CN110366559B - Ras-raf-mapk通路蛋白的检测和量化 - Google Patents

Ras-raf-mapk通路蛋白的检测和量化 Download PDF

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Abstract

本公开涉及质谱分析领域。在一些实施例中，本公开涉及通过免疫沉淀富集、随后进行质谱分析来检测和量化RAS‑RAF‑MAPK通路中的蛋白质的组合物和方法。

Description

RAS-RAF-MAPK通路蛋白的检测和量化
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月28日提交的美国临时申请第62/465,102号的权益和优先权，其通过引用以其整体并入用于任何目的。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用以其整体在此并入。所述ASCII副本，创建于2018年2月22日，命名为2018-02-22_01129-0062-00PCT_Seq_List_ST25，且大小为485千字节。
技术领域
本公开涉及通过免疫沉淀和质谱法来检测和量化包含邻近通路蛋白的RAS-RAF-MAPK通路蛋白的领域。
背景技术
RAS-RAF-MAPK和AKT-mTOR信号通路是正常细胞生长和恶性转化的若干方面的关键调节剂，如细胞存活、分化、增殖、代谢和响应细胞外信号的运动性。这两种通路进行广泛串扰，以便两者相互正面和负面地调节。由于其在癌症中的重要性，RAS-MAPK通路靶标在过去二十年中一直是药物靶向的焦点。靶向RAS通路的关键调节剂的合理疗法可能抑制肿瘤生长、存活和扩散。参见Mendoza MC；Er EE；Blenis J.；《生物化学趋势(Trends BiochemSci.)》2011Jun；36(6):320-8。
检测和量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的主要限制是缺少严格验证的方法和试剂。目前，仅可使用来自蛋白质印迹、ELISA以及Luminex测定的半量化结果。质谱法(MS)逐渐成为选择用于测定蛋白质丰度和转译后修饰的检测方法。然而，迄今为止，MS还未成功量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白，可能是由于它们的低丰度和大量的转译后修饰特性。
免疫富集或免疫沉淀(IP)是通常在MS的上游用作低丰度蛋白质靶的富集工具。参见Gingras等人，《自然综述：分子细胞生物学(Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.)》，Aug 2007,8(8),645-54；和Carr,S.A.等人，《分子与细胞蛋白质组学(Mol.Cell.Proteomics)》Mar2014,13(3),907-17。识别用于MS上游的IP的适当抗体很重要，因为并不是所有结合蛋白质的抗体都是有效的免疫沉淀工具，并且进一步，并不是所有有效的免疫沉淀工具的抗体都能通过MS成功识别。
发明内容
本公开提供了通过免疫沉淀(IP)、质谱法(MS)以及免疫沉淀、随后进行质谱法(IP-MS)来检测和量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的试剂和方法。
在一些实施例中，提供了用于使RAS-RAF-MAPK通路蛋白发生免疫沉淀的方法，其包括使生物样品与表1中所述的抗体中的任一种接触。在一些实施例中，可用于IP方法中的抗体包括表6中所述的抗体。所述方法可以包括冲洗接触的生物样品，以富集抗体-蛋白结合物。另外的方法包含检测抗体-蛋白结合物，以测定生物样品中的RAS-RAF-MAPK通路蛋白。在一些实施例中，所述抗体是标记的。在一些实施例中，向富集的抗体-蛋白结合物提供检测试剂。在一些实施例中，所述标记是生物素，并且所述检测试剂是链霉亲合素。
在一些实施例中，IP是单重的。在一些实施例中，IP是多重的。可用于多重IP的抗体可以包括表6的抗体。
在一些实施例中，提供了一种用于通过MS检测RAS-RAF-MAPK通路蛋白的方法，其包括：从生物样品分离蛋白质；消化经过分离的蛋白质；通过质谱法测定消化的蛋白质，以确定用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽的存在；以及确定所述样品中一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的同一性。在一些实施例中，所述用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽包括SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列。在一些实施例中，所述肽的长度小于或等于40个氨基酸。在一些实施例中，所述用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽由SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列组成。SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700的肽可以是标记的。在一些实施例中，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700上的标记不同于SEQ ID NO:701-SEQID NO:1400的肽上示出的标记。
在一些实施例中，提供了一种用于通过MS量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的方法，其包括：从生物样品分离蛋白质；消化经过分离的蛋白质；通过质谱法测定消化的蛋白质，以确定存在用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽；以及确定样品中一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量。在一些实施例中，所述用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽包括SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列。在一些实施例中，所述肽的长度小于或等于40个氨基酸。在一些实施例中，所述用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽由SEQID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列组成。SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700的肽可以是标记的。在一些实施例中，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700上的标记不同于SEQ ID NO:701-SEQ ID NO:1400的肽上示出的标记。在一些实施例中，所述肽包括选自表5中所示肽的肽或由其组成(SEQ ID NO:13、15、18、28、31、47、48、51、127、128、132、133、141、142、143、144、171、173、177、180、181、182、183、190、192、213、219、220、224、226、231、233、234、235、236、258、270、295、297、300、301、302、304、306、308、310、347、348、353、362、392、393、405、416、429、443、446、451、467、483、487、501、502、506、507、510、512、521、522、523、528、572、580、588、591、598、603、615、617、635、636、655、657、660、662、670、678、683、691、692、696、698和699)。
在一些实施例中，提供了一种用于通过IP-MS检测RAS-RAF-MAPK通路蛋白的方法，其包括：用至少一种能够免疫沉淀来自生物样品的一种或多种RAS-RAF-MAPK靶通路蛋白的抗体处理生物样品；消化经过分离的蛋白质；通过质谱法测定消化的蛋白质，以确定存在用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽；以及确定样品中一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的同一性。在一些实施例中，所述用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽包括SEQID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列。在一些实施例中，所述肽的长度小于或等于40个氨基酸。在一些实施例中，所述用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽由SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:1400的序列组成。SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700的肽可以是标记的。在一些实施例中，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700上的标记不同于SEQ ID NO:701-SEQ ID NO:1400的肽上示出的标记。在一些实施例中，所述肽包括选自表5中所示肽的肽或由其组成(SEQ ID NO:13、15、18、28、31、47、48、51、127、128、132、133、141、142、143、144、171、173、177、180、181、182、183、190、192、213、219、220、224、226、231、233、234、235、236、258、270、295、297、300、301、302、304、306、308、310、347、348、353、362、392、393、405、416、429、443、446、451、467、483、487、501、502、506、507、510、512、521、522、523、528、572、580、588、591、598、603、615、617、635、636、655、657、660、662、670、678、683、691、692、696、698和699)。
