CN111766281A - 一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法及应用,属于新型功能材料与生物传感检测技术领域;本发明以尖晶石型锰铁氧体为基底材料以可见光做光源来获得光电流;基底材料的三种组分能带匹配良好,大大提高光电转换效率,从而获得大的输出信号;待测PCT溶液的浓度不同,导致形成不同量的免疫复合物,进而导致了对光电信号不同程度的影响;该传感器对目标物表现出了高的灵敏度,宽的检测范围以及低的检出限,能够实现人体血清中PCT的快速灵敏测定,对临床上患者感染类型的判断有着较大的应用价值。

Description

一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器的 制备方法及应用
技术领域
本发明涉及基于尖晶石型锰铁氧体的光电化学免疫传感器的制备方法及应用,具体是采用尖晶石型锰铁氧体作为基底材料制备了一种灵敏检测PCT的夹心型光电化学免疫传感器,属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
光电化学(PEC)免疫传感器的光电转换过程是通过光电活性材料实现的,材料在光的激发下,电子从价带跃迁到导带,而产生电子-空穴对,电子与空穴的分离产生光电压,在外部电路形成光电流,使光信号转换为电信号;基于此原理,寻求具有高转换性能、高稳定性、无毒的光电活性材料用于构建光电化学传感器至关重要;目前研究最多的TiO2因禁带较宽,仅能对只占太阳光总能量4%的紫外光(<400 nm)响应,发展可见光响应光电材料是实现高效光电转换的最重要途径之一。
尖晶石型铁氧体磁性纳米材料因其带有表面电荷和含有变价元素所以具有良好的表面吸附和氧化还原等化学活性,多用于通信技术、锂电池、微波吸收剂、催化材料和医药应用等领域;尖晶石结构的锰铁氧体种类繁多,禁带宽度在1.7-2.0 eV之间,能带宽度相对较窄,能对可见光响应;Zn0.1Cd0.9S、Au NPs的引入形成匹配的三能级结构,以及材料表面的等离子共振效应都进一步增强对可见光的吸收,提高对光的利用率,增强光电信号的激发。
在PEC免疫传感器制备过程中,由于空间位阻,电子的转移受到了阻碍。因此,大多数PEC免疫传感器属于信号衰减型;二氧化硅(SiO2)纳米颗粒因其具有表面积大、生物相容性好、稳定性高、成本低、导电性差且易修饰等优点,可作为连接检测抗体Ab2进行信号放大的良好信号标签;而银纳米粒子(Ag NPs)与抗体之间的Ag-NH2键可以有效增加复合材料表面Ab2分子的数量;为了将SiO2与Ag NPs连接起来,利用具有良好的生物相容性和弱还原能力的多巴胺(PDA)在SiO2表面形成涂层,Ag NPs可以在PDA表面原位形成,得到SiO2/PDA-AgNPs。
通过抗原与抗体的特异性结合,将不同水平的PCT在电极上固定,再通过PCT与Ab2的特异性反应将固定浓度的SiO2/PDA-Ag-Ab2结合在电极上,使光电流明显降低;所提出的夹心型 PEC免疫传感器具有超高的灵敏度、良好的重现性和可接受的特异性。
发明内容
本发明的目的之一是通过水热法得到性能优越的尖晶石型锰铁氧体,并通过复合、电镀等修饰进一步优化光电转换活性。
本发明的目的之二是以尖晶石型锰铁氧体为基底制备出一种灵敏度高、特异性强、检测速度快的夹心型光电化学免疫传感器,实现可见光条件下对PCT的超灵敏检测;
本发明的技术方案如下:
1. 一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将ITO导电玻璃切割成2.5×1.0 cm2,依次用去污粉、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗0.5 h,氮气下吹干;
2)取6 µL、1 ~ 6 mg/mL的锌掺杂硫化镉修饰的尖晶石结构锰铁氧体溶液(MnFe2O4/Zn0.1Cd0.9S)滴加到ITO导电玻璃的导电面,室温下晾干;
3)将以上修饰的电极在浓度为1% ~ 5%的氯金酸溶液中以-0.2 V电镀30 s,在电极表面沉积金膜;
4)在修饰电极表面滴加1 ~ 5 mg/mL的降钙素原(PCT)Ab1溶液,4 oC下孵化1 h后超纯水清洗,自然晾至湿润薄膜状态;
5)滴加6 µL、质量分数为1% ~ 3%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面,0.5 h后用超纯水冲洗电极表面,4 oC冰箱中晾至湿润薄膜状态;
6)滴加6 µL不同浓度水平的PCT标准溶液,4 ℃恒温孵化4 h后超纯水冲洗电极表面;
