CN111751552A - 一种缺血修饰白蛋白测定试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种缺血修饰白蛋白测定试剂盒及其使用方法,属于医学检测测定技术领域。本发明的缺血修饰白蛋白检测试剂盒由试剂1和试剂2组成,试剂1包含缓冲液、硫酸钴;试剂2包含缓冲液、二硫苏糖醇、抗冻剂和还原剂。本发明通过添加还原剂、抗冻剂等优化反应体系,进一步提高了测定试剂盒的分析灵敏度和稳定性;避免在运输过程中因震荡或挤压造成局部与冰袋直接接触,使试剂盒产生冻结,试剂失活影响测定结果;同时其检测灵敏度高、特异性强、精密度好、成本低,可实现对缺血修饰白蛋白(IMA)的准确检测。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测测定技术领域,具体涉及一种缺血修饰白蛋白测定试剂盒及其使用方法。
背景技术
缺血修饰白蛋白(IMA)是人血清白蛋白流经缺血组织时产生的。成熟的白蛋白在肝脏合成,由585个氨基酸残基组成。完整的血清白蛋白含N-天冬氨酸(Asp)-丙氨酸(Ala)-组氨酸(His)-赖氨酸(Lys)的氨基酸序列,该序列是过渡金属元素(如钴、铜、镍)的一个很强的结合位置。在生理情况下,过渡金属紧密结合与该序列以避免或减少白蛋白的损伤。当组织缺血或再灌注时,由于组织局部反应性氧产物增多、酸中毒、细胞膜上各种离子泵破坏等变化,导致白蛋白结构发生改变,与过渡金属钴的结合能力下降。
IMA是急性冠脉综合征(ACS)诊断的生物标志。ACS包括不稳定型心绞痛(unstableangina pectoris,UA)、非ST段抬高心肌梗死(Non-ST segment elevation myocardialinfarction,NSTEMI)及STEM,具有发病急、变化快、临床表现与危险性不均一等特征,早期诊断困难。IMA会在缺血的时候升高,传统的生物标志物如肌钙蛋白(cTn)、肌红蛋白(Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)只有在心肌发生坏死时才升高,但这时已给患者带来了不可逆的病理损害。因此,医务工作者迫切需要一种在心肌缺血早期出现而又比较敏感的心肌缺血标志物。缺血修饰白蛋白(IMA)是美国食品药品管理局(FDA)认可的第一个检测心肌缺血的生化标志物,其对ACS患者心肌缺血检出的灵敏度是ECG的2倍、cTn的4倍,利用白蛋白-钴结合法(ACB法),检测缺血修饰白蛋白的含量,可以作为检测早期心肌缺血的指标,敏感地反应心肌缺血的状况,并对急性冠状动脉综合征的早期诊断、指导治疗等方面有重要的临床意义,为ACS早期诊断的研究开辟了新的道路。
目前,临床生化诊断试剂盒的冷链运输需要专门的冷链运输工具,包括冷藏车、冷藏船、冷藏集装箱等。但这些运输工具结构复杂,且成本极高,仅仅适合大批量运输。当遇到单个或小批量多次运输时,这类传统的运输装置成本就更高;在小批量运输过程中普遍采用具有隔热、防水、抗震、抗老化和价格低廉等特点的独立泡沫保温箱,添加若干块在-20℃~-30℃预冷的冰袋,再将缺血修饰白蛋白(IMA)测定试剂盒放入泡沫保温箱内的方式进行贮运,此贮运方式存在以下不足:
包装简易,恒温效果差,而且试剂盒的位置放置不合理,运输过程中会因震荡或挤压造成局部与冰袋直接接触,因冰袋在-20℃~-30℃预冷,当冰袋放入泡沫保温箱时,受温度直接传导效应,泡沫保温箱和生化诊断试剂盒瞬时温度会低于0℃,从而极可能导致试剂盒产生冻结,会造成试剂冻融致使试剂中的因子失活从而影响测定结果。
因此,急需一种能够解决以上抗冻问题而又不影响试剂性能的缺血修饰白蛋白(IMA)测定试剂盒。
发明内容
本发明目的在于克服上述现有技术的不足而提供一种稳定性强、检测灵敏度高的缺血修饰白蛋白检测试剂盒。
为了实现上述目的,本发明采用了如下的技术方案:
一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒包括试剂1和试剂2,其中:
pH值为7.0~9.0的缓冲液:10~150mmoL/L;
硫酸钴:1~50mmol/L;
所述试剂2包括以下成分:
pH值为7.0~8.5的缓冲液:90~150mmol/L;
二硫苏糖醇:1~30mmol/L;
抗冻剂:5~25g/L;
还原剂:1~15mmol/L。
本试剂盒添加了还原剂抗坏血酸钠,用于促进钴离子与二硫苏糖醇(DTT)结合,从而提高检测的灵敏度。添加抗冻剂赤藓糖醇后,即使IMA测定试剂盒的温度低于0℃,甚至低于-20℃仍可以贮存一周,有效保证了试剂的稳定性。
优选的,所述的缺血修饰白蛋白测定试剂盒,包括试剂1和试剂2,其中,所述试剂1包括以下成分:
pH值为7.0~9.0的缓冲液:100mmoL/L;
硫酸钴:1mmol/L;
所述试剂2包括以下成分:
pH值为7.0~8.5的缓冲液:150mmol/L;
二硫苏糖醇:2mmol/L;
抗冻剂:10g/L;
还原剂:10mmol/L。