在一些实施例中，提供了一种用于通过IP-MS量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的方法，其包括：用至少一种能够免疫沉淀来自生物样品的一种或多种RAS-RAF-MAPK靶通路蛋白的抗体处理生物样品；消化经过分离的蛋白质；通过质谱法测定消化的蛋白质，以确定存在用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽；以及确定样品中一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量。在一些实施例中，所述用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽包括SEQID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列。在一些实施例中，所述肽的长度小于或等于40个氨基酸。在一些实施例中，所述用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽由SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:1400的序列组成。SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700的肽可以是标记的。在一些实施例中，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700上的标记不同于SEQ ID NO:701-SEQ ID NO:1400的肽上示出的标记。在一些实施例中，所述肽包括选自表5中所示肽的肽或由其组成(SEQ ID NO:13、15、18、28、31、47、48、51、127、128、132、133、141、142、143、144、171、173、177、180、181、182、183、190、192、213、219、220、224、226、231、233、234、235、236、258、270、295、297、300、301、302、304、306、308、310、347、348、353、362、392、393、405、416、429、443、446、451、467、483、487、501、502、506、507、510、512、521、522、523、528、572、580、588、591、598、603、615、617、635、636、655、657、660、662、670、678、683、691、692、696、698和699)。
在一个实施例中，所述RAS-RAF-MAPK通路靶蛋白被磷酸化。
提供了用于确定磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白与非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的比率的方法，其包括上述IP、MS或MS-IP方法中的任何一种方法，其中提供了确定磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的比率的另外的步骤。在一些实施例中，所述方法是MS-IP方法，其包括：用一种或多种能够免疫沉淀一种或多种磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的抗体处理生物样品，并且用一种或多种能够免疫沉淀相同或不同非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白中的至少一种或多种通路蛋白的抗体分别处理同一生物样品；消化经过免疫沉淀的RAS-RAF-MAPK通路蛋白；将已知量的第一可检测地标记的内部标准肽和第二可检测地标记的内部标准肽添加到经过消化的蛋白质中，其中所述第一内部标准肽具有与用于识别所述磷酸化蛋白的磷酸化RAS-RAF-MAPK通路肽相同的氨基酸序列，并且所述第二内部标准肽具有与用于识别所述非磷酸化蛋白的所述非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路肽相同的氨基酸序列；通过质谱法测定所述经过消化的蛋白和内部标准品，以确定磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白和非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的存在和量，其中所述RAS-RAF-MAPK通路肽包括SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:1400的肽，并且其长度小于或等于40个氨基酸；确定所述样品中RAS-RAF-MAPK磷酸化通路蛋白和RAS-RAF-MAPK非磷酸化通路蛋白的数量，并且确定磷酸化通路蛋白与非磷酸化通路蛋白的比率。在一些实施例中，所述用于一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽由SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列组成。SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700的肽可以是标记的。在一些实施例中，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700上的标记不同于SEQ ID NO:701-SEQ ID NO:1400的肽上示出的标记。在一些实施例中，所述肽包括选自表5中所示肽的肽或由其组成(SEQ ID NO:13、15、18、28、31、47、48、51、127、128、132、133、141、142、143、144、171、173、177、180、181、182、183、190、192、213、219、220、224、226、231、233、234、235、236、258、270、295、297、300、301、302、304、306、308、310、347、348、353、362、392、393、405、416、429、443、446、451、467、483、487、501、502、506、507、510、512、521、522、523、528、572、580、588、591、598、603、615、617、635、636、655、657、660、662、670、678、683、691、692、696、698和699)。
在一些实施例中，所述生物样品是人。在一些实施例中，所述生物样品是非人。在一些实施例中，所述生物样品是哺乳动物。在一些实施例中，所述生物样品来自大鼠、小鼠、荷兰猪、仓鼠、母牛、猪、马、山羊、绵羊、狗、猫或非人灵长类。
在利用RAS-RAF-MAPK通路肽的实施例中，所述肽可以用可检测的标记修饰。所述可检测的标记可以包括同位素，如重同位素，如本领域技术人员已知的那些，包含13C、15N、2H和18O。在一些实施例中，经过修饰/标记的肽包括SEQ ID NO:701-1400的肽。在一些实施例中，所述肽的长度小于或等于40个氨基酸。在一些实施例中，经过修饰/标记的肽由SEQ IDNO:701-1400的肽组成。在一些实施例中，经过修饰/标记的肽由SEQ ID NO:701-1400的肽组成，其中所述肽被进一步修饰。
在一些实施例中，用于IP的抗体选自表1中所述的抗体。在一些实施例中，用于IP的抗体是具有表1的任何抗体的六个CDR的抗体。所述抗体可能能够免疫沉淀多于一种RAS-RAF-MAPK通路蛋白。在一些实施例中，所述抗体是标记的或能够被标记。所述标记可以是本领域技术人员已知的任何标记，包含酶和荧光标记，如生物素。在一些实施例中，多于一种抗体用于多重IP中。在一些实施例中，所述多重IP包括表6的抗体。在一些实施例中，所述用于多重IP的抗体是具有表6中的任何抗体的六个CDR的抗体。
在一些实施例中，两种或更多种抗体用于分析一种生物样品。例如，第一抗体能够免疫沉淀磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白，并且第二抗体能够免疫沉淀由第一抗体沉淀的RAS-RAF-MAPK通路蛋白的非磷酸化形式。在此类情况下，可以将单个生物样品分成两个等分试样，并且第一抗体用于对第一等分试样进行免疫沉淀，并且第二抗体用于对第二等分试样进行免疫沉淀。当所述第二抗体可以沉淀RAS-RAF-MAPK蛋白的磷酸化和非磷酸化形式两者时，这是合适的；如果所述第二抗体只可以沉淀非磷酸化形式，则这也是合适的。在另一个实例中，可以首先从样品中对RAS-RAF-MAPK通路蛋白的磷酸化形式进行免疫沉淀(使用第一抗体)和评估，并且然后在后面的步骤中，可以对非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白进行免疫沉淀(使用第二抗体)和评估。如果所述第二抗体可以沉淀RAS-RAF-MAPK蛋白的磷酸化形式和非磷酸化形式两者时，此方法是合适的；在一些实施例中，单个抗体能够免疫沉淀磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白和非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白。