7)滴加6 µL二氧化硅/聚多巴胺-银纳米微粒缀连的PCT抗体标准溶液(SiO2/PDA-AgNPs-Ab2),4 ℃恒温孵化4 h后超纯水冲洗电极表面,制得工作电极。
2. 如权利要求1所述浓度为1 μg/mL的PCT抗体溶液为从南京金斯瑞生物科技有限公司购得的1 mg/mL的PCT抗体溶液用磷酸盐缓冲液稀释得到。
3. 如权利要求1所述的固定浓度SiO2/PDA-Ag NPs-Ab2溶液为,将3 ~ 6 mg SiO2/PDA-Ag NPs溶入1 mL PBS(pH = 7.4)中,然后加入从南京金斯瑞生物科技有限公司购得的1 mg/mL的PCT抗体标准溶液,并用磷酸盐缓冲液稀释。
4. 如权利要求1所述磷酸盐缓冲液,为用0.1 mol/L的磷酸氢二钠溶液与0.1mol/L的磷酸二氢钾混合制得,并且调制其酸碱度为7.4。
5. 如权利要求3所述SiO2/PDA-Ag NPs溶液为,将1 wt% ~ 5 wt%的氨水逐渐加入到10 mg/mL AgNO3溶液中,得到银氨溶液作为Ag NPs前驱液后;将50 mg ~ 80 mg SiO2/PDA粉末溶解于40 mL以上的溶液中,室温下黑暗中连续搅拌所得。
6. 如权利要求5所述SiO2/PDA粉末为二氧化硅与盐酸多巴胺按1:1比例溶解在40ml 三羟甲基氨基甲烷(10 mM,PH = 8.5)中,在常温下搅拌过夜后,离心分离,并用超纯水和无水乙醇洗涤,然后在真空中于35 oC干燥所制得。
7. 如权利要求1所述MnFe2O4/Zn0.1Cd0.9S溶液,其特征在于,制备步骤如下:
六水合硝酸锰与九水合硝酸铁摩尔比1:2加入到45ml超纯水中,搅拌30 min完全溶解,用氢氧化钠调节PH值至10,然后转移至反应釜中160~180 oC下反应12 h;反应结束后,收集产物,离心洗涤,在60 oC真空干燥;研磨后得到尖晶石型铁氧体材料;
乙酸锌与乙酸镉摩尔比1:9加入到40ml超纯水中搅拌溶解,搅拌中再缓慢加入40ml(0.125 M )硫化钠,然后在室温下继续搅拌约8小时。最后加入已合成MnFe2O4粉末,160~180℃下反应12小时。反应结束后,收集产物,离心洗涤,在60℃真空干燥过夜;研磨粉末配置成浓度为1 ~ 6 mg/mL的水溶液。
8. 如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器,用于PCT的检测,其特征在于,检测步骤如下:
1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,修饰的ITO电极为工作电极,在15 mL、pH 为5.0 ~ 8.0的溶有浓度为0.05 ~0.25 mol/L的抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
2)用时间-电流法对PCT标准标准溶液进行检测,设置电压为0 V,运行时间120 s,光源波长为400 ~ 500 nm;
3)电极放置好之后,每隔20 s开灯持续照射20 s,记录光电流,绘制工作曲线;
4)用待测的PCT样品溶液代替PCT标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
1. 本发明首次应用尖晶石型MnFe2O4材料构建PEC传感模型,通过Zn0.1Cd0.9S的复合解决了材料单独使用时光电转换效率低的问题,并通过引入进一步放大材料对可见光的响应,该复合材料在光电转换方面应用潜力巨大;
2. 本发明制备的夹心型光电化学免疫传感器,用于PCT的检测,响应时间短,检测限低,线性范围宽,稳定性好,可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测,为PCT的早期临床检测提供了一种全新的分析方法。
具体实施方案
实施例1 一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法:
1)将ITO导电玻璃切割成2.5×1.0 cm2,依次用去污粉、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗0.5 h,氮气下吹干;
2)取6 µL、1mg/mL的MnFe2O4/Zn0.1Cd0.9S溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面,室温下晾干;
3)将以上修饰的电极在浓度为2%的氯金酸溶液中以-0.2 V电镀30 s,在电极表面沉积金膜;
4)在修饰电极表面滴加5 mg/mL的Ab1溶液,4 oC下孵化1 h后超纯水清洗,自然晾至湿润薄膜状态;
5)滴加6 µL、质量分数为2%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面,0.5 h后用超纯水冲洗电极表面,4 oC冰箱中晾至湿润薄膜状态;