经过工艺配方改进、优化获得该优选方案,其检测灵敏度高、特异性强、精密度好。
优选的,所述的缓冲液为甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或3-三羟甲基-2-羟基丙磺酸缓冲液。
优选的,所述试剂2中的抗冻剂为赤藓糖醇。
优选的,所述的防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的至少一种。
优选的,所述的缓冲液为甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-三羟甲基-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种。
优选的,所述试剂2中的抗冻剂为赤藓糖醇。
优选的,所述试剂2中的还原剂为硫代硫酸钠、抗坏血酸钠、谷胱甘肽中的至少一种。
优选的,所述试剂1和试剂2均还包含1~15g/L的稳定剂和0.05~1g/L的防腐剂。
防腐剂和稳定剂的添加保证了试剂盒的稳定性。
优选的,所述试剂1和试剂2均还包含10g/L的稳定剂和0.5g/L的防腐剂。
优选的,所述稳定剂为曲拉通X-100、乙二胺四乙酸二钠、海藻酸钠、甘油、吐温-20中的至少一种。
优选的,所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的至少一种。
上述缺血白蛋白测定试剂盒的制备方法为:试剂1和试剂2的配置方法均为按照配方比例,将试剂中所述的各组分加入蒸馏水搅拌混匀即可。
上述缺血白蛋白测定试剂盒的使用方法为:
(1)向血清样品中加入试剂1,混匀,孵育3~5min,在510nm波长下检测吸光度,读取吸光度值A1;
(2)向步骤(1)的溶液中继续加入试剂2,混匀,孵育3~5min,在510nm波长下检测吸光度,读取吸光度值A2;
(3)通过血清标准别数据计算IMA含量。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明在现有的白蛋白-钴结合法的基础上,通过特定的制备方法以及添加还原剂、抗冻剂等优化反应体系,进一步提高了测定试剂盒的分析灵敏度及稳定性,即使缺血白蛋白(IMA)测定试剂盒在温度低于0℃,甚至低于-20℃的条件下,可以贮存一周,也能有效保证其试剂的稳定性,同时其检测灵敏度高、特异性强、精密度好、成本较低,可以实现对IMA的准确检测。
(2)本发明的试剂盒可在具备有400~800m波长的全自动生化分析仪上检测缺血修饰白蛋白的含量,直接上机使用,快速精准,自动化程度高,从而大大提高工作效率。而且所述检测样本量少,能满足少量样本和急诊样本测定的要求。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的,技术方案和优点,下面个将结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1:
一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒由试剂1和试剂2组成,其中:
试剂1包含以下成分:
Tris-HCl缓冲液:100mmoL/L;
硫酸钴:1mmol/L;
吐温-20:10g/L;
Proclin300:0.05g/L;
所述试剂2包括以下成分:
PBS缓冲液:100mmol/L;
二硫苏糖醇:2mmol/L;
海藻酸钠:10g/L;
赤藓糖醇:10g/L;
抗坏血酸钠:10mmol/L;
Proclin300:0.05g/L。
实施例2:
一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒由试剂1和试剂2组成,其中:
试剂1包含以下成分:
甘氨酸缓冲液:150mmoL/L;
硫酸钴:50mmol/L;
曲拉通X-100:15g/L;
叠氮化钠:1g/L;
所述试剂2包括以下成分:
Hepes缓冲液:90mmol/L;
二硫苏糖醇:1mmol/L;
甘油:1g/L;
赤藓糖醇:5g/L;
硫代硫酸钠:1mmol/L;
异噻唑啉酮:1g/L。
实施例3:
一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒由试剂1和试剂2组成,其中:
试剂1包含以下成分:
Tris-HCl缓冲液:10mmoL/L;
硫酸钴:1mmol/L;
吐温-20:10g/L;
庆大霉素:0.05g/L;
所述试剂2包括以下成分:
PBS缓冲液:100mmol/L;
二硫苏糖醇:30mmol/L;
乙二胺四乙酸二钠:15g/L;
赤藓糖醇:25g/L;
谷胱甘肽:15mmol/L;
硫柳汞:0.05g/L。
对比例1:
一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒由试剂1和试剂2组成,其中:
试剂1包含以下成分:
DIPSO缓冲液:150mmoL/L;
硫酸钴:1mmol/L;
吐温-20:10g/L;