在一些实施例中，所述免疫沉淀包括用能够结合RAS-RAF-MAPK通路蛋白的标记的抗体处理样品，以提供标记的抗体-蛋白结合物；所述方法可以进一步包括使所述标记的抗体-蛋白结合物与能够结合所述标记的抗体的捕获剂接触，以从所述样品分离所述通路蛋白。所述标记可以是生物素，并且所述捕获剂可以是链霉亲和素。
可以通过在质谱法之前将已知量的内部标准肽添加到经过消化的蛋白质来确定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量。在一些实施例中，所述内部标准肽具有与RAS-RAF-MAPK通路肽相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述内部标准品被可检测地标记。所述方法可以进一步包括通过与所述内部标准品比较而确定RAS-RAF-MAPK通路肽的数量。
在一些实施例中，所述内部标准肽包括SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列。在一些实施例中，所述肽的长度小于或等于40个氨基酸。在一些实施例中，所述肽由SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:1400的序列组成。SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700的肽可以是标记的。在一些实施例中，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700上的标记不同于SEQ ID NO:701-SEQ ID NO:1400的肽上示出的标记。在一些实施例中，所述肽包括选自表5中所示肽的肽或由其组成(SEQ ID NO:13、15、18、28、31、47、48、51、127、128、132、133、141、142、143、144、171、173、177、180、181、182、183、190、192、213、219、220、224、226、231、233、234、235、236、258、270、295、297、300、301、302、304、306、308、310、347、348、353、362、392、393、405、416、429、443、446、451、467、483、487、501、502、506、507、510、512、521、522、523、528、572、580、588、591、598、603、615、617、635、636、655、657、660、662、670、678、683、691、692、696、698和699)。
在一些实施例中，量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白包括将所述样品中RAS-RAF-MAPK通路肽的量与对照样品中相同RAS-RAF-MAPK通路肽的量进行比较。
量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白可以包括将RAS-RAF-MAPK通路肽的量与已知量的内部标准肽进行比较，其中生物样品中的肽和内部标准肽两者都包括SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:1400，其中所述标准肽被可检测地标记，并且其中肽小于或等于40个氨基酸长。在一些实施例中，所述标准肽由SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列组成。SEQ ID NO:1-SEQ IDNO:700的肽可以是标记的。在一些实施例中，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700上的标记不同于SEQ ID NO:701-SEQ ID NO:1400的肽上示出的标记。在一些实施例中，所述肽包括选自表5中所示肽的肽或由其组成(SEQ ID NO:13、15、18、28、31、47、48、51、127、128、132、133、141、142、143、144、171、173、177、180、181、182、183、190、192、213、219、220、224、226、231、233、234、235、236、258、270、295、297、300、301、302、304、306、308、310、347、348、353、362、392、393、405、416、429、443、446、451、467、483、487、501、502、506、507、510、512、521、522、523、528、572、580、588、591、598、603、615、617、635、636、655、657、660、662、670、678、683、691、692、696、698和699)。
在一些实施例中，所述质谱法选自串联质谱法和发现质谱法。所述靶向质谱法可以选自多反应监测(MRM)、选择反应监测(SRM)和平行反应监测(PRM)，或其组合。
在一些实施例中，所述生物样品选自分离的人细胞、血浆、血清、全血、CSF、尿、痰、组织和肿瘤组织。
在一些实施例中，所述方法进一步包括量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的相对量。在一些实施例中，所述方法进一步包括量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的绝对量。
在一些实施例中，所述消化包括蛋白酶或化学消化。在一些实施例中，所述消化可以是单一的或顺序的。所述蛋白酶消化可以包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysNpromisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。
化学裂解可以包括CNBr、亚碘酰苯甲酸盐、或甲酸。
在一些实施例中，消化是用胰蛋白酶的蛋白酶消化。
在一些实施例中，所述方法进一步包括在消化之后和质谱法之前进行脱盐。
所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白可以选自表4中列出的蛋白质。
在一个实施例中，所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白被磷酸化。
在一些实施例中，可以检测到的RAS-RAF-MAPK蛋白质的浓度范围为约0.04fmol到约2000fmol。
在一些实施例中，检测下限不超过约0.04fmol、0.05fmol、0.06fmol、0.07fmol、0.08fmol、0.09fmol、0.10fmol、0.11fmol、0.12fmol、0.13fmol、0.14fmol、0.15fmol、0.16fmol、0.17fmol、0.18fmol、0.19fmol、0.20fmol、0.21fmol、0.22fmol、0.23fmol、0.24fmol或1.23fmol。所述检测下限可以为约0.04fmol-1.23fmol。
在一些实施例中，量化下限不超过约0.04fmol、0.05fmol、0.06fmol、0.07fmol、0.08fmol、0.09fmol、0.10fmol、0.11fmol、0.12fmol、0.13fmol、0.14fmol、0.15fmol、0.16fmol、0.17fmol、0.18fmol、0.19fmol、0.20fmol、0.21fmol、0.22fmol、0.23fmol、0.24fmol、0.25fmol、0.30fmol、0.35fmol、0.40fmol、0.45fmol、0.50fmol、0.55fmol、0.60fmol、0.65fmol、0.70fmol、或11.11fmol。所述量化下限可以为约0.04fmol-11.11fmol。
涵盖了包括一种或多种能够免疫沉淀RAS-RAF-MAPK通路蛋白的抗体的试剂盒。
还提供了包括一种或多种能够免疫沉淀RAS-RAF-MAPK通路蛋白的抗体和可用于进行质谱法以检测RAS-RAF-MAPK通路蛋白的试剂的试剂盒。
还涵盖了包括一种或多种能够免疫沉淀RAS-RAF-MAPK通路靶蛋白的抗体和可用于进行质谱法以量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的试剂的试剂盒。
包含在所述试剂盒中的所述抗体可以选自表1中所述的抗体中的任何一种或多种抗体。在一些实施例中，所述抗体是标记的或能够被标记。所述标记可以是本领域技术人员已知的任何标记，包含酶和荧光标记，如生物素。在一些实施例中，所述试剂盒包括多于一种抗体。在一些实施例中，所述试剂盒包括选自表6中所述抗体的两种或更多种抗体。
所述试剂盒可以进一步包括RAS-RAF-MAPK通路肽。在一些实施例中，所述肽包括SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列。在一些实施例中，所述肽的长度小于或等于40个氨基酸。在一些实施例中，所述肽由SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:1400的序列组成。SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700的肽可以是标记的。在一些实施例中，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700上的标记不同于SEQ ID NO:701-SEQ ID NO:1400的肽上示出的标记。在一些实施例中，所述肽包括选自表5中所示肽的肽或由其组成(SEQ ID NO:13、15、18、28、31、47、48、51、127、128、132、133、141、142、143、144、171、173、177、180、181、182、183、190、192、213、219、220、224、226、231、233、234、235、236、258、270、295、297、300、301、302、304、306、308、310、347、348、353、362、392、393、405、416、429、443、446、451、467、483、487、501、502、506、507、510、512、521、522、523、528、572、580、588、591、598、603、615、617、635、636、655、657、660、662、670、678、683、691、692、696、698和699)。
