CN111741762A - 使用防御素预防和治疗移植物抗宿主病 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗和/或预防急性以及慢性移植物抗宿主病(GVHD)的方法，特别是涉及用于降低死亡率以及增加尤其是长期存活；基于正常化肠、肝脏、肺和皮肤微生物群和粘膜防御减少与GVHD相关的疾病并发症例如腹泻、体重减轻和败血症的方法；正常化IFN‑γ、TNF‑α、Il‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑8、IL‑9、IL‑10和IL‑13的细胞因子产生而再平衡免疫系统以及预防和/或治疗细胞因子风暴的方法；用于治疗和/或预防与GVHD相关的慢性并发症诸如闭塞性细支气管炎和硬皮症的方法，所述方法包括在已经或即将接受同种异体造血干细胞移植的受试者中口服、皮下、肺内和/或皮肤/经皮施用一种或多种哺乳动物防御素，所述防御素选自α‑防御素和β‑防御素。

Description

使用防御素预防和治疗移植物抗宿主病
发明领域
本发明涉及通过施用一种或多种哺乳动物防御素来治疗和/或预防已经接受或即将接受同种异体造血干细胞移植的患者中的急性以及慢性移植物抗宿主病(GVHD)以及与GVHD有关的并发症的方法。当前的方法可以基于肠和肺微生物群的正常化以及通过减少细胞因子产生从而消除细胞因子风暴的风险而使免疫系统再平衡，导致对GVHD症状(诸如腹泻和败血症)的治疗。
背景技术
移植物抗宿主病依然是同种异体造血干细胞移植后的发病和死亡的主要原因。胃肠道GVHD是导致死亡的主要原因(Teshima,2016)。急性GVHD的初始阶段是由组织损伤和相关的粘膜屏障功能丧失引起的，主要是在胃肠道中，这是由使恶性疾病达到适合于后续免疫控制的最低残留水平并消融现有免疫功能(从而允许幼稚的供体接种物移植)所需的预处理方案所引起的。干细胞移植通常使用全身照射，免疫抑制和化疗来达到这些双重目的；然而，它们也导致对GI道粘膜和其它细胞的损害，从而导致“细胞因子风暴”，其特征在于促炎性细胞因子的释放；经典的是Th1细胞因子：IFNγ、IL-2和TNF-α，以及Th2细胞因子：IL-4、IL-5、IL-10和IL-13(Henden,2015)。当前的主流GVHD疗法集中于广泛的免疫抑制，这可能会影响移植，并在某些情况下降低期望的移植物抗肿瘤活性(Nalle,2015)。在移植后阶段通过使用抗微生物排除污染来减少细菌负荷，可以降低GVHD严重性。肺和皮肤是慢性GVHD的主要靶器官，所述慢性GVHD表现为纤维化-闭塞性细支气管炎和硬皮病(Henden,2015)。急性GVHD仍然是治疗失败的主要原因，导致20％的接受者死亡，60-80％的幸存者经历一定程度的慢性GVHD(Markey,2014)。
发明概述
发明人在同种异体造血干细胞移植引起的急性移植物抗宿主病的小鼠模型中令人惊讶地证明，口服预防剂量的hBD2或HD5能够显著降低死亡率，而且比环孢霉素(最常用的GVHD治疗方法)降低死亡率的程度更大。在该模型中还证明，hBD2能够减少髓样细胞(CD11c+树突状细胞和CD11b+Ly6FG-细胞)中IL-1β的产生。IL-1β是肠道GvHD的主要驱动因素。
本发明人还在重度肠道炎症(DSS、TNBS、T细胞转移)的预防和治疗小鼠模型中令人惊讶地证明，β-防御素可通过改善肠道健康状况而减轻腹泻和体重减轻，并与标准免疫抑制剂(如泼尼松龙/地塞米松和环孢霉素以及抗TNF-α，其通常用于预防和/或治疗GVHD)同等水平地降低疾病活动指数。
已经令人惊讶地证明，β-防御素可以通过使细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13的产生正常化来再平衡免疫系统。虽然一些药物例如抗TNF-α可以使一种或几种细胞因子正常化，但尚未鉴定出可使所有这些细胞因子正常化并防止细胞因子风暴的其它药物。炎性细胞因子释放或细胞因子风暴已经被认为是急性GVHD发生和严重性的主要调节物(Ball&Egeler,2008)。
而且，在预防性和治疗性小鼠模型中均已证明，α-防御素和β-防御素均对微生物群的组成具有强烈影响。例如防御素可增加微生物的多样性，即改善/标准化微生物群，而且防御素可增加产生短链脂肪酸的细菌的丰度。在结肠T reg细胞稳态中起关键作用的短链脂肪酸在急性GVHD中是被扰乱的。防御素的作用因防御素种类的不同而不同，并且α-防御素和β-防御素的组合又不同于单独的作用。
在急性哮喘的小鼠模型中已经令人惊讶地进一步证明，无论是口服还是鼻内施用的一定剂量的人β-防御素2(hBD2)均能够预防细胞因子风暴的出现和发展成哮喘并显著改善肺功能。与以一般免疫抑制为目标的常规哮喘预防相反，使用hBD2预防可以使免疫系统再平衡。
在急性哮喘的小鼠模型中进一步令人惊讶地证明，无论是口服还是鼻内施用的一定剂量的人β-防御素2(hBD2)也均能够治疗哮喘，使气道高反应性和顺应性正常化。
总之，本发明人已经证明α-防御素和β-防御素具有为了安全且有效地治疗由同种异体造血干细胞移植引起的并发症所需要的所有特性。由于这些肽是内源性的生理性的人的肽，因此它们是安全的。防御素的使用量不超过足月新生婴儿接受的初乳中存在的含量。防御素可以通过口服、皮下或肺内施用来施用。防御素可以在不抑制免疫系统的情况下使免疫系统再平衡。防御素可以预防细胞因子风暴，其是急性GVHD的主要元凶。防御素可使微生物群和代谢物组正常化，并促进短链脂肪酸的产生，从而保持结肠T reg细胞的稳态。防御素可以治疗重度肠、肝脏和肺部炎症。
因此，在一个方面中，本公开涉及一种用于预防或治疗已经接受或即将接受同种异体造血干细胞移植的患者的急性移植物抗宿主病的方法，该方法包括向所述患者施用至少一种来自由α-防御素和β-防御素组成的组的哺乳动物防御素。
患者可能患有重度肠和肝脏炎症(例如，以腹痛、恶心、呕吐和黄疸为特征)以及粘膜防御丧失、细胞因子风暴、体重减轻或败血症、皮疹、瘙痒和发红。
治疗的效果可包括通过使组织细胞因子产生正常化而使免疫系统再平衡并且预防或治疗细胞因子风暴。
治疗的效果可包括通过使肠中粘膜防御或髓过氧化物酶活性正常化来治疗肠通透性和败血症。
治疗的效果可包括治疗呼吸系统并发症、肺部炎症和败血症。
治疗的效果可包括减少组织学上的肺部炎症、支气管周围和血管周围的炎症以及炎症细胞向支气管肺泡灌洗液中的迁移。
治疗的效果可包括治疗和/或预防肺和皮肤的炎症和纤维化，诸如闭塞性细支气管炎和硬皮病。
治疗的效果可包括增加基因丰富度、增加门(phylae)数、增加细菌的存在、增加细菌丰度和/或增加短链脂肪酸的产生、丁酸盐的产生和/或减少从所述患者的肠或肺微生物群产生乙酸盐。
治疗的效果可包括使所述患者的肠、肺或皮肤中的正常微生物群成熟、维持和/或稳定所述患者的肠、肺或皮肤中的正常微生物群。
治疗的效果可包括增加所述患者的肠或肺中的别样棒菌属(Allobaculum)、Alloprevotella、阿克曼菌属(Akkermansia)、巴恩斯氏菌属(Barnesiella)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、毛螺菌属(Lachnospira)、罗氏菌属(Roseburia)和韦永氏球菌属(Veillonella)的丰度。
治疗的效果可包括增加所述患者的食物摄取和体重增加。
所述哺乳动物防御素可选自HD5、HD6、hBD1、hBD2、hBD3和hBD4，优选为HD5或hBD2。
所述防御素可单独或以组合物形式施用，其中所述组合物包含一种以上防御素，诸如两种防御素，诸如三种防御素，诸如四种防御素，诸如五种防御素。优选地，两种防御素是hBD2和HD5。
所述哺乳动物防御素可进一步包含至少一种额外的部分，该部分选自细胞穿透肽(CPP)、白蛋白结合部分(ABM)，可检测部分(Z)和半衰期延长肽。
所述哺乳动物防御素可以单独施用或与益生元、益生菌、色氨酸、短链脂肪酸、糖皮质激素、环孢霉素、抗TNF-α、整合素、抗生素、免疫抑制剂、排泄物移植物、辐射或这些的组合联合施用。
在其它方面，本公开涉及供在根据本公开的治疗方法中使用的哺乳动物防御素多肽，并且涉及哺乳动物防御素多肽在制备用于治疗如本公开所定义的病症的药物中的用途。
附图简述
图1.用于研究防御素在结肠炎的葡聚糖硫酸钠预防性模型中的作用的实验设置的示意图。
图2.用于研究防御素在结肠炎的葡聚糖硫酸钠治疗性模型中的作用的实验设置的示意图。
图3.用于研究哺乳动物防御素(HD5、hBD2和HD5+hBD2)对高脂肪饮食鼠类模型中微生物群的组成的影响的实验设置的示意图。
图4.用于研究哺乳动物防御素在鼠类类固醇敏感性模型中预防哮喘的作用的实验设置的示意图，在该模型中，小鼠通过屋尘螨(HDM)+弗氏佐剂免疫并用HDM激发。
图5.用于研究哺乳动物防御素在鼠类类固醇敏感型模型中治疗哮喘的作用的实验设置的示意图，在该模型中，小鼠通过屋尘螨(HDM)+弗氏佐剂免疫并用HDM激发。
图6a.人β防御素1-4的Clustal W(2.1)多序列比对：
在Clustal W比对中：
*表示具有单个完全保守性残基的位置。
：表示以下“强”组之一是完全保守的：
-S，T，A；N，E，Q，K；N，H，Q，K；N，D，E，Q；Q，H，R，K；M，I，L，V；M，I，L，F；H，Y；F，Y，W。
.表示以下“较弱”组之一是完全保守的：
-C，S，A；A，T，V；S，A，G；S，T，N，K；S，T，P，A；S，G，N，D；S，N，D，E，Q，K；N，D，E，Q，H，K；N，E，Q，H，R，K；V，L，I，M；H，F，Y。
图6b.HD5和HD6的Clustal比对。
图6c.HD5、HD6以及hBD1、hBD2、hBD3和hBD4的Clustal比对。
图7.用于结肠炎研究的疾病活动指数评分系统的描述。
图8.用于结肠炎研究的组织学评分系统的描述。
图9.10天的鼠类预防性葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎研究中对远端结肠的组织学评分，显示HBD2(NZ39000)在统计学上显著优于小鼠抗TNF-α，并且皮下hBD2施用显示出优于HBD2的i.v.施用。说明：
A：对照媒介物每日一次i.v.
