CN111778260A - 一种水稻耐旱基因OsUGT40及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻耐旱基因OsUGT40，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述基因是通过反转录PCR技术从水稻中克隆获得。本发明还公开了所述基因OsUGT40在提高植物耐干旱性中的应用，实验证实利用本发明的基因OsUGT40构建植物过表达载体，进行植物转基因操作获得的转基因植物耐旱性得到显著提高，预示本发明的基因OsUGT40的实施将能创造新型耐干旱植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。

Description

一种水稻耐旱基因OsUGT40及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐旱基因及其应用，尤其涉及一种水稻耐旱相关的基因OsUGT40及其在提高植物耐旱性中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)作为一种经济作物，是养活世界上大部分人口的主要粮食作物。由于气候变化和淡水短缺，干旱已成为影响全世界农业的最严重的环境压力，特别是对水稻这样的喜水的大田作物。因此，在干旱胁迫条件下提高水稻的耐旱性，从而提高水稻产量将具有重要意义。

干旱胁迫是影响植物生长发育的一个重要逆境因子(Hong et al.,2020)，干旱对于植物的影响主要分为以下几方面。首先，是对植物的形态影响。根作为与干旱直接相关的植物器官，对地上植物生长发育及产量具有重要影响(Zhou et al.,2018)。根系越发达，在干旱来临时抵抗这种胁迫的能力越强。叶片作为负责植物蒸腾和同化的重要器官，在干旱胁迫条件下，其形态也会发生一定变化，比如叶片会变小变厚、叶片气孔变小、叶肉细胞变小、排列紧密等(Bastide et al.,1993)。其次，干旱也会对植物光合作用效率造成影响(Santos et al.,2018；Yang et al.,2019)。在轻微干旱条件下，气孔关闭是影响光合效率的主要原因(Medeiros et al.,2016)。在严重干旱条件下，叶绿体本身结构发生了变化，与光合作用相关的一系列反应发生变化，从而导致光合作用效率降低(Liu et al.,2018)。

目前国内外的研究指出，在干旱胁迫环境下，植物将发展出一系列复杂的应对缓解机制，其对干旱的应答主要依靠三条信号转导途径。第一种是依赖脱落酸(ABA)的途径：植物在干旱条件下会诱导产生ABA，ABA信号影响下游一系列基因表达，从而对干旱做出应答(Lim et al.,2015；Cornish et al.,1985)。第二种是不依赖于ABA的途径：这条途径主要由转录因子DREB2A控制，它能够与下游耐逆相关基因的启动子中DRE元件结合，从而诱导抗逆基因的表达(Mizoi et al.,2019)。第三种是部分依赖ABA的途径：研究发现拟南芥的RD29A是一个脱水响应基因，它的启动子内存在ABA响应元件和应答干旱的脱水元件(Leeet al.,2016)。ABA响应元件参与对干旱的慢应答，而脱水元件参与对干旱的快速应答。如今随着生物技术的快速发展，对于植物耐旱基因和信号通路的研究，将是今后植物耐旱研究的重点。

目前，植物的耐旱基因及其应用研究主要来自于模式植物拟南芥，对重要粮食作物水稻耐旱基因的发现很少。因此，从水稻中克隆并鉴定具有耐旱功能的植物基因，明确这些基因发挥耐性的作用，从科学层面上有助于加深理解植物耐旱的分子机理，丰富耐旱基因资源；从应用层面上，这些挖掘的新的耐旱基因将被用到作物耐旱新品种培育中，有助于通过遗传操作手段改良农作物，提高抗逆能力。

基于此，申请人从水稻克隆了诸多耐旱相关的基因序列，并经过实验研究确定了一段与耐旱相关的基因序列，命名为水稻耐旱基因OsUGT40，同时证明了该基因序列能够增强植物的耐旱能力。经过检索，有关水稻耐旱基因OsUGT40及其在提高植物耐旱性的应用未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种水稻耐旱相关的基因OsUGT40及其在提高植物耐旱性中的应用。

本发明所述的水稻耐旱相关基因，其特征在于：所述基因命名为水稻耐旱基因OsUGT40，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；该水稻耐旱基因OsUGT40编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了所述的水稻耐旱基因OsUGT40在提高植物耐旱性中的应用。

