CN111778235A - 一种微生物的固化和连续培养方法 - Google Patents

Abstract

一种微生物的固化和连续培养方法，属于生物湿法冶金领域。微生物的固化方法通过使用下进上出的循环回流方式进行固化操作，并且在该过程中采用较高的初始接种率，并随着接种次数的增加而逐渐降低接种率，从而使得微生物快速地附着在载体上，在短时间内完成固化。随后试验证实，在不充气的条件下，采用上进下出方式可以实现微生物的连续快速培养，大大节约充气成本。本申请中提出的方法可以快速进行微生物的固化和连续培养，从而有助于将其应用于生物湿法冶金。

Description

一种微生物的固化和连续培养方法

技术领域

本申请涉及细菌培养领域，具体而言，涉及一种微生物的固化和连续培养方法。

背景技术

生物湿法冶金技术(又称生物浸出技术)是利用微生物在液体环境中从矿石里浸取有用金属的一种技术。通常地，该技术主要通过微生物的氧化作用而实现。因此，该技术的关键是快速、高效地培养微生物。

发明内容

为了解决微生物培养慢的问题，本申请提供了一种微生物的固化和连续培养方法。

本申请是这样实现的：

在第一方面，本申请的示例提供了一种用于生物湿法冶金以处理选定的金属离子的微生物的固化方法。

固化方法包括：提供填充有用于负载微生物的载体且被支立的第一固化柱；逆重力方向，将气体和原液一并由第一固化柱的底部连续输入；其中，原液是通过在含有金属离子的第一培养基中接种微生物获得，且被存储于通入气体的第一原液槽中；使从第一固化柱顶部溢流的液体回流至第一原液槽中，直至第一原液槽中的金属离子的第一浓度低于第一阈值；监测第一原液槽中的金属离子的第二浓度，重复执行调整操作，直至满足终止条件；其中，调整操作包括：当在选定时间内第二浓度第N次低于阈值时，向第一原液槽中注入接种率为第N选定值的调整液；其中，调整液由第一培养基和以第N选定值的量接种于其中的微生物构成；其中，N为大于等于1的自然数，第N选定值大于第N+1选定值；其中，终止条件为：第N选定值、第N+1选定值以及第N+2选定值均为零。

在第二方面，本申请的示例提供了一种微生物的连续培养方法。该连续培养方法包括：将载体填充于支立的第二固化柱中，该载体经过权利上述的微生物的固化方法处理而负载并固化有微生物；

沿重力方向，将存储于第二原液槽中的第二培养基，从第二固化柱顶部注入，经驻留后由底部排出至集液槽，在此期间，所述第二固化柱及所述第二原液槽中均不充气；

或者，逆重力方向，将存储于第二原液槽中的第二培养基，从所述第二固化柱底部注入，经驻留后由顶部溢流排出至集液槽，在此期间，由所述第二固化柱的底部向其中注入气体，输入气体的流量为1.5L/min，第二原液槽中不充气。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为现有的微生物培养设备的结构示意图；

图2示出了本申请示例中提供的应用于对微生物进行固化的培养设备的结构示意图；

图3示出了本申请示例中在固化培养阶段使用不同的载体固化微生物工艺中的接种率和平均氧化率的对比图；

图4示出了本申请示例中在连续培养阶段使用的培养设备、与之作为对比的另一培养设备的结构示意图；

图5示出了本申请示例中在连续培养阶段使用不同的进液方式工艺中的亚铁离子的浓度差和氧化速率的对比图。

图标：1-高位槽；2-流量计；3-填料塔；4-恒温水浴夹套；5-低位槽；6-空气泵；7-气体流量计；201-原液槽；202-蠕动泵；203-进液管；204-载体柱；205-出液管；207-充气泵；208-进气管；302-蠕动泵；301-原液槽；303-进液管；304-载体柱；305-出液管；306-集液槽；307-充气泵；308-进气管。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下针对本申请实施例的一种微生物的固化和连续培养方法进行具体说明：

