CN111771127A - 经改良的免疫亲和富集法和质谱法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及质谱法分析领域。在一些实施例中，本公开涉及通过富集和随后的质谱法分析来检测和定量蛋白质的方法。
Description
技术领域
本公开涉及通过免疫亲和富集和质谱法检测和定量蛋白质的领域。
背景技术
质谱法(MS)正日益成为选择用于测定蛋白质丰度和翻译后修饰的检测方法。免疫沉淀(IP)通常在MS的上游用作低丰度蛋白质靶标的富集工具。参见Gingras等人,《自然综述：分子细胞生物学(Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.)》,2007年8月,8(8),645-54；和Carr,S.A.等人,《分子细胞蛋白质组学(Mol.Cell.Proteomics)》,2014年3月,13(3),907-17。还可以使用在MS的上游富集感兴趣的蛋白质的另外的方法。参见例如Lin等人,《蛋白质组研究杂志(J.Proteome Res.)》,2013年12月6日；12(12)；5996-6003；Schwertman等人,《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》,第440卷,第2期,2013年9月15日,227-236；以及Rafalko等人,《分析化学(Anal.Chem.)》,2010,82(21),8998-9005。
本公开提供了通过免疫亲和富集、质谱法(MS)以及免疫亲和富集和随后的质谱法(IP-MS)来检测和定量蛋白质的方法。
发明内容
在一些实施例中，提供了用于检测生物样品中的一种或多种靶蛋白的方法。在一些实施例中，提供了包括通过使所述一种或多种靶蛋白与固相载体结合来从生物样品中富集所述一种或多种靶蛋白的方法。在实施例中，提供了包括使所富集的一种或多种靶蛋白片段化的方法。在实施例中，提供了包括以下的方法：在与所述固相载体结合的同时通过第一酶消化处理所富集的一种或多种靶蛋白；在单个反应容器中同时还原并烷基化经过消化的一种或多种靶蛋白；在第二酶消化中消化经过还原、烷基化和消化的一种或多种靶蛋白，其中任选地允许所述第二酶消化进行达到18小时(例如至多4小时)。在一些实施例中，提供了包括检测所述样品中的一种或多种靶蛋白的方法。在一些实施例中，其中所述通过使一种或多种靶蛋白与固相载体结合来从生物样品中富集所述一种或多种靶蛋白包括用能够从生物样品中免疫亲和富集所述一种或多种靶蛋白的至少一种抗体处理所述生物样品。在一些实施例中，检测所述样品中的一种或多种靶蛋白包括通过质谱法测定经过片段化的一种或多种蛋白质，以确定所述一种或多种靶蛋白中至少一种肽的存在与否，并且检测一种或多种靶蛋白。在一些实施例中，检测所述样品中的一种或多种靶蛋白包括ELISA、蛋白质印迹法、珠基多分析物分析(如Luminex)、基于荧光的成像或基于化学发光的成像。
在实施例中，提供了其中在单个反应容器中发生还原和烷基化的方法。在实施例中，提供了其中允许所述第二酶消化进行持续至多18小时(例如至多4小时)的方法。在一些实施例中，来自所述一种或多种靶蛋白的所述肽的长度为小于或等于40个氨基酸。
在一些实施例中，提供了其中所述第一酶消化和/或所述第二酶消化包括用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysN promisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶进行消化的方法。在一些实施例中，所述第一酶消化和/或所述第二酶消化包括用胰蛋白酶进行消化。在一些实施例中，所述第一酶消化和/或所述第二酶消化包括用胰蛋白酶和LysC进行消化。在一些实施例中，胰蛋白酶以约0.5μg到约2μg的量或约0.1μg/μl到约0.4μg/μl的浓度存在于所述第一酶消化中。在一些实施例中，胰蛋白酶以约1μg/μl的量或约0.2μg/μl的浓度存在于所述第一酶消化中。在一些实施例中，所述胰蛋白酶以约0.2μg/μl到0.8μg/μl的量或约0.02μg/μl到约0.08μg/μl的浓度存在于所述第二酶消化中。在一些实施例中，所述胰蛋白酶以约0.6μg/μl的量或约0.06μg/μl的浓度存在于所述第二酶消化中。
在一些实施例中，提供了其中还原/烷基化步骤包括使所述第一酶消化的产物与包括TCEP和氯乙酰胺的溶液混合的方法。在一些实施例中，所述TCEP和所述氯乙酰胺以1:1、1:2、1:3、1:4或1:5的比率存在。在一些实施例中，TCEP以约5mM到约10mM的浓度存在。在一些实施例中，氯乙酰胺以约5mM到约50mM的浓度存在。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述第二消化之后并且在质谱法之前的中和步骤。在一些实施例中，所述中和步骤包括向所述第二酶消化的产物中添加三氟乙酸(TFA)。
在一些实施例中，提供包括以下的方法：包括用能够与所述靶蛋白结合的标记抗体处理所述样品，以提供标记抗体-蛋白质缀合物；以及使所述标记抗体-蛋白质缀合物与能够与所述标记抗体结合的捕获剂结合，以从所述样品分离所述靶蛋白。在一些实施例中，所述标记是生物素，并且所述捕获剂是链霉亲合素。
在一些实施例中，所述一种或多种蛋白质的检测下限为约0.04fmol到约11.11fmol。
在一些实施例中，提供了进一步包括确定所述靶蛋白的量的方法。在一些实施例中，在质谱法之前通过向所述经过消化的蛋白质中添加已知量的内标肽来确定靶蛋白的量，其中所述内标肽的氨基酸序列与靶肽的氨基酸序列相同并且所述内标肽是经过可检测标记的，以及通过与内标进行比较来确定靶肽的量。在一些实施例中，靶蛋白的量是通过包括将所述样品中的靶肽的量与对照样品中的相同靶肽的量进行比较的方法来确定的。
在一些实施例中，提供了进一步包括定量所述靶蛋白的相关量的方法。在一些实施例中，提供了进一步包括定量所述靶蛋白的绝对量的方法。在一些实施例中，所述定量的下限为约0.04fmol到约11.11fmol。
在一些实施例中，提供了进一步包括在片段化之后并且在质谱法之前进行脱盐的方法。在一些实施例中，提供了进一步包括在液相色谱法和质谱法分析之前使用C18阱柱在线进行脱盐的方法。
在一些实施例中，所述质谱法可以选自靶向质谱法和发现质谱法。在一些实施例中，所述靶向质谱法可以选自多反应监测(MRM)、选择反应监测(SRM)和平行反应监测(PRM)或其组合。
在一些实施例中，所述生物样品可以选自分离的细胞、血浆、血清、全血、CSF、尿、痰、组织和肿瘤组织。在一些实施例中，所述生物样品是人。
在一些实施例中，提供了其中来自所述一种或多种靶蛋白的所述肽包括与能够免疫亲和富集所述一种或多种靶蛋白的所述抗体相对应的表位的方法。
在一些实施例中，方法包含评估消化的完成。完全消化包括90％或更高的零漏切。
在一些实施例中，所述方法进一步包括将所述固相载体与所述经过消化的一种或多种蛋白质分离。
附图说明
图1示出了用于鉴定靶蛋白的免疫亲和富集的质谱法测定的代表性经改良的工作流程。
图2示出了用于加工免疫亲和富集的样品的代表性工作流程的比较。
图3示出了与基于尿素的方法相比，用于低pH/有机IP洗脱的MS样品制备方法的结果。
图4示出了使用酶和连续的还原/烷基化进行IP洗脱的各种条件的结果。
图5示出了与IP-MS洗脱缓冲液方法相比，用酶洗脱获得的IgG水平。
图6示出了用不同加工方法获得的靶肽的回收(以相对于对照的百分比形式)。尿素法用作对照。
图7示出了用尿素与酶洗脱方法获得的靶肽的回收。
图8比较了使用基于尿素的方法、胰蛋白酶洗脱以及用单锅法还原/烷基化的胰蛋白酶洗脱的肽的回收。
图9A-B示出了不同酶消化时间的面积最大的肽的平均面积的结果。过夜(O/N)消化用作对照，并且数据示出为相对于对照的％。
图10A-B示出了用不同酶消化时间和消化温度获得的平均肽面积的结果。过夜(O/N)消化用作对照，并且数据示出为相对于对照的％。
图11A-C示出了从三个不同实验获得的肽面积的CV％(变异系数)，其中比较了不同酶消化时间。
图12A-F示出了跨不同消化时间对于每个靶标的独特肽进行的靶向MS分析的结果，呈现为相对于过夜消化(对照)的％。A)mTOR；B)RAS；C)STAT3；D)RPTOR；E)CTNNB1；F)IQGAP1。
图13A-B示出了对于在消化中不同量的一种或多种酶和消化时间，肽的A)肽强度和B)0％漏切(missed cleavage)的结果。用200ng胰蛋白酶过夜消化用作对照，并且数据示出为相对于对照的％。(T：胰蛋白酶；T+L：胰蛋白酶+LysC)
图14A-F示出了与过夜对照消化相比，在与酶、酶量和消化时间相关的不同消化条件下，对于每个靶标的独特肽进行的靶向分析的结果。A)mTOR；B)RAS；C)STAT3；D)RPTOR；E)CTNNB1；F)IQGAP1。
图15提供了概述用于测试用不同量的酶和初始消化时间从珠粒酶洗脱免疫沉淀的材料的条件的实验方案的流程图。
图16A-B示出了在酶IP洗脱的不同条件下从珠粒回收的肽。将图表绘制为相对于对照(使用1ug的胰蛋白酶持续1小时的胰蛋白酶洗脱(E))的％。
图17A-F示出了肽在不同酶洗脱条件下的平行反应监测(PRM)分析。
图18示出了用于测试从珠粒酶洗脱免疫沉淀的材料的条件的实验方案的流程图。胰蛋白酶的等级、胰蛋白酶的量和洗脱消化的时间是变化的。
图19A-B示出了优化从珠粒酶洗脱免疫沉淀的材料的实验结果。胰蛋白酶的等级、胰蛋白酶的量和洗脱消化的时间是变化的。(T：胰蛋白酶)
图20示出了来自用于测试使用胰蛋白酶对免疫沉淀的材料进行酶洗脱的条件的两个实验的CV％。
图21概括了来自用于测试使用1μg胰蛋白酶对免疫沉淀的材料进行酶洗脱的条件的两个实验的结果。
具体实施方式
I.定义