在一些实施例中，所述试剂盒可以包括选自SEQ ID NO:701-SEQ ID NO:1400的肽的至少一种肽，其中所述肽小于或等于40个氨基酸。在一个实施例中，所述试剂盒包括由SEQ ID NO:701-SEQ ID NO:1400组成的至少一种肽。
所述试剂盒中提供的所述肽可以被可检测地标记或能够被修饰以被可检测地标记。在一些实施例中，所述试剂盒可以包括选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:700的肽的至少一种肽，其中所述肽被可检测地标记或能够被修饰以被可检测地标记。
在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括能够消化免疫沉淀的蛋白质样品的蛋白酶或化学剂。所述蛋白酶试剂可以为胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysN promisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。所述化学剂可以是CNBr、亚碘酰苯甲酸盐、或甲酸。
在一些实施例中，所述试剂盒可以包括以下项中的一些或全部：单个或多个生物素化抗体混合物、链霉亲和素磁珠(如Pierce链霉亲和素磁珠)、IP-MS细胞裂解缓冲液、一种或多种IP-MS洗涤缓冲液、IP-MS洗脱缓冲液、阳性对照裂解液、低结合管、用于MS样品制备的还原/烷基化试剂、用于MS样品制备的消化缓冲液、胰蛋白酶、用于阻止胰蛋白酶消化的缓冲液(如10％三氟乙酸)、AQUA(绝对量化)重肽混合物、肽的稀释剂(如0.1％三氟乙酸/5％乙腈)、基质(掺入6种蛋白质消化混合物的轻质粗肽)和记忆装置(如USB棒)，包含仪器方法、天际线软件模板和说明。
所述试剂盒可以被用于检测表4中列出的RAS-RAF-MAPK通路蛋白。
通过试剂盒检测和量化的RAS-RAF-MAPK蛋白可以被磷酸化。
附图说明
图1示出了用于免疫沉淀富集-质谱分析法测定，以识别RAS-RAF-MAPK通路蛋白的一个代表性流程。
图2示出了从HCT116或BT549细胞富集低丰度RAS-RAF-MAPK通路蛋白的实验的结果。
图3示出了RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽的量化限。
图4示出了12种RAS-RAF-MAPK通路蛋白组1的多重免疫沉淀加nanoLC-MS/MS测定的结果。
图5示出了12种RAS-RAF-MAPK通路蛋白组2的多重免疫沉淀加nanoLC-MS/MS测定的结果。
图6示出了13种RAS-RAF-MAPK通路蛋白组3的多重免疫沉淀加nanoLC-MS/MS测定的结果。
图7示出了在HCT116细胞系中，在存在和不存在免疫沉淀富集的情况下，使用质谱方法识别和量化的RAS-RAF-MAPK通路蛋白的总结。
具体实施方式
本说明书和示例性实施例不应视为是限制性的。为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另外指出，否则表示数量、百分数或比例的所有数值和本说明书和权利要求中使用的其它数值在所有情况下应理解为被术语“约”修饰到它们还未如此修饰的程度。因此，除非相反指出，否则在下面说明书和所附权利要求中阐释的数值参数是近似值，其可以根据期望寻求获得的特性而改变。至少，并且不尝试将等同原则的应用限于权利要求的范围，每个数值参数应至少从报告的有效数字的值的角度考虑，并且应用常规的四舍五入技术。
注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”以及任何词语的任何单数使用包含复数指示物，除非明确和确切地限于一个指示物。如本文所用，术语“包含”和其语法变型旨在是非限制性的，使得列表中项目的叙述不排除可以替换或添加到所列项目的其它相似的项目。
如本文所用，“RAS-RAF-MAPK通路蛋白”包含但不限于BRAF(UniProtKB-P15056)、HRAS(UniProtKB-P01112)、KRAS(UniProtKB P01116)、NRAS(UniProtKB-P01111)、MAP2K1(UniProtKB-Q02750)、MAP2K2(UniProtKB-P36507)、MAPK1(UniProtKB-P28482)、MAPK3(UniProtKB-P27361)、MAPK8(UniProtKB-P45983)、MAPK9(UniProtKB-P45984)、PIK3CA(UniProtKB-P42336)、RPS6KA1(也称为p90S6K)(UniProtKB-Q15418)和TP53(UniProtKB-P04637)。
如本文所用，“蛋白质”、“肽”和“多肽”可通篇交换使用，指氨基酸链，其中每个氨基酸通过肽键连接到下一个氨基酸。在一些实施例中，当氨基酸链由约两个到四十个氨基酸组成时，使用术语“肽”。然而，术语“肽”不应解释为限制性的，除非明确指出。
从最广义上看，使用术语“抗体”，并且涵盖各种抗体结构，包含但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示期望的免疫沉淀活性。这样，术语抗体包含但不限于能够结合抗原的片段，如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、di-scFv、sdAb(单个结构域抗体)和(Fab')2(包含化学连接的F(ab')2)。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点的F(ab')2片段。术语抗体也包含但不限于嵌合抗体、人源化的抗体和各种物种，如小鼠、山羊、马、绵羊、鸡等的抗体。更进一步，对于本文提供的所有抗体构建体来说，也设想了具有来自其它生物体序列的突变体，如CDR-移植的抗体或嵌合抗体。抗体片段也包含单链scFv、串联双scFv、双抗体、串联三sdcFv、微抗体等的朝向。抗体片段也包含纳米抗体(sdAb，具有单个单体结构域，如一对重链的可变结构域，而没有轻链的抗体)。在一些实施例中，抗体片段可以称为特异性物种(例如，人scFv或小鼠scFv)。这表示至少部分非CDR区域的序列，而不是构建体的来源。通过参考名称和登记参考提及抗体。持有此名称和登记信息的技术人员能够确定抗体的序列，并且因此本申请涵盖具有参考抗体的至少部分序列的任何抗体，只要抗体维持其免疫沉淀其抗原蛋白的能力。在一些实施例中，抗体包括具有与表1或表6中提供的抗体相同CDR的抗体。
“免疫沉淀(Immunoprecipitate)”或“免疫沉淀(immunoprecipitation)”是指任何抗体驱动的富集步骤，无论是否形成实际沉淀。因此，免疫沉淀包含任何免疫富集步骤。
质谱法(MS)是用于基于它们的质荷比(m/z)分析蛋白质的主要技术。MS技术一般包含化合物的电离和所得离子的任选片段化，以及检测和分析离子和/或片段离子的m/z，随后计算对应的离子质量。“质谱仪”一般包含离子发生器和离子检测器。“质谱法(Massspectrometry)”、“质谱(mass spec)”、“质谱法”和“MS”可通篇交换使用。
“靶向质谱法”，本文也称为“靶向质谱”、“靶向MS”和“tMS”提高了质谱分析的速度、灵敏度和量化的精度。非靶向质谱法，有时称为“数据依赖性扫描”、“发现MS”和“dMS”以及靶向质谱的相似性在于：在每个中，分析物(蛋白质、小分子或肽)从附接到液体色谱工具的反相柱注入或洗脱，并且通过电喷射电离转化成气相离子。分析物在质谱中片段化(称为串联MS或MS/MS的过程)，并且片段和母体质量用于建立分析物的同一性。发现MS分析MS/MS片段谱的整体含量。相反，在靶向质谱法中，参考谱用于引导分析仅仅数个选择的片段离子而不是整体含量。
“多反应监测”、“MRM”、“选择反应监测”和“SRM”可通篇交换使用，指依赖于三节四极(QQQ)工具上可用的独特扫描模式的一类靶向质谱法。参见，例如，Chambers等人，《蛋白质组学专家综述(Expert Rev.Proteomics)》，1-12(2014)。
“平行反应监测”和“PRM”可在本文交换使用，以描述另一个类型的靶向质谱，其中SRM中使用的第二质量分析仪(四极)在PRM中被高分辨率轨道阱质量分析仪替换。与SRM允许在给定的时间点测量一个单个转变不同，PRM允许在一个MS/MS谱中平行监测。PRM也允许分离具有接近m/z值(即，在10ppm范围内)的离子，并且因此可以允许检测和量化的下限(LOD或LLOD和LOQ或LLOQ)。
本文公开的方法可以应用于任何类型的MS分析。本公开不受使用的具体设备或分析的限制。用于分析样品的m/z的任何设备的使用将包含在质谱法的定义中。可以使用的MS分析和/或设备的非限制性实例包含电喷射电离、离子迁移率、时飞、串联、离子捕获、MRM、SRM、MRM/SRM、PRM和轨道阱。本公开既不受MS分析中使用的离子发生器或检测器的限制，也不受MS的具体构造的限制。本公开不限于与具体设备或软件一起使用。本公开不限于实例中描述的设备和软件。
在一些实施例中，提供了免疫沉淀RAS-RAF-MAPK通路蛋白的方法，其包括使生物样品与表1中所述的至少一种抗体接触。免疫沉淀方法可以为单重的或多重的。“单重的”IP每个测定使用一种抗体，而“多重的”IP每个测定使用多于一种抗体。
在一些实施例中，提供了用于检测和量化磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白和非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的IP-MS方法。所述方法可以包括使生物样品与表1中所述的至少一种抗体接触、消化一种或多种免疫沉淀的蛋白质、以及通过质谱法测定消化的蛋白质。IP和MS可以为单重的或多重的。“单重的”MS是指在单个MS试验中监测单个肽，而“多重的”MS是指在单个MS试验中监测多于一种靶肽。