生物湿法冶金技术可以被用于通过氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌、氧化亚铁钩端螺旋菌或它们的组合菌种将溶液中的亚铁离子或矿石中的黄铁矿等硫化物氧化，从而生成三价铁。

实践证明，该技术的关键在于：快速高效地培养细菌，保持亚铁的快速氧化。

已有文献资料表明，细菌固定化连续培养方法是实现快速高效培养细菌的最佳选择。目前，常用的细菌固定化方法是吸附法。吸附法是指：先通过间歇培养，将细菌富集吸附到固定床中的载体上，然后让新鲜培养基由下至上连续流过固定床。并且，该方案可以通过如图1的以沸石为载体的气液并流固化细菌的实验装置进行实施。

其中，高位槽1通过具有液体流量计2的管道与填料塔3连通，并用以向其中注入流体。填料塔3还设置有恒温水浴夹套4，用以对其中的填料和气液控温。填料塔3的底部与空气泵6通过具有气体流量计7的管道连通，用以向填料塔3内注入空气。填料塔3的顶部通过管道连接低位槽5。

但是，发明人发现前述方案至少存在下述的两个问题：

(1)在间歇培养阶段，采用单一较低的接种率，不利于细菌在载体上的快速富集，延长了固定化时间；

(2)连续培养阶段，采用下进上出的液流方式，且必须底部连续充气，氧化效率不高而能耗较高。

有鉴于此，为了克服上述问题，在本申请，发明人提出了一种新型的微生物培养方法，该方法包括为微生物的固化阶段和连续培养阶段。通过该方法可以快速、低能耗地将微生物负载在选定的载体上，并且还能够保持具有较高的活性(如前述对亚铁离子的氧化)。

固化培养阶段

微生物的固化方法包括下述的步骤。

步骤S101、提供填充有用于负载微生物的载体且被支立的第一固化柱。

其中的第一固化柱通常被选择为支立(例如竖直放置)方式布置。当然其可以水平放置。通常地支立布置更易于载体和微生物的接触，控制接触时间。

第一固化柱通过可以选择为玻璃柱、树脂柱等各种生物培养中常用的材料。该第一固化柱被提供用以将载体以柱状形式限定，并且确保培养液和空气能够与其充分地接触。并且基于此，第一固化柱内的载体的填充高度一般是小于第一固化柱的高度的。例如，第一固化柱选择为有机玻璃柱，内径为50mm、柱高为55cm。其中的载体填充高度可以是且填充高度为50cm。

填充于第一固化柱中的载体提供微生物生长和附着的场合。载体一般具有较高的空隙率，从而能够提供更大的表面积和流体的流动空间。示例性地，载体可以是沸石或刨花。可选地，载体是粒径为2至5厘米的沸石，且填充高度为50cm、填充质量为600克。或者，载体是宽度为5至20cm、长度为20至50cm的刨花，且填充高度为50cm、填充质量为60克。

步骤S102、逆重力方向，将气体和原液一并由第一固化柱的底部连续输入；其中，原液是通过在含有金属离子的第一培养基中接种微生物获得，且被存储于通入气体的第一原液槽中。

针对于支立的第一固化柱，采用由下及上(即逆重力方向)的方式向其中通入选定材料。其中的选定材料包括气体和原液。其中气体提供细菌(能够氧化亚铁离子的氧化性细菌)所需的氧气，且一般是使用的是空气，并通过空气泵输送。原液是接种有细菌的培养基。例如，在本申请示例中，细菌例如是氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌、氧化亚铁钩端螺旋菌或它们的组合菌种；培养基可以选择为9K培养基或9K加硫培养基(含有亚铁离子)。微生物通过摄取各种空气以及培养基中的特定物质并氧化亚铁离子，从而完成生命活动而实现自身的正常生长。