本说明书和示例性实施例不应视为是限制性的。出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另外说明，否则表示量、百分比或比例的所有数值和本说明书和权利要求书中使用的其它数值在所有情况下应理解为被术语“约”修饰到其尚未如此修饰的程度。因此，除非相反指出，否则以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据寻求获得的期望性质而改变。至少，并且不尝试将等效原则的应用限制于权利要求的范围，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数量，并且通过应用常规的舍入技术来解释。
注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”以及任何词语的任何单数使用包含复数指示物，除非明确和确切地限于一个指示物。如本文所使用的，术语“包含(include)”和其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中列举的项目并不排除可以被替代或添加到所列项目的其它相似项目。
如本文所使用的，“蛋白质”、“肽”和“多肽”可通篇互换使用，意指氨基酸链，其中每个氨基酸通过肽键连接到下一个氨基酸。在一些实施例中，当氨基酸链由约两个到四十个氨基酸组成时，使用术语“肽”。然而，术语“肽”不应解释为限制性的，除非明确指出。
术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包含但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体片段，只要其展示期望的免疫沉淀活性。如此，术语抗体包含但不限于能够与抗原结合的片段，如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、双scFv、sdAb(单个结构域抗体)和(Fab')2(包含化学连接的F(ab')2)。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点的F(ab')2片段。术语抗体也包含但不限于嵌合抗体、人源化的抗体和各种物种(如小鼠、山羊、马、绵羊、鸡等)的抗体。此外，对于本文提供的所有抗体构建体来说，也设想了具有来自其它生物体序列的变体，如CDR-移植的抗体或嵌合抗体。抗体片段也包含单链scFv、串联双scFv、双抗体、串联三sdcFv、微抗体等的朝向。抗体片段也包含纳米抗体(sdAb，具有单个单体结构域，如一对重链的可变结构域，而没有轻链的抗体)。在一些实施例中，抗体片段可以称为特异性物种(例如，人scFv或小鼠scFv)。这表示至少部分非CDR区的序列，而不是构建体的来源。通过参考名称和目录参考提及抗体。持有此名称和目录信息的技术人员能够确定抗体的序列，并且因此本申请涵盖具有参考抗体的至少部分序列的任何抗体，只要抗体维持其免疫亲和富集其抗原蛋白的能力。
“免疫亲和富集”是指任何抗体驱动的富集步骤。其包含但不限于其中形成沉淀的方法，如“免疫沉淀”。
质谱法(MS)是用于在蛋白质质荷比(m/z)的基础上对其进行分析的技术。MS技术通常包含化合物的电离和所得离子的任选片段化，以及检测和分析离子和/或片段离子的m/z，随后计算对应的离子质量。“质谱仪”通常包含离子发生器和离子检测器。“质谱法”、“质谱(mass spec)”、“质谱法(mass spectroscopy)”和“MS”可通篇互换使用。
“靶向质谱法”在本文中也称为“靶向质谱”、“靶向MS”和“tMS”增加了质谱分析的速度、灵敏度和定量精度。非靶向质谱法，有时称为“数据依赖性扫描”、“发现MS”和“dMS”以及靶向质谱的相似性在于：在每个中，分析物(蛋白质、小分子或肽)从附接到液体色谱仪器的反相柱注入或洗脱，并且通过电喷雾电离转化成气相离子。分析物在质谱中被片段化(称为串联MS或MS/MS的过程)，并且片段和母体质量用于确定分析物的同一性。发现MS分析MS/MS片段谱的整体含量。相比之下，在靶向质谱法中，使用参考谱来指导对仅仅数个所选择的片段离子而不是整体含量的分析。
“多反应监测”、“MRM”、“选择反应监测”和“SRM”可通篇互换使用，是指依赖于三重四极(triple-quadrupole)(QQQ)仪器上可用的独特扫描模式的一种类型的靶向质谱法。参见例如，Chambers等人,《蛋白质组学专家综述(Expert Rev.Proteomics)》,1-12(2014)。
“平行反应监测”和“PRM”在本文中可互换使用以描述另一种类型的靶向质谱，其中SRM中使用的第二质量分析仪(四极)在PRM中被高分辨率轨道阱质量分析仪替代。与允许在给定的时间点测量一个单一转换的SRM不同，PRM允许在一个MS/MS谱中平行监测。PRM也允许分离具有接近m/z值(即，在10ppm范围内)的离子，并且因此可以允许检测和定量的下限(LOD或LLOD和LOQ或LLOQ)。
为了评估靶蛋白的消化的完成，计算“漏切”的数量。例如，胰蛋白酶切割赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基的C端侧处的蛋白质。如果肽具有单个内部K或R以及C端K或R，则所述肽具有一个漏切。如果肽仅具有C端K或R，则所述肽具有零漏切。如果肽具有总共两个内部K或R残基以及C端K或R残基，则所述肽具有两个漏切。这同样适用于其它酶和其在其切割的残基。
在一些实施例中，完全消化可以包括90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％零漏切。在一些实施例中，完全消化可以包括0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的两个漏切。在一些实施例中，完全消化可以包括0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的一个漏切。
II.用于免疫亲和富集法/质谱法的经改良的样品制备方法
用于免疫亲和富集法/质谱法的经改良的样品制备方法包含具有在第二次酶消化中更短的消化时间的益处的方法，从而允许经改良的用户工作流程以及通过质谱法从初始免疫亲和富集更少的时间。因此，一种用于检测生物样品中的一种或多种靶蛋白的方法，所述方法包括：
a.通过使所述一种或多种靶蛋白与固相载体结合来从生物样品中富集所述一种或多种靶蛋白；
b.通过以下过程使所富集的一种或多种靶蛋白片段化：
i.在与所述固相载体结合的同时通过第一酶消化处理所述所富集的一种或多种靶蛋白，
ii.在单个反应容器中还原并烷基化经过消化的一种或多种靶蛋白，以及iii.在第二酶消化中消化经过还原、烷基化和消化的一种或多种靶蛋白，其中任选地允许所述第二酶消化进行达到18小时(例如至多4小时)；
c.检测所述样品中的一种或多种靶蛋白。
在一些实施例中，允许第二酶消化进行达到18小时。在一些实施例中，允许第二酶消化进行达到4小时。在一些实施例中，靶蛋白与包括珠粒或树脂的固相载体结合。在一些实施例中，靶蛋白与包括磁珠的固相载体结合。在一些实施例中，靶蛋白与包括免疫亲和珠粒的固相载体结合。
在实施例中，可以使已经富集(包含免疫亲和富集)一种或多种靶蛋白的样品经受洗脱步骤，以从固相载体分离抗体-蛋白质复合物。在实施例中，所述洗脱可以是酶洗脱。在实施例中，可以用低pH/有机试剂执行洗脱。在实施例中，可以使所富集的样品(包含免疫亲和富集的样品)首先经受酶洗脱，并且可以使与底物结合的剩余抗体-蛋白质复合物随后经受低pH/有机洗脱。
在实施例中，本公开提供了处理富集的生物样品(包含免疫亲和富集的样品)的用于MS分析的方法。在实施例中，所述样品是低量样品(<10微克)。在实施例中，本文所描述的方法可以用于确定蛋白质复合物中的抗体表位、特异性和/或抗原。
A.免疫亲和富集
在一些实施例中，提供了免疫亲和富集靶蛋白的方法，所述方法包括使生物样品与至少一种抗体接触。免疫亲和富集方法可以为单重的或多重的。“单重的”方法利用每个测定一种抗体，而“多重的”方法利用每个测定多于一种抗体。免疫亲和富集可以包括或可以不包括免疫沉淀。
B.还原和烷基化
在实施例中，使所富集的一种或多种蛋白质(包含免疫亲和富集的样品)经受还原和烷基化。富集的靶蛋白可以在片段化(例如，消化)之前被还原和烷基化。已经被还原和烷基化的样品可以包括修饰，如半胱氨酸残基。在实施例中，还原和烷基化可以连续地发生。在实施例中，还原和烷基化可以在单个反应容器中发生。
C.消化
本发明方法包括用于使所富集的一种或多种靶蛋白(包含免疫亲和富集的样品)片段化的两个消化步骤：第一消化步骤，所述第一消化步骤是在富集一种或多种靶蛋白之后；以及第二消化步骤，所述第二消化步骤是在还原和烷基化一种或多种靶蛋白之后。在一些实施例中，蛋白质样品在片段化之前被变性或溶解。
在实施例中，消化是酶的。在实施例中，酶消化包含但不限于用蛋白酶进行消化，例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、GluC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、LysC/P、LysN Promisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。在一些实施例中，片段化方案使用MS级可商购获得的蛋白酶。在一些实施例中，使用不同蛋白酶的混合物(例如，胰蛋白酶和LysC)。在一些实施例中，所述消化是不完全的，以便看到更大的重叠肽。在一些实施例中，用IdeS、IdeZ、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶执行抗体消化，以生成大的抗体结构域，用于“中下”蛋白质表征。在一些实施例中，片段化方案使用被修饰的胰蛋白酶。
在一些实施例中，第一消化步骤持续约5分钟到约4小时，约10分钟到约1.5小时，约15分钟到约1小时。在一些实施例中，第一消化步骤为约15分钟、约30分钟、或约1小时、或至多约15分钟、至多约30分钟或至多约1小时。
在一些实施例中，第二消化(即，经过还原和经过烷基化的一种或多种靶蛋白的第二消化)可以进行达到约4小时、至多3小时、至多2小时或至多1小时。在一些实施例中，第二消化步骤可以进行持续约4小时、约3小时、约2小时或约1小时。在一些实施例中，第二消化步骤可以进行约1小时到约4小时。