表1提供了可用于IP和IP-MS方法中的抗体的列表。表2提供了已知结合它们的抗原RAS-RAF-MAPK蛋白，但是发现较少用于IP和IP-MS方法中的抗体的列表。
表1：用于RAS-RAF-MAPK通路蛋白的IP到MS验证的抗体的列表
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表2：用于RAS-RAF-MAPK通路蛋白的IP到MS较不成功的抗体的列表
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在片段化(例如，消化)之前，免疫沉淀的RAS-RAF-MAPK通路蛋白可以被还原和烷基化。已经被还原和烷基化的样品可以包括修饰，如对半胱氨酸残基的修饰(例如，CAM)。在SEQ ID NO:1-1400的RAS-RAF-MAPK肽示出源自例如还原/烷基化的修饰的情况下，也涵盖未被修饰的肽。例如，在提及SEQ ID NO:1-1400的RAS-RAF-MAPK通路肽的每种情况下，也涵盖SEQ ID NO:1-1400的未被修饰的肽。
在通过质谱法分析之前，样品可以任选地被脱盐。涵盖酶和化学消化二者。酶消化包含但不限于用蛋白酶的消化，如例如，胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluC biocarb、LysC/P、LysN Promisc、蛋白质肽链内切酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。化学消化包含使用例如CNBr、亚碘酰苯甲酸盐和甲酸。
在一些实施例中，在片段化(例如，消化)之后，通过质谱法(MS)分析肽样品，并且将所得谱与来自已知蛋白质的理论谱比较，以确定样品中的肽和蛋白质。对于RAS-RAF-MAPK通路蛋白，发现MS是繁琐的和耗费时间的，并且非切实可行的临床方法。因此，发明人已经识别了与RAS-RAF-MAPK通路蛋白相关联的新的肽，用于IP-MS方法中。在靶向MS和IP靶向MS方法中使用这些肽允许量化甚至低丰度的RAS-RAF-MAPK蛋白。此外，在靶向MS和IP靶向MS方法中使用这些肽允许量化磷酸化RAS-RAF-MAPK蛋白。
理论上，可用于MS中以检测和量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽可以通过使用计算机软件等设计。然而，令人惊讶的是，许多这些潜在的肽序列在基于MS的测定，包含SRM/MRM和PRM中是不合适的或低效的。因为不可能预测最合适的用于MS分析的肽，所以有必要实验识别被修饰和未被修饰的肽，以开发为临床试剂。为了使分析复杂化，发现在测定典型的样品时可用的某些肽在测定已经进行了免疫沉淀的样品时是不可预测的。
典型地，通过量化蛋白质的特定独特的肽进行靶向MS。在一些实施例中，已知量的同位素标记(例如，重同位素标记)版本的这些靶向肽可以用作内部标准品进行绝对量化。在一些情况下，感兴趣的蛋白质是不可检测的，即使在识别独特的肽标准品之后。特异性抗体与特定靶向肽的组合已经使得发明人改善了通过MS检测RAS-RAF-MAPK通路蛋白的灵敏度，并且已经允许比先前所见的更低水平的检测和更低水平的量化。参见，例如，图3。
在一些实施例中，试剂盒中提供的并且可用于描述的方法中的RAS-RAF-MAPK通路肽列在表3中。SEQ ID No:1-700是原生肽序列，其可用于识别“靶ID”列中所述的RAS-RAF-MAPK通路蛋白。某些肽序列在修饰残基之后，在某些残基处被磷酸化，如括号“(PO3H2)”中示出的。
某些肽在修饰的残基之后，在半胱氨酸残基处修饰，如通过“(CAM)”所示。“CAM”转译后修饰是本领域技术人员熟知的，指源自蛋白质/肽的烷基化的脲甲基化。肽可以如表3中示出，或可以为缺少脲甲基化的这些肽的非修饰版本。
表3.用于量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽的列表
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在一些实施例中，肽试剂和可用于方法中的肽列于表5中(SEQ ID No:13、15、18、28、31、47、48、51、127、128、132、133、141、142、143、144、171、173、177、180、181、182、183、190、192、213、219、220、224、226、231、233、234、235、236、258、270、295、297、300、301、302、304、306、308、310、347、348、353、362、392、393、405、416、429、443、446、451、467、483、487、501、502、506、507、510、512、521、522、523、528、572、580、588、591、598、603、615、617、635、636、655、657、660、662、670、678、683、691、692、696、698和699)。在一些实施例中，表5的肽可用于多重的MS方法中。
在一些实施例中，蛋白质样品在片段化之前被变性或溶解。
在一些实施例中，片段化方案使用化学裂解。在一些实施例中，化学裂解使用CNBr。在一些实施例中，使用酶进行片段化方案。在一些实施例中，片段化方案使用MS级商业上可得的蛋白酶。可以用于消化样品的蛋白酶的实例包含胰蛋白酶、蛋白内切酶GluC、蛋白内切酶ArgC、胃蛋白酶、糜蛋白酶、LysN蛋白酶、LysC蛋白酶、GluC蛋白酶、AspN蛋白酶、蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶。在一些实施例中，使用不同蛋白酶的混合物，并且在消化和分析之后，将个体结果组合在一起。在一些实施例中，消化是不完全的，以便看到较大的重叠肽。在一些实施例中，用IdeS、IdeZ、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶进行抗体消化，以生成大的抗体结构域，用于“中下”蛋白质表征。在一些实施例中，片段化方案使用修饰的胰蛋白酶。在一些实施例中，可以使用10:1、20:1、25:1、50:1、66:1或100:1的蛋白质:蛋白酶的比率(w/w)。在一些实施例中，所用胰蛋白酶的浓度为约100ng/ml-1mg/ml、或约100ng/ml-500μg/ml、或约100ng/ml-100μg/ml、或约1μg/ml-1mg/ml、或约1μg/ml-500μg/ml、或约1μg/ml-100μg/ml、或约10μg/mg-1mg/ml、或约10μg/mg-500μg/ml、或约10μg/mg-100μg/ml。在一些实施例中，消化步骤持续约10分钟到48小时、或约30分钟到48小时、或约30分钟到24小时、或约30分钟到16小时、或约1小时到48小时、或约1小时到24小时、或约1小时到16小时、或约1小时到8小时、或约1小时到6小时、或约1小时到4小时。在一些实施例中，消化步骤在约20℃到45℃、或约20℃到40℃、或约22℃到40℃、或约25℃到37℃的温度下温育。在一些实施例中，消化步骤在约37℃或30℃下温育。在一些实施例中，包含步骤，以结束消化步骤。用于结束消化方案的步骤可以为添加终止液或将样品旋转或粒化的步骤。在一些实施例中，消化随后是胍基化。
在一些实施例中，片段化方案包含使用蛋白质凝胶。在一些实施例中，片段化方案包括胶内消化。用于进行胶内消化的示例性商业上可得的试剂盒是胶内胰蛋白酶消化试剂盒(赛默飞世尔登记编号89871)。
在一些实施例中，片段化方案在溶液中进行。用于进行溶液内消化的示例性商业上可得的试剂盒是溶液内胰蛋白酶消化和胍基化试剂盒(赛默飞世尔登记编号89895)。
在一些实施例中，片段化方案使用珠子。在一些实施例中，片段化方案包括珠上消化。在一些实施例中，使用琼脂糖珠子或蛋白质G珠子。在一些实施例中，使用磁珠。
在一些实施例中，在MS分析之前，使用液相色谱法将蛋白质样品分开。在一些实施例中，在MS分析之前，使用液相色谱法将片段样品分开。
本文所述的IP和IP-MS方法能够检测磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白，包含表4中描述的那些。
表4.总RAS-RAF-MAPK通路靶蛋白的列表
在一些实施例中，本文所述的MS方法中使用的RAS-RAF-MAPK通路肽具有被视为在临床和研究方法中有用的检测限。参见例如表5。在一些实施例中，MS和IP-MS方法中使用的RAS-RAF-MAPK通路肽包括表5描述的肽或由其组成。在一些实施例中，表5的肽被可检测地标记。
表5.用于RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽的量化下限
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表6.用于多重IP、单重IP(+/-MS)的抗体的列表。
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在一个实例中，一起评估总TP53和磷酸化TP53。在一些实施例中，一起评估KRAS、HRAS和NRAS。在其它实施例中，一起评估EGFR、SOS1、ARAF、BRAF、RAF1、KRAS、HRAS和NRAS、RPS6KA1、PIK3R1、PIK3R2和PIK3CA。在一些实施例中，一起评估ERBB2、SOS1、ARAF、BRAF、RAF1、KRAS、HRAS和NRAS、RPS6KA1、PIK3R1、PIK3R2和PIK3CA。在一些实施例中，一起评估SPRY1、SPRY2、DUSP4、RASA1、NF1、SPRED1、SPRED2、KRAS、HRAS和NRAS。在一些实施例中，一起评估MAPK1/3和TP53(包含总蛋白质或磷酸化形式，如例如MAPK1/3(包含磷酸化形式pThr202/pTyr204)和TP53(包含磷酸化形式pSer15))。在一些实施例中，一起评估PIK3R1、PIK3R2、PIK3CA、ARAF、BRAF、RAF1、KRAS、HRAS、NRAS、RPS6KA1、RPS6KB1、AKT1、AKT2、AKT3、MTOR、磷酸化TP53(pSer15)、磷酸化MAPK1/3(pThr202/pTyr204)以及磷酸化MAPK8/9(pThr183/pTyr185)。表6中提及的对应于这些蛋白质的任何抗体可以以多重IP形式使用，例如，如表7中列出的组。