Proclin300:0.05g/L;
所述试剂2包括以下成分:
PBS缓冲液:100mmol/L;
二硫苏糖醇:2mmol/L;
海藻酸钠:10g/L;
Proclin300:0.05g/L。
对比例2:
一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒由试剂1和试剂2组成,其中:
试剂1包含以下成分:
Tris-HCl缓冲液:100mmoL/L;
硫酸钴:1mmol/L;
吐温-20:10g/L;
Proclin300:0.05g/L;
所述试剂2包括以下成分:
PBS缓冲液:100mmol/L;
二硫苏糖醇:2mmol/L;
海藻酸钠:10g/L;
赤藓糖醇:10g/L;
Proclin300:0.05g/L。
对比例3:
一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒由试剂1和试剂2组成,其中:
试剂1包含以下成分:
Tris-HCl缓冲液:100mmoL/L;
硫酸钴:1mmol/L;
吐温-20:10g/L;
Proclin300:0.05g/L;
所述试剂2包括以下成分:
PBS缓冲液:100mmol/L;
二硫苏糖醇:2mmol/L;
海藻酸钠:10g/L;
抗坏血酸钠:10mmol/L;
Proclin300:0.05g/L。
实验例1:准确度分析
检测样本:40例缺血修饰白蛋白(IMA)浓度较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的血清样本(靶值为115U/mL)
对照试剂盒:国家食品药品监督管理局已批准上市的某厂家缺血修饰白蛋白(IMA)检测试剂盒(白蛋白-钴结合法)(包括试剂1和2,但成分与本发明不同,以下简称为对照试剂)
分别使用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3测定试剂盒及对照试剂(白蛋白-钴结合法)同时对浓度缺血修饰白蛋白(IMA)较高的无溶血、黄疸、浑浊现象的人血清样本进行测定,重复3遍,计算均值、CV和偏差。偏差范围在±10%以内视为无干扰,偏差范围超过±10%视为干扰。结果如表1所示;
表1实施例1、2、3、4的样品检测结果(单位:U/mL)
表2缺血修饰白蛋白(IMA)血清样本(靶值为115U/mL)检测结果(单位:U/mL)
结果显示,根据对比例1、对比例2、对比例3、实施例1检测结果计算出的相对偏差分别为8.44%、5.02%、1.90%、0.75%,表明本发明所述方法检测结果与对照试剂盒结果无明显差异,具有较高准确度(符合度),而且实施例1为最优的选择。
实验例2:灵敏度分析
检测样本:1份纯化水、1份浓度为180U/mL的缺血修饰白蛋白(IMA)低值样本。
用实施例1的试剂和对照试剂(某厂家缺血修饰白蛋白(IMA)检测试剂盒)用各自的检测方法同时定标同时对每份待测样本重复检测20次,记录吸光度数值,计算平均值和标准偏差(SD);水的吸光度平均值加上2SD作为最低检出限对应的吸光度值,由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系,可以通过和50U/mL样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度,即灵敏度。检测结果见表3。
表3实施例1试剂与对照试剂灵敏度分析结果(单位:U/mL)
结果显示,实施例1试剂盒的灵敏度为1.38U/mL,对照试剂盒的灵敏度为1.73U/mL,表明本发明所述试剂盒具有较高的灵敏度。
灵敏度=(水吸光度差值平均值+2SD)*样本浓度/样本吸光度差值平均值。
实验例3:精密度分析
检测样本:1份临床血清样本(低值样本)、1份缺血修饰白蛋白(IMA)血清样本(135U/mL)(高值样本);
用实施例1的试剂盒对每份待测样本重复检测10次,检测结果见表4。
表4实施例1精密度分析结果(单位:U/mL)
结果显示,本发明的精密度:CV低值为1.55、CV高值为0.47,均小于等于10%,而对照试剂CV低值为2.38、CV高值为0.86,表明本发明所述试剂盒具有较高的精密度。
实验例4:线性分析
检测样本:高缺血修饰白蛋白(IMA)血清样本(180U/mL)
将高缺血修饰白蛋白(IMA)血清样本(180U/mL)用校准品稀释液稀释成6个不同浓度,分别为0U/mL、240U/mL、480U/mL、720U/mL、960U/mL、1200U/mL,采用实验例1的试剂盒对上述样品的每个浓度进行检测,每个浓度检测三次,计算相关系数R值,实施例1的检测结果见表5。
表5实施例1线性分析结果(单位:U/mL)
结果显示,根据检测结果得到的回归方程为y=0.9974x-1.1384,相关系数R2=0.9998,表明本发明试剂盒在0U/mL~180U/mL范围内具有良好的线性度。
实验例5:稳定性分析
检测样本:40例随机血清样本。