B：抗TNFα(以300μg/小鼠i.p.3次)
C：hBD2(以0.1mg/kg i.v.每日一次)
D：hBD2(以0.1mg/kg s.c.每日一次)
E：hBD2(以0.1mg/kg i.v.+s.c.每日两次)
F：hBD2(以0.1mg/kg s.c.+s.c.每日两次)
K：未经处理的动物。
图10.在10天的鼠类预防性葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎研究中的动物体重变化显示出，对比1mg/kg口服泼尼松龙，口服施用的HBD2hBD2的所有剂量都具有体重保持效果。治疗组：A：对照媒介物PBS每日两次p.o.；B：泼尼松龙1mg/kg每日两次p.o.；C：hBD2以0.05mg/kg每日两次p.o.；D：hBD2以0.5mg/kg每日两次p.o.；E：hBD2以5mg/kg每日两次p.o.。与对照(媒介物)组值的显著差异显示为**P<0,01；***P<0,001(Kruskal-Wallis检验+非参数数据的Dunn后期检验)。
图11.10天的鼠类预防性葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎研究中的疾病活动指数评分显示出，口服施用的hBD2在统计学上显著优于1mg/kg泼尼松龙。治疗组和显著性如图10所示。
图12.10天的鼠类预防性葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎中的组织学评分显示，口服HBD2的所有剂量的统计学显著效果与1mg/kg泼尼松龙同等。治疗组和显著性如图10所示。
图13.在8天的预防性三硝基苯磺酸诱导的结肠炎研究中的组织学评分显示，0.03和0.1mg/kg hBD2(E和F组)的统计学显著效果与10mg/kg泼尼松龙同等。
A：媒介物对照，每日一次s.c.
B：泼尼松龙，以10mg/kg每日一次s.c.
C：hBD2，每日一次s.c.＝1mg/kg
D：hBD2，每日一次s.c.＝0.3mg/kg
E：hBD2，每日一次s.c.＝0.1mg/kg
F：hBD2，每日一次s.c.＝0.03mg/kg
G：hBD2，每日一次s.c.＝0.1mg/kg
图14.在7天的鼠类预防性葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎研究中的结肠长度显示，hBD2的统计学显著效果与环孢菌效果同等。*p<0.05对比DSS，曼惠特尼检验。
图15.在7天的鼠类预防性葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎研究中的临床评分(粪便评分：0＝正常；1＝潮湿/粘稠粪便；2＝软便；3＝腹泻；粪便出血评分：0＝无血；1＝粪便中或肛门周围的血液证据；2＝严重出血；小鼠外观：0＝正常；1＝皮毛褶皱或姿势改变；2＝无精打采)显示，hBD2的统计学显著效果与环孢霉素同等，以及不论给药途径如何，hBD2的TID给药优于BID给药。*p<0.05对比DSS；双向ANOVA和Bonferroni多重比较检验。
图16.14天的鼠类治疗性葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎的组织学评分显示，hBD20.1mg/kg的统计学显著效果与1mg/kg地塞米松同等，且优于300μg/小鼠的小鼠抗TNF-α。
图17.在14周的鼠类治疗性SCID CD4+CD25+T细胞转移性结肠炎模型中的临床评分(体重减轻、粪便稠度和每次经直肠时血液的存在)显示，hBD21mg/kg s.c.OD的效果与每周两次的100μg/小鼠的抗TNF-α(Enbrel)s.c.和腹膜内施用的0.3mg/kg地塞米松OD同等。
图18.在14周的鼠类治疗性SCID CD4+CD25+T细胞转移性结肠炎模型中的结肠重量显示，hBD2 1mg/kg s.c.OD的效果与每周两次的100μg/小鼠的抗TNF-α(Enbrel)s.c.以及腹膜内OD施用的0.3mg/kg地塞米松等同。通过t检验，对比媒介物*p<0.05；**p<0.01。
图19.在14周的鼠类治疗性SCID CD4+CD25+T细胞转移模型中的髓过氧化物酶活性显示，1mg/kg s.c.hBD2的效果与每周两次的100μg/小鼠的抗TNF-αs.c.(Enbrel)以及腹膜内OD施用的0.3mg/kg地塞米松等同。通过t检验，对比媒介物*p<0.05；**p<0.01。
图20.在鼠类高脂肪饮食模型中，口服HD5、hBD2和HD5+hBD2预防性处理后，对微生物的存在和丰度进行的未加权和加权unifrac分析。
图21.在鼠类高脂肪饮食模型中，用口服HD5和hBD2预防性治疗后小肠中的别样棒菌属的丰度。
图22.在鼠类高脂肪饮食模型中，用口服HD5、hBD2和HD5+hBD2预防性治疗后，对微生物丰度进行的属分析。
图23.在鼠类高脂肪饮食模型中，用口服hBD2预防性治疗后结肠中的乳杆菌科的丰度。
图24.在鼠类高脂肪饮食模型中，用口服hBD2预防性治疗的4周(左图)和10周(右图)后，结肠中巴恩斯氏菌的相对丰度。
图25.在鼠类高脂肪饮食模型中，用HD5或hBD2治疗性治疗后，对微生物的存在和丰度进行的未加权和加权unifrac分析。上图显示第0周的数据。下图显示第10周的数据。
图26.在鼠类高脂肪饮食模型中，口服HD5和hBD2进行治疗性干预后，结肠中的别样棒菌属的相对丰富。
图27.在鼠类高脂肪饮食模型中，用HD5或hBD2进行治疗性干预后，小肠和结肠中的双歧杆菌科的相对丰富。
图28-31的附图说明。盐水IN是未激发且未经治疗的对照。HDM/媒介物代表未治疗但经HDM激发的动物。HDM是经屋尘螨激发的动物。PO是经口施用，并且IN是鼻内施用。标记为*的列在统计学上与经媒介物处理的对照显著不同。
图28：鼠类屋尘螨固醇敏感性哮喘模型中分别预防性鼻内和口服施用hBD2后的气道高反应性。
图29：鼠类屋尘螨固醇敏感性哮喘模型中分别预防性鼻内和口服施用hBD2后的肺顺应性。
图30：屋尘螨鼠类类固醇敏感性哮喘模型中预防性口服施用hBD-2后的BALF中的中性粒细胞计数。结果显示为平均值+/-SEM。
图31a-f.屋尘螨鼠类类固醇敏感性哮喘模型中预防性口服施用hBD-2后的肺匀浆中的TNF-α(31a)、IL-4(31b)、IL-5(31c)、IL-6(31d)、IL-9(31e)和IL-13(31f)的细胞因子浓度。#p<0.05对比HDM/媒介物PO，曼惠特尼检验。结果显示为平均值+/-SEM。
图32a和32b：鼠类屋尘螨固醇敏感性哮喘模型中分别治疗性鼻内(图32a)和口服(图32b)施用hBD2后的气道高反应性。盐水是未经激发的对照。HDM/媒介物是用媒介物处理的屋尘螨激发的对照。
“hBD2 IN 1.2mpk”是以1.2mg/kg鼻内施用的hBD2。5mpk是5mg/kg。
图33a和33b：鼠类屋尘螨固醇敏感性哮喘模型中分别治疗性鼻内(图33a)和口服(图33b)施用hBD2后的肺顺应性。
图34：屋尘螨鼠类类固醇敏感性哮喘模型中治疗性鼻内施用hBD-2后的BALF中的总细胞计数(34a)、中性粒细胞计数(34b)和巨噬细胞计数(34c)。结果显示为平均值+/-SEM。
图35-42.在屋尘螨鼠类类固醇敏感性哮喘模型中分别治疗性鼻内和口服施用hBD-2后的肺匀浆中的IFN-γ(图35)、TNF-α(图36)、IL-4(图37)、IL-5(图38)、IL-6(图39)、IL-9(图40)、IL-10(图41)和IL-13(图42)的细胞因子浓度。每个图都具有来自左侧的鼻内方式和右侧的经口方式的数据，其中这些图中均显示了这两种方式。对比相应的媒介物，‘p<0.05；曼惠特尼检验。结果显示为平均值+/-SEM。
图43.在屋尘螨鼠类类固醇敏感性哮喘模型中分别治疗性鼻内和口服施用hBD2后用H&E/PAS制剂进行肺组织学检查。左上图：未治疗且未受激发的对照。右上图：未治疗且经HDM激发的对照。左下图：经HDM激发的用hBD2 PO治疗的。右下图：经HDM激发的用hBD2 IN治疗的。50倍放大。
图44.屋尘螨鼠类类固醇敏感性哮喘模型中分别治疗性鼻内和口服施用hBD2后的肺部炎症严重程度。对比媒介物*p<0.05，曼惠特尼检验；对比媒介物，#p<0.05，WilcoxSigned Rank检验。
图45.屋尘螨鼠类类固醇敏感性哮喘模型中分别治疗性鼻内和口服施用hBD2后的血管周围和支气管周围炎症。对于血管周围的嗜酸性粒细胞浸润，对比媒介物*p<0.05，曼惠特尼检验；对于血管周围/支气管周围的嗜酸性粒细胞和单核细胞浸润，对比媒介物#p<0.05，Wilcox Signed Rank检验。□单核细胞；◆嗜酸性粒细胞。
图46.在14周的鼠类治疗性SCID CD4+CD25+T细胞转移性模型中的髓过氧化物酶活性显示出，1mg/kg s.c.hBD2的效果与每周两次的100μg/小鼠的抗TNF-αs.c.(Enbrel)以及腹膜内OD施用的0.3mg/kg地塞米松等同。通过t检验，对比媒介物*p<0.05；**p<0.01。
图47.Kaplan-Meyer图显示出，在第0天进行干细胞移植并从第0天至第10天用1.2mg/kg/天的hBD2或媒介物(PBS 100μL/天)治疗(n＝15)后，小鼠移植物抗宿主病模型中的存活显著增加(p<0.0001)。
图48.从干细胞移植之日起经口服hBD-2治疗10天的10只小鼠的小肠、结肠和肝脏的组织学评分有统计学显著降低。
图49.自干细胞移植之日起经口服hBD-2治疗10天的小鼠的按自基线的％计的体重减轻(a)以及按克数计的体重减轻(b)。
图50.自干细胞移植之日起经口服hBD-2治疗10天的10只小鼠的CD45+白细胞迁移到结肠和小肠固有层有所降低。
图51a-c.自干细胞移植之日起经口服hBD-2治疗10天的10只小鼠的结肠和小肠固有层的肠T细胞和髓样细胞浸润有所降低。
图52a-c.自干细胞移植之日起经口服hBD-2治疗10天的10只小鼠的血清中细胞因子TNF-α(a)、IL-6(b)和IL-10(c)的浓度。
图53a-c.自干细胞移植之日起经口服hBD-2治疗10天的10只小鼠的髓样细胞中IL-1β产生有所降低。
图54a-f.自干细胞移植之日起经口服hBD-2治疗10天的10只小鼠中的中性粒细胞降低的比例(a)，以及CD4 T细胞中(b)、CD8 T细胞中(c)和CD69+CD4 T细胞中(d)的Th1细胞因子IFN-γ产生的降低；和CD4 T细胞中(e)和CD8 T细胞中(f)的Th1细胞因子TNF-α产生的降低。
图55.自干细胞移植之日起经口服PBS治疗10天的10只小鼠的炎症、髓样细胞和白细胞浸润增加，以及结肠中的组织修复增加。
图56.与分别用环孢霉素和PBS治疗的13只小鼠相比，从干细胞移植之日起经口服hBD-2治疗10天的7只小鼠的死亡率统计学上显著降低(p＝0.03)。
图57.自干细胞移植之日起经口服hBD-2、环孢霉素或PBS治疗10天的小鼠的按自基线的％计的体重减轻。
图58.自干细胞移植之日起分别经口服hBD-2、口服HD5或PBS治疗10天的22只小鼠的死亡率显著降低。
图59.与低脂肪饮食或西方饮食的小鼠相比，小鼠中口服施用的HD5和hBD-2所发挥的细菌种群控制，其以从肠道内壁到细菌种群(溶解区)的距离(以μm计)来衡量。此实验证明，在小鼠中口服施用的人HD5和hBD-2令人惊讶地在上皮表面上发挥了其微生物群调节作用，就好像它们是由小鼠自身的上皮细胞产生的小鼠防御素，而非如所期望的在口服施用后主要在肠腔中产生的。