表7.多重IP(+/-MS)抗体的选定组合(当针对给定蛋白质列出多于一种抗体时，可以选择任何一种抗体)。
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实例
提供下述实例，以阐释某些公开的实施例，并且决不视为限制本公开的范围。
实例1-RAS-RAF-MAPK通路蛋白的免疫沉淀和发现MS
RAS-RAF-MAPK通路蛋白在包含癌症的疾病中起到核心作用。尽管期望作为监测疾病进展的方式和作为科学研究的工具，但是RAS-RAF-MAPK通路蛋白的识别已经受到限制，部分原因是RAS-RAF-MAPK通路蛋白的低丰度，并且部分原因是缺少验证方法和试剂。磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白对于识别和量化作为蛋白质活化状态的量度尤其重要，并且还作为疾病进展的标志物。如图1中所示，设计和测试了用于检测RAS-RAF-MAPK通路蛋白，包含磷酸化蛋白和其蛋白质相互作用的方法和试剂。对多重免疫沉淀(IP)到MS(mIP-MS)的测量总的和磷酸化RAS-RAF-MAPK通路靶的能力进行了评估。还将mIP-MS方法与现有单重免疫测定(蛋白质印迹(WB)和ELISA)和多重Luminex测定进行了比较。
免疫沉淀和MS样品制备
Thermo ScientificTM Pierce MS兼容性磁性IP试剂盒(蛋白质A/G)用于从500μg细胞裂解物中筛选和验证用于78种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的抗体。验证的抗体被ThermoScientificTM Pierce抗体生物素化试剂盒生物素化，以用于IP。Thermo ScientificTMPierce MS兼容性磁性IP试剂盒(链霉亲和素)用于进行单重或多重IP，用于靶富集。通过溶液内消化方法处理IP样品，其中将IP洗脱液在pH 8.5的6M尿素、50mM三乙铵碳酸氢盐(TEAB)中重构，随后在37℃°下进行还原、烷基化以及胰蛋白酶消化过夜。在MS分析之前，将消化的样品用三氟乙酸(TFA)酸化。
用酶洗脱的免疫沉淀和MS样品制备
开发了采用较短胰蛋白酶消化的另外方法(数据未显示)。将抗体和合适的裂解物在4℃下旋转温育过夜。第二天，洗涤免疫复合物，并且使其在37℃下与1.0μg胰蛋白酶在50mM TEAB中一起温育1小时，并且以800rpm在热混合器中摇动。将酶衍生的IP洗脱液与珠子分离，并且使珠子与MS兼容性洗脱缓冲液(赛默飞世尔科技，PN：90409)在室温下一起温育10分钟。分别收集此第二洗脱液。使第二洗脱液在真空离心机中向下干燥，并且用基于尿素的溶液内消化方法处理，其中将IP洗脱液在pH 8.5的6M尿素、50mM TEAB中重构，随后在37℃下进行还原、烷基化以及胰蛋白酶消化过夜。在MS分析之前，将消化的样品用TFA酸化。
将酶衍生的IP洗脱液与25ng绿色荧光蛋白(GFP)组合，并且以1:4的比例在95℃下暴露于三[2-羧乙基]磷化氢(TCEP)/氯乙酰胺的溶液中5-10分钟，并且然后在加入600ng胰蛋白酶之前使其短暂冷却，并且在37℃下，以500rpm在热混合器中温育2小时。将胰蛋白酶消化的样品用10％TFA中和，并且在真空离心机中向下干燥。将样品在5％乙腈(ACN)和0.1％TFA中重构，并且进行LC-MS分析。
液相色谱法和质谱法
在MS分析之前，在线使用Thermo ScientificTM AcclaimTM PepMap 100C18捕获柱使胰蛋白酶消化的样品脱盐。对于发现MS，通过nanoLC-MS/MS使用Thermo ScientificTMDionexTM UltiMateTM 3000RSLCnano系统和Thermo ScientificTM Q ExactiveTM HF混合型四极轨道阱质谱仪，分析样品。对于靶向MS，使用UltiMate 3000RSLCnano系统和ThermoScientificTM TSQTM VantageTM质谱仪(SRM模式)或Thermo ScientificTM Q ExactiveTM HF混合型四极轨道阱质谱仪(PRM模式)，分析样品。
MS数据分析
用Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 1.4分析发现MS数据，以评估序列覆盖百分数、独特肽、MS1强度、谱计数和PTM。使用Uniprot人蛋白质数据库进行ProteomeDiscoverer软件搜索。具有最高MS1强度和相关磷酸化位点的胰蛋白酶肽选自发现数据，用于靶向测定开发。对于靶向MS数据分析，Thermo ScientificTM Pinpoint软件和Skyline软件(华盛顿大学)用于根据校准曲线和来自未知样品的靶分析物浓度测量量化限(LOQ)。
结果
如图2中所示，用Thermo ScientificTM Pierce MS兼容性磁性IP试剂盒(蛋白质A/G或链霉亲和素)，将RAS-RAF-MAPK通路蛋白从HCT116或BT549细胞裂解物免疫沉淀，用于MS分析。筛选各种抗体，以确定对IP RAS-RAF-MAPK通路蛋白的能力的有效性，以及它们在与MS组合时的有用性。表1(上方)提供了验证用于IP-MS方法中的抗体的列表。表2(上方)提供了经测试但是发现较不成功的抗体的列表。
与净(非IP富集的)裂解物相比，在IP富集的样品中识别了较大量的独特肽。参见图2。识别了RAS(K,H,N)、JNKs(MAPK8,MAPK9)、PI3K(PIK3CA,PIK3CB,PIK3R1,PIK3R2)和SOS1靶标的蛋白质同种型和相互作用蛋白质配偶体。识别了ERbb2、PIK3R2、RAF1、RPS6KA1、SOS1和TP53靶标的相关磷酸肽。选择用于靶向MS测定开发的候选量化的肽。
分析RAS-RAF-MAPK通路蛋白，包含BRAF、ERBB2、FOS、FOXO1、FOXO3、HRAS、KRAS、MAP2K1、MAP2K2、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK9、NRAS、RPS6KA1、SOS1和TP53的检测限(LOD)和量化下限(LLOQ)。结果呈现在图3中。表示量化下限到上限(LLOQ到ULOQ)之间的浓度范围的测定动态范围是其中蛋白质浓度在可接受的准确度和精度水平下的可测量范围。为了确保测量的线性，对于每个内部标准肽，在柱上从横跨300-0.05fmol浓度，掺入36fmol和200ng的等摩尔浓度的6种蛋白质消化的恒定轻肽的稀释系列实验确定线性信号到丰度范围(LLOQ和ULOQ)。在一些情况下，可以建立检测和量化的下限，即使这些下限目前尚未测试。因此，下限不超过实验确定的数字。
实例2-RAS-RAF-MAPK通路蛋白的多重IP和多重MS
从未刺激的和人胰岛素样生长因子(hIGF-1)刺激的HCT116裂解物，用生物素化的抗体和Thermo ScientificTM Pierce MS兼容性磁性IP试剂盒(链霉亲和素)，同时富集多RAS-RAF-MAPK通路蛋白靶。在用100ng/ml的IGF刺激15分钟之前，使HCT116细胞在0.1％炭剥离的牛胎儿血清(FBS)中挨饿24小时。对于29种RAS-RAF-MAPK通路靶，如说明书手册中所建议的，使用Thermo ScientificTM Pierce抗体生物素化试剂盒，将验证的IP-MS抗体生物素化，以用于IP(PN：90407)。将29个总靶分为三个不同的多重IP组。对于包括10-15种总靶的每个组，将1μg每种生物素化的抗体同时添加到1000μg的对照和IGF刺激的HCT116细胞裂解物中，一式两份。如具有以下改变的Thermo ScientificTM Pierce MS兼容性磁性IP试剂盒(链霉亲和素)(PN：90408)中所建议的，进行IP。对于每微克生物素化的抗体浓度，将5微克链霉亲和素磁珠用于多重IP。
通过溶液内消化方法处理IP样品，其中IP洗脱液在pH 8.5的6M尿素、50mM TEAB中重构，随后还原(35°℃下5mM TCEP持续30分钟)，烷基化(室温下暗处20mM碘乙酰胺持续30分钟)以及在37°℃下进行胰蛋白酶消化过夜。在发现MS分析之前，将消化的样品用3.5μL的10％TFA酸化。对于发现MS，通过nanoLC-MS/MS使用Thermo ScientificTM DionexTMUltiMateTM 3000RSLCnano系统和Thermo ScientificTM Q ExactiveTM HF混合型四极轨道阱质谱仪，分析样品。简言之，在线使用C18捕获柱(赛默飞世尔科技，PN：164564)清洁消化的样品，随后使用具有2-30％梯度的缓冲液B的分析C18柱(75μm内径x 15cm，nanoViper，3μm粒度，赛默飞世尔科技，PN：ES800)，使用缓冲液A(0.1％甲酸)和缓冲液B(0.1％甲酸/99.9％乙腈)以0.300μL/min进行反相分离。
图4示出了IP-nanoLC-MS/MS分析能够识别多重测定组1中的14种蛋白质。多重测定的MS分析识别了RAS-RAF-MAPK通路靶的相互作用蛋白(KRAS-2b、MAPK8和SOS1)。表6提供了在此多重IP中使用的抗体的列表。
图5示出了IP-nanoLC-MS/MS分析能够识别多重测定组2中的12种蛋白质。表6提供了在此多重IP中使用的抗体的列表。
图6示出了IP-nanoLC-MS/MS分析能够识别多重测定组3中的15种蛋白质。多重测定的MS分析识别了RAS-RAF-MAPK通路靶的相互作用蛋白(PIK3CA、PIK3CB和PIK3R1)。表6提供了在此多重IP中使用的抗体的列表。