6)滴加6 µL不同浓度水平的PCT标准溶液,4 ℃恒温孵化4 h后超纯水冲洗电极表面;
7)滴加6 µL SiO2/PDA-Ag NPs-Ab2溶液,4 ℃恒温孵化4 h后超纯水冲洗电极表面,制得工作电极。
实施例2 一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法:
1)将ITO导电玻璃切割成2.5×1.0 cm2,依次用去污粉、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗0.5 h,氮气下吹干;
2)取6 µL、3mg/mL的MnFe2O4/Zn0.1Cd0.9S溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面,室温下晾干;
3)将以上修饰的电极在浓度为1%的氯金酸溶液中以-0.2 V电镀30 s,在电极表面沉积金膜;
4)在修饰电极表面滴加3mg/mL的Ab1溶液,4 oC下孵化1 h后超纯水清洗,自然晾至湿润薄膜状态;
5)滴加6 µL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面,0.5 h后用超纯水冲洗电极表面,4 oC冰箱中晾至湿润薄膜状态;
6)滴加6 µL不同浓度水平的PCT标准溶液,4 ℃恒温孵化4 h后超纯水冲洗电极表面;
7)滴加6 µL SiO2/PDA-Ag NPs-Ab2溶液,4 ℃恒温孵化4 h后超纯水冲洗电极表面,制得工作电极。
实施例3 一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法:
1)将ITO导电玻璃切割成2.5×1.0 cm2,依次用去污粉、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗0.5 h,氮气下吹干;
2)取6 µL、6mg/mL的MnFe2O4/Zn0.1Cd0.9S溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面,室温下晾干;
3)将以上修饰的电极在浓度为5%的氯金酸溶液中以-0.2 V电镀30 s,在电极表面沉积金膜;
4)在修饰电极表面滴加1 mg/mL的Ab1溶液,4 oC下孵化1 h后超纯水清洗,自然晾至湿润薄膜状态;
5)滴加6 µL、质量分数为3%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面,0.5 h后用超纯水冲洗电极表面,4 oC冰箱中晾至湿润薄膜状态;
6)滴加6 µL不同浓度水平的PCT标准溶液,4 ℃恒温孵化4 h后超纯水冲洗电极表面;
7)滴加6 µL SiO2/PDA-Ag NPs-Ab2溶液,4 ℃恒温孵化4 h后超纯水冲洗电极表面,制得工作电极。
实施例4 MnFe2O4/Zn0.1Cd0.9S复合材料的制备:
0.7 mmol的六水合硝酸锰与1.4 mmol的九水合硝酸铁摩尔加入到45ml超纯水中,搅拌30 min完全溶解,用氢氧化钠调节PH值至10,然后转移至反应釜中160 oC下反应12 h;反应结束后,收集产物,离心洗涤,在60 oC真空干燥;研磨后得到尖晶石型铁氧体材料;
1 mmol乙酸锌与9 mmol乙酸镉摩尔加入到40ml超纯水中搅拌溶解,搅拌中再缓慢加入40 ml(0.125 M )硫化钠,然后在室温下继续搅拌约8小时;最后加入已合成MnFe2O4粉末,170 ℃下反应12小时;反应结束后,收集产物,离心洗涤,在60℃真空干燥过夜;研磨粉末配置成浓度为3 mg/mL的水溶液。
实施例5 MnFe2O4/Zn0.1Cd0.9S复合材料的制备:
5 mmol的六水合硝酸锰与10 mmol的九水合硝酸铁摩尔加入到45ml超纯水中,搅拌30min完全溶解,用氢氧化钠调节PH值至10,然后转移至反应釜中170 oC下反应12 h;反应结束后,收集产物,离心洗涤,在60 oC真空干燥;研磨后得到尖晶石型铁氧体材料;
0.5 mmol乙酸锌与4.5 mmol乙酸镉摩尔加入到40 ml超纯水中搅拌溶解,搅拌中再缓慢加入40ml(0.125 M )硫化钠,然后在室温下继续搅拌约8小时;最后加入已合成MnFe2O4粉末,180 ℃下反应12小时;反应结束后,收集产物,离心洗涤,在60℃真空干燥过夜;研磨粉末配置成浓度为1 mg/mL的水溶液。
实施例6 MnFe2O4/Zn0.1Cd0.9S复合材料的制备:
2.5 mmol的六水合硝酸锰与5 mmol的九水合硝酸铁摩尔加入到45ml超纯水中,搅拌30min完全溶解,用氢氧化钠调节PH值至10,然后转移至反应釜中1890 oC下反应12 h;反应结束后,收集产物,离心洗涤,在60 oC真空干燥;研磨后得到尖晶石型铁氧体材料;
0.7 mmol乙酸锌与6.3 mmol乙酸镉摩尔加入到40ml超纯水中搅拌溶解,搅拌中再缓慢加入40 ml(0.125 M )硫化钠,然后在室温下继续搅拌约8小时;最后加入已合成MnFe2O4粉末,160 ℃下反应12小时;反应结束后,收集产物,离心洗涤,在60℃真空干燥过夜;研磨粉末配置成浓度为6 mg/mL的水溶液。
实施例7 SiO2/PDA-Ag NPs-Ab2溶液的制备:
8 mmol二氧化硅与8 mmol盐酸多巴胺溶解在40 ml 三羟甲基氨基甲烷(10 mM,PH =8.5)中,在常温下搅拌过夜后,离心分离,并用超纯水和无水乙醇洗涤,然后在真空中于35 oC干燥制得SiO2/PDA粉末;将3 wt%的氨水逐渐加入到10 mg/mL AgNO3溶液中,得到银氨溶液作为Ag NPs前驱液后;将50 mg SiO2/PDA粉末溶解于40 mL以上的溶液中,室温下黑暗中连续搅拌所得SiO2/PDA-Ag NPs溶液;将5 mg SiO2/PDA-Ag NPs溶入1 mL PBS(pH = 7.4)中,然后加入1 mg/mL的PCT抗体标准溶液,并用磷酸盐缓冲液稀释。
实施例8 SiO2/PDA-Ag NPs-Ab2溶液的制备:
4 mmol二氧化硅与4 mmol盐酸多巴胺溶解在40 ml 三羟甲基氨基甲烷(10 mM,PH =8.5)中,在常温下搅拌过夜后,离心分离,并用超纯水和无水乙醇洗涤,然后在真空中于35 oC干燥制得SiO2/PDA粉末;将5 wt%的氨水逐渐加入到10 mg/mL AgNO3溶液中,得到银氨溶液作为Ag NPs前驱液后;将60 mg SiO2/PDA粉末溶解于40 mL以上的溶液中,室温下黑暗中连续搅拌所得SiO2/PDA-Ag NPs溶液;将6 mg SiO2/PDA-Ag NPs溶入1 mL PBS(pH = 7.4)中,然后加入1 mg/mL的PCT抗体标准溶液,并用磷酸盐缓冲液稀释。
实施例9 SiO2/PDA-Ag NPs-Ab2溶液的制备:
6 mmol二氧化硅与6 mmol盐酸多巴胺溶解在40 ml 三羟甲基氨基甲烷(10 mM,PH =8.5)中,在常温下搅拌过夜后,离心分离,并用超纯水和无水乙醇洗涤,然后在真空中于35 oC干燥制得SiO2/PDA粉末;将2 wt%的氨水逐渐加入到10 mg/mL AgNO3溶液中,得到银氨溶液作为Ag NPs前驱液后;将80 mg SiO2/PDA粉末溶解于40 mL以上的溶液中,室温下黑暗中连续搅拌所得SiO2/PDA-Ag NPs溶液;将3 mg SiO2/PDA-Ag NPs溶入1 mL PBS(pH = 7.4)中,然后加入1 mg/mL的PCT抗体标准溶液,并用磷酸盐缓冲液稀释。
实施例10 PCT的检测:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,制备的ITO修饰电极为工作电极,在15 mL、pH 为5.5的溶有浓度为0.1 mol/L的抗坏血酸的PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)用时间-电流法对PCT标准标准溶液进行检测,设置电压为0 V,运行时间120 s,光源波长为400 nm;
(3)电极放置好之后,每隔20 s开灯持续照射20 s,记录光电流,绘制工作曲线;
(4)用待测的PCT样品溶液代替PCT标准溶液进行检测。
实施例11 PCT的检测:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,制备的ITO修饰电极为工作电极,在15 mL、pH 为7.4的溶有浓度为0.2 mol/L的抗坏血酸的PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)用时间-电流法对PCT标准标准溶液进行检测,设置电压为0 V,运行时间120 s,光源波长为450 nm;
(3)电极放置好之后,每隔20 s开灯持续照射20 s,记录光电流,绘制工作曲线;
(4)用待测的PCT样品溶液代替PCT标准溶液进行检测。
实施例12 PCT的检测:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,制备的ITO修饰电极为工作电极,在15 mL、pH 为8.0的溶有浓度为1.5 mol/L的抗坏血酸的PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)用时间-电流法对PCT标准标准溶液进行检测,设置电压为0 V,运行时间120 s,光源波长为500 nm;