图60.在鼠类高脂肪饮食模型中用hBD2预防性治疗后的肝脏的苏木精/曙红染色。在低脂肪饮食的小鼠中未注意到肝细胞中的脂肪累积，而在饲喂西方高脂肪饮食的小鼠中注意到大量的脂肪变性(肝细胞中的脂肪累积)，并且在通过每日预防性施用口服1.2mg/kghBD-2补充的西方高脂肪饮食的小鼠组中注意到最小的肝细胞内脂肪累积。
发明详述
定义：
防御素：如本文所用的术语“防御素”是指属于抗微生物肽的防御素类别的多肽。防御素代表主要的先天宿主防御之一，其用于维持健康的微生物组并抵御潜在的病原体(Wehkamp等,2002和Salzman等,2007)。防御素是对革兰氏阳性和阴性细菌、真菌和古生菌具有抗微生物活性以及发挥抗炎活性的肽。
人防御素是小阳离子肽，基于其三个分子内半胱氨酸二硫键的拓扑结构而分为α-防御素和β-防御素(图6)。哺乳动物防御素具有明确的结构特征：成熟的肽很小(3–6kDa，长度为28–42个氨基酸)，是阳离子型的(净电荷+1至+11)、两亲的且具有高度保守的三重反向平行链β-片层的三级结构。考虑到氨基酸序列的可变性，防御素之间的结构保守性有些令人惊讶，这是由于整个防御素家族中有六个保守的半胱氨酸残基。这六个半胱氨酸残基形成三个二硫键，其可稳定三重链β-片层核心结构(哺乳动物抗微生物肽；防御素和Cathelicidin)Dorin等,Molecular Medical Microbiology(第2版),2015。
α-防御素是由在小肠隐窝中的Paneth细胞表达的防御素(HD5和HD6或DEFA5和DEFA6)。β-防御素(DEFBn)主要由多种组织和器官中的上皮细胞产生，所述组织和器官包括皮肤、眼睛、中耳、口、气管、肺、胃肠道、泌尿生殖系统、肾脏、阴道、肝脏、胰腺和乳腺。防御素的实例包括人肠α防御素5(HD5；SEQ ID NO:5)；人肠α防御素6(HD6；SEQ ID NO:6)；二者均属于α防御素类别；以及人β防御素1(hBD1；SEQ ID NO:1)；人β防御素2(hBD2；SEQ ID NO:2)；人β防御素3(hBD3；SEQ ID NO:3)；人β防御素4(hBD4；SEQ ID NO:4)；截短的人β防御素2(SEQ ID NO:7)。防御素表达为前体，并且在分泌到细胞外空间之前通过信号肽(并且在一些情况下也通过前肽)切割来加工。一些人防御素(例如hBD1)是组成性产生的，而其它(例如hBD2、hBD3和hBD4)则是由促炎性细胞因子或外源性微生物产物诱导的。上文鉴定的序列代表预测的成熟生物活性防御素。本领域技术人员将理解，加工可以在细胞与细胞之间而有所不同，并且所得分泌的成熟肽可以与所预测的序列相差一个或两个C末端或N末端氨基酸，并且仍然保留生物活性。
同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。使用如在EMBOSS包(Rice等,2000,http://emboss.org)(优选3.0.0或更高版本)的Needle程序中实现的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的同一性程度。所使用的可选参数是空位开放罚分10，空位扩展罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle输出(使用–nobrief选项获得)用作百分比同一性，并如下计算：(相同残基x100)/(比对的长度-比对中的空位总数)。
正常微生物群：术语“正常微生物群”在本文中用于指示未生态失调(dysbiotic)的微生物群。正常微生物群的特征在于具有大的基因丰富度。正常肠道微生物群的特征在于包含属于以下属的细菌：拟杆菌门(Bacteriodetes)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、罗氏菌属(Roseburia)、布劳特氏菌属(Blautia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、乳杆菌属(Lactobacillu)、粪球菌属、梭菌属(Clostridium)、阿克曼菌属(Akkermansia)、优杆菌属(Eubacterium)。
正常肺微生物群的特征在于包含属于以下属的细菌：拟杆菌门、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)，其核心微生物群由以下组成：假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、普氏菌属(Prevotella)、梭杆菌属(Fusobacteria)、韦永氏球菌属(Veillonella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)。
治疗：如本文所用的术语“治疗(treatment和treating)”是指出于对抗病况、疾病或病症的目的对患者进行的管理和护理。该术语旨在包括对患者所患的给定病况的全部治疗，例如出于以下目的施用活性化合物：减轻或缓解症状或并发症；延缓该病况、疾病或病症的进展；治愈或消除该病况、疾病或病症；和/或预防该病况、疾病或病症，其中“预防(preventing或prevention)”应理解为指出于阻碍的目的对患者进行的管理和护理，减少活性化合物以预防症状或并发症发生或者降低症状或并发症发生的风险。待治疗的患者优选是哺乳动物，特别是人类。
患者：患者是已经用造血干细胞移植治疗或即将接受造血干细胞移植的受试者。
哺乳动物α防御素和哺乳动物β防御素。
本公开涉及哺乳动物α防御素和/或β防御素，诸如人α和β防御素，更优选人科防御素在治疗或预防已经或即将用同种异体造血干细胞移植治疗的受试者中的用途。
在一个实施方案中，所述哺乳动物α和/或β防御素与氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7中的任一个具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％且最优选至少95％的同一性程度。在另一实施方案中，防御素与SEQ ID NO:1-7之一相差少于10个氨基酸，诸如少于8个，例如少于5个，诸如少于4个，例如少于3个，诸如少于2个氨基酸。
在优选的实施方案中，所述人α防御素由α防御素5(SEQ ID NO:5)和/或α防御素6(SEQ ID NO:6)组成。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物β防御素由人β防御素1(SEQID NO:1)、人β防御素2(SEQ ID NO:2)、截短的人β防御素2(SEQ ID NO:7)、人β防御素3(SEQID NO:3)和/或人β防御素4(SEQ ID NO:4)组成。
在优选的实施方案中，人α防御素与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性程度。在优选的实施方案中，所述人哺乳动物α防御素由α防御素5(SEQ ID NO:5)组成。
在优选的实施方案中，所述人β防御素与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性程度。在优选的实施方案中，所述人哺乳动物β防御素由人β防御素2(SEQ ID NO:2)组成。
在又一实施方案中，所述哺乳动物α防御素包含人α防御素和/或小鼠α防御素及其功能上等同的变体。优选地，所述哺乳动物α防御素由人α防御素5、人α防御素6及其功能上等同的变体组成。更优选地，所述哺乳动物α防御素由人α防御素5及其功能上等同的变体或其直系同源物组成。
在又一实施方案中，所述哺乳动物β防御素由人β防御素和/或小鼠β防御素及其功能上等同的变体组成。优选地，所述哺乳动物β防御素由人β防御素1、人β防御素2、截短的人β防御素2、人β防御素3、人β防御素4及其功能上等同的变体组成。更优选地，所述哺乳动物β防御素由人β防御素2及其功能上等同的变体或其直系同源物组成。
哺乳动物(例如人)α或β防御素的“功能上等同的变体”是修饰的哺乳动物(例如人)α或β防御素，其对肺或肠道或皮肤中的微生物群表现出与亲本哺乳动物(例如人)α和/或β防御素近似相同的作用。与哺乳动物(例如人)防御素氨基酸序列(例如SEQ ID NO 1-6中的任何一个)相比，哺乳动物(例如人)防御素的功能上等同的变体可包含1-5个氨基酸修饰，优选1-4个氨基酸修饰，更优选1-3个氨基酸修饰，最优选1-2个氨基酸修饰，特别是1个氨基酸修饰。优选地，对于β哺乳动物防御素，与具有SEQ ID NO 2的人β防御素2相比，且对于α防御素，与HD5(SEQ ID NO 5)相比。
术语“修饰”在本文中意指哺乳动物(例如人)防御素的任何化学修饰。修饰可以是氨基酸的取代、缺失和/或插入以及氨基酸侧链的取代；或在氨基酸序列中具有相似特征的非天然氨基酸的使用。特别地，修饰可以是酰胺化，诸如C末端的酰胺化。优选地，氨基酸修饰具有次要性质，即不会显著影响多肽的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代或插入；单缺失；小的氨基或羧基末端的延伸；或通过改变净电荷或另一种功能促进纯化的小延伸(诸如多组氨酸标签、抗原表位或结合结构域)。在一个实施方案中，小延伸(诸如多组氨酸标签、抗原表位或结合结构域)通过最多约20-25个残基的小接头肽与该哺乳动物(例如人)α防御素或β防御素附接，并且所述接头可含有限制酶切割位点。
图6中的Clustal W比对可用于预测哪些氨基酸残基可以被替代而基本上不影响蛋白质的生物活性。使用Clustal W2.1(http://www.geno,me.jp/tools/clustalw/)和以下设置进行序列比对：空位开放罚分：10，空位扩展罚分：0,05，权重转移(WeightTransition)：否，蛋白质的亲水性残基：GPSNDQE，亲水性空位：是，权重矩阵：BLOSUM(用于蛋白质)。下组(Clustal W，“强”保守组)内的取代被视为保守性取代：-S，T，A；N，E，Q，K；N，H，Q，K；N，D，E，Q；Q，H，R，K；M，I，L，V；M，I，L，F；H，Y；F，Y，W。下组(Clustal W，“弱”保守组)内的取代被视为半保守性取代：-C，S，A；A，T，V；S，A，G；S，T，N，K；S，T，P，A；S，G，N，D；S，N，D，E，Q，K；N，D，E，Q，H，K；N，E，Q，H，R，K；V，L，I，M；H，F，Y；
保守性取代的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内进行的取代。
通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
除20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(诸如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可代替野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守性氨基酸、不由遗传密码子编码的氨基酸和非天然氨基酸可替代氨基酸残基。“非天然氨基酸”已经在蛋白质合成后被修饰，和/或已经在其侧链中具有不同于标准氨基酸的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，并且优选地是可商购的，并且包括哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-甲基脯氨酸和4-甲基脯氨酸和3,3-二甲基脯氨酸。