使用本文所述的IP-MS方法识别和量化的RAS-RAF-MAPK通路蛋白的总结提供在图7中。大部分RAS-RAF-MAPK通路靶在发现MS中没有被识别，并且被靶向MS(PRM或SRM)量化，而不需要通过免疫沉淀富集。
与仅MS相比，使用特定选择抗体的免疫沉淀产生更高产率的RAS-RAF-MAPK通路靶蛋白和更少的非特异性结合蛋白质。IP-MS测定也比其它商业上可得的非MS测定更成功。更进一步，RAS-RAF-MAPK通路蛋白的IP到MS分析识别了多种同种型、相关蛋白质相互作用和磷酸化位点。三组mIP-tMS测定允许在低到亚fmol范围内从未刺激的和IGF刺激的HCT116细胞裂解物同时量化14种、12种和15种RAS-RAF-MAPK通路蛋白。基于MS的测定的主要优势是靶同一性的高置信度，加上同时量化多个靶、相互作用蛋白和其磷酸化形式。

Claims (48)

1.一种用于检测RAS-RAF-MAPK通路蛋白的方法，其包括：
a.用至少一种抗体处理生物样品，所述抗体能够使来自生物样品的RAS-RAF-MAPK通路蛋白发生免疫沉淀，其中所述一种或多种抗体选自表1和/或表6中列举的抗体；
b.消化经过免疫沉淀的所述靶蛋白；
c.通过质谱分析经过消化的所述蛋白质，以确定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的肽的存在或不存在，其中RAS-RAF-MAPK通路蛋白的所述肽选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:1400的序列并且长度小于或等于40个氨基酸；以及
d.检测所述样品中的一种或多种RAS-RAF-MAPK通路蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括测定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白被磷酸化。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RAS-RAF-MAPK通路肽包括表5中的至少一种肽。
5.一种用于测定磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白与非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的比率的方法，其包括：
a.用一种或多种能够使磷酸化RAS-RAF-MAPK靶蛋白发生免疫沉淀的抗体处理生物样品，并且用一种或多种能够使非磷酸化RAS-RAF-MAPK靶蛋白发生免疫沉淀的抗体单独处理所述同一生物样品，其中所述一种或多种抗体选自表6中列举的抗体；
b.消化经过免疫沉淀的所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白；
c.将已知量的第一和第二可检测标记内部标准肽添加到经过消化的所述蛋白质中，其中所述第一内部标准肽与用于识别所述磷酸化蛋白的磷酸化RAS-RAF-MAPK通路肽具有相同的氨基酸序列，并且所述第二内部标准肽与用于识别所述非磷酸化蛋白的所述非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路肽具有相同的氨基酸序列；
d.通过质谱分析经过消化的所述蛋白质和内部标准品，以测定磷酸化和非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路肽的存在和量，其中所述RAS-RAF-MAPK通路肽选自SEQ ID NO:1到SEQ IDNO:1400；以及
e.测定所述样品中RAS-RAF-MAPK磷酸化和非磷酸化通路蛋白的数量，并且测定磷酸化靶蛋白与非磷酸化靶蛋白的比率。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品源自人。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述RAS-RAF-MAPK通路肽包括表5中的至少一种肽。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中用于检测非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的所述抗体包括表6中的抗体。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用可检测标记修饰所述肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述可检测标记包括选自13C、15N、2H和18O的同位素。
11.根据权利要求9所述的方法，其中经过修饰的所述肽选自SEQ ID NO:701至1400的肽。
12.根据权利要求1、2和3到11中任一项所述的方法，其中所述抗体选自表1中所述的抗体。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体能够使多于一种RAS-RAF-MAPK通路蛋白发生免疫沉淀。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多于一种RAS-RAF-MAPK通路蛋白选自：
a.KRAS、HRAS和NRAS；
b.EGFR、SOS1、ARAF、BRAF、RAF1、KRAS、HRAS、和NRAS、RPS6KA1、PIK3R1、PIK3R2和PIK3CA；
c.ERBB2、SOS1、ARAF、BRAF、RAF1、KRAS、HRAS、和NRAS、RPS6KA1、PIK3R1、PIK3R2和PIK3CA；
d.SPRY1、SPRY2、DUSP4、RASA1、NF1、SPRED1、SPRED2、KRAS、HRAS和NRAS；
e.将MAPK1/3和TP53一起评估；或
f.PIK3R1、PIK3R2、PIK3CA、ARAF、BRAF、RAF1、KRAS、HRAS、NRAS、RPS6KA1、RPS6KB1、AKT1、AKT2、AKT3、MTOR、TP53磷酸化形式pSer15以及MAPK1/3磷酸化形式pThr202/pTyr204。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所用的所述抗体来自表7中的组合B、C、D、E、F或G。
16.根据权利要求5到15中任一项所述的方法，其中所述方法评估至少一种RAS-RAF-MAPK通路蛋白的非磷酸化形式和磷酸化形式，其包括：
g.采用第一抗体和第二抗体，所述第一抗体能够使所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白的磷酸化形式发生免疫沉淀，所述第二抗体能够使通过所述第一抗体沉淀的磷酸化和非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白发生免疫沉淀，或
h.将所述样品分成两个等分试样，并且使第一等分试样中的总RAS-RAF-MAPK通路蛋白或非磷酸化RAS-RAF-MAPK通路蛋白发生免疫沉淀，并且使第二等分试样中的所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白的磷酸化形式发生免疫沉淀。
17.根据权利要求16所述的方法，其中将总TP53和磷酸化TP53一起评估。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所用的所述抗体来自表7中的组合A。
19.根据权利要求14所述的方法，其中MAPK1/3是MAPK1/3磷酸化形式pThr202/pTyr204，并且TP53是TP53磷酸化形式pSer15。
20.根据权利要求1、2和3到19中任一项所述的方法，其中步骤a)包括用能够结合所述通路蛋白的经标记抗体处理所述样品，以提供标记的抗体-蛋白质结合物；以及使所述经标记的抗体-蛋白质结合物与能够结合所述经标记抗体的捕获剂结合，以从所述样品中分离出所述靶蛋白。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述标记是生物素，并且所述捕获剂是链霉亲和素。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过将已知量的内部标准肽添加到经过消化的所述蛋白质中、随后进行质谱法来测定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量，其中所述内部标准肽具有与所述RAS-RAF-MAPK通路肽相同的氨基酸序列并且被可检测地标记，并且通过与所述内部标准品比较而测定RAS-RAF-MAPK通路肽的数量。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过包括以下的方法测定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量：将所述样品中RAS-RAF-MAPK通路肽的量与对照样品中相同RAS-RAF-MAPK通路肽的量进行比较。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过包括以下的方法测定RAS-RAF-MAPK通路蛋白的数量：将所述RAS-RAF-MAPK通路肽的量与已知量的内部标准肽进行比较，其中所述生物样品中的肽和所述内部标准肽均选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:701，其中所述标准肽被可检测地标记。
25.根据权利要求22和24中任一项所述的方法，其中所述内部标准肽选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:700。