其中，原液和气体的输送量与第一固化柱中的载体特性相关联，并且需要考虑能耗和节约原料，以及原料中的细菌的接种率。其中的接种率是指溶液中接入活性菌液的百分比。示例性地，例如50％接种率，意味着50ml活性菌液加入50ml纯9k培养基中，构成100ml的50％接种率的溶液。

可选地，在第一原液槽中的原液的体积控制在1.5L、亚铁离子浓度为10g/L、pH＝1.6；第一培养基为9K培养基，接种的微生物为氧化亚铁硫杆菌且接种率为50％(750ml已经培养到稳定期的活性菌液+750ml纯9k培养基)。

在本申请示例中，原液槽中的原液的接种率为50％，并且结合前述的第一固化柱的载体填充情况，向第一固化柱输入培养液的流量为400至600mL/h、输入气体的流量为1.5L/min，向第一原液槽输入气体的流量为1L/min。气体和原液的输送速度(流量)可以调整其在第一固化柱中的停留时间，从而也可以控制细菌在载体的负载时间。其中的停留时间是指溶液穿过载体柱所用的时间，即溶液与载体接触的时间。

步骤S103、使从第一固化柱顶部溢流的液体回流至第一原液槽中，直至第一原液槽中的金属离子的第一浓度低于第一阈值。

在上述步骤S102中，输入到第一固化柱中的原液并被其中的细菌所利用，原液和气体持续输入，而溢流则回流至第一原液槽。由此，第一原液中的原液循环地利用。在该循环输送过程中，可以通过向第一原液槽中和从第一固化柱的底部通入空气，以便同时补充在第一固化柱和第一原液槽中的细菌所需的氧气。

该过程中，以原始注入第一原液槽中的原液为循环流动的流体，而不予继续注入另外的液体。即通过原液的循环流动，任细菌生长，直到满足一定的条件即可进行下一步骤的操作。本申请示例中，该条件是第一原液槽中的金属离子的第一浓度低于第一阈值。例如，亚铁浓度被氧化降低到0.5g/L以下甚至等于0之后。该条件下，细菌正常生长的成分已不足够，因此可以进行下一次营养的补充，即执行下述步骤S104。

步骤S104、监测第一原液槽中的金属离子的第二浓度，重复执行调整操作，直至满足终止条件。

在该步骤中，通过执行连续的调整培养，可以使细菌快速地在载体负载。而为了实现连续的调整培养，通过监控第一原液槽中的金属离子的浓度，并对应适时地调整向第一固化柱中输入的细菌的量。

具体而言，当在选定时间内第二浓度第N次低于阈值时，向第一原液槽中注入接种率为第N选定值的调整液。其中，调整液由第一培养基和以第N选定值的量接种于其中的微生物构成。其中，N为大于等于1的自然数，第N选定值大于第N+1选定值。其中，终止条件为：第N选定值、第N+1选定值以及第N+2选定值均为零。

换言之，在上述步骤S102持续一段时间(例如为24小时)后，由于细菌的持续生长并固着于载体，细菌持续地消耗亚铁离子，从而使第一原液槽中的亚铁离子浓度逐渐降低。当亚铁离子降低到0.5g/L的阈值，或更低如0时，即可进行后续的继续固化操作(即，第二次接种、第三次接种，等等)，具体实施是以上述的。

示例性，当第一原液槽中的原液的(初始)接种率为50％时，调整液的接种率最大值为40％，最小值为0，且以10％的量递减。或者，当原液的接种率为70％时，调整液的接种率最大值为60％，最小值为0，且以10％的量递减。或者，当原液的接种率为60％时，调整液的接种率最大值为50％，最小值为0，且以10％的量递减。即总体上而言，当原液的接种率为10m％时，调整液的接种率最大值为10(m-1)％，最小值为0，且以10％的量递减，其中m为大于等于5且小于等于10的自然数。