哺乳动物α防御素和/或β防御素中的必需氨基酸可以根据本领域已知的程序鉴定，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的生物活性(即，针对气道高反应性的活性或抑制细胞因子例如TNF-α活性)以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。还参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。必需氨基酸的身份也可以从与哺乳动物α防御素和/或β防御素相关的多肽的同一性分析来推断(参见图5中的Clustal W比对)。
可以通过以下方法制备和测试单个或多个氨基酸取代:使用已知的诱变、重组和/或改组方法,随后进行相关的筛选程序，如Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625所公开的那些。可以使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochem.30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；Ner等,1988,DNA 7:127)。当不能够确定地预测给定取代的结果时，可以根据上文所述的方法容易地测定衍生物以确定生物活性的存在或不存在。
长效防御素
可以通过将该α-防御素或β-防御素与另一部分融合或缀合来延长哺乳动物α-防御素或β-防御素的半衰期，即构建与药学上可接受的分子连接的长效生物活性α-防御素或β-防御素，所述分子提供与α-防御素或β-防御素的体内血浆半衰期相比大量增加的α-防御素或β-防御素的体内血浆半衰期，其以与α-防御素或β-防御素相同的方式施用。
一种长效生物活性α-防御素或β-防御素，包含与药学上可接受的分子连接的哺乳动物α-防御素或其类似物或者哺乳动物β-防御素或其类似物，所述药学上可接受的分子选自与以下结合的分子：新生儿Fc受体(FcRn)、转铁蛋白、白蛋白(HAS)、
Figure BDA0002506992870000161
或PEG、高氨基酸聚合物(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)或弹性蛋白样肽(ELP)、透明质酸、带负电荷的高唾液酸化肽诸如绒毛膜促性腺激素(CG)β-链的羧基末端肽(CTP)、人IgG和CH3(CH2)nCO-，其中n为8至22。
所述α-防御素类似物或β-防御素类似物也可以是非哺乳动物来源的，并且可选自肽、多肽和蛋白质。
α-防御素激动剂或β-防御素激动剂能以如现有技术文献中描述的多种方式与药学上可接受的分子连接，诸如(不限于)通过双功能接头进行的化学偶联，基因技术上通过将防御素(诸如α-防御素或β-防御素)的N末端或C末端与药学上可接受的分子(诸如白蛋白或白蛋白类似物)偶联。特别地，白蛋白或白蛋白类似物(例如人白蛋白)的N末端可以与α-防御素或β-防御素的C末端或者α-防御素或β-防御素的N末端偶联；或者白蛋白(例如人白蛋白)的C末端可以与α-防御素或β-防御素的C末端或者α-防御素或β-防御素的N末端偶联。可以在白蛋白与α-或β-防御素链之间插入接头序列。
α-防御素激动剂或β-防御素激动剂可以通过稳定的接头或更不稳定的接头与药学上可接受的分子连接。本领域已知若干接头，包括双功能PEG分子(例如参见Paige等Pharmaceutical Research,vol.12,no.12,1995)、可水解接头(Shechter等BioconjugateChem.2005,16:913-920和International Journal of PeptideResearch andTherapeutics,Vol.13,Nos.1-2,June 2007和W02009095479)、PDPH和EMCH(参见例如W02010092135中)。在α-防御素激动剂或β-防御素激动剂与药学上可接受的分子的化学缀合(两个或更多个分子的连接)强烈降低功能性α-防御素或β-防御素活性的特殊情况下，可优选使用可释放该功能性α-防御素激动剂或β-防御素激动剂的更不稳定的接头。
半衰期延长也可以通过将具有间隔子(例如γ-L-谷氨酰间隔子)和C-18脂肪二酸链的肽骨架酰化为赖氨酸来实现。脂肪二酸位点链和间隔子介导与白蛋白的强烈但可逆的结合，这减缓从注射部位的释放并减少肾清除。
方法和用途
已在重度肠炎症和失调(葡聚糖硫酸钠、三硝基苯磺酸和CD4+CD25+T细胞转移)的预防性和治疗性动物模型中测试了人β防御素2和HD5。无论是口服还是皮下施用的α-防御素和β-防御素，均可通过改善肠道健康来缓解由这些化学物质引起的腹泻和体重减轻。重要的是，防御素降低疾病活动指数和作为炎症标志的髓过氧化物酶活性，其与强标准的GVHD免疫抑制剂(诸如泼尼松龙/地塞米松和环孢霉素以及抗TNF-α，这些全部通常用于GVHD的治疗)的水平等同。因此，防御素显示出对已经或即将进行同种异体造血干细胞移植的患者具有有效的预防性和/或治疗性治疗活性。
已经证明β-防御素可以通过正常化IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13组织浓度而使免疫系统再平衡，从而预防或预防治疗导致急性GVHD的细胞因子风暴，且因此显示出对已经或即将接受同种异体造血干细胞移植的患者具有有效的预防性和/或治疗性治疗活性。
在预防性和治疗性高脂肪饮食小鼠模型中均已证明，α-防御素和β-防御素均对微生物群的组成具有强烈影响，即维持/正常化/重新设置微生物群,以及促进关键共生细菌的丰度，因此提出了一种治疗失调(急性GVHD的常见特征)的方法。已经证明，β-防御素可以通过降低髓过氧化物酶活性来使肠健康、炎症和功能正常化，因此提出了一种用于改善已经进行同种异体造血干细胞移植的患者的肠健康的方法。
已在急性变应性哮喘的小鼠模型中进一步证明，无论是口服还是鼻内施用的一定剂量的人β-防御素2(hBD2)均能预防哮喘的发展，因此提出了一种预防通常与急性和慢性GVHD相关的肺部并发症和肺活量降低的方法。
在急性变应性哮喘的小鼠模型中也已经证明，无论是口服还是鼻内施用的一定剂量人β-防御素2(hBD2)也能够治疗哮喘，因此提出了一种用于治疗通常与急性和慢性GVHD相关的肺部并发症和肺活量降低的方法。
因此，在一方面，提供了一种用于治疗重度肠炎症和细胞因子风暴的方法，该方法包括口服或皮下施用一种或多种哺乳动物防御素，其中受试者已经用或即将用同种异体造血干细胞移植治疗。
因此，在一方面，提供了一种维持/正常化/重新设置肠微生物群的方法，该维持/正常化/重新设置肠微生物群包括增加关键共生细菌(例如双歧杆菌科)的存在和丰度，该方法包括口服施用一种或多种哺乳动物防御素，其中受试者已用或即将用同种异体造血干细胞移植治疗。
在其它方面，提供了一种治疗和/或预防肺和肠的炎症和纤维化、预防闭塞性细支气管炎和硬皮病的方法，该方法包括口服、皮下、肺内、皮肤或经皮施用至少一种防御素，其中受试者已用或即将用同种异体造血干细胞移植治疗。
还提供了减少已经用或即将用同种异体造血干细胞移植治疗的受试者的肺组织中的组织学肺部炎症、血管周围和支气管血管炎症、BALF炎性细胞计数和/或炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13的产生的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少一种防御素。
在其他方面，本公开涉及供在根据本文描述的任何方法的治疗方法中使用的防御素，以及防御素在制备用于治疗已经用或即将用同种异体造血干细胞移植治疗的受试者的病症的药物中的用途。
所提供的方法可以通过在用或即将用同种异体造血干细胞移植治疗的受试者中,通过转录水平的改变来改变细菌表型，以及改变肺和/或肠和/或肝脏细菌丛或者肺和/或肠代谢组物的结构和组成,来治疗或预防肺和/或肠炎症和/或肝脏炎症。
不受理论的束缚，使用口服施用观察到的效果可能归因于肠微生物区系(microflora)和肠代谢组物的改变，这可能通过所谓的肠-肺轴对肺产生影响。慢性肺部病症(诸如哮喘、COPD和慢性GVHD)均表现出肠道疾病表现的一个组成，这指示人体的这两个粘膜部位之间存在重要的串音(cross talk)，并且多种呼吸系统疾病不仅与气道微生物群的失调有关，还与肠道微生物群的失调有关。
共生微生物主要通过产生介导宿主-微生物相互作用的小分子来校准固有免疫反应和适应性免疫反应以及影响病原性刺激的激活阈值(Donia和Fishback,2015)。虽然上皮屏障可确保微生物在很大程度上局限于肠，但微生物代谢物仍可穿透上皮屏障，从而使它们进入宿主循环系统并在其中累积，在宿主循环系统中它们被免疫细胞感知(Dorrestein,2014)。2013年Trompette在小鼠中证明，饮食中的可发酵纤维不仅改变了肠微生物群的组成，而且改变了肺微生物群的组成，特别是改变了厚壁菌门与拟杆菌门的比例，后者导致短链脂肪酸的局部和全身水平升高，继而影响树突状细胞造血作用和功能性，从而塑造了肺中的免疫环境并影响了变应性炎症的严重性。Schirmer等(2016)在人类功能基因组工程(Human Functional Genomics Project)中进一步证明，细胞因子应答的个体间差异与具体的微生物生物体以及微生物功能有关。大多数检测到的关联性均是细胞因子和刺激物特异性的，这表明免疫系统以高特异性识别微生物生物体和产物并与其相互作用，以及这些微生物因子与特定的免疫表型有关。TNF-α和IFN-γ的生成能力似乎更强烈地受到微生物组的影响，而其它细胞因子(诸如IL-1β、IL-6和Th17衍生的IL-17和IL-22)表现出与肠微生物群的较少但更特异的关联性。
本文所述的治疗方法可通过施用包含至少一种哺乳动物α-防御素和/或β-防御素的组合物联合任一益生元、益生菌、色氨酸、糖皮质激素、环孢霉素、抗TNF-α、整合素、抗生素、免疫抑制剂、排泄物移植、辐射或这些的组合来进行。防御素可以单独施用或与这些疗法中的一种或多种一起施用。防御素也可以与可用于治疗已经或即将进行异基因同种异体造血干细胞移植的患者的其它药物一起施用。
重要的是，所公开的方法可以用于在已接受和/或正在接受抗生素治疗、微生物净化或免疫抑制疗法或对肺或肠微生物群有负面影响的另一种治疗的受试者的肠和/或肺中治疗、重新设置或正常化失调微生物菌群/代谢物组。
正常化肠道和/或肺微生物群还可涉及将代谢物组变为产生相对较多的丁酸酯或色氨酸和相对较少的乙酸酯的代谢物组。
体外合成
包括哺乳动物α防御素和哺乳动物β防御素在内的哺乳动物抗微生物肽可以通过体外合成使用本领域已知的常规方法制备。各种商业合成装置是可得的，例如应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.)、贝克曼公司(Beckman)等的自动合成仪。通过使用合成仪，天然存在的氨基酸可以被非天然氨基酸(特别是D-异构体(或D-形式)例如D-丙氨酸和D-异亮氨酸、非对映异构体、具有不同长度或官能度的侧链等)替代。具体的序列和制备方式将由方便性、经济性、所需纯度等决定。可以向各种肽或蛋白质提供化学连接，包括方便的用于键合的官能度，如用于酰胺或取代胺形成(例如还原胺化)的氨基、用于硫醚或二硫化物形成的硫醇基团、用于酰胺形成的羧基等。如果需要，可以在合成期间或在表达期间将各个基团引入肽中，这允许连接到其他分子或表面。因此，半胱氨酸可用于制备硫醚，组氨酸用于连接到金属离子络合物，羧基用于形成酰胺或酯，氨基用于形成酰胺等。