26.根据权利要求22和24中任一项所述的方法，其中所述内部标准肽选自SEQ ID NO:701至SEQ ID NO:1400。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述质谱法选自串联质谱法和发现质谱法。
28.根据权利要求27所述的方法，其中靶向质谱法选自多反应监测(MRM)、选择反应监测(SRM)和平行反应监测(PRM)或其组合。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自全血、CSF、尿、痰和组织。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述组织为肿瘤组织。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述生物样品选自血浆和血清。
32.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自分离的细胞。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的相对量。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括量化RAS-RAF-MAPK通路蛋白的绝对量。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述消化包括蛋白酶或化学消化。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述消化是单一的或依序的。
37.根据权利要求35和36中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶消化使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、AspN、GluC、LysC、LysN、ArgC、蛋白酶K、胃蛋白酶、梭菌蛋白酶、弹性蛋白酶、GluCbiocarb、LysC/P、LysN promisc、蛋白质内肽酶、葡萄球菌蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。
38.根据权利要求35和36中任一项所述的方法，其中化学裂解使用CNBr、亚碘酰苯甲酸盐或甲酸。
39.根据权利要求35和36中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶消化是胰蛋白酶消化。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括在消化之后且在质谱法之前进行脱盐。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白选自ALK(UniProtKB-Q9UM73)、ARAF(UniProtKB-P10398)、BRAF(UniProtKB-P15056)、CALM1(UniProtKB-P62158)、CAMK2A(UniProtKB-Q9UQM7)、CCND1(UniProtKB-P24385)、CDH1(UniProtKB-P12830)、CDH2(UniProtKB-P19022)、CDK2(UniProtKB-P24941)、CDKN1A(UniProtKB-P38936)、CDKN1B(UniProtKB-P46527)、CDKN2A(UniProtKB-Q8N726)、CTNNA1(UniProtKB-P35221)、CTNNB1(UniProtKB-P35222)、DDR2(UniProtKB-Q16832)、DUSP22(UniProtKB-Q9NRW4)、DUSP4(UniProtKB-Q13115)、DUSP6(UniProtKB-Q16828)、EGFR(UniProtKB-P00533)、EIF2A(UniProtKB-Q9BY44)、EIF4E(UniProtKB-P06730)、EIF4EBP1(UniProtKB-Q13541)、ERBB2(UniProtKB-P04626)、ERBB3(UniProtKB-P21860)、ERBB4(UniProtKB-Q15303)、ESR1(UniProtKB-P03372)、FBXO7(UniProtKB-Q9Y3I1)、FGFR1(UniProtKB-P11362)、FGFR3(UniProtKB-P22607)、FOS(UniProtKB-P01100)、FOXO1(UniProtKB-Q12778)、FOXO3(UniProtKB-O43524)、HRAS(UniProtKB-P01112)、IQGAP1(UniProtKB-P46940)、JAK1(UniProtKB-P23458)、JAK2(UniProtKB-O60674)、KRAS(UniProtKB-P01116)、MAP2K1(UniProtKB-Q02750)、MAP2K2(UniProtKB-P36507)、MAPK1(UniProtKB-P28482)、MAPK11(UniProtKB-Q15759)、MAPK3(UniProtKB-P27361)、MAPK8(UniProtKB-P45983)、MAPK9(UniProtKB-P45984)、MET(UniProtKB-P08581)、NF1(UniProtKB-P21359)、NOTCH1(UniProtKB-P46531)、NRAS(UniProtKB-P01111)、PAK1(UniProtKB-Q13153)、PARP1(UniProtKB-P09874)、PGR(UniProtKB-P06401)、PIK3CA(UniProtKB-P42336)、PIK3R1(UniProtKB-P27986)、PIK3R2(UniProtKB-O00459)、PSMG1(UniProtKB-O95456)、RAF1(UniProtKB-P04049)、RASA1(UniProtKB-P20936)、RASGRF1(UniProtKB-Q13972)、RASGRF2(UniProtKB-O14827)、RICTOR(UniProtKB-Q6R327)、RPS6KA1(UniProtKB-Q15418)、RPS6KA2(UniProtKB-Q15349)、RPS6KA3(UniProtKB-P51812)、RPS6KB2(UniProtKB-Q9UBS0)、RPTOR(UniProtKB-Q8N122)、SMAD3(UniProtKB-P84022)、SMAD4(UniProtKB-Q13485)、SOS1(UniProtKB-Q07889)、SPRED1(UniProtKB-Q7Z699)、SPRED2(UniProtKB-Q7Z698)、SPRY1(UniProtKB-O43609)、SPRY2(UniProtKB-O43597)、SPRY3(UniProtKB-O43610)、SPRY4(UniProtKB-Q9C004)、STAT1(UniProtKB-P42224)、STAT3(UniProtKB-P40763)、STK11(UniProtKB-Q15831)、TP53(UniProtKB-P04637)、ATF2(UniProtKB-P15336)、MAPK12(UniProtKB-P53778)、MAPK13(UniProtKB-O15264)、MAPK14(UniProtKB-Q16539)、MAP2K3(UniProtKB-P46734)、MAP2K6(UniProtKB-P52564)、RPS6KA5(UniProtKB-O75582)和MAPKAPK2(UniProtKB-P49137)。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RAS-RAF-MAPK通路蛋白选自权利要求41中所述的蛋白质。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RAS-RAF-MAPK蛋白被磷酸化。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所检测的RAS-RAF-MAPK肽的浓度范围为0.04fmol到2000fmol。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中检测下限不超过0.04fmol、0.05fmol、0.06fmol、0.07fmol、0.08fmol、0.09fmol、0.10fmol、0.11fmol、0.12fmol、0.13fmol、0.14fmol、0.15fmol、0.16fmol、0.17fmol、0.18fmol、0.19fmol、0.20fmol、0.21fmol、0.22fmol、0.23fmol、0.24fmol或1.23fmol。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测下限为0.04fmol至1.23fmol。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中量化下限不超过0.04fmol、0.05fmol、0.06fmol、0.07fmol、0.08fmol、0.09fmol、0.10fmol、0.11fmol、0.12fmol、0.13fmol、0.14fmol、0.15fmol、0.16fmol、0.17fmol、0.18fmol、0.19fmol、0.20fmol、0.21fmol、0.22fmol、0.23fmol、0.24fmol、0.25fmol、0.30fmol、0.35fmol、0.40fmol、0.45fmol、0.50fmol、0.55fmol、0.60fmol、0.65fmol、0.70fmol或11.11fmol。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述量化下限为0.04fmol至11.11fmol。
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