其中：所述植物优选是十字花科植物；最优选的实施方式是：所述十字花科植物是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。

本发明提供的水稻耐旱基因OsUGT40序列能够显著增强植物的耐旱能力。

利用SEQ ID No.3(UGT40-F)和SEQ ID No.4(UGT40-R)所示的引物序列，通过RT-PCR技术从水稻中克隆出耐干旱基因OsUGT40，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，可获得转基因植物。进一步的实验结果显示：本发明提供的水稻基因OsUGT40可以显著提高转基因植物的耐旱性(见图1、图2、图3、图4、图5)。预示本发明提供的水稻基因OsUGT40的实施将能创造新型耐旱植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。

附图说明

图1.OsUGT40受PEG胁迫的诱导表达情况图。

水稻幼苗分别进行不同时间段的PEG(模拟干旱)处理。提取RNA，反转录为cDNA，用qPCR检测OsUGT40在PEG处理下的诱导表达量。结果发现在用PEG处理后，OsUGT40表达量明显上调。说明OsUGT40基因可能参与对干旱胁迫的响应。

图2.转基因株系在含有不同浓度Mannitol的培养基上子叶转绿的统计图。

其中：WT为野生型拟南芥对照株系；OE-15和OE-26为水稻OsUGT40基因过表达的拟南芥转基因株系。

在基本MS培养基上添加mannitol模拟渗透胁迫，在添加不同浓度Mannitol的渗透胁迫条件下，比较WT、OE-15、OE-26的种子萌发14天后子叶转绿的比率，统计结果说明了在不含有Mannitol的对照培养基上，转基因株系与野生型的子叶转绿比率没有差别；在含有Mannitol的培养基上，OsUGT40过表达转基因植株表现出比野生型更强的耐受渗透胁迫的能力。

图3.在Mannitol处理下各转基因株系主根生长表型图(上)和统计图(下)。

其中：WT为野生型拟南芥对照株系；OE-15和OE-26为水稻OsUGT40基因过表达的拟南芥转基因株系。

在基本MS培养基上添加mannitol模拟渗透胁迫，在添加不同浓度Mannitol的渗透胁迫条件下，比较WT、OE-15、OE-26各株系的主根生长情况。表型结果(表型图)和统计结果(统计图)都说明在不含有Mannitol的对照培养基上，转基因株系与野生型的主根生长没有差别；在含有Mannitol的培养基上，OsUGT40过表达转基因植株的主根生长优于野生型，表现出比野生型更强的耐受渗透胁迫的能力。因此OsUGT40过表达后提高了植物根部的耐逆性。

图4.在干旱处理下转基因株系的生长表型图。

其中：WT为野生型拟南芥对照株系；OE-14、OE-15和OE-26为OsUGT40基因过表达的拟南芥转基因株系。

为了调查OsUGT40基因增强耐旱的功能，观察了在土壤干旱环境下各株系的生长对比情况。实验结果指出，在干旱处理前WT及各株系的生长情况基本一致。但是在对WT及转基因各株系干旱处理2周以后，发现WT存活率较低，而过表达株系存活率较高。这表明OsUGT40过表达后增强了植物的耐逆性，能更好的抵抗干旱胁迫。

图5.耐逆途径相关基因表达情况图。

其中：WT为野生型拟南芥对照株系；OE-14、OE-15和OE-26为OsUGT40基因过表达的拟南芥转基因株系。

为了更进一步探究OsUGT40基因的耐旱机制，实验检测了转基因拟南芥受到Mannitol渗透胁迫时耐逆相关基因的表达情况。此处检测的耐逆相关基因包括DREB2A、AIL1、COR47、CAT1。结果显示，在没有处理之前各基因表达量基本一致；在Mannitol处理后过表达体中DREB2A、AIL1、COR47、CAT1基因都有明显上调。进一步证明OsUGT40在面对逆境胁迫时能够通过上调耐逆基因表达来增强植物的耐旱性。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中涉及的质粒载体、菌株、试剂盒来源：