在一些实施例中，包含步骤，以结束消化步骤。用于结束消化方案的步骤可以是添加终止溶液或使样品旋转或造粒的步骤。在一些实施例中，消化随后是胍基化。
在一些实施例中，片段化方案在溶液中进行。用于执行溶液内消化的示例性可商购获得的试剂盒是溶液内胰蛋白酶消化和胍基化试剂盒(赛默飞世尔(Thermo Fisher)目录#89895)。
在一些实施例中，片段化方案使用珠粒。在一些实施例中，片段化方案包括珠粒上消化。在一些实施例中，使用琼脂糖珠粒或蛋白质G珠粒。在一些实施例中，使用磁珠。
在一些实施例中，通过计算在MS分析后零漏切肽的数量或零个、一个和/或两个漏切肽的数量来评估消化的完成。
D.质谱法
本文公开的方法可以应用于任何类型的MS分析。本公开不受使用的具体设备或分析的限制。用于分析样品的m/z的任何设备的使用将包含在质谱法的定义中。可以使用的MS分析和/或设备的非限制性实例包含电喷雾电离、离子迁移率、飞行时间、串联、离子阱、MRM、SRM、MRM/SRM、PRM和轨道阱。本公开既不受MS分析中使用的离子发生器或检测器的限制，也不受MS的具体构造的限制。本公开不限于与具体设备或软件一起使用。本公开不限于实例中描述的设备和软件。
在实施例中，在通过质谱法分析之前，样品可以任选地被脱盐。
在一些实施例中，在片段化(例如，消化)之后，通过质谱法(MS)分析肽样品，并且将所得谱与来自已知蛋白质的理论谱比较，以确定样品中的肽和蛋白质。
典型地，通过定量蛋白质的特定独特的肽来执行靶向MS。在一些实施例中，这些靶向肽的同位素标记(例如，重同位素标记)版本的已知量可以用作内标进行绝对定量。在一些情况下，感兴趣的蛋白质是不可检测的，即使在鉴定独特的肽标准之后。特异性抗体与特定靶肽的组合已经允许发明人通过MS改良检测靶蛋白的灵敏度，并且已经允许比先前所见的更低水平的检测和更低水平的定量。
在一些实施例中，在MS分析之前，使用液相色谱法将蛋白质样品分离。在一些实施例中，在MS分析之前，使用液相色谱法将片段化样品分离。
在一些实施例中，本文所描述的MS方法中使用的肽具有被视为在临床和研究方法中有用的检测限。在一些实施例中，所述肽被可检测地标记。
在实施例中，提供了包括用于执行本文所描述的方法的试剂的试剂盒。
实例
提供以下实例以说明某些公开的实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
实例1—低pH/有机IP洗脱与基于尿素的方法的比较。
执行实验以针对低pH/有机IP洗脱与基于尿素的(对照)方法的比较评估不同的MS样品制备方法。通过使用多抗体混合物执行IP-MS来评估各种样品制备方法以减少时间/手工操作/speed vac时间。测试以下两个参数：1)用MS相容缓冲液进行的IP洗脱以及连续的还原/烷基化，其包含下文更详细描述的：a)对照：尿素法；b)用1M TEAB(无尿素)调节IP；c)50mM TEAB；d)50mM TEAB/30％乙腈，以及2)用MS相容缓冲液进行IP洗脱和一锅法(onepot)还原/烷基化，其包含：a)具有SDS的旋转柱装置；b)不具有SDS的旋转柱装置；c)PreOmics溶液内消化试剂盒。以下材料用于此实验，如下表1中所描述的。
表1材料：
表2
| 靶标 | 抗体 | 每IP(μg)的量 |
| mTOR | PA1-188 | 3 |
| STAT3 | 13-7000 | 1 |
| PAK1 | 71-9300 | 1 |
| Ras | MA1-012 | 2 |
| IQGAP1 | 33-8900 | 1 |
| CTNNB1 | 71-2700 | 1 |
| RPTOR | 42-4000 | 1 |
实验方案：
步骤1.如上表2所示制备生物素化抗体混合物，并且与0.5mg每种HCT116(IGF刺激:未刺激)/HEK293裂解物混合。通过在5mL低蛋白结合管中添加适当量的抗体混合物(97.9μL/5mL裂解物)执行总共25个IP反应。将每个管用Parafilm封口，并且在4℃下在旋转器上混合温育过夜。在温育之后，使用1:5的比率添加链霉亲和素磁珠(抗体:珠子，由于使用10μg抗体，所以每1mL添加50μL珠粒)。用2X体积冷IP裂解缓冲液洗涤珠粒两次。去除洗涤缓冲液，然后向每个管中添加回原始体积的IP裂解缓冲液。将所有IP在50mL锥形管中汇集在一起，并且将其等分到25个1mL管中，并且然后向每个IP中添加经过洗涤的珠粒。使抗体/抗原样品混合并且将其在室温下旋转1小时。用500μL洗涤缓冲液A洗涤3次。用500μL洗涤缓冲液B洗涤2次。
步骤2.制备了以下MS样品制备溶液：50mM TEAB—通过添加pH为8.5的含0.5mLTEAB的9.5mL MS级水，将1M三乙铵碳酸氢盐(TEAB)(PN#90114)稀释到50mM；变性溶液(6M尿素，重组GFP)—向675μL 50mM TEAB和涡旋(放热反应)中添加360mg尿素。向GFP标准管50ng中添加400μL此溶液；含50mM TEAB的30％ACN—向300μL ACN和200μL MS级水中添加500μL100mM TEAB；10mM TCEP—用490μL pH为8.5的50mM TEAB稀释10μL 0.5M TCEP(PN#77720)；5mM TCEP—用495μL pH为8.5的50mM TEAB稀释5μL 0.5M TCEP；0.5mM碘乙酰胺(IAA)—将9.3mg无需称重的IAA(PN#90034)溶解于100μL MS级水(避光)；0.1μg/μL胰蛋白酶原液—将20μg胰蛋白酶蛋白酶(PN#90057)溶解于200μL 0.1％乙酸，在-80℃下以30μL等分试样的方式储存。
步骤3.质谱样品制备包含以下测试方法。样品1-3＝6M尿素；样品4-6＝无尿素—50mM TEAB+30％ACN；样品7-9＝Preomics试剂盒；样品10-12＝从珠粒进行的LysC洗脱；样品13-15＝从珠粒进行的胰蛋白酶洗脱；样品16-18＝LysC+从珠粒进行胰蛋白酶洗脱；样品19-21＝珠粒上消化—从珠粒去除，然后胰蛋白酶；样品22-25＝在珠粒上消化过夜—然后在珠粒上保持胰蛋白酶。测试以下洗脱方法。用220μL IP-MS洗脱缓冲液(0.5％甲酸；30％乙腈溶液)洗脱样品1-9，充分涡旋、快速旋转并且将其在室温下静置10分钟、涡旋并且快速旋转并且放在磁铁上，然后尽可能多地取出到2个2mL管中，以将洗脱液汇集在一起。将所汇集的裂解物在15000x g下旋转2分钟并且放在磁铁上，然后取出洗脱液并且按每管205μL分配到10个不同的标记为1-9的管中。将样品在speed vac中干燥>1小时(35℃)—每30分钟检查、涡旋和干燥，直到完成；没有看到任何沉淀物。通过向每个样品中添加含1μg LysC(PN#90051)的100μL 50mM TEAB来洗脱样品10-12。通过添加每个样品5μL的0.2μg/μl溶液+95μl50mM TEAB来制备此溶液。通过添加含1μg胰蛋白酶(PN#1862748)的100μL 50mM TEAB来洗脱样品13-15。通过添加每个样品5μL的0.2μg/μl溶液+95μl 50mM TEAB来制备此溶液。通过添加含1μg LysC/胰蛋白酶的100μL 50mM TEAB来洗脱样品16-18。通过添加每个样品5μL的0.2μg/μl LysC/胰蛋白酶溶液+95μl 50mM TEAB来制备此溶液。所有样品10-18随后在37℃下以800rpm温育1.5小时。然后将珠粒收集在磁铁上，将90μl上清液取出到干净的管中。这随后添加2μl 25ng/μl重组GFP和0.92μl 0.5M TCEP，并且然后在60℃下温育30分钟。对于样品19-24，制备60μl胰蛋白酶加上540μl 50mM TEAB，并且向各自添加100μl的此溶液，并且在37℃下以800rpm温育1小时。在温育1小时之后，添加1μl 0.5M TCEP和2μl 25ng/μlGFP，并且在37℃下以800rpm温育30分钟。
步骤4.样品制备如下所述继续胰蛋白酶消化：对于样品1-3，将经过干燥的样品悬浮于10μL 6M尿素/TEAB/GFP溶液中并且涡旋30秒，随后添加10μL 10mM TCEP，混合并且在35℃下以1000rpm混合温育30分钟；对于样品4-6—重悬于20μL的含有50mM TEAB/30％ACN、50ng rGFP的溶液中。在60℃下以500rpm温育30分钟。对于样品7-9，使沉淀在-20℃下保持干燥，以供第二天的Preomics试剂盒使用。
步骤5.使用如下所述的IAA执行肽的烷基化：对于样品1-6—添加1μL IAA溶液混合物；对于样品10-18—添加4.6μL IAA；对于样品19-24：添加5.15μL IAA。在RT下避光温育所有样品，持续30分钟。
步骤6.如下所述执行胰蛋白酶消化：对于样品1-6—立即添加45μL pH为8.5的50mM TEAB。通过向0.1μg/μL胰蛋白酶原液的30μL等分试样添加120μL 50mM TEAB溶液，并且然后向样品1-18中添加10μL的此溶液来制备20ng/μL胰蛋白酶溶液。此时的体积为76μL(样品1-6)、107.676μL(样品10-18)。对于样品19-21，从珠粒去除92μL，然后添加10μL的胰蛋白酶。对于样品22-24，保持在珠粒上用于胰蛋白酶消化。将所有样品在37℃下以500rpm温育18.5小时。
步骤7.通过添加940μL MS级水、20μL 10％FA和40μL的100％ACN制备0.2％甲酸(FA)、4％乙腈(ACN)的混合物以重悬经过干燥的样品。从珠粒去除92μL的样品22-24。通过添加3.5μL 10％TFA(pH<3)酸化样品。添加4.5μL的10％TFA以酸化样品10-24。将所有样品以15,000x g离心2分钟。将65μL的样品1-6、90μL的样品10-18和82μL的样品19-24取出到新的低蛋白结合管中。将样品干燥持续约1小时。如下所述，向每个管中添加0.2％FA和4％ACN：对于样品1-3添加13μL，对于所有其余样品添加17μL，并且涡旋以混合。在nanoLC-MS/MS分析之前，将所有样品储存在-20℃下。
如图3所示，与没有尿素和装置辅助的方法相比，尿素方法效果最好。
实例2—与低pH/有机IP洗脱方法相比的酶洗脱。