例如，在步骤S103中，第一原液槽中的原液的接种率为50％，开始循环回流培养，直到第一原液槽中液体的亚铁浓度被氧化降低到0.5g/L以下甚至等于0之后，开始第二次接种培养。如果某一次的接种原液能够在24小时内氧化到0.5g/L以下，则随后的接种率降低为40％。以此方法，逐渐降低接种率为30％、20％、10％，直至降低到0％，即不再在原液中加入活性菌液，而仅仅以纯9k培养基为原液进行循环回流。当连续3次0％接种率情况下，原液中的亚铁浓度依然能够在24小时内被氧化降低到0.5g/L以下为止，认为细菌在载体上固定化完成，细菌固定化阶段结束。

为了便于本领域技术人员实施上述技术方案，示例中还提出了一种用以实施上述工艺的设备，其结构如图2所示。该设备包括原液槽201、蠕动泵202、进液管203、载体柱204、出液管205、充气泵207、进气管208。

其中，载体柱204竖直地布置，且其中填充了用于固化/负载细菌的载体(或称为填料)。载体柱204位于高位，而存储向其中输入接种液的原液槽201位于低位。载体柱204和原液槽201通过管道进行连接，其中一个支路通过进液管203连接在载体柱204的底部，另一个支路通过出液管205连接在载体柱204的顶部。另外，两个充气泵207分别通过管道连接在载体柱204的底部和原液槽201内。图2中，黑色实心箭头表示了该设备工作时，其中的液体流向；对于载体柱204而言，其采取的是下进上出的逆重力方向。

在具体的实施过程中，针对上述的培养过程，记录数据如下。

亚铁氧化速率的计算：

其中，v表示细菌固定化阶段亚铁的平均氧化速率(g/(L·h))；C₀表示每次刚刚接种时，原液槽中的亚铁浓度(g/L)；C_t表示经过时间t之后，每次循环结束时，原液槽中的亚铁浓度(g/L)；t表示每次循环培养的历时(h)。

表1沸石柱固定化阶段数据记录表

表2刨花柱固定化阶段数据记录表

根据上述表1和表2所示的方式进行培养，结果如图3所示。结合表1、表2和图3可知，在沸石柱和刨花柱中的接种次数分别为12次和11次，固定化完成历时均为20天。最后3次0％接种率情况下，两个载体柱的亚铁平均氧化率均为逐次上升，均由最初的0.42g/(L·h)增加到0.86g/(L·h)，认为细菌在载体柱上的吸附固定完成，可开展后续连续培养。如果以第一次接种率为0时作为固定化完成时间，则本技术方案的固定化时间为14天。

连续培养阶段

在上述固化培养阶段，细菌被固化在载体上，再进行该阶段进行快速的培养。

该连续培养方法包括以下步骤

步骤S201、将载体填充于支立的第二固化柱中。

该步骤中的载体经过前述的固化方法处理，并且因此负载并固化有微生物。其中的第二固化柱也可以选择玻璃柱或者树脂柱等。填充的高度可以选择与前述固化培养阶段的相同的高度。填充不宜太紧实，以其能够使流体通过为宜。

步骤S202、沿重力方向，将存储于第二原液槽中的第二培养基，从第二固化柱顶部注入，经驻留后有底部排出至集液槽。

在上述设置载体之后，利用培养基进行连续地培养。在本申请示例中主要是通过将培养基向第二固化柱中注入。由于培养基中含有细菌正常地生长所需的各种营养物质和元素，因此，固化在载体上的细菌可以利用这些物质进行代谢和繁殖，从而可以快速地增殖。

在上述利用培养基进行培养的过程中，虽然非必须的，但是也可以根据需要注入气体。例如由第二固化柱的底部向其中注入气体，或者，向集液槽中注入气体；或者，同时向第二固化柱和集液槽中注入气体(气体和液体逆向在第二固化中输送)。

在上述过程中，向第二固化柱中注入培养基的方式是上进下出。为了评价该方式的效果，示例中针对性进行了培养基的下进上出的对比。相应地，还给出了实施上述方案的设备，如图4所示。