还可根据重组合成的常规方法分离和纯化包括哺乳动物α-防御素、哺乳动物β-防御素或其功能等同物在内的哺乳动物抗微生物肽。可以使用适当的表达载体和真核或原核表达系统进行重组合成。可以制备表达宿主和培养基的溶液，以及使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其他纯化技术纯化存在的防御素。在WO 2010/007166(Novozymes)中公开了在大肠杆菌中重组表达人β防御素-2的方法。
哺乳动物α防御素和β防御素也可以通过施用相应的mRNA来诱导。
剂量
哺乳动物α防御素或哺乳动物β防御素(诸如人α防御素或人β防御素)优选地以有效预防或治疗已进行同种异体造血干细胞移植的患者的移植物抗宿主病并且优选对患者具有可接受的毒性的量用于药物组合物中。哺乳动物α防御素和哺乳动物β防御素(诸如人α防御素和人β防御素)也优选以有效维持肺和/或肠中正常微生物群组成或治疗肺和/或肠中的失调的微生物群或使之正常化并且优选对需要治疗的患者具有可接受的毒性的量用于药物组合物中。
对于此类治疗，适当的剂量当然将根据例如所用化合物的化学性质和药代动力学数据、个体宿主、施用方式和所治疗病症的性质和严重程度而变化。
然而，通常，为了在哺乳动物(例如人)中获得令人满意的结果，人α防御素的指示的每日剂量优选为约0.1mg HD5/kg体重至约10mg HD5/kg体重，更优选为约0.5mg HD5/kg体重至约10mg HD5/kg体重；诸如1mg HD5/kg体重至10mg HD5/kg体重，更优选约1.2mgHD5/kg体重至约10mg HD5/kg体重，更优选约1.2mg HD5/kg体重至约5mg HD5/kg体重，甚至更优选1.2mg HD5/kg体重，例如，以高达一天一次、两次或三次的分剂量施用。
在一个实施方案中，人β防御素的指示的每日剂量优选为约0.1mg hBD2/kg体重至约10mg hBD2/kg体重，更优选为约0.5mg hBD2/kg体重至约10mg hBD2/kg体重；诸如1mghBD2/kg体重至10mg hBD2/kg体重，更优选约1.2mg hBD2/kg体重至约10mg hBD2/kg体重，优选约1.2mg hBD2/kg体重至约5mg hBD2/kg体重，甚至更优选1.2mg hBD2/kg体重，例如，以高达一天一次、两次或三次的分剂量施用。
当以一个剂量给予两种不同的防御素时，该剂量可以包含基于重量或基于摩尔测定的等量或近似等量的两种防御素。该比例也可以不同，使得α防御素与β-防御素的比例在10:1至1:10，诸如5:1至1:5，例如2:1至1:2变化(基于重量或摩尔测定)之间变化。
优选实施方案的化合物可以通过与常规使用的类似的施用方式以类似的剂量施用至哺乳动物例如人。
在一个实施方案中，如本文所述的提供了方法，其中每日剂量介于每天0.1与10mg防御素/kg之间，诸如0.5与5mg防御素/kg之间，诸如1与2mg防御素/kg之间，诸如1.2mg防御素/kg。
在某些实施方案中，优选实施方案的药物组合物可包括哺乳动物α防御素和/或哺乳动物β防御素(诸如人α防御素和/或人β防御素)，其量为每单位剂型约0.1mg或更少至约1500mg或更多，优选约0.1、0.2、0.3、0.4或0.5mg至约150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000mg，且更优选约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25mg至约30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。然而，在某些实施方案中，可以优选比上述剂量更低或更高的剂量。本领域技术人员可以容易地确定适当的浓度和剂量。在某些实施方案中，优选的实施方案的药物组合物包括哺乳动物α防御素，诸如人α防御素。在其他实施方案中，优选的实施方案的药物组合物包括哺乳动物β防御素，例如人β防御素。在进一步的实施方案中，优选实施方案的药物组合物包括哺乳动物α防御素和哺乳动物β防御素，诸如人α防御素和人β防御素，其中该α防御素和该β防御素基于摩尔浓度或基于mg/mL等量存在。
在一个实施方案中，哺乳动物α防御素和/或β防御素每天至少一次施用，如每天至少两次，例如每天至少3次或连续施用。
施用
在一个实施方案中，在患者接受同种异体造血干细胞移植之前，向该患者施用哺乳动物防御素持续一段时间。
在这种情况下，防御素的施用可以在移植过程中继续进行，并且可以在移植完成后进一步施用。在一个实施方案中，在接受同种异体造血干细胞移植时，向患者施用根据本公开的哺乳动物防御素。例如，防御素可以在与移植相同的日期施用。移植后可继续施用防御素。
在一个实施方案中，在同种异体造血干细胞移植后施用哺乳动物防御素。在此实施方案中，一旦同种异体造血干细胞移植完成，就可以继续施用防御素。例如，防御素可以在与移植相同的日期施用，并且在移植后的每一天施用一次或多次。在一个实施方案中，在移植后通过以诸如每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天或每七天的间隔施用来继续治疗。如实施例13所示例的，治疗可以在移植当天开始，并在移植后持续数天，诸如在移植后持续1天或更长时间，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。治疗也可能已经在移植前开始并且在移植后持续数天，诸如在移植后持续1天或更长时间，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。
口服或肠胃外施用的配制剂
哺乳动物α防御素和β防御素可以治疗性地用于组合物中，该组合物经配制用于通过任何常规途径施用。
在一个实施方案中，所述施用是口服、颊、舌下、直肠、阴道、气管内、肺内、鼻内、颅内、皮下、静脉内、皮肤或经皮的。优选地，施用是口服的。
在一个实施方案中，根据所公开的方法，至少一种哺乳动物α-防御素和/或至少一种哺乳动物β-防御素的施用是口服的。
在一个实施方案中，根据所公开的方法，至少一种哺乳动物β-防御素的施用通常是鼻内或肺内的。鼻内和肺内施用对于肺部药物递送是正常的。
在一个实施方案中，根据所公开的方法，至少一种哺乳动物α-防御素和/或至少一种哺乳动物β-防御素的施用是皮下或静脉内的。
在一些实施方案中，优选实施方案的组合物可被配制成冻干物，其利用提供稳定性的合适赋形剂而成为冻干物，并且随后进行再水化。可以根据常规方法，例如通过混合、制粒、包衣、溶解或冻干过程来制备含有哺乳动物α防御素和/或哺乳动物β防御素(诸如人α防御素和/或人β防御素)的药物组合物。在一个优选的实施方案中，将含有哺乳动物α防御素和/或哺乳动物β防御素的药物组合物配制为无菌且等渗的溶液。
药学上可接受的载剂和/或稀释剂是本领域技术人员熟悉的。对于配制为液体溶液的组合物，可接受的载剂和/或稀释剂包括盐水，且应包括无菌水，并且该组合物可任选地包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和其他常见的添加剂。
所公开的化合物可以配制成用于口服施用的多种配制剂。固体形式的制剂可包括粉剂、片剂、滴剂、胶囊剂、扁囊剂、锭剂和可分散颗粒剂。其他适合口服施用的形式可包括液体形式的制剂(包括乳剂、糖浆剂、酏剂、水溶液、水性悬浮液、洁齿剂、凝胶牙膏、口香糖)或意欲在使用前不久转变成液体形式的制剂诸如溶液、悬浮液和乳液的固体形式制剂。
所公开的组合物可以配制成多种配制剂用于颊、舌下、口服、直肠、阴道、皮肤、经皮、颅内、皮下或静脉内施用。所述配制剂可以含有(除了哺乳动物α防御素和/或哺乳动物β防御素和其他可选的活性成分之外)载剂、填充剂、崩解剂、流动调节剂、糖和甜味剂、香料、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂、稀释剂、分散剂和表面活性剂、粘合剂、润滑剂和/或本领域已知的其他药物赋形剂。本领域技术人员可以以适当的方式并按照公认的实践，诸如Remington's Pharmaceutical Sciences,Gennaro(1990)中描述的实践，进一步配制哺乳动物α防御素、哺乳动物β防御素。
哺乳动物α防御素或哺乳动物β防御素(诸如人α防御素或人β防御素)可以单独使用，也可以与一种、两种或更多种其他药物化合物或药物物质联合治疗，例如与益生元、益生菌、糖皮质激素、环孢霉素、抗TNF-α、整合素、抗生素、免疫抑制剂或它们的组合和/或与一种或多种药学上可接受的赋形剂。
气道施用
气道施用可用于施用本发明的组合物。肺内施用意指对肺的局部施用。当在本文中使用时，术语“气管内、支气管内或肺泡内施用”包括此类施用的所有形式，由此将防御素分别应用至气管、支气管或肺泡，不论其是分别通过滴注防御素溶液，通过以粉剂形式应用防御素，还是通过吸入防御素作为雾化的或雾状的溶液或混悬液或吸入的粉剂或凝胶(在具有或不具有添加的稳定剂或其他赋形剂的情况下)而使防御素到达气道的相关部分。
支气管内/肺泡施用的方法包括但不限于根据本领域技术人员熟知的方法使用防御素已经被溶解于其中的生理上可接受的组合物作为灌洗液或实际上通过支气管内施用的任何其他有效形式进行的支气管肺泡灌洗(BAL)，所述支气管内施用的任何其他有形式包括使用干燥形式的含有防御素的吸入性粉末(有或没有赋形剂)，或在支气管镜检查期间以溶液或悬浮液或粉末形式直接应用防御素。气管内施用的方法包括但不限于用溶解的防御素或防御素悬浮液的相似溶液进行盲气管清洗，或通过使用任何适合此目的的雾化装置吸入含有溶解的防御素或防御素悬浮液的雾化液滴。
在另一个实施方案中，气管内、支气管内或肺泡内施用不包括吸入产品，而是将防御素溶液或含有防御素的粉末或凝胶滴入或应用到气管或下气道。
其他优选的施用方法可包括使用以下设备：
1.使用压缩的空气/氧气混合物的加压雾化器
2.超声波雾化器
3.电子微型泵雾化器
4.定量吸入器(MDI)
5.干粉吸入器系统(DPI)。
气雾剂可以经由a)面罩递送，或b)在插管的患者中在机械通气期间经由气管内管来递送(设备1、2和3)。只要患者能够自己激活气雾剂设备，设备4和5也可以由患者在不需协助的情况下使用。
包含防御素和/或防御素的功能同系物或变体的溶液的优选浓度在每ml溶液约0.1μg至1000μg的范围内，例如在ml溶液约0.1μg至250μg的范围内。
用于肺内施用的药物组合物
用于本公开的药物组合物或配制剂包括防御素，该防御素与药学上可接受的载剂(优选水性载剂或稀释剂)组合，优选地防御素溶解于药学上可接受的载剂中，或该防御剂以经由吸入作为气雾剂施用的聚乙二醇化制剂或脂质体或纳米颗粒制剂而被携带至下气道，或以作为支气管肺泡灌洗液或作为盲气管内冲洗液或灌洗液经由支气管镜施用的灌洗液而被携带至下气道。可以使用多种水性载剂，包括但不限于0.9％盐水、缓冲盐水、生理相容性缓冲液等。可通过本领域技术人员众所周知的常规技术对组合物进行灭菌。所得的水溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并冷冻干燥，将冷冻干燥的制剂在施用前溶解在无菌水溶液中。
在一个实施方案中，可以将冷冻干燥的防御素制剂预包装在例如单剂量单位中。在一个甚至更优选的实施方案中，单剂量单位适合患者。
所述组合物可含有药学上可接受的辅助物质或佐剂，包括但不限于pH调节剂和缓冲剂和/或张度调节剂，诸如，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。