执行另一项实验以通过使用QC混合物抗体执行IP-MS来评估各种样品制备方法。在连续的还原和烷基化(具有/不具有珠粒)之后进行第二胰蛋白酶消化过夜。
步骤1.如表2所示，制备用于15个IP的QC混合物。
步骤2.每个IP使用0.5mg每种HCT116(IGF刺激:未刺激)/HEK293裂解物。通过向每IP 1mg裂解物中添加适当量的抗体混合物来建立15个IP反应。用封口膜覆盖管帽，并且在4℃下旋转过夜。
步骤3.使用1:5的抗体量与珠粒体积的比率针对每个IP使用50μL珠粒。用2X体积冷IP裂解缓冲液洗涤珠粒两次。向50μL珠粒中添加1mL抗原-抗体混合物，并且在室温下旋转1小时。用500μL的洗涤缓冲液A洗涤3次，随后用500μL的洗涤缓冲液B洗涤2次。针对质谱样品制备评估以下方法：样品1-3＝洗脱缓冲液，随后进行尿素溶液内消化；样品4-6＝从珠粒进行的胰蛋白酶洗脱；样品7-9＝LysC+从珠粒进行的胰蛋白酶洗脱；样品10-12＝在珠粒上消化过夜—然后在珠粒上保持胰蛋白酶；样品13-15＝在珠粒上消化，从珠粒去除，然后胰蛋白酶。
步骤4.在室温下，用220μL IP-MS洗脱缓冲液洗脱样品1-3，持续10分钟。放置在磁铁上，并且将220μL取出到新的1.5mL低蛋白结合管，以将洗脱液汇集在一起。将所汇集的样品在15000x g下离心2分钟并且放在磁铁上，然后将拉洗脱液按每管205μL分配到3个不同的标记为1-3的管中。将样品在speed vac>1小时(35℃)中干燥。通过添加含1μg胰蛋白酶的100μL 50mM TEAB来洗脱样品4-6，并且在37℃下以800rpm温育1.5小时。在温育之后，放在磁铁上以去除珠粒，并且取90μl上清液，随后添加2μl 25ng/μl GFP和0.92μl 0.5M TCEP，并且在60℃下温育30分钟。通过添加pH为8.5的含1μg LysC/胰蛋白酶的100μL 50mM TEAB来洗脱样品7-9，并且在37℃下以800rpm温育1.5小时。通过添加含1μg胰蛋白酶的50mMTEAB缓冲液来洗脱样品10-15，并且在37℃下以800rpm温育1小时。在温育1小时之后，添加1μl 0.5M TCEP和2μl 25ng/μl rGFP，并且在37℃下以800rpm温育30分钟。
步骤5.制备以下溶液用于样品制备的下一步骤：变性溶液—6M尿素+GFP—通过添加675μL 50mM TEAB和涡旋(放热反应)使用360mg尿素的等分试样。向GFP标准管50ng中添加400μL的此溶液；10mM TCEP—用490μL pH为8.5的50mM TEAB稀释10μL 0.5M TCEP；5mMTCEP—用495μL pH为8.5的50mM TEAB稀释5μL 0.5M TCEP；0.5mM IAA—将无需称重的IAA9.3mg溶解于100μL MS级水(避光)；0.1μg/μL胰蛋白酶原液—将20μg胰蛋白酶蛋白酶(P#90057)溶解于200μL 0.1％乙酸，在-80℃下以30μL等分试样的方式储存。20ng/μL胰蛋白酶工作溶液(刚好在使用前制备)—向0.1μg/μL胰蛋白酶原液的30μL等分试样中添加120μL 50mM TEAB溶液；0.2％甲酸(FA)、4％乙腈(ACN)—向20μL 10％FA和40μL 100％ACN中添加940μL MS级水。
步骤6.对于样品1-3，向经过干燥的样品中添加10μL 6M尿素/50mM TEAB/rGFP溶液并且涡旋30秒。添加10μL 10mM TCEP混合物，并且在35℃下以1000rpm混合温育30分钟。对于样品1-3，添加1μL IAA；对于样品4-9，添加4.6μL IAA；对于样品10-15，添加5.15μLIAA。将所有样品在室温下避光温育持续30分钟。向样品1-3中添加45μL pH为8.5的50mMTEAB。对于样品13-15，从磁铁上的珠粒去除92μL上清液。向样品1-15中的每个样品中添加10μL的20ng/μL胰蛋白酶工作溶液，并且在37℃下以500rpm温育18.5小时。从珠粒去除92μL的每个样品10-12。通过添加5μL 10％TFA酸化所有样品，检查pH(pH<3)。以15,000x g离心2分钟。对于每个样品组，去除以下体积：对于样品1-3，去除65μL；
对于样品4-9，去除90μL；对于样品10-15，去除82μL。将样品Speed-vac干燥约1小时。向每个管中添加0.2％FA和4％ACN溶液：对于样品1-3添加13μL，并且对于所有其余样品添加17μL。在nanoLC-MS/MS分析之前，将所有样品储存在-20℃下。
图4示出了用酶和连续的还原/烷基化进行IP洗脱的结果。所示结果包含以下：a)LysC洗脱；b)胰蛋白酶洗脱；c)LysC/胰蛋白酶洗脱；d)用珠粒上还原/烷基化(无珠粒)的胰蛋白酶洗脱；e)用珠粒上还原/烷基化/消化的胰蛋白酶洗脱。
如图4所示，与基于IP-MS洗脱缓冲液的方法相比，酶洗脱方法示出了更好的回收大多数靶标。
用酶洗脱方法观察到抗体浸出显著减少。如图5所示，与IP-MS洗脱缓冲液方法相比，酶洗脱显示IgG水平低1到2个数量级。在胰蛋白酶洗脱之后，随着珠粒的去除，发现抗体的浸出更低。
实例3—使用胰蛋白酶和/或LysC酶洗脱方法的单锅法(Single pot)还原/烷基化。
执行另外的实验以通过使用QC混合物抗体执行IP-MS来评估各种样品制备方法以减少时间/手工操作/speed vac时间。针对用酶进行的IP洗脱和一锅法还原/烷基化对以下进行评估：a)通过一锅法还原/烷基化进行LysC或胰蛋白酶或LysC/胰蛋白酶洗脱；b)用珠粒通过一锅法还原/烷基化进行LysC或胰蛋白酶或LysC/胰蛋白酶洗脱；c)用珠粒通过一锅法还原/烷基化和消化进行LysC或胰蛋白酶或LysC/胰蛋白酶洗脱。
步骤1.如表2所示，制备用于15个IP的QC混合物，除了替换Ras抗体(PN#33-7200)之外。针对每个IP反应使用0.5mg每种HCT116(IGF刺激:未刺激)/HEK293裂解物。用Parafilm密封管，并且在4℃下旋转过夜。
步骤2.使用1:5的抗体量与珠粒体积的比率针对每个IP使用50μL珠粒。用2X体积冷IP裂解缓冲液洗涤珠粒两次。向50μL珠粒中添加1mL抗原-抗体混合物，并且在室温下旋转1小时。用500μL的洗涤缓冲液A洗涤3次，随后用500μL的洗涤缓冲液B洗涤2次。针对质谱样品制备评估以下方法：样品1-3＝从珠粒进行的胰蛋白酶洗脱；样品4-6＝胰蛋白酶洗脱—单锅法(SP)还原/烷基化；样品7-9＝在珠粒上消化，从珠粒去除，然后胰蛋白酶(无珠粒)；样品10-12＝在珠粒上消化，从珠粒去除，然后胰蛋白酶—单锅法还原/烷基化(无珠粒-SP)；样品13-15＝对照(尿素)。
步骤3.用220μL IP-MS洗脱缓冲液洗脱样品13-15，充分涡旋，快速旋转并且在室温下温育10分钟，涡旋并且快速旋转并且放在磁铁上，然后尽可能多地取出到2mL管中，以将洗脱液汇集在一起。将所汇集的样品在15000x g下离心2分钟并且放在磁铁上，然后将拉洗脱液按每管205μL分配到不同的标记为13-15的管中。将样品在speed vac中干燥约1小时(35℃)。通过添加含1μg胰蛋白酶的100μL 50mM TEAB来洗脱样品1-12，并且在37℃下以800rpm温育1小时。在温育之后，将样品1-6放在磁铁上以去除珠粒，并且取90μl上清液，随后添加2μl 25ng/μl GFP和0.92μl 0.5M TCEP。将样品1-3在60℃下温育30分钟，并且将样品4-6在95℃下温育5分钟。对于样品7-9，添加1μl 0.5M TCEP和2μl 25ng/μl GFP，并且在37℃下以800rpm温育30分钟。对于样品10-12，添加2μL 25ng/μL GFP和25μL一锅法还原/烷基化溶液(最终pH为8.5的50mM TEAB；10mM TCEP；20mM氯乙酰胺(CLAA)(赛默飞世尔科技公司；PN#A39270))，并且在95℃下温育5分钟。
步骤4.制备以下溶液用于样品制备的下一步骤：变性溶液—6M尿素+GFP—通过添加675μL 50mM TEAB和涡旋(放热反应)使用360mg尿素的等分试样。向GFP标准管50ng中添加400μL的此溶液；10mM TCEP—用490μL pH为8.5的50mM TEAB稀释10μL 0.5M TCEP；5mMTCEP—用495μL pH为8.5的50mM TEAB稀释5μL 0.5M TCEP；0.5mM IAA—将无需称重的IAA9.3mg溶解于100μL MS级水(避光)；0.1μg/μL胰蛋白酶原液—将20μg胰蛋白酶蛋白酶(P#90057)溶解于200μL 0.1％乙酸，在-80℃下以30μL等分试样的方式储存。20ng/μL胰蛋白酶工作溶液(刚好在使用前制备)—向0.1μg/μL胰蛋白酶原液的30μL等分试样中添加120μL 50mM TEAB溶液；0.2％甲酸(FA)、4％乙腈(ACN)—向20μL 10％FA和40μL 100％ACN中添加940μL MS级水。
步骤5.对于样品13-15，向经过干燥的样品中添加10μL 6M尿素/50mM TEAB/rGFP溶液并且涡旋30秒。添加10μL 10mM TCEP混合物，并且在35℃下以1000rpm混合温育30分钟。对于样品13-15，添加1μL IAA；对于样品1-3，添加4.6μL IAA；对于样品7-9，添加4.9μLIAA。将所有样品在室温下避光温育持续30分钟。向样品13-15中添加45μL pH为8.5的50mMTEAB。对于样品7-12，从磁铁上的珠粒去除上清液。向样品1-15中的每个样品中添加10μL的20ng/μL胰蛋白酶工作溶液，并且在37℃下以500rpm温育18.5小时。通过添加5μL 10％TFA酸化所有样品，检查pH(pH<3)。以15,000x g离心2分钟。对于每个样品组，去除以下体积：对于样品1-3和样品7-9，去除96μL；对于样品4-6和样品10-12，去除112μL。将样品Speed-vac干燥约1小时。向每个管中添加0.2％FA和4％ACN溶液：对于样品1-12，添加17μL，并且对于样品13-15，添加13μL。在nanoLC-MS/MS分析之前，将所有样品储存在-20℃下。
如图6所示，用单锅法还原/烷基化进行的酶洗脱显示出从QC混合物中更好地回收靶标。