将对照试剂、对比例1、对比例2、对比例3和实施例1的试剂进行37度加速破坏性实验,以考察其组分的稳定性,结果如表6所示。
表6对照试剂、对比例1、例2、例3和实施例1未加速与经加速破坏性实验1周后的样品检测结果(单位:U/mL)
37度加速破坏性实验:指把试剂装在瓶子里并密封保存,放在37度水浴箱里面,进行加速破坏性实验,37度破坏性实验1周的时间相当于一般储存温度(2~8度)(未加速)保存1年。
从表6可知,未加速时,对照试剂、对比例1、对比例2、对比例3、实施例1的40例样品检测结果平均值分别为94.59U/mL、80.89U/mL、75.90U/mL、92.18U/mL、92.01U/mL;经37度加速破坏性实验1周后,对照试剂、对比例1、对比例2、对比例3、实施例1的40例样品检测结果平均值分别为82.08U/mL、48.38U/mL、70.51U/mL、48.94U/mL、89.74U/mL。
对比例1、对比例3经破坏性实验1周后的样品检测结果均显著下降,平均下降幅度分别达到了40.18%及46.91%,而对比例2、实施例1由于含量一定量的赤藓糖醇作为抗冻剂,经破坏性实验1周后的样品检测结果并未发生明显变化,平均下降幅度分别仅为3.74%及4.38%,属于合理范围。平均下降幅度=(未加速时的均值-加速1周的均值)/未加速时的均值。
以上结果表明,添加赤藓糖醇的对比例2、实施例1试剂稳定性好于未添加赤藓糖醇的对比例1、对比例3的试剂,可见,赤藓糖醇的添加增强了试剂盒的稳定性。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案剂型修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种缺血修饰白蛋白测定试剂盒,其特征在于,包括试剂1和试剂2,其中,所述试剂1包括以下成分:
pH值为7.0~9.0的缓冲液:10~150mmoL/L;
硫酸钴:1~50mmol/L;
所述试剂2包括以下成分:
pH值为7.0~8.5的缓冲液:90~150mmol/L;
二硫苏糖醇:1~30mmol/L;
抗冻剂:5~25g/L;
还原剂:1~10mmol/L。
2.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白测定试剂盒,其特征在于,包括试剂1和试剂2,其中,所述试剂1包括以下成分:
pH值为7.0~9.0的缓冲液:100mmoL/L;
硫酸钴:1mmol/L;
所述试剂2包括以下成分:
pH值为7.0~8.5的缓冲液:150mmol/L;
二硫苏糖醇:2mmol/L;
抗冻剂:10g/L;
还原剂:15mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的缺血修饰白蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或3-三羟甲基-2-羟基丙磺酸缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述的缺血修饰白蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述试剂2中的抗冻剂为赤藓糖醇。
5.根据权利要求1或2所述的缺血修饰白蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述试剂2中的还原剂为硫代硫酸钠、抗坏血酸钠、谷胱甘肽中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述试剂1和试剂2均还包含1~15g/L的稳定剂和0.05~1g/L的防腐剂。
7.根据权利要求6所述的缺血修饰白蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述试剂1和试剂2中,稳定剂为10g/L,防腐剂为0.5g/L。
8.根据权利要求6或7所述的缺血修饰白蛋白测定试剂盒,其特征在于,所述稳定剂为曲拉通X-100、乙二胺四乙酸二钠、海藻酸钠、甘油、吐温-20中的至少一种;
所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的至少一种。
9.根据权利要求1~8任意一项所述的缺血修饰白蛋白测定试剂盒的制备方法,其特征在于,试剂1和试剂2的配置方法均为:按照配方比例,将试剂中所述的各组分加入蒸馏水搅拌混匀即可。
10.根据权利要求1~8任意一项所述的缺血修饰白蛋白测定试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
(1)向血清样品中加入试剂1,混匀孵育,检测吸光度,读取吸光度值A1;
(2)向步骤(1)中的样品中加入试剂2,混匀孵育,检测吸光度,读取吸光度值A2;
(3)通过血清标准品数据计算IMA含量。
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