佐剂组合物包括0.25％W/V-10.0％W/V HLB值为5以下的蔗糖酯，0.25％W/V-10.0％W/V维生素E，1-5％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油，0.25-2％w/v DEAE葡聚糖；优选地，所述水包油佐剂组合物还包括0.025％W/V-0.1％W/V聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
5.根据权利要求4所述的水包油佐剂组合物，其特征在于，所述水包油佐剂组合物包括4％w/v蔗糖酯，5％w/v维生素E，2％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，0.25-2％w/v DEAE葡聚糖；或所述水包油佐剂组合物包括4％w/v蔗糖酯，5％w/v维生素E，1～2％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40，1％w/v DEAE葡聚糖，0.05％w/v聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
6.根据权利要求2所述的水包油佐剂组合物，其特征在于，所述水包油佐剂组合物包括0.25％W/V-10.0％W/V HLB值为5以下的蔗糖酯，0.25％W/V-10.0％W/V维生素E，1-5％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油，1～2％w/v DEAE葡聚糖；或所述水包油佐剂组合物包括6％W/V HLB值为5以下的蔗糖酯，8％W/V维生素E，2.5％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油，1～2％w/v DEAE葡聚糖，0.025％W/V-0.1％W/V聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物；优选地，所述水包油佐剂组合物包括0.25％W/V-10.0％W/V HLB值为5以下的蔗糖酯，0.25％W/V-10.0％W/V维生素E，1-5％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油，1％w/v DEAE葡聚糖；或所述水包油佐剂组合物包括6％W/V HLB值为5以下的蔗糖酯，8％W/V维生素E，2.5％w/v聚氧乙烯氢化蓖麻油，1％w/v DEAE葡聚糖，0.025％W/V-0.1％W/V聚肌苷酸:聚胞苷酸或其衍生物。
7.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物包含权利要求1-7所述的水包油佐剂组合物以及免疫量的抗原；所述抗原为灭活抗原和/或亚单位抗原和/或病毒样粒子抗原，所述水包油佐剂组合物占总体积10％-50％。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述抗原选自口蹄疫抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒抗原、伪狂犬病毒抗原。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述口蹄疫抗原为O/MYA98抗原，所述O/MYA98病毒样粒子抗原含量为100微克/头份；所述伪狂犬病毒抗原为HN1201株灭活抗原，所述HN1201株灭活抗原含量为灭活前病毒含量为2×106.5TCID50；所述水包油佐剂组合物和抗原比例为体积比1:1。
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