所述配制剂可含有药学上可接受的载剂和赋形剂，包括微球、脂质体、微胶囊、纳米颗粒等。常规脂质体通常由磷脂(中性或带负电荷)和/或胆固醇组成。脂质体是基于围绕水性区室的脂质双层的囊泡结构。它们的生理化学性质可以变化，诸如大小、脂质组成、表面电荷以及磷脂双层的数目和流动性。用于脂质体形成的最常用脂质是：1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸(单钠盐)(DMPA)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油3-磷酸(单钠盐)(DPPA)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸(单钠盐)(DOPA)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)(DMPG)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-[3-磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)(DPPG)、1,2-二油酰基-sn-甘油3-[磷酸-rac-(1-甘油)](钠盐)(DOPG)，1,2-二豆蔻酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DMPS)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DPPS)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-L-丝氨酸](钠盐)(DOPS)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(戊二烯基)(钠盐)和1,1',2,2'-四肉豆蔻酰心磷脂(铵盐)。由DPPC与其他脂质或脂质体改性剂组合组成的配制剂是优选的，例如，与胆固醇和/或磷脂酰胆碱组合。
长循环脂质体的特征在于其在血管壁通透性增加的身体部位渗出的能力。产生长循环脂质体的最流行方法是将亲水性聚合物聚乙二醇(PEG)共价附接至脂质体的外表面。一些优选的脂质是：1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](铵盐)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(氯盐)(DOTAP)。
由Avanti,Polar Lipids,Inc,Alabaster,AL提供了可应用于脂质体的可能的脂质。另外，脂质体悬浮液可包括脂质保护剂，其在储存时保护脂质免受自由基和脂质过氧化损害。亲脂性自由基猝灭剂(诸如α-生育酚)和水溶性铁特异性螯合剂(诸如ferrioxianine)是优选的。
多种方法可用于制备脂质体，如例如Szoka等,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)、美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028中描述的方法，其全部通过提述并入本文。另一种方法产生异质大小的多层囊泡。在此方法中，形成囊泡的脂质溶解在适合的有机溶剂或溶剂系统中，并在真空下或惰性气体中干燥以形成薄的脂质膜。如果需要，可以将膜重新溶解在合适的溶剂(诸如叔丁醇)中，然后冻干以形成更均质的脂质混合物，该脂质混合物为更易水合的粉末状形式。用被靶向的药物和靶向成分的水溶液覆盖这种膜，并使其水化，一般搅动15-60分钟。通过在更剧烈的搅拌条件下使脂质水合或通过添加增溶去污剂(诸如脱氧胆酸盐)，可以使所得的多层囊泡的尺寸分布向较小的尺寸转移。
胶束是通过水溶液中的表面活性剂(含有疏水部分和一个或多个离子或另外的强亲水基团的分子)形成的。
本领域技术人员众所周知的常见的表面活性剂可在本发明的胶束中使用。合适的表面活性剂包括月桂酸钠、油酸钠、月桂基硫酸钠、辛氧基乙二醇单十二烷基醚、辛苯聚醇9和PLURONIC F-127(Wyandotte Chemicals Corp.)。优选的表面活性剂是与IV注射剂相容的非离子聚氧乙烯和聚氧丙烯去污剂，诸如吐温-80、PLURONIC F-68、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷等。此外，磷脂(诸如用于脂质体产生中所描述的磷脂)也可用于胶束形成。
实施例
实施例1.
在预防性、鼠类、口服10天葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎模型中，s.c.和i.v.施用的hBD2对比腹膜内小鼠抗TNF-α的抗炎作用。
治疗方案：
图1说明了研究设计。
70只雄性C57BL/6小鼠，以每笼每组五只圈养，分配为7个不同的治疗组。所有动物饮用补充有DSS 2％的饮用水，持续7天，以诱发结肠炎，从而引起明显的炎症和结肠组织损伤。在尾静脉中静脉内地或在背侧皮肤下皮下地给药hBD2，腹膜内给药小鼠抗TNF-α或给药PBS作为媒介物来治疗动物，持续10天。
测试：
应用疾病活动指数(DAI)评分系统进行临床评估(图7)。在第10天处死动物，并取出结肠以便采用组织学评分系统进行组织学评估(图8)。
结果：
当每天一次或每天两次经由皮下途径施用hBD2时，获得了最显著的效果，但是静脉内施用hBD2也导致DAI的显著降低。抗TNFα和hBD2均显示出对DAI的相似且统计学上显著的效果。hBD2，尤其是以s.c.每天两次施用时，对组织学评分具有高度统计学显著的作用，而抗TNF-α对此评分无显著作用(图9)。
急性GVHD的特征在于隐窝细胞坏死，并且在严重的情况下，整个肠道上皮完全丧失。化学诱导的鼠类DSS模型，其引起上皮的丧失，因此似乎与测试化合物对GVHD的预防作用相关。实施例1中的结果证明，特别是s.c.施用hBD2与抗TNF-α治疗一样有效。一些出版物报道了抗TNF-α在GVHD中具有积极作用。
实施例2.
在预防性鼠类口服10天葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎模型中，口服施用的hBD2对比口服泼尼松龙的抗炎作用。
治疗方案：
50只雄性C57BL/6小鼠，以每笼每组五只圈养，分配为5个不同的治疗组。所有动物均饮用补充有DSS 2％的饮用水，持续7天，以诱发结肠炎，从而引起明显的炎症和结肠组织损伤。每天两次以三种不同剂量水平给药口服hBD2或每天两次给药口服泼尼松龙1mg/kg或给药PBS作为媒介物来治疗动物，持续10天。
测试：
应用疾病活动指数(DAI)评分系统进行临床评估(图7)。在第10天处死动物，并取出结肠以便采用组织学评分系统进行组织学评估(图8)。
结果：
显著抑制体重降低指示，对于所有三种hBD2剂量水平观察到动物进食更多并且经历了更好的健康状况，但在接受5mg/kg BID的高剂量组中最为明显(图10)。两种较低剂量水平的hBD2对DAI具有统计学上显著的作用，这与泼尼松龙相当，而高剂量的hBD2(5mg/kgBID)对DAI的作用则明显优于这些低剂量(图11)。泼尼松龙和hBD2均显示出对组织学评分有统计学上显著的作用，但所有三个hBD2剂量组的作用均明显优于泼尼松龙(图12)。
急性GVHD的特征在于隐窝细胞坏死，并且在严重的情况下，整个肠道上皮完全丧失。化学诱导的鼠类DSS模型，其引起上皮的丧失，因此似乎与测试化合物对GVHD的预防作用相关。实施例2的结果表明，口服hBD2施用与口服泼尼松龙的标准GVHD预防性治疗一样有效。
实施例3.
在预防性鼠类、8天三硝基苯磺酸诱发的结肠炎模型中，s.c.施用的hBD2对比s.c.泼尼松龙的抗炎作用。
治疗方案：
105只雄性BALB/cByJ小鼠，以每笼每组五只圈养，分配为7个不同的治疗组。在轻度麻醉下在第0天通过结肠内施用三硝基苯磺酸诱导结肠炎，从而导致明显的炎症和结肠组织损伤。用hBD以四种不同给药水平(1mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg和0.03mg/kg)每天一次2，或每日一次在背侧皮肤下皮下给药泼尼松龙10mg/kg、或给药PBS作为媒介物，来治疗动物，持续7天。
测试：
应用疾病活动指数(DAI)评分系统进行临床评估(图7)。在第10天处死动物，并取出结肠以便采用组织学评分系统进行组织学评估(图8)。
结果：
体重有高度统计学上显著的增加表明，对于最低的两个hBD2剂量水平(0.03和0.1mg/kg OD)观察到这些动物进食更多并经历了更好的健康状况。泼尼松龙和hBD2(0.1、0.3和1mg/kg)对组织学评分均显示出有高度统计学上显著的临床作用(图13)。
急性GVHD的特征在于隐窝细胞坏死，并且在严重的情况下，整个肠道上皮完全丧失。化学诱导的鼠类TNBS模型，其引起上皮的重度丧失，因此似乎与测试化合物对GVHD的预防作用相关。实施例3的结果表明，s.c.施用hBD2与泼尼松龙的标准预防性治疗一样有效。
实施例4.
在预防性鼠类7天葡聚糖硫酸钠诱发的结肠炎模型中，口服和s.c.施用的hBD2对比口服环孢霉素的抗炎作用。
治疗方案：
80只雄性C57BL/6小鼠，以每笼每组五只圈养，分配为7个不同的治疗组。所有动物均饮用补充有3％DSS的饮用水，持续7天，以诱发以上皮损伤、隐窝结构破坏为特征的结肠炎和以粘膜和黏膜下层中单核和中性粒细胞积累为特征的中度炎症。以0.6mg/kg BID或0.4mg/kg TID口服给药hBD2；以0.15mg/kg BID或0.1mg/kg TID s.c.给药hBD2；或环孢霉素50mg/kg OD或用水来治疗动物，持续7天。
测试：
按照评分系统(0＝粪便中无血；1＝粪便中有血的证据；以及2＝严重出血)进行临床评估。在第7天处死动物，并取出结肠用于组织学评估。
结果：
对于所有四个hBD2给药组以及环孢霉素，在维持结肠长度(图14)和临床评分(图15)方面均观察到高度的统计学上显著的改善。hBD2的TID给药比两种给药途径的BID给药更有效，并且和s.c.给药似乎比口服给药更有效(图15)。
急性GVHD的特征在于隐窝细胞坏死，并且在严重的情况下，整个肠道上皮完全丧失。化学诱导的鼠类DSS模型，其引起上皮的重度丧失，因此似乎与测试化合物对GVHD的预防作用相关。实施例4的结果表明，s.c.和口服hBD2施用都与用环孢霉素的标准GVDH预防性治疗一样有效，尤其是在临床评估方面。
实施例5.
在治疗性鼠类14天葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎模型中，s.c.施用的hBD2对比腹膜内抗TNF-α和腹膜内地塞米松的抗炎作用。
治疗方案：
70只雄性C57BL/6小鼠，以每笼每组五只圈养，分配为7个不同的治疗组。所有动物均饮用补充有DSS 2％的饮用水，持续14天，以诱发结肠炎，从而引起明显的炎症和结肠组织损伤。从第8天至14天以0.1mg/kg s.c.BID；以0.1mg/kg s.c.OD或1.2mg/kg i.v.OD的hBD2，或在第8天、10天和13天腹膜内施用小鼠抗TNFα250μg/小鼠，腹膜内OD施用地塞米松1mg/kg，或s.c.施用PBS作为媒介物，来治疗小鼠。
测试：
应用疾病活动指数(DAI)评分系统进行临床评估(图7)。在第14天处死动物，并取出结肠以便采用组织学评分系统进行组织学评估(图8)。
结果：
对于hBD2 0.1mg s.c.OD以及对于地塞米松1mg/kg i.p.OD，观察到对DAI有统计学上显著的作用。类似地，对于hBD2 0.1mg/kg s.c.OD和地塞米松均观察到对组织学评分有统计学上显著的作用(图16)。
急性GVHD的特征在于隐窝细胞坏死，并且在严重的情况下，整个肠道上皮完全丧失。化学诱导的鼠类DSS模型，其引起上皮的重度丧失，因此似乎与测试化合物对GVHD的治疗作用相关。实施例5的结果表明，s.c.施用的hBD2与用泼尼松龙进行的GVHD标准治疗一样有效。
实施例6.