实例4：使用QC混合物抗体的IP-MS
进行另外的实验以通过使用QC混合物抗体执行IP-MS来评估各种样品制备方法以进一步验证酶洗脱。
步骤1.如表2所示，制备用于12个IP的QC混合物，除了替换Ras抗体(PN#33-7200)之外。针对每个IP反应使用0.5mg每种HCT116(IGF刺激:未刺激)/HEK293裂解物。用Parafilm密封管，并且在4℃下旋转过夜。
步骤2.使用1:5的抗体量与珠粒体积的比率针对每个IP使用50μL珠粒。用2X体积冷IP裂解缓冲液洗涤珠粒两次。向50μL珠粒中添加1mL抗原-抗体混合物，并且在室温下旋转1小时。用500μL的洗涤缓冲液A洗涤3次，随后用500μL的洗涤缓冲液B洗涤2次。针对质谱样品制备评估以下方法：样品1-3＝对照(尿素)；样品4-6＝从珠粒进行的胰蛋白酶洗脱；样品7-9＝从珠粒进行的胰蛋白酶洗脱—单锅法(SP)还原/烷基化；样品10-12＝在珠粒上消化，从珠粒去除，然后胰蛋白酶。
步骤3.用220μL IP-MS洗脱缓冲液洗脱样品1-3，充分涡旋，快速旋转并且在室温下温育10分钟，涡旋并且快速旋转并且放在磁铁上，然后尽可能多地取出到1.5mL管中，以将洗脱液汇集在一起。将汇集的样品在15000x g下离心2分钟，并且放在磁铁上，然后等分成每管205μL，所述管分成不同的标记为1-3的管。将样品在speed vac中干燥约1小时(35℃)。通过添加含1μg胰蛋白酶的100μL 50mM TEAB来洗脱样品4-12，并且在37℃下以800rpm温育1小时。在温育之后，将样品4-6放在磁铁上以去除珠粒，并且取90μl上清液，随后添加2μl 25ng/μl GFP和0.92μl 0.5M TCEP。将样品4-6在60℃下温育30分钟。在温育之后，将样品7-9放在磁铁上以去除珠粒，并且取90μl上清液，随后添加2μl 25ng/μl GFP和25μL一锅法还原/烷基化溶液(25μL一锅法还原/烷基化溶液(最终pH为8.5的50mM TEAB；10mM TCEP；20mM氯乙酰胺(CLAA)(赛默飞世尔科技公司；PN#A39270))，并且在95℃下温育5分钟。对于样品10-12，添加1μl 0.5M TCEP和2μl 25ng/μl GFP，并且在37℃下以800rpm温育30分钟。
步骤4.制备以下溶液用于样品制备的下一步骤：变性溶液—6M尿素+GFP—通过添加675μL 50mM TEAB和涡旋(放热反应)使用360mg尿素的等分试样。向GFP标准管50ng中添加400μL的此溶液；10mM TCEP—用490μL pH为8.5的50mM TEAB稀释10μL 0.5M TCEP；5mMTCEP—用495μL pH为8.5的50mM TEAB稀释5μL 0.5M TCEP；0.5mM IAA—将无需称重的IAA9.3mg溶解于100μL MS级水(避光)；0.1μg/μL胰蛋白酶原液—将20μg胰蛋白酶蛋白酶(P#90057)溶解于200μL 0.1％乙酸，在-80℃下以30μL等分试样的方式储存。20ng/μL胰蛋白酶工作溶液(刚好在使用前制备)—向0.1μg/μL胰蛋白酶原液的30μL等分试样中添加120μL 50mM TEAB溶液；0.2％甲酸(FA)、4％乙腈(ACN)—向20μL 10％FA和40μL 100％ACN中添加940μL MS级水。
步骤5.对于样品1-3，向经过干燥的样品中添加10μL 6M尿素/50mM TEAB/rGFP溶液并且涡旋30秒。添加10μL 10mM TCEP混合物，并且在35℃下以1000rpm混合温育30分钟。对于样品1-3，添加1μL IAA；对于样品4-6，添加4.6μL IAA；对于样品10-12，添加4.9μLIAA。将所有样品在室温下避光温育持续30分钟。向样品13-15中添加45μL pH为8.5的50mMTEAB。对于样品7-12，从磁铁上的珠粒去除上清液。向样品1-12中的每个样品中添加10μL的20ng/μL胰蛋白酶工作溶液，并且在37℃下以500rpm温育18.5小时。通过添加5μL 10％TFA酸化所有样品，检查pH(pH<3)。以15,000x g离心2分钟。对于每个样品组，去除以下体积：对于样品1-3，去除68μL；对于样品4-6和样品10-12，去除96μL；对于样品7-9，去除112μL。将样品Speed-vac干燥约1小时。向每个管中添加0.2％FA和4％ACN溶液：对于样品1-3，添加13μL，并且对于样品4-12，添加17μL。在nanoLC-MS/MS分析之前，将所有样品储存在-20℃下。
结果示出于图7。与尿素、使用连续的还原/烷基化的胰蛋白酶洗脱以及在珠粒上胰蛋白酶消化相比，使用单锅法(SP)还原/烷基化的胰蛋白酶洗脱显示9种靶蛋白的相同或更好的回收。
实例5：使用Akt磷酸混合物抗体的IP-MS
执行实验以通过使用Akt磷酸混合物抗体(赛默飞世尔科技公司，PN#A40086)执行IP-MS来评估样品制备方法。
步骤1.制备用于9个IP的AKT磷酸抗体混合物。针对每个IP反应使用1mg的每种MCF7刺激(+hIGF)裂解物。用Parafilm密封管，并且在4℃下旋转过夜。
步骤2.使用1:5的抗体量与珠粒体积的比率针对每个IP使用55μL珠粒。用2X体积冷IP裂解缓冲液洗涤珠粒两次。向55μL珠粒中添加1mL抗原-抗体混合物，并且在室温下旋转1小时。用500μL的洗涤缓冲液A洗涤3次，随后用500μL的洗涤缓冲液B洗涤2次。针对质谱样品制备评估以下方法：样品1-3＝对照(尿素)；样品4-6＝从珠粒进行的胰蛋白酶洗脱；样品7-9＝从珠粒进行的胰蛋白酶洗脱—单锅法(SP)还原/烷基化。
步骤3.用220μL IP-MS洗脱缓冲液洗脱样品1-3，充分涡旋，快速旋转并且在室温下温育10分钟，涡旋并且快速旋转并且放在磁铁上，然后尽可能多地取出到1.5mL管中，以将洗脱液汇集在一起。将汇集的样品在15000x g下离心2分钟，并且放在磁铁上，然后等分成每管205μL，所述管分成不同的标记为1-3的管。将样品在speed vac中干燥约1小时(35℃)。通过添加含1μg胰蛋白酶的100μL 50mM TEAB来洗脱样品4-9，并且在37℃下以800rpm温育1小时。在温育之后，将样品4-6放在磁铁上以去除珠粒，并且取90μl上清液，随后添加2μl 25ng/μl GFP和0.92μl 0.5M TCEP。将样品4-6在60℃下温育30分钟。在温育之后，将样品7-9放在磁铁上以去除珠粒，并且取90μl上清液，随后添加2μl 25ng/μl GFP和25μL一锅法还原/烷基化溶液(25μL一锅法还原/烷基化溶液(最终pH为8.5的50mM TEAB；10mM TCEP；20mM氯乙酰胺(CLAA)(赛默飞世尔科技公司；PN#A39270))，并且在95℃下温育5分钟。
步骤4.制备以下溶液用于样品制备的下一步骤：变性溶液—6M尿素+GFP—通过添加675μL 50mM TEAB和涡旋(放热反应)使用360mg尿素的等分试样。向GFP标准管50ng中添加400μL的此溶液；10mM TCEP—用490μL pH为8.5的50mM TEAB稀释10μL 0.5M TCEP；5mMTCEP—用495μL pH为8.5的50mM TEAB稀释5μL 0.5M TCEP；0.5mM IAA—将无需称重的IAA9.3mg溶解于100μL MS级水(避光)；0.2μg/μL胰蛋白酶原液—将20μg胰蛋白酶蛋白酶(P#90057)溶解于100μL 0.1％乙酸，在-80℃下以30μL等分试样的方式储存。40ng/μL胰蛋白酶工作溶液(刚好在使用前制备)—向0.2μg/μL胰蛋白酶原液的30μL等分试样中添加120μL 50mM TEAB溶液；0.2％甲酸(FA)、4％乙腈(ACN)—向20μL 10％FA和40μL 100％ACN中添加940μL MS级水。
步骤5.对于样品1-3，向经过干燥的样品中添加10μL 6M尿素/50mM TEAB/rGFP溶液并且涡旋30秒。添加10μL 10mM TCEP混合物，并且在35℃下以1000rpm混合温育30分钟。对于样品1-3，添加1μL IAA，并且对于样品4-6，添加4.6μL IAA。将所有样品在室温下避光温育持续30分钟。向样品13-15中添加45μL pH为8.5的50mM TEAB。对于样品7-9，从磁铁上的珠粒去除上清液。向样品1-9中的每个样品添加10μL的20ng/μL胰蛋白酶工作溶液，并且在37℃下以500rpm温育18.5小时。通过添加5μL 10％TFA酸化所有样品，检查pH(pH<3)。以15,000x g离心2分钟。对于每个样品组，去除以下体积：对于样品1-3，去除68μL；对于样品4-6，去除96μL；对于样品7-9，去除112μL。将样品Speed-vac干燥约1小时。向每个管中添加0.2％FA和4％ACN溶液：对于样品1-3，添加13μL，并且对于样品4-9，添加17μL。在nanoLC-MS/MS分析之前，将所有样品储存在-20℃下。
结果示出于图8。与对照尿素和使用连续的还原/烷基化方法的胰蛋白酶洗脱相比，使用单锅法(SP)还原/烷基化的胰蛋白酶洗脱显示11种AKT途径磷酸化蛋白中的9种的更好回收。
表3示出了日间变异系数(CV)对于酶洗脱更好(即，小于25％)。
表3
鉴于上述内容，发现最佳条件是从珠粒胰蛋白酶洗脱，与单锅法还原/烷基化结合，随后进行第二胰蛋白酶消化过夜。
实例6—优化第二胰蛋白酶消化的时间
设置实验以测试用于MS样品制备优化的第二胰蛋白酶消化的不同消化时间。重点是比较过夜第二胰蛋白酶消化与较短的消化时间，目的是产生一天的样品制备方法。
实验方案：
步骤1.所使用材料与表1中列出的材料相同。使用AKT磷酸多重抗体混合物(PN#A40086)，并且与0.5mg的每种HCT116(+/-)裂解物混合。通过在1.5mL低蛋白结合管中添加适当量的抗体混合物执行总共16个IP反应(每个条件2个重复)。将每个管用Parafilm封口，并且在4℃下在旋转器上混合温育过夜。在温育之后，使用1:5的比率添加链霉亲和素磁珠(抗体:珠子，由于使用14μg抗体，所以每1mL添加70μL珠粒)。用2X体积冷IP裂解缓冲液洗涤珠粒两次。去除洗涤缓冲液，然后向每个管中添加回原始体积的IP裂解缓冲液，然后向每个IP添加经过洗涤的珠粒。使抗体/抗原样品混合并且将其在室温下旋转1小时。用500μL洗涤缓冲液A洗涤3次。用500μL洗涤缓冲液B洗涤2次。