其中，(A)下进上出式如下：含亚铁的纯9k培养溶液经过蠕动泵302从原液槽301中抽出，经进液管303被压入载体柱304中，经过一定的停留时间，穿越载体柱304，从上端的出液管305中溢流入集液槽306中。

其中，(B)上进下出式如下：含亚铁的纯9k培养溶液经过蠕动泵302从原液槽301中抽出，从上端被压人载体柱304中，经过一定的停留时间，穿越载体柱304，从下端的出液管305中流入集液槽306中。以上两种方式进行过程中，根据试验设计确定是否采用充气泵307通过进气管308对载体柱或原液槽中的溶液充气。

在另一些示例中，步骤S202还可以选择通过下述方式实施：逆重力方向(在竖直方向上是由底至高)，将存储于第二原液槽中的第二培养基，从第二固化柱底部注入，经驻留后由顶部溢流排出至集液槽，并且在此期间，由第二固化柱的底部向其中注入气体，输入气体的流量为1.5L/min，同时第二原液槽中不充气。

在具体的实施过程中，针对上述的培养过程，记录数据如下。

(1)亚铁氧化速率的计算方法

采用下式进行该阶段细菌氧化亚铁的速率计算：

其中，v-溶液穿越载体柱时亚铁的氧化速率(g/(L·h))；C₀表示原液槽中的溶液的亚铁浓度(g/L)；C_t表示经过停留时间t之后，从载体柱中流出的溶液的亚铁浓度(g/L)；△C表示进液与出液的亚铁离子浓度差(g/L)；t表示溶液在载体中的停留时间(h)。

(2)不同进液方式时的亚铁氧化速率

以沸石柱为例，在不同泵速情况下，分别测定下进上出方式和上进下出方式时载体柱中细菌对亚铁离子的氧化速率。

表3下进上出方式情况下不同泵速的亚铁氧化速率计算表

表4上进下出方式情况下不同泵速的亚铁氧化速率计算表

图5为基于上述表3和表4中的数据所获得的不同进液方式下的氧化速率和亚铁离子的浓度差。其中，1表示上进下出方式时亚铁氧化速率；2表示下进上出方式时亚铁氧化速率；3表示下进上出方式时进出液的亚铁浓度差；4表示上进下出方式时进出液的亚铁浓度差。

根据图5可知，虽然下进上出方式时进出液的亚铁浓度差(图中3号线)大于上进下出方式时进出液的亚铁浓度差(图中4号线)。但是，由于下进上出方式时，溶液在载体柱中的停留时间更好，即溶液与载体上的细菌个体接触的时间更长，所以计算得到的亚铁氧化速率比上进下出方式时的小。因此，采用上进下出方式利用载体上富集的细菌氧化亚铁离子更有利。

进一步地，示例中还对是否充气对培养结果的影响进行了研究，结果如表5所示。

表5上进下出，不同充气方式时的亚铁氧化速率计算表

注：其中充气方式中所涉及的“液”表示集液槽，“柱”表示载体柱。

由表5可知，在利用图4的装置进行试验时，不同的充气方式条件下，载体柱内的附着富集的细菌对亚铁的氧化速率不同。对比2号和3号试验，仅仅对原液槽中的溶液充气，与载体柱和溶液均不充气时的效果一样，说明在原液槽中对溶液充气，没有发挥充气的作用。对比1号和3、4号试验、对比5号和6号试验，均能看出，对载体柱进行充气更有利于细菌氧化亚铁，但效果增长不太大。因此，从节能角度来看，在上进下出方式时，完全可以不对载体柱和原液槽中的溶液充气，也能实现细菌对亚铁的氧化。这可能主要是因为空气中的氧气可以从载体柱上端敞口处自由进入柱体，满足细菌的生长需求。