pBluescript II SK(+)载体(简称pBSK)、植物表达载体pBI121，均购自于北京鼎国生物有限公司。

大肠杆菌和农杆菌GV3101：购自于北京Transgene生物公司。

TRIzol试剂盒、反转录试剂盒、高保真PrimeSTAR DNA：购自于大连TaKaRa公司。

其它所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1：克隆水稻基因OsUGT40

水稻基因OsUGT40具体克隆步骤是：

合成两条寡核苷酸引物。

正向引物为UGT40-F：5’-GGATCCATGGCGCCAACGCTGGAG-3’，

反向引物为UGT40-R：5’-GAGCTCTTACTGTTCTGGAGCGTTCTTGGC-3’。

利用TRIzol试剂盒提取水稻叶片RNA，使用反转录PCR方法和上述两个引物扩增OsUGT40基因的DNA序列。

将扩增的DNA片段用限制性内切酶BamH I和Sac I酶切，后连入经过同样的两种酶酶切的pBluescript II SK(+)载体中，构建成中间载体，称为pKUGT40。然后用pKUGT40载体作为基因模板，使用上述两个引物进行PCR扩增以及限制性内切酶BamH I+Sac I双酶切验证，验证OsUGT40序列是否被克隆。后进行克隆序列测定，并进行序列信息与特性分析，确定并命名为水稻基因OsUGT40。

该OsUGT40基因序列为1506bp的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；该水稻基因OsUGT40的DNA序列编码由501个氨基酸组成的55.2kDa蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

实施例2：水稻基因OsUGT40的转基因植株获得和耐旱性证明

1.水稻OsUGT40基因转入拟南芥获得拟南芥过表达体

(1)拟南芥过表达载体构建：中间载体pKUGT40经过限制性内切酶BamH I和Sac I双酶切后，获得带有上述两种限制性内切酶酶切粘性末端的DNA序列。与此同时，用相同的两种限制性内切酶酶切pBI121载体。将酶切后的DNA片段和酶切后的载体连接，得到以CaMV35S启动子驱动OsUGT40基因过表达的植物表达载体。

(2)拟南芥过表达体的获得：农杆菌菌株GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的含有水稻基因OsUGT40的拟南芥过表达载体转入农杆菌菌株GV3101。然后利用浸花法(一种公开的通用方法)，使含有OsUGT40基因的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待拟南芥长出的角果成熟之后，收集T1代种子并在筛选培养基(MS基本培养基附加30mg/L卡那霉素)上进行筛选，将能够正常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养。分别收获其T2代种子再进行下一轮的卡那霉素筛选，挑选出绿苗：白苗为3∶1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子得到T3代。对每一单株的部分种子再使用筛选培养基进行筛选，在筛选培养基上为全绿的株系，即为纯合的过表达转基因株系。

2.转基因植株的分子鉴定

拟南芥过表达体鉴定：利用反转录PCR方法检测OsUGT40基因在拟南芥过表达植株中的表达量。选取在拟南芥中OsUGT40表达量高的至少两个株系，进行后续的验证工作。

3.OsUGT40基因的耐旱性功能验证

(1)OsUGT40基因受PEG诱导上调表达。将一周大的水稻野生型中花11，利用20％PEG处理0、6、12和24h，相应时间点取材，提取RNA，通过定量PCR检测该基因的表达水平。

结果见图1。结果显示，在PEG处理12h时，OsUGT40表达水平最高。通过该实验说明PEG处理能明显诱导OsUGT40的表达，预示着该基因可能参与水稻抗旱。

(2)Mannitol处理实验观察拟南芥幼苗子叶转绿。将同一时期收获的野生型、过表达体拟南芥的种子进行灭菌后，先用75％的酒精洗1min，然后用10％的次氯酸钠溶液洗10分钟，最后用经过灭菌的去离子水洗4-5次，然后均匀点种至基本MS培养基、含不同浓度Mannitol的MS培养基中，28度培养，连续统计子叶转绿的情况。