在治疗性鼠类14周CD4+CD25+T细胞转移诱导的结肠炎模型中，s.c.施用的hBD2对比s.c.抗TNF-α(Enbrel)和腹膜内地塞米松的功效。
治疗方案：
70只雌性BALB/c小鼠，以每笼每组五只圈养，分配至7个不同的治疗组。通过从BALB/c小鼠移植CD4+CD25+T细胞，在SCID小鼠中诱发结肠炎。从来自BALB/c小鼠的脾脏和淋巴结中分离出的淋巴细胞进行CD4+T细胞的阴性选择。然后，通过与来自CD4+T细胞悬浮液的珠子结合来阳性分离出CD4+CD25+细胞，并从上清液中收集CD4+CD25-。从第7天起连续86天以0.1mg/kg s.c.OD；1mg/kg s.c.OD或3mg/kg s.c.OD的hBD2，或每周两次用小鼠抗TNFα100μg/小鼠或，以0.3mg/kg腹膜内施用的地塞米松，或以s.c.PBS作为媒介物，来治疗动物。
测试：
基于体重减轻、粪便稠度和经直肠的血液存在进行临床评估。在第95天处死动物，并取出结肠用于评估重量和髓过氧化物酶活性。
结果：
对于hBD2 1mg/kg s.c.OD、对于地塞米松0.3mg/kg i.p.OD、和对于Enbrel，均观察到对临床评分有统计学上显著的且相似的作用(图17)。类似地，这三种给药方案对结肠重量(图18)和髓过氧化物酶活性(图19)显示出统计学上显著的且相似的作用。
急性GVHD被认为是T细胞介导的综合征，其特征在于隐窝细胞坏死，并且在严重的情况下，整个肠道上皮的全部丧失，尤其是CD4+CD25+Treg细胞已成为急性GVHD发病机理的一部分，引起了广泛关注(Ball&Egeler,2008)。鼠类CD4+CD25+T细胞转移模型，其引起上皮的严重丧失，因此似乎与测试化合物对重度且持久的GVHD的治疗作用相关。
髓过氧化物酶是一种在炎症的发生和发展中起重要作用的人类酶，并且是氧化应激和炎症的生物标志物，最近已被报道为GVHD的潜在生物标志物(Ge和Ye,2013)。实施例6的结果表明，hBD2施用与使用地塞米松的GVHD的标准抗炎治疗一样有效，还与较不成熟的使用抗TNF-α的治疗一样有效。
实施例7.
通过使用防御素的预防性治疗来保护和维持肠微生物群。
小鼠：以每组4个笼子，每笼三只(in trios)来圈养小鼠。每天下午6点熄灯前，每天记录一次采食量。按组和笼子的改变的顺序对各个小鼠进行实验程序。在SPF标准条件下，将小鼠在室温下以12小时的光/暗循环保持在室温下。
饮食：对于给药，平均重量评估为每只小鼠25克。小鼠每天每只小鼠吃大约3克饲料。
治疗方案：给小鼠饲喂高脂肪饮食(HFD)或低脂肪(LF)对照饮食。HFD包含4个子组；1个hBD2、1个HD5、1个hBD2/HD5和1个不补充防御素的标准HFD(图3)。防御素浓度为每天每kg小鼠1.2mg hBD2。以与hBD2等摩尔的浓度给予HD5。向结合组给予50％hBD2+50％HD5，因此防御素的总量与其余测试组相当。
测试：
进行了微生物分析以研究肠的微生物群。在来自60只小鼠的4个配对样品(总共240个样品)上进行了纵向16S表征。在饮食改变前，饮食改变后1周，饮食改变后4周以及终止时,对每只小鼠进行采样，从而确保了对粪便微生物群进行了全面表征作为防御素治疗的结果。
结果
重量变化.尽管三个实验饮食组的食物摄入量相似，但在10周的研究期内，两个高脂肪饮食(HFD)组获得显著高于低脂肪饮食(LFD)参考组(*p<0.0001，双向ANOVA，图基事后检验)的重量。然而，HFD加hBD2组获得的重量显著低于HFD参考组(*p＝0.0028)。
微生物组.hBD2主要影响微生物的存在，而HD5和hBD2+HD5主要影响微生物的丰度(图20)。用HD5预防后，看到小肠中别样棒菌属的丰度有统计学上的显著增加(p<0.02；图21)。别样棒菌属是产生短链脂肪酸的物种。短链脂肪酸在调节经由GPCR43介导的结肠Treg细胞稳态中起到重要作用。T细胞发育不全和T细胞稳态紊乱是急性和慢性GVHD二者的核心部分。图22是属分析，其显示了不同处理组中物种的相对丰度，并说明了hBD2和HD5对肠菌群(flora)的作用。在用hBD2进行预防性治疗后，观察到结肠中巴恩斯氏菌的丰度有统计学上的显著增加(p<0.03；图24)。巴恩斯氏菌是能够消除和保护免于发生可在住院患者中观察到的对抗生素具有耐药性的致病细菌成为肠道优势的细菌。巴恩斯氏菌的丰度对应于几种免疫调节细胞的量。结肠中巴恩斯氏菌的水平越高，在脾脏和肝脏中列举出的边缘区B细胞和不变的自然杀伤性T细胞就越多。在IL-10-/-小鼠的结肠炎的发展中，较高的巴恩斯氏菌种系型水平与较低的疾病活动水平相关。在用hBD2进行预防性治疗后，观察到结肠中乳酸杆菌科向更低的丰度发展的趋势(p＝0.1；图23)。
HFD组的小鼠发展为大量的脂肪变性(肝细胞内脂肪积累)，而经hBD-2预防性治疗的HFD组的小鼠则发生最小的脂肪变性(图60)。
微生物群似乎在GVHD的发展中起到重要作用，尤其是在干细胞移植后立即进行了显著的细菌净化之后。特别地，微生物群似乎在GVHD的发展中起着重要作用，尤其是在干细胞移植之前进行了显著的细菌净化之后。此实施例7表明，防御素就存在的物种数以及细菌的总数而言对微生物群组成具有深远的影响，因此似乎可以保护和维持健康的微生物群。更具体地，防御素似乎促进产生短链脂肪酸的细菌，该短链脂肪酸SCFA在结肠Treg细胞稳态中起关键作用。此外，防御素似乎可以防止肝脏炎症和脂肪变性。
实施例8.通过防御素的介入治疗来治疗失调。
小鼠和饮食.该实验阐明了hBD2和HD5对饮食诱导的肥胖小鼠中的微生物群的作用。在干预前的进行为期13周的进行(run-in)期中，给小鼠饲喂非常高的HFD(60％的能量来自脂肪)。在最终分析中仅包括符合在进行期期间最小体重增加12克(约占初始体重的50％)的标准的小鼠。不符合这些标准的小鼠作为“留守者”等级留在其各自的笼子里。它们被暴露于所有实验测试，但是从分析中排除。
治疗方案.在干预之前，对所有小鼠进行MR扫描。基于小鼠的脂肪量，将小鼠的笼子分配至实验组。所有后续测量结果均与干预之前的来自同一只小鼠的数据进行配对。LFD(低脂肪饮食)参考组平行运行。作为干预措施的对照，还包括2个额外的组：1个非常HFD和1个LFD。实验小鼠在干预期间保持非常HFD(图3)。小鼠接受实验饮食10周。在整个实验过程中将它们共同圈养，每笼4只小鼠，每组3个笼。所有测试进行了3天，每组每天1个笼子。
测试.进行了微生物分析以研究肠的微生物群。在来自60只小鼠的4个配对样品(总共240个样品)上进行了纵向16S表征。在饮食改变前，饮食改变后1周，饮食改变后4周以及终止时对每只小鼠进行采样，从而确保了对粪便微生物群进行了全面表征作为防御素治疗的结果。
结果
体重变化–hBD2.标准高脂肪饮食(HFD)饲喂组在整个研究期间具有相同的食物摄入量，并且在前13周具有相同的体重发展，具有相同的脂肪和瘦肉量，因此饮食干预之前具有相同的起始点。体重获得显著大于低脂肪饮食(LFD)组(*p<0.05双向ANOVA)。饮食干预后，HFD组的重量继续增加，然而，在饮食干预后的前4周，HFD加hBD2组倾向于获得更少的重量，尽管并不显著(*p＝0.07,双向ANOVA)。从第4周到研究期结束，HFD加hBD2组获得与标准HFD组相似的体重(*p＝0.82,双向ANOVA)。
重量变化–HD5.在研究期期间，所有HFD饲喂组的食物摄入量均相同，并且在为期13周的进行期期间内具有相等的体重获得。饮食干预后，饲喂HFD加HD5的组获得显著低于HFD对照的体重(*p<0.05,双向ANOVA)。此外，观察到HFD加HD5组的脂肪百分比降低的趋势，并且与HFD对照相比，饮食改变后4周，测量到HFD加HD5的脂肪百分比明显更低(*p＝0.009，双向ANOVA)。
微生物群.
两种防御素均显示对细菌的存在和细菌的缺失具有深远影响(图25)。HD5在统计学上显著地增加结肠中的Alloprevotella的丰度(p<0.02)(图26)，而hBD2对Alloprevotella的丰度没有影响。hBD2显著且有统计学上显著地增加小肠和结肠中双歧杆菌科的相对丰度(分别为p<0.0001和p<0.04；图27)。HD5有增加小肠中双歧杆菌科的丰度的趋势(图27)。
微生物群似乎在GVHD中起到重要作用，尤其是在干细胞移植后立即进行的显著的细菌净化之后。目前在世界上许多中心正在进行使用排泄物移植物的实验性治疗，例如，德国雷根斯堡的Holler教授试图在细菌净化后重新设置正常的微生物群。此实施例8表明，防御素在存在的物种数和细菌总数方面对微生物群组成具有深远的影响，因此似乎能够治疗失调状况并重新设置正常的微生物群，这对于维持例如结肠Treg细胞稳态至关重要。
实施例9.