步骤2.制备了以下MS样品制备溶液：50mM TEAB—通过添加pH为8.5的含0.5mLTEAB的9.5mL MS级水，将1M三乙铵碳酸氢盐(TEAB)(PN#90114)稀释到50mM；单锅法还原烷基化—最终pH为8.5的50mM TEAB；10mM TCEP；20mM氯乙酰胺(CLAA)(赛默飞世尔科技公司；PN#A39270)；0.2μg/μL胰蛋白酶原液—将20μg胰蛋白酶蛋白酶(PN#90057)溶解于100μL0.1％乙酸中；CaCl2溶液—添加含13.78mg CaCl2的150μL胰蛋白酶+50mM TEAB溶液；0.2％甲酸(FA)、4％乙腈(ACN)—添加940μL MS级水、20μL10％FA和40μL的100％ACN。
步骤3.质谱样品制备包含以下测试方法。样品1-2＝对照—在37℃下定期过夜胰蛋白酶消化；样品3-4＝在37℃下1小时胰蛋白酶消化；样品5-6＝在37℃下2小时胰蛋白酶消化；样品7-8＝在37℃下3小时胰蛋白酶消化；样品9-10＝在37℃下4小时胰蛋白酶消化；样品11-12＝在60℃下1小时胰蛋白酶消化；样品13-14＝在60℃下2小时胰蛋白酶消化；以及样品15-16＝在60℃+50mM CaCl2下2小时胰蛋白酶消化。所有反应均在设置在所述温度和800rpm下的热混合器中执行。
步骤4.通过向每个样品中添加含1μg胰蛋白酶的100μl 50mM TEAB，样品制备继续用于胰蛋白酶洗脱，并且在37℃下以800rpm在热混合器中振荡温育1小时。在1小时温育之后，将管放置于磁铁上以去除珠粒。去除90μL上清液，并且向每个反应中添加2μL 25ng/μLGFP和25μl单锅法还原/烷基化溶液，并且在95℃下温育5分钟。
步骤5.在还原/烷基化之后，如步骤3中所述添加胰蛋白酶消化酶，并且在用于消化反应的所述时间和温度下温育。
步骤6.通过向除了15-16之外的所有样品中添加3.5μL 10％TFA(pH<3)来酸化样品，其中添加4.5μL的10％TFA+1μL 25％TFA来酸化样品。将所有样品以15,000x g离心2分钟，并且然后将112μL样品取出到干净的1.5ml低蛋白结合管中。将样品在speed vac中干燥约1小时。向每个管中添加17μL的0.2％FA和4％ACN。在nanoLC-MS/MS分析之前，将所有样品储存在-20℃下。
三个实验的结果概括于下表4中。
表4
如图9-11所示，与过夜消化相比，1、2和3小时显示出非常相当的数据。
图9A和9B示出来自以上实验1的面积最大的肽的平均面积。与过夜消化的样品相比，消化1/2/3小时的样品给出所有靶标的等效或更好的强度。消化4小时的样品显示较低的强度。PD 1.4和2.2结果相关。
图10A示出以上实验2的平均肽面积。与过夜消化的样品相比，消化1/2/3小时的样品给出所有靶标的等效或更好的强度。消化4小时的样品显示相当的强度。
图10B示出以上实验3的平均肽面积。除IQGAP1以外，所有靶标均满足所有条件的规格。
图11示出了上表4所示的三个实验的肽面积的CV％。在1/2/3/4小时或O/N消化时间点观察到总体<25％CV。
将温度增加到60℃，并且添加CaCl2未改良结果。
进行了靶向MS分析，以评估跨不同消化时间针对每种靶蛋白的多个独特肽的回收。结果示出于图12A-F中。在不同的消化时间点观察到CTNNB1(图12E)和IQGAP1(图12F)的大多数肽的低回收。
实例7—胰蛋白酶量的影响以及在第二消化中用LysC进行测试。
执行实验以在具有和不具有LysC的情况下测试在不同消化时间下的不同胰蛋白酶量，用于MS样品制备优化。IP之后进行MS(单锅法还原/烷基化)和经过修饰胰蛋白酶消化步骤。下表5示出了实验设计。
表5
实验方案：
步骤1.所使用材料与表1中列出的材料相同。如上表2所示制备生物素化抗体混合物，并且与0.5mg每种HCT116(IGF刺激:未刺激)/HEK293裂解物混合。通过在1.5mL低蛋白结合管中添加适当量的抗体混合物执行总共24个IP反应。将每个管用Parafilm封口，并且在4℃下在旋转器上混合温育过夜。在温育之后，使用1:5的比率添加链霉亲和素磁珠(抗体:珠子，由于使用10μg抗体，所以每1mL添加50μL珠粒)。用2X体积冷IP裂解缓冲液洗涤珠粒两次。去除洗涤缓冲液，然后向每个管中添加回原始体积的IP裂解缓冲液。将所有IP在50mL锥形管中汇集在一起，并且将其等分到25个1mL管中，并且然后向每个IP中添加经过洗涤的珠粒。使抗体/抗原样品混合并且将其在室温下旋转1小时。用500μL洗涤缓冲液A洗涤3次。用500μL洗涤缓冲液B洗涤2次。
步骤2.制备了以下MS样品制备溶液：50mM TEAB—通过添加pH为8.5的含0.5mLTEAB的9.5mL MS级水，将1M三乙铵碳酸氢盐(TEAB)(PN#90114)稀释到50mM；单锅法还原烷基化—最终pH为8.5的50mM TEAB；10mM TCEP；20mM氯乙酰胺(CLAA)(赛默飞世尔科技公司；PN#A39270)；0.2μg/μL胰蛋白酶原液—将20μg胰蛋白酶蛋白酶(PN#90057)溶解于100μL0.1％乙酸中；各种胰蛋白酶原液—20ng/μL＝30μL胰蛋白酶原液+120μL 50mM TEAB溶液，然后向样品1、2、9、10、17、18、19-24中添加10μL；60ng/μL＝90μL胰蛋白酶原液+60μL 50mMTEAB溶液，然后向样品3、4、11和12中添加10μL；80ng/μL＝120μL胰蛋白酶原液+30μL 50mMTEAB溶液，然后向样品7、8、15和16中添加10μL；60ng/μL胰蛋白酶/LysC原液—向20μg胰蛋白酶/LysC中添加200μL 50mM乙酸，然后制备溶液＝90μL胰蛋白酶/LysC原液+60μL 50mMTEAB溶液，然后向样品5、6、13和14中添加10μL；0.2％甲酸(FA)、4％乙腈(ACN)—添加940μLMS级水、20μL 10％FA和40μL的100％ACN。
步骤3.质谱样品制备包含以下测试方法。样品1-2＝1小时胰蛋白酶消化，在37℃下，200ng胰蛋白酶(～1:40，假设具有6-8μg肽)；样品3-4＝1小时胰蛋白酶消化，在37℃下，600ng胰蛋白酶(～1:10)；样品5-6＝1小时胰蛋白酶消化，在37℃下，300ng胰蛋白酶+300ngLysC(～1:10)；样品7-8＝1小时胰蛋白酶消化，在37℃下，800ng胰蛋白酶(～1:10)；样品9-10＝2小时胰蛋白酶消化，在37℃下，200ng胰蛋白酶；样品11-12＝2小时胰蛋白酶消化，在37℃下，600ng胰蛋白酶；样品13-14＝2小时胰蛋白酶消化，在37℃下，300ng胰蛋白酶+300ng LysC；样品15-16＝2小时胰蛋白酶消化，在37℃下，800ng胰蛋白酶；样品17-18＝过夜胰蛋白酶消化，在37℃下，200ng胰蛋白酶；样品19-21＝2小时胰蛋白酶消化，在37℃下，200ng胰蛋白酶(额外用于肽测定)；样品22-24＝过夜胰蛋白酶消化，在37℃下，200ng胰蛋白酶。
步骤4.通过向每个样品中添加含1μg胰蛋白酶的100μl 50mM TEAB，样品制备继续用于胰蛋白酶洗脱，并且在37℃下以800rpm在热混合器中振荡温育1小时。
步骤5.在1小时温育后，将管放置于磁铁上以去除珠粒，并且去除90μL上清液，并且向每个反应中添加2μL 25ng/μL GFP和25μl单锅法还原/烷基化溶液，并且在95℃下温育5分钟。
步骤6.在还原/烷基化之后，如步骤3中所述添加消化酶，并且在用于消化反应的所述时间和温度下温育。
步骤7.通过添加4.5μL 10％TFA+1μL 25％TFA来酸化样品，以酸化样品(pH<3)。将所有样品以15,000x g离心2分钟，并且然后去除112μL的样品并且转移到干净的1.5ml低蛋白结合管中。将样品在speed vac中干燥约1小时。向样品1-18中添加含17μL的QC肽混合物(80fmol)的0.2％FA和4％ACN。在17μL 4％ACN和MS级水中将样品19-24复原。在nanoLC-MS/MS分析之前，将所有样品储存在-20℃下。
结果示出于图13-14中。在图13A中，对于肽面积：1小时与胰蛋白酶/LysC组合通过所有靶标的规格(<20％)。在图13B中，0％漏切肽：所有靶标跨所有条件通过规格，除了1小时处的KRAS/NRAS之外。
靶向分析的结果示出于图14A-F中。图14A-B示出了用不同量的胰蛋白酶或胰蛋白酶/LysC组合未发现显著差异。图14C和D示出了用不同量的胰蛋白酶或胰蛋白酶/LysC组合未发现显著差异，除了用800ng胰蛋白酶的2小时之外。图14E-F示出了用更多胰蛋白酶(600-800ng)或胰蛋白酶/LysC组合(600ng)观察到CTNNB1和IQGAP1的大多数肽的更好回收。
实例8—酶IP洗脱的优化
执行实验以通过改变酶量和洗脱时间来测试从珠粒进行的胰蛋白酶洗脱。流程图示出于图1中。
实验方案：
步骤1.所使用材料与表1中列出的材料相同。如上表2所示制备生物素化抗体混合物，并且与0.5mg每种HCT116(IGF刺激:未刺激)/HEK293裂解物混合。通过在1.5mL低蛋白结合管中添加适当量的抗体混合物执行总共27个IP反应。将每个管用Parafilm封口，并且在4℃下在旋转器上混合温育过夜。在温育之后，使用1:5的比率添加链霉亲和素磁珠(抗体:珠子，由于使用10μg抗体，所以每1mL添加50μL珠粒)。用2X体积冷IP裂解缓冲液洗涤珠粒两次。去除洗涤缓冲液，然后向每个管中添加回原始体积的IP裂解缓冲液。将所有IP在50mL锥形管中汇集在一起，并且将其等分到25个1mL管中，并且然后向每个IP中添加经过洗涤的珠粒。使抗体/抗原样品混合并且将其在室温下旋转1小时。用500μL洗涤缓冲液A洗涤3次。用500μL洗涤缓冲液B洗涤2次。