结果见图2。图中统计结果显示在基本MS培养基的对照条件下，WT与OE-15、OE-26子叶转绿比率是相似的。在含不同度Mannitol的渗透胁迫条件下，OE-15、OE-26子叶转绿比率明显超过WT。这说明OsUGT40基因参与了植物对渗透胁迫的响应，以至于基因过表达以后增强了植株对逆境的耐受性，提高了幼苗子叶的转绿。证明水稻基因OsUGT40过表达后使得转基因植株表现出对干旱胁迫较强的耐受性。

(3)Mannitol处理实验观察OsUGT40转基因拟南芥根长。将经过灭菌的拟南芥种子铺至基本MS培养基中，4度低温处理3天后，在组培室内垂直培养3-4天，待根长至1cm左右时，将生长状态基本一致的幼苗栽至含有不同浓度Mannitol的MS培养基中，继续垂直培养14天，观察拍照，并统计各株系的根伸长量。

结果见图3。在基本MS培养基中，转基因拟南芥和野生型株系的根长基本一致，没有差异。但是在含有不同浓度Mannitol的MS培养基中，OsUGT40过表达拟南芥株系OE-15、OE-26的主根根长明显比WT长。这说明拟南芥转入OsUGT40基因以后使植物的耐旱性更强，进而加快了植物根系生长。这也进一步说明了OsUGT40在增强耐旱性方面的作用。证明了水稻的OsUGT40基因转入拟南芥后也能增强拟南芥的根的耐旱性。

(4)OsUGT40基因过表达系在土壤干旱处理后观察转基因拟南芥耐旱性。

拟南芥的野生型WT及OsUGT40转基因过表达株系OE-14、OE-15和OE-26的种子，在MS培养基萌发和生长两周后，转至土壤中。然后进行2周的干旱处理，观察拟南芥生长情况。干旱处理前后分别拍照。

结果见图4，在干旱处理前野生型及过表达株系OE-14、OE-15和OE-26生长情况基本一致。但在经过干旱处理后，发现WT存活率较低，而过表达株系存活率较高。这表明在拟南芥中OsUGT40过表达后增强了植物的耐旱性，能更好地抵抗干旱胁迫。

(5)检测300mM Mannitol处理OsUGT40过表达株系后抗旱相关基因的表达情况。

拟南芥的野生型WT及OsUGT40转基因过表达株系OE-14、OE-15和OE-26的种子，在MS培养基萌发和生长两周。每个株系取等量的幼苗，转至含300mM Mannitol的溶液中处理一定时间，提取各株系RNA，进行荧光定量PCR分析，调查逆境相关基因的表达情况。

结果见图5，在未处理的对照组，OsUGT40OE-14、OE-15和OE-26与WT中的DREB2A、AIL1、COR47、CAT1表达量并无显著差异。但经过300mM Mannitol处理之后，DREB2A、AIL1、COR47、CAT1基因在OE-14、OE-15和OE-26表达量均明显超过野生型，特别是在OE-15和OE-26这两个株系中更加明显，因为这两个株系中转入的OsUGT40基因表达水平更高。这些结果说明来源于水稻的OsUGT40基因增强植物的抗旱性，可能是通过正调控这些抗旱相关基因实现的。