因此，在连续培养阶段，采用上进下出不充气方式可以实现细菌固定化载体柱对溶液中的亚铁的快速氧化，并且还可以大大节约充气所需的能耗。

总体上而言，本申请方案中的微生物固化方法采用下进上出的循环回流方式，接种率由50％逐步降低到0％，有利于细菌快速附着富集在载体表面，并在短时间内完成固定化。而连续培养方法采用上进下出方式连续流动培养细菌。该连续培养过程中，细菌氧化二价铁为三价铁，既不对溶液充气，也不对载体柱充气，完全依靠空气中的氧气自行进入柱体，供给细菌所需，大大节约了充气所需的能量消耗。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种微生物的固化方法，用于生物湿法冶金以处理选定的金属离子，其特征在于，所述固化方法包括：

提供填充有用于负载所述微生物的载体且被支立的第一固化柱；

逆重力方向，将气体和原液一并由所述第一固化柱的底部连续输入；其中，所述原液是通过在含有所述金属离子的第一培养基中接种所述微生物获得，且被存储于通入所述气体的第一原液槽中；

使从所述第一固化柱顶部溢流的液体回流至所述第一原液槽中，直至所述第一原液槽中的所述金属离子的第一浓度低于第一阈值；

监测所述第一原液槽中的所述金属离子的第二浓度，重复执行调整操作，直至满足终止条件；

其中，所述调整操作包括：当在选定时间内所述第二浓度第N次低于第二阈值时，向所述第一原液槽中注入接种率为第N选定值的调整液；

其中，所述调整液由所述第一培养基和以所述第N选定值的量接种于其中的微生物构成；

其中，N为大于等于1的自然数，第N选定值大于第N+1选定值；

其中，所述终止条件为：第N选定值、第N+1选定值以及第N+2选定值均为零。

2.根据权利要求1所述的微生物的固化方法，其特征在于，所述第一固化柱为有机玻璃柱，所述载体是沸石或刨花；

可选地，所述有机玻璃柱的内径为50mm、柱高为55cm；

可选地，所述载体是粒径为2至5厘米的沸石，且填充高度为50cm、填充质量为600克；

可选地，所述载体是宽度为5至20cm、长度为20至50cm的刨花，且填充高度为50cm、填充质量为60克。

3.根据权利要求2所述的微生物的固化方法，其特征在于，向所述第一固化柱输入原液的流量为400至600mL/h、输入气体的流量为1.5L/min，向所述第一原液槽输入气体的流量为1L/min。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的微生物的固化方法，其特征在于，在所述第一原液槽中的原液的体积为1.5L、亚铁离子浓度为10g/L、pH＝1.6；第一培养基为9K培养基，接种的微生物为氧化亚铁硫杆菌且接种率为50％。

5.根据权利要求4所述的微生物的固化方法，其特征在于，第一阈值小于等于0.5g/L，所述第二阈值为0.5g/L，所述选定时间为24小时。

6.根据权利要求1所述的微生物的固化方法，其特征在于，当所述原液的接种率为10m％时，所述调整液的接种率最大值为10(m-1)％，最小值为0，且以10％的量递减，其中m为大于等于5且小于等于10的自然数；

或者，当所述原液的接种率为50％时，所述调整液的接种率最大值为40％，最小值为0，且以10％的量递减；

或者，当所述原液的接种率为70％时，所述调整液的接种率最大值为60％，最小值为0，且以10％的量递减；

或者，当所述原液的接种率为60％时，所述调整液的接种率最大值为50％，最小值为0，且以10％的量递减。

7.一种微生物的连续培养方法，其特征在于，所述连续培养方法包括：

将所述载体填充于支立的第二固化柱中，该载体经过权利要求1至6中任意一项所述的微生物的固化方法处理而负载并固化有所述微生物；

沿重力方向，将存储于第二原液槽中的第二培养基，从所述第二固化柱顶部注入，经驻留后由底部排出至集液槽，在此期间，所述第二固化柱及所述第二原液槽中均不充气；

或者，逆重力方向，将存储于第二原液槽中的第二培养基，从所述第二固化柱底部注入，经驻留后由顶部溢流排出至集液槽，在此期间，由所述第二固化柱的底部向其中注入气体，输入气体的流量为1.5L/min，第二原液槽中不充气。

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