步骤2.制备了以下MS样品制备溶液：50mM TEAB—通过添加pH为8.5的含0.5mLTEAB的9.5mL MS级水，将1M三乙铵碳酸氢盐(TEAB)(PN#90114)稀释到50mM；单锅法还原烷基化—最终pH为8.5的50mM TEAB；10mM TCEP；20mM氯乙酰胺(CLAA)(赛默飞世尔科技公司；PN#A39270)；0.2μg/μL胰蛋白酶原液—将20μg胰蛋白酶蛋白酶(PN#90057)溶解于100μL0.1％乙酸中；各种胰蛋白酶原液—1μg胰蛋白酶＝5μL 0.2μg/μL胰蛋白酶原液+95μL50mM TEAB溶液，然后向样品1-9中添加10μL；2μg胰蛋白酶＝10μL0.2μg/μL胰蛋白酶原液+90μL 50mM TEAB溶液，然后向样品10-18中添加10μL；0.5μg胰蛋白酶＝2.5μL 0.2μg/μL胰蛋白酶原液+97.5μL 50mM TEAB溶液，然后向样品19-27中添加10μL；0.2％甲酸(FA)、4％乙腈(ACN)—添加940μL MS级水、20μL 10％FA和40μL的100％ACN。
步骤3.质谱样品制备包含以下测试方法。样品1-3＝1μg胰蛋白酶消化，1小时，在37℃下；样品4-6＝1μg胰蛋白酶消化，30分钟，在37℃下；样品7-9＝1μg胰蛋白酶消化，15分钟，在37℃下；样品10-12＝2μg胰蛋白酶消化，1小时，在37℃下；样品13-15＝2μg胰蛋白酶消化，30分钟，在37℃下；样品16-18＝2μg胰蛋白酶消化，15分钟，在37℃下；样品19-21＝0.5μg胰蛋白酶消化，1小时，在37℃下；样品22-24＝0.5μg胰蛋白酶消化，30分钟，在37℃下；样品25-27＝2μg胰蛋白酶消化，15分钟，在37℃下。
步骤4.通过向每个样品中添加含0.5、1或2μg胰蛋白酶的100μl 50mM TEAB，样品制备继续用于胰蛋白酶洗脱，并且在37℃下以800rpm在热混合器中振荡温育15分钟、30分钟或1小时。
步骤5.在1小时温育后，将管放置于磁铁上以去除珠粒，并且去除90μL上清液，并且向每个反应中添加2μL 25ng/μL GFP和25μl单锅法还原/烷基化溶液，并且在95℃下温育5分钟。
步骤6.在还原/烷基化之后，将1μg胰蛋白酶添加到50mM TEAB中，并且在37℃下以800rpm振荡温育2小时。
步骤7.通过添加2.5μL 25％TFA来酸化样品，以酸化样品(pH<3)。将所有样品以15,000x g离心2分钟，并且然后去除112μL的样品并且转移到干净的1.5ml低蛋白结合管中。将样品在speed vac中干燥约1小时。向样品1-18中添加含20μL的QC肽混合物(80fmol)的0.2％FA和4％ACN。在17μL 4％ACN和MS级水中将样品19-24复原。在nanoLC-MS/MS分析之前，将所有样品储存在-20℃下。
结果示出于图16A-C、17A-F中。将所有图表绘制为相对于对照(使用1ug胰蛋白酶进行胰蛋白酶洗脱1小时)的％，即在将使用1ug胰蛋白酶洗脱1小时的样品所获得的结果视为100的情况下，将针对所有样品获得的肽峰面积强度(图16)或PRM比率(图17)进行绘图。
用1ug和500ng的洗脱通过所有时间，而对于大多数靶标，2ug的洗脱未通过15分钟和30分钟。
MS级胰蛋白酶在LC-MS分析中显示出更好的回收靶标的和低胰蛋白酶自溶峰。
实例9—从珠粒进行的胰蛋白酶洗脱的优化—时间、酶的量和等级。
执行实验，所述实验被设计成通过改变时间、胰蛋白酶量以及胰蛋白酶等级来评估从IP珠粒的酶洗脱。
步骤1.所使用材料与表1中列出的具有低级胰蛋白酶的材料相同。如上表2所示制备生物素化抗体混合物，并且与0.5mg每种HCT116(IGF刺激:未刺激)/HEK293裂解物混合。通过在1.5mL低蛋白结合管中添加适当量的抗体混合物执行总共63个IP反应。将每个管用Parafilm封口，并且在4℃下在旋转器上混合温育过夜。在温育之后，使用1:5的比率添加链霉亲和素磁珠(抗体:珠子，由于使用10μg抗体，所以每1mL添加50μL珠粒)。用2X体积冷IP裂解缓冲液洗涤珠粒两次。去除洗涤缓冲液，然后向每个管中添加回原始体积的IP裂解缓冲液。将所有IP在50mL锥形管中汇集在一起，并且将其等分到25个1mL管中，并且然后向每个IP中添加经过洗涤的珠粒。使抗体/抗原样品混合并且将其在室温下旋转1小时。用500μL洗涤缓冲液A洗涤3次。用500μL洗涤缓冲液B洗涤2次。
步骤2.制备了以下MS样品制备溶液：50mM TEAB—通过添加pH为8.5的含0.5mLTEAB的9.5mL MS级水，将1M三乙铵碳酸氢盐(TEAB)(PN#90114)稀释到50mM；单锅法还原烷基化—最终pH为8.5的50mM TEAB；10mM TCEP；20mM氯乙酰胺(CLAA)(赛默飞世尔科技公司；PN#A39270)；0.2μg/μL胰蛋白酶原液—将20μg胰蛋白酶蛋白酶(MS级PN#90057；低级PN#1879820)溶解于100μL 0.1％乙酸中；对于两种类型的胰蛋白酶—100ng＝每个样品1-9MS级和样品28-36低级胰蛋白酶添加0.5μl 0.2μg/μl溶液+99.5μl 50mM TEAB；500ng＝每个样品10-18MS级和样品37-45低级胰蛋白酶添加2.5μl 0.2μg/μl溶液+97.5μl 50mM TEAB；1μg＝每个样品19-27MS级和样品46-54低级胰蛋白酶添加5μl 0.2μg/μl溶液+95μl 50mMTEAB；1μg＝每个样品55-63低级胰蛋白酶添加10μl 0.2μg/μl溶液+90μl 50mM TEAB；胰蛋白酶消化60ng/μL＝90μL胰蛋白酶原液+60μL 50mM TEAB溶液，然后向所有样品中添加10μL；0.2％甲酸(FA)、4％乙腈(ACN)—添加940μL MS级水、20μL 10％FA和40μL的100％ACN。
步骤3.质谱样品制备包含以下测试方法。样品1-3＝胰蛋白酶消化15分钟，在37℃下，100ng MS级胰蛋白酶；样品4-6＝胰蛋白酶消化30分钟，在37℃下，100ng MS级胰蛋白酶；样品7-9＝胰蛋白酶消化1小时，在37℃下，100ng MS级胰蛋白酶；样品10-12＝胰蛋白酶消化15分钟，在37℃下，500ng MS级胰蛋白酶；样品13-15＝胰蛋白酶消化30分钟，在37℃下，500ng MS级胰蛋白酶；样品16-18＝胰蛋白酶消化1小时，在37℃下，500ng MS级胰蛋白酶；样品19-21＝胰蛋白酶消化15分钟，在37℃下，1μg MS级胰蛋白酶；样品22-24＝胰蛋白酶消化30分钟，在37℃下，1μg MS级胰蛋白酶；样品25-27＝胰蛋白酶消化1小时，在37℃下，1μg MS级胰蛋白酶；样品28-30＝胰蛋白酶消化15分钟，在37℃下，100ng低级胰蛋白酶；样品31-33＝胰蛋白酶消化30分钟，在37℃下，100ng低级胰蛋白酶；样品34-36＝胰蛋白酶消化1小时，在37℃下，100ng低级胰蛋白酶；样品37-39＝胰蛋白酶消化15分钟，在37℃下，500ng低级胰蛋白酶；样品40-42＝胰蛋白酶消化30分钟，在37℃下，500ng低级胰蛋白酶；样品43-45＝胰蛋白酶消化1小时，在37℃下，500ng低级胰蛋白酶；样品46-48＝胰蛋白酶消化15分钟，在37℃下，1μg低级胰蛋白酶；样品49-51＝胰蛋白酶消化30分钟，在37℃下，1μg低级胰蛋白酶；样品52-54＝胰蛋白酶消化1小时，在37℃下，1μg低级胰蛋白酶；样品55-57＝胰蛋白酶消化15分钟，在37℃下，2μg低级胰蛋白酶；样品58-60＝胰蛋白酶消化30分钟，在37℃下，2μg低级胰蛋白酶；样品61-63＝胰蛋白酶消化1小时，在37℃下，2μg低级胰蛋白酶；
步骤4.通过向每个样品中添加100μl 50mM TEAB中的所述量和类型的胰蛋白酶，样品制备继续用于胰蛋白酶洗脱，并且在37℃下以500rpm在热混合器中振荡温育所述时间。
步骤5.在1小时温育后，将管放置于磁铁上以去除珠粒，并且去除90μL上清液，并且向每个反应中添加2μL 25ng/μL GFP和25μl单锅法还原/烷基化溶液，并且在95℃下温育5分钟。
步骤6.在还原/烷基化之后，添加60ng/μl消化胰蛋白酶，并且在37℃下以500rpm振荡温育2小时。
步骤7.通过添加2.5μL 25％TFA来酸化样品，以酸化样品(pH<3)。将所有样品以15,000x g离心2分钟，并且然后去除112μL的样品并且转移到干净的1.5ml低蛋白结合管中。将样品在speed vac中干燥约1小时。向样品1-18中添加含17μL的QC肽混合物(80fmol)的0.2％FA和4％ACN。在17μL 4％ACN和MS级水中将样品19-24复原。在nanoLC-MS/MS分析之前，将所有样品储存在-20℃下。
结果示出于图19A-B中。将图表绘制为相对于对照(使用1ug MS级胰蛋白酶洗脱样品1小时)的％。
在所有时间点使用500ng低级或MS级胰蛋白酶的洗脱显示大多数靶标的强度下降。
1ug低级—强度下降，在30分钟处2次不通过，在1小时处1次不通过。
1ug MS级—与在1小时处的洗脱相比，15和30分钟的等效或更好的强度。
2ug低级—所有靶标通过，与对照相比稍微更低的强度。
与对照相比，具有低级胰蛋白酶的KRAS显示出400-500％增加。
图20A-B提供了示出以上实例8(图20A)和此实例9(图20B)的CV％的表格。
图21提供了来自实例8和9的1μg胰蛋白酶洗脱的结果的比较。
实例10：某些实施例
以下编号的项目提供了本文实施例的另外的支持和描述。
项目1.一种用于检测生物样品中的一种或多种靶蛋白的方法，所述方法包括：
a.通过使所述一种或多种靶蛋白与固相载体结合来从生物样品中富集所述一种或多种靶蛋白；
b.通过以下过程使所富集的一种或多种靶蛋白片段化：
i.在与所述固相载体结合的同时通过第一酶消化处理所述所富集的一种或多种靶蛋白，
ii.在单个反应容器中还原并烷基化经过消化的一种或多种靶蛋白，以及
iii.在第二酶消化中消化经过还原、烷基化和消化的一种或多种靶蛋白，其中任选地允许所述第二酶消化进行达到18小时(例如至多4小时)；以及
c.检测所述样品中的一种或多种靶蛋白。
项目2.根据项目1所述的方法，其中所述固相载体包括珠粒或树脂。
项目3.根据项目1所述的方法，其中所述固相载体包括磁珠。
项目4.根据项目1所述的方法，其中所述固相载体包括免疫亲和珠粒。