(3)电极放置好之后,每隔20 s开灯持续照射20 s,记录光电流,绘制工作曲线;
(4)用待测的PCT样品溶液代替PCT标准溶液进行检测。

Claims (8)

1.一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将ITO导电玻璃切割成2.5×1.0 cm2,依次用去污粉、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗0.5 h,氮气下吹干;
2)取6 µL、1 ~ 6 mg/mL的锌掺杂硫化镉修饰的尖晶石结构锰铁氧体溶液(MnFe2O4/Zn0.1Cd0.9S)滴加到ITO导电玻璃的导电面,室温下晾干;
3)将以上修饰的电极在浓度为1% ~ 5%的氯金酸溶液中以-0.2 V电镀30 s,在电极表面沉积金膜;
4)在修饰电极表面滴加1 ~ 5 mg/mL的降钙素原(PCT)Ab1溶液,4 oC下孵化1 h后超纯水清洗,自然晾至湿润薄膜状态;
5)滴加6 µL、质量分数为1% ~ 3%的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面,0.5 h后用超纯水冲洗电极表面,4 oC冰箱中晾至湿润薄膜状态;
6)滴加6 µL不同浓度水平的PCT标准溶液,4 ℃恒温孵化4 h后超纯水冲洗电极表面;
7)滴加6 µL二氧化硅/聚多巴胺-银纳米微粒缀连的PCT抗体标准溶液(SiO2/PDA-AgNPs-Ab2),4 ℃恒温孵化4 h后超纯水冲洗电极表面,制得工作电极。
2.如权利要求1所述浓度为1 μg/mL的PCT抗体溶液为从南京金斯瑞生物科技有限公司购得的1 mg/mL的PCT抗体溶液用磷酸盐缓冲液稀释得到。
3.如权利要求1所述的固定浓度SiO2/PDA-Ag NPs-Ab2溶液为,将3 ~ 6 mg SiO2/PDA-Ag NPs溶入1 mL PBS(pH = 7.4)中,然后加入从南京金斯瑞生物科技有限公司购得的1mg/mL的PCT抗体标准溶液,并用磷酸盐缓冲液稀释。
4.如权利要求1所述磷酸盐缓冲液,为用0.1 mol/L的磷酸氢二钠溶液与0.1 mol/L的磷酸二氢钾混合制得,并且调制其酸碱度为7.4。
5.如权利要求3所述SiO2/PDA-Ag NPs溶液为,将1 wt% ~ 5 wt%的氨水逐渐加入到10mg/mL AgNO3溶液中,得到银氨溶液作为Ag NPs前驱液后;将50 mg ~ 80 mg SiO2/PDA粉末溶解于40 mL以上的溶液中,室温下黑暗中连续搅拌所得。
6.如权利要求5所述SiO2/PDA粉末为二氧化硅与盐酸多巴胺按1:1比例溶解在40 ml 三羟甲基氨基甲烷(10 mM,PH = 8.5)中,在常温下搅拌过夜后,离心分离,并用超纯水和无水乙醇洗涤,然后在真空中于35 oC干燥所制得。
7.如权利要求1所述MnFe2O4/Zn0.1Cd0.9S溶液,其特征在于,制备步骤如下:
六水合硝酸锰与九水合硝酸铁摩尔比1:2加入到45ml超纯水中,搅拌30 min完全溶解,用氢氧化钠调节PH值至10,然后转移至反应釜中160~180 oC下反应12 h;反应结束后,收集产物,离心洗涤,在60 oC真空干燥;研磨后得到尖晶石型铁氧体材料;
乙酸锌与乙酸镉摩尔比1:9加入到40ml超纯水中搅拌溶解,搅拌中再缓慢加入40ml(0.125 M )硫化钠,然后在室温下继续搅拌约8小时;最后加入已合成MnFe2O4粉末,160~180℃下反应12小时;反应结束后,收集产物,离心洗涤,在60℃真空干燥过夜;研磨粉末配置成浓度为1 ~ 6 mg/mL的水溶液。
8.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于尖晶石型锰铁氧体的夹心型光电化学免疫传感器,用于PCT的检测,其特征在于,检测步骤如下:
1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,修饰的ITO电极为工作电极,在15 mL、pH 为5.0 ~ 8.0的溶有浓度为0.05 ~0.25 mol/L的抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
2)用时间-电流法对PCT标准标准溶液进行检测,设置电压为0 V,运行时间120 s,光源波长为400 ~ 500 nm;
3)电极放置好之后,每隔20 s开灯持续照射20 s,记录光电流,绘制工作曲线;
4)用待测的PCT样品溶液代替PCT标准溶液进行检测。
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