为了在鼠类屋尘螨驱动的变应性哮喘模型中确定和评估鼻内(IN)对比口服防御素的预防性治疗的疗效。
材料和方法
治疗方案：在研究开始前一天，将7-10周龄的雌性BALB/c小鼠随机分配至5个研究组，并使用屋尘螨(200μL盐水中的100μg HDM加0.9％盐水中的弗氏完全佐剂)进行皮下(SC)致敏。从第12天的早晨开始，分别以1.2mg/kg/天(0.4mg/kg TID)的剂量口服和鼻内用hBD2治疗小鼠，并以约6小时的间隔继续进行TID。在第14天，在激发前一小时施用最后一剂。剂量总数为8剂或总量为2mg/kg hBD2。然后在第14天用HDM鼻内(IN)激发小鼠(50μL盐水中HDM 25μg)(图4)。
测试：
气道炎症：激发后48小时，进行支气管肺泡灌洗，用3体积的冷PBS(0.4；0.3和0.3mL，总计1mL)洗涤肺。在自动血液分析仪Sysmex XT-2000iV上测定总的和白细胞分类细胞计数。
肺功能：在HDM激发后48小时开始，使用DSI的Buxco Finepoint RC系统，通过麻醉的插管小鼠在乙酰甲胆碱(3.125MCH1；6.25MCH2；12.5MCH3和25mg/mL MCH4)激发后进行肺阻力和肺顺应性的测量。数据表示为10mg/kg乙酰甲胆碱下的气道阻力和剂量反应曲线。
用于细胞因子分析的肺采样：每次BAL完成后，将肺从胸腔中取出，在液氮中速冻，并在–80摄氏度下冷冻保存，直到通过ELISA来分析肺匀浆中的细胞因子TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13和IL-33的浓度。
结果
观察到与盐水激发的(非哮喘)小鼠相比，HDM激发的媒介物治疗的动物的肺阻力值增加，肺顺应性值降低。用HDM致敏后14天，在两种媒介物治疗的小鼠组(口腔和鼻内)中均通过单次HDM激发诱发了炎症性应答。与盐水激发的对照相比，其特征在于BALF中的总细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞计数有统计学上的显著增加(p<0.05)。而且，对肺组织匀浆中的七种细胞因子TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13和IL-33的浓度的分析揭露了与盐水激发的对照相比，HDM激发的动物的水平明显更高。
在口服和鼻内应用TID后，从第12天到第14天施用hBD2(8次施用总计2.0mg/kg)，与HDM激发的媒介物治疗的动物相比，其有效抑制了气道阻力的增加(图28)和有效抑制了肺顺应性的下降(图29)。口服应用后观察到对BALF中细胞内流的作用，其显著抑制了中性粒细胞计数(图30)。在口服施用后，在TNF-α(图31a)、IL-4(31b)、L-5(31c)、IL-6(31d)、IL-9(31e)和IL-13(31f)细胞因子水平上观察到免疫系统的再平衡，即肺组织匀浆中的细胞因子浓度的完全正常化。经鼻内施用hBD2后，存在TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9和IL-13降低的趋势，但与对照组相比在统计学上无显著性差异。所有获得的结果指示，hBD2在屋尘螨驱动的变应性哮喘小鼠模型中具有明显的预防和抗炎作用。
肺是继肠道、肝脏和皮肤之后在GVHD中涉及的第四器官。此实施例证明，防御素不仅能够维持完整的免疫系统，而且可以关键地阻止所有关键GVHD细胞因子TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9和IL-13的细胞因子风暴的出现，细胞因子风暴是急性GVHD的标志。炎症性细胞因子释放或细胞因子风暴已被认为是急性GVHD发生和严重程度的主要中介物(Ball&Egeler,2008)。
实施例10.
为了确定和评估在变应性哮喘的鼠类屋尘螨模型中防御素的IN对比口服治疗性干预的疗效。
材料和方法
治疗方案：在研究开始前一天，将7-10周龄的雌性BALB/c小鼠随机分配至7个研究组，并使用屋尘螨(200μL盐水中的100μg HDM加0.9％盐水中的弗氏完全佐剂)进行皮下(SC)致敏。然后在第14天用HDM鼻内(IN)激发小鼠(50μL盐水中HDM 25μg)。在第14天口服施用地塞米松(1mg/kg BID；50μL磷酸盐缓冲的盐水(PBS))。在第14天，IN或口服施用hBD2(1.7mg/kg TID IN；0.4mg/kg TID IN；0.4mg/kg TID口服，50μL磷酸盐缓冲的盐水)。在激发前60分钟施用初始剂量，后续剂量间隔约6小时(图5)。
测试：
气道炎症：激发后48小时，进行支气管肺泡灌洗，用3体积的冷PBS(0.4；0.3和0.3mL，总计1mL)洗涤肺。在自动血液分析仪Sysmex XT-2000iV上测定总的和白细胞分类细胞计数。
肺功能：在HDM激发后48小时开始，使用DSI的Buxco Finepoint RC系统，通过麻醉的插管小鼠在乙酰甲胆碱(3.125MCH1；6.25MCH2；12.5MCH3和25mg/mL MCH4)激发后进行肺阻力和肺顺应性的测量。数据表示为10mg/kg乙酰甲胆碱下的气道阻力和剂量反应曲线。
用于细胞因子分析的肺采样：每次BAL完成后，将肺从胸腔中取出，在液氮中速冻，并在–80摄氏度下冷冻保存，直到通过ELISA来分析细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和IFNγ的浓度。
结果
观察到与盐水激发的(非哮喘)小鼠相比，HDM激发的媒介物治疗的动物的肺阻力值增加，肺顺应性值降低。用HDM和佐剂致敏后14天，在两种媒介物治疗的小鼠组(口腔和鼻内)中均通过单次HDM激发诱发了炎症性应答。与盐水激发的对照相比，其特征在于BALF中的总细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞计数有统计学上的显著增加(p<0.05)。而且，对肺组织匀浆中的五种细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和IFN-γ的浓度的分析揭露了与盐水激发的对照相比，HDM激发的动物的水平明显更高。
地塞米松治疗可显著抑制BALF中的总细胞和嗜酸性粒细胞计数，但不能抑制中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞计数。根据细胞数据，与HDM/媒介物对照相比，地塞米松不影响肺组织匀浆中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和IFN-γ的水平。但是，它影响了与嗜酸性粒细胞计数有关的AHR测量。获得的结果指示此模型在一定程度上对类固醇具有抗性。
与HDM激发的媒介物治疗的动物相比，在口服和鼻内应用TID后，hBD2在第14天均有效抑制了气道阻力的增加(图32a和32b)和有效抑制了肺顺应性的降低(图33a和33b)。鼻内应用后，在某些测量参数上观察到了更显著的作用，诸如BALF中的细胞内流，其中两种IN剂量(0.4mg/kg/天TID和1.7mg/kg/天TID)均显著抑制总小包、中性粒细胞和巨噬细胞计数(图34a，b和c)和嗜酸性粒细胞降低的趋势，而类固醇标准地塞米松未能抑制它们。在两种给药途径的情况下，对肺组织匀浆中的IFN-γ(图35)、IL-4(图37)、IL-5(图38)、IL-6(图39)、IL-9(图40)和IL-10(图41)细胞因子水平观察到相似的显著作用。经口服施用的hBD2显著降低TNF-α(图36)，而鼻内施用的hBD2与对照不同但不显著。所有获得的结果指示，hBD2在屋尘螨/弗氏完全佐剂驱动的变应性哮喘小鼠模型中具有明显的抗炎作用。
肺是继肠道、肝脏和皮肤之后在GVHD中涉及的第四器官。此实施例10证明，防御素不仅能够使免疫系统再平衡，而且可以关键地治疗或预防关键GVHD细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的细胞因子风暴，细胞因子风暴是急性GVHD的标志。事实上，炎症性细胞因子释放或细胞因子风暴已被认为是急性GVHD发生和严重程度的主要中介物(Ball&Egeler,2008)。
实施例11.
为了确定和评估在变应性哮喘的鼠类屋尘螨模型中在施用防御素的情况下IN对比口服治疗性干预的疗效。
材料和方法
治疗方案：在研究开始前一天，将7-10周龄的雌性BALB/c小鼠随机分配至4个研究组，并使用屋尘螨(200μL盐水中的100μg HDM加0.9％盐水中的弗氏完全佐剂)进行皮下(SC)致敏。在第14天用HDM鼻内(IN)激发小鼠(50μL盐水中HDM 25μg)。在第14天，IN或口服施用hBD2(0.4mg/kg TID IN；0.4mg/kg TID口服，50μL磷酸缓冲的盐水)。在激发前60分钟施用初始剂量，后续剂量间隔约6小时。
测试：
肺组织取样：从胸腔中取出肺，在液氮中速冻，并在–80摄氏度下冷冻保存，直到通过ELISA分析肺匀浆中IL-4、IL-5、IL-8(KC)、IL-9和IL-13的细胞因子浓度。
将肺在10％缓冲的福尔马林中原位膨胀，从胸腔中取出，单独地置于10％缓冲的福尔马林中，完全石蜡包埋，切片并进行H&E/PAS染色。
血液采样：经由颈静脉出血收集所有末梢血样品。将血液采样到肝素锂管中，置于冰上，并立即在4℃下离心。分离血浆并储存在-80℃，直到进行潜在的SCFA分析。
肺组织取样：轻轻打开胸腔并切掉胸骨和肋骨的任一侧并修剪，暴露并切除肺部。将每组的前6只动物的肺从胸腔中取出，在液氮中速冻并在-80℃下冷冻保存，直到通过ELISA分析细胞因子浓度。
将每组其它8只动物的肺用10％缓冲的福尔马林原位膨胀，从胸腔中取出，分别置于10％缓冲的福尔马林中，完全石蜡包埋，切片并进行H&E/PAS染色。保留石蜡块用于IHC分析。
读数
·组织病理学(H&E；PAS)(N＝8/组；总计N＝32)
·肺组织匀浆物中的细胞因子(IL-4、IL-5、IL-8(KC)、IL-9和IL-13)
(N＝6/组；总计N＝24)
组织病理学
在H&E染色载玻片上分别对支气管周/支气管和血管周间隙的细胞流入量(单核细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞)进行半定量评估：
0 不存在
1 少量分散的炎症细胞
2 较大的聚集体
3 明显的细胞累积
将炎症的总得分计算为所有个体得分的总和。
在PAS染色的载玻片上分别评估了在大气道和远端气道水平的杯状细胞转化(metaplasia)，如下所示：
0不存在沿基底膜的含粘液的细胞
1沿基底膜的阳性细胞很少，少于75％的染色的细胞质
2沿基底膜的阳性细胞很少，多于75％的染色的细胞质
3沿基底膜的阳性细胞很多，少于75％的染色的细胞质
4沿基底膜的阳性细胞很多，多于75％的染色的细胞质
统计学评价
使用MS Excel处理数据。使用GraphPad Prism软件(5.04版)进行统计分析。当p<0.05时，组之间的差异被认为是统计学上显著的。
使用中位数和非参数曼惠特尼检验对所选组织学评分值数据进行统计学分析。
结果
用HDM和佐剂致敏后14天，在两种媒介物治疗的小鼠组(口腔和鼻内)中均通过单次HDM激发诱发了炎症性应答。与盐水激发的对照相比，其特征在于肺组织匀浆中五种细胞因子IL-4、IL-5、IL-8、IL-9和IL-13的浓度有统计学上显著的增加，以及HDM激发的动物中肺组织的严重组织学炎症变化。
与HDM激发的媒介物治疗的动物相比，hBD2在口服和鼻内应用TID后，在第14天，均有效抑制了肺组织的组织学炎症增加(图43、44、45)。口服施用后对肺组织匀