序列表

<110>山东大学

<120>一种水稻耐旱基因OsUGT40及其应用

<141>2020-07-08

<160>4

<210>1

<211>1506

<212>DNA

<213>水稻（Oryza sativa L.）

<221>水稻耐旱基因OsUGT40的核苷酸序列

<222>（1）…（1506）

<400> 1

atggcgccaa cgctggagtc cgtttctgct acgtcaccgc cgccgccgcc gccgccgcat 60

ttcgtcatcg tccccttgcc ggcgcagggc cacaccatcc ccatggtcga cctcgcgcgc 120

ctcctcgcgg agcgcggcgc ccgcgccagc ctcctcgtca cgcccgtgaa cgccgcgcgc 180

ctgcgcggcg ccgccgacct cgccgtgcgc gccgagctgc cgctcgagat agtggaggtc 240

ccgttcccgc cgtcggccgc cgacgccggc ctccctccgg gcgtcgagaa cgtcgaccag 300

atcaccgact acgcccactt ccgcccgttc ttcgacgtca tgcgcgacct cgccgcgccg 360

ctcgaggcgt acctgcgcgc gctgccggcg ccgccgagct gcatcatctc cgactggtcc 420

aactcgtgga cggccggcgt ggcgcgccgc gccggcgtgc cgcggctgtt cttccatggc 480

ccgtcgtgct tctactccct ctgcgacctc aacgccgccg cgcacgggct gcagcagcag 540

gccgacgacg acaggtacgt cgtgccgggc atgccggtgc gtgtggaggt gaccaaggac 600

acgcaaccag gattcttgaa ctcgccaggg tgggaggact tacgggacgc ggccatggag 660

gccatgcgca cggccgacgg cgcggtggtg aacacgttcc tggacctcga ggacgagttc 720

atcgcgtgct acgaggccgc gctcggcaag ccggtgtgga cgctggggcc gttctgcctc 780

tacaaccggg acgccgatgc catggcgtcg cgcgggaaca cgcccgacgt cgctcagagc 840

gcgatcacca catggctcga cgccatggac accgactccg tcatctacgt caactttggc 900

agcctcgccc gcaaggtgcc caagtacttg ttcgaggtcg gccatggcct cgaggactcc 960

ggcaagccgt tcatctgggt ggtgaaggtg tcggaggtgg ccacgccgga ggtgcaagaa 1020

tggctgtccg cgctggaggc ccgtgtggcg gcgcgcggcc tcgtggtccg cggctgggcg 1080

ccgcagctcg ccatcctgtc gcaccgcgcc gtcggtggct tcgtcaccca ctgcggctgg 1140

aactcgatgc tggagtccat cgcccatggc gtccccgtcg tgacgtggcc gcacttctcc 1200

gaccagttcc tgaacgagcg gctcgccgtc gacgtgctcg gcgtcggcgt gccggtcggc 1260

gtgacggcgc ccgtgctgct gttcggcgac gaggccatgg cggtcacccg gggtgacgtc 1320

gcgcgggcgg tgtcaaagct catggacagc ggcgaggccg agtccgacga gaggaggagg 1380

aaggcgaagg agtacgggga gaaagctcgc agagccatgg agaaaggagg atcctcgtac 1440

gaaagcctga cgcagctgat acacagcttc accctgcagg gagccaagaa cgctccagaa 1500

cagtaa 1506

<210> 2

<211> 501

<212> RNA

<213>人工序列

<221>水稻耐旱基因OsUGT40编码的氨基酸序列

<222>（1）…（501）

<400> 2

MAPTLESVSA TSPPPPPPPH FVIVPLPAQG HTIPMVDLAR LLAERGARAS LLVTPVNAAR 60

LRGAADLAVR AELPLEIVEV PFPPSAADAG LPPGVENVDQ ITDYAHFRPF FDVMRDLAAP 120

LEAYLRALPA PPSCIISDWS NSWTAGVARR AGVPRLFFHG PSCFYSLCDL NAAAHGLQQQ 180

ADDDRYVVPG MPVRVEVTKD TQPGFLNSPG WEDLRDAAME AMRTADGAVV NTFLDLEDEF 240

IACYEAALGK PVWTLGPFCL YNRDADAMAS RGNTPDVAQS AITTWLDAMD TDSVIYVNFG 300

SLARKVPKYL FEVGHGLEDS GKPFIWVVKV SEVATPEVQE WLSALEARVA ARGLVVRGWA 360

PQLAILSHRA VGGFVTHCGW NSMLESIAHG VPVVTWPHFS DQFLNERLAV DVLGVGVPVG 420

VTAPVLLFGD EAMAVTRGDV ARAVSKLMDS GEAESDERRR KAKEYGEKAR RAMEKGGSSY 480

ESLTQLIHSF TLQGAKNAPE Q 501

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<221> UGT40-F

<222>（1）…（24）

<400> 3

ggatccatgg cgccaacgct ggag 24

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<221> UGT40-R

<222>（1）…（30）

<400> 4

gagctcttac tgttctggag cgttcttggc 30

Claims (4)

1.一种水稻耐旱相关基因，其特征在于：所述基因命名为水稻耐旱基因OsUGT40，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；该水稻耐旱基因OsUGT40编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述的水稻耐旱基因OsUGT40在提高植物耐旱性中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物是十字花科植物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。

Images