项目5.根据项目1所述的方法，其中使所述一种或多种靶蛋白与固相载体结合来从生物样品中富集所述一种或多种靶蛋白包括用能够从生物样品中免疫亲和富集所述一种或多种靶蛋白的至少一种抗体处理所述生物样品。
项目6.根据项目1到5中任一项所述的方法，其中所述检测样品中的一种或多种靶蛋白包括通过质谱法测定经过片段化的一种或多种蛋白质，以确定所述一种或多种靶蛋白中至少一种肽的存在与否。
项目7.根据项目6所述的方法，其中所述肽的长度为小于或等于40个氨基酸。
项目8.根据项目1到7中任一项所述的方法，其中所述检测样品中的一种或多种靶蛋白包括ELISA、蛋白质印迹法、珠基多分析物分析(如Luminex)、基于荧光的成像或基于化学发光的成像。
项目9.根据项目1-8中任一项所述的方法，其中所述第一酶消化和/或所述第二酶消化包括用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysN promisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶进行消化。
项目10.根据项目9所述的方法，其中所述第一酶消化和/或所述第二酶消化包括用胰蛋白酶进行消化。
项目11.根据项目9所述的方法，其中所述第一酶消化和/或所述第二酶消化包括用胰蛋白酶和LysC进行消化。
项目12.根据项目9到11中任一项所述的方法，其中所述胰蛋白酶以0.5μg到2μg的量或0.1μg/μl到0.4μg/μl的量存在所述第一酶消化中。
项目13.根据项目9到11中任一项所述的方法，其中所述胰蛋白酶以0.2μg到0.8μg的量或0.02μg/μl到0.08μg/μl的量存在于所述第二酶消化中。
项目14.根据项目1到13中任一项所述的方法，其中所述还原/烷基化步骤包括使所述第一酶消化的产物与包括TCEP和氯乙酰胺的溶液混合。
项目15.根据项目14所述的方法，其中所述TCEP和所述氯乙酰胺以1:1、1:2、1:3、1:4或1:5的比率存在。
项目16.根据项目1到15中任一项所述的方法，其进一步包括在所述第二消化之后并且在质谱法之前的中和步骤。
项目17.根据项目16所述的方法，其中所述中和步骤包括向所述第二酶消化的产物中添加三氟乙酸(TFA)。
项目18.根据项目1到17中任一项所述的方法，其中步骤a)包括用能够与所述靶蛋白结合的标记抗体处理所述样品，以提供标记抗体-蛋白质缀合物；以及使所述标记抗体-蛋白质缀合物与能够与所述标记抗体结合的捕获剂结合，以从所述样品分离所述靶蛋白。
项目19.根据项目17所述的方法，其中所述标记是生物素，并且所述捕获剂是链霉亲和素。
项目20.根据项目1到19中任一项所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质的检测下限为0.04fmol到11.11fmol。
项目21.根据项目1到20中任一项所述的方法，其进一步包括确定所述靶蛋白的量。
项目22.根据项目21所述的方法，其中在质谱法之前通过向所述经过消化的蛋白质中添加已知量的内标肽来确定靶蛋白的量，其中所述内标肽的氨基酸序列与靶肽的氨基酸序列相同并且所述内标肽是经过可检测标记的，以及通过与内标进行比较来确定靶肽的量。
项目23.根据项目21所述的方法，其中所述靶蛋白的量是通过包括将所述样品中的靶肽的量与对照样品中的相同靶肽的量进行比较的方法来确定的。
项目24.根据项目21到23中任一项所述的方法，其进一步包括定量所述靶蛋白的相对量。
项目25.根据项目21到24中任一项所述的方法，其进一步包括定量所述靶蛋白的绝对量。
项目26.根据项目21到25中任一项所述的方法，其中定量的下限为0.04fmol到11.11fmol。
项目27.根据项目1到26中任一项所述的方法，其进一步包括在片段化之后并且在质谱法之前进行脱盐。
项目28.根据项目1到27中任一项所述的方法，其中所述质谱法选自靶向质谱法和发现质谱法。
项目29.根据项目21所述的方法，其中所述靶向质谱法选自多反应监测(MRM)、选择反应监测(SRM)和平行反应监测(PRM)或其组合。
项目30.根据项目1到29中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自分离的细胞、血浆、血清、全血、CSF、尿、痰、组织和肿瘤组织。
项目31.根据项目1到30中任一项所述的方法，其中所述生物样品是人。
项目32.根据项目1到31中任一项所述的方法，其中来自所述一种或多种靶蛋白的所述肽包括与能够免疫亲和富集所述一种或多种靶蛋白的所述抗体相对应的表位。
项目33.根据项目1到32中任一项所述的方法，其中所述消化在4小时或更短时间内完成。
项目34.根据项目1到33中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述固相载体与所述经过消化的一种或多种蛋白质分离。
项目35.根据项目1到34中任一项所述的方法，其中允许所述第二酶消化进行达到18小时。
项目35.根据权利要求35所述的方法，其中允许所述第二酶消化进行达到4小时。
Claims (20)
1.一种用于检测生物样品中的一种或多种靶蛋白的方法，所述方法包括：
a.通过使所述一种或多种靶蛋白与固相载体结合来从生物样品中富集所述一种或多种靶蛋白；
b.通过以下过程使所富集的一种或多种靶蛋白片段化：
i.在与所述固相载体结合的同时通过第一酶消化处理所述所富集的一种或多种靶蛋白，
ii.在单个反应容器中还原并烷基化经过消化的一种或多种靶蛋白，以及
iii.在第二酶消化中消化经过还原、烷基化和消化的一种或多种靶蛋白，其中任选地允许所述第二酶消化进行达到18小时；
c.检测所述样品中的一种或多种靶蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述通过使一种或多种靶蛋白与固相载体结合来从生物样品中富集所述一种或多种靶蛋白包括用能够从生物样品中免疫亲和富集所述一种或多种靶蛋白的至少一种抗体处理所述生物样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测样品中的一种或多种靶蛋白包括通过质谱法测定经过片段化的一种或多种蛋白质，以确定所述一种或多种靶蛋白中至少一种肽的存在与否。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述肽的长度为小于或等于40个氨基酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测样品中的一种或多种靶蛋白包括ELISA、蛋白质印迹法、珠基多分析物分析、基于荧光的成像或基于化学发光的成像。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一酶消化和/或所述第二酶消化包括用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysN promisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶进行消化。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一酶消化和/或所述第二酶消化包括用胰蛋白酶进行消化。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一酶消化和/或所述第二酶消化包括用胰蛋白酶和LysC进行消化。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述还原/烷基化步骤包括使所述第一酶消化的产物与包括TCEP和氯乙酰胺的溶液混合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述TCEP和所述氯乙酰胺以1:1、1:2、1:3、1:4或1:5的比率存在。
11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述第二消化之后并且在质谱法之前的中和步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述中和步骤包括向所述第二酶消化的产物中添加三氟乙酸(TFA)。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)包括用能够与所述靶蛋白结合的标记抗体处理所述样品，以提供标记抗体-蛋白质缀合物；以及使所述标记抗体-蛋白质缀合物与能够与所述标记抗体结合的捕获剂结合，以从所述样品分离所述靶蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述标记是生物素，并且所述捕获剂是链霉亲和素。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种蛋白质的检测下限为0.04fmol到11.11fmol。
16.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在质谱法之前通过向所述经过消化的蛋白质中添加已知量的内标肽来确定所述靶蛋白的量，其中所述内标肽的氨基酸序列与靶肽的氨基酸序列相同并且所述内标肽是经过可检测标记的，以及通过与内标进行比较来确定靶肽的量。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述靶蛋白的量是通过包括将所述样品中的靶肽的量与对照样品中的相同靶肽的量进行比较的方法来确定的。
18.根据权利要求1所述的方法，其中来自所述一种或多种靶蛋白的肽包括与能够免疫亲和富集所述一种或多种靶蛋白的所述抗体相对应的表位。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化在4小时或更短时间内完成。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述固相载体与所述经过消化的一种或多种蛋白质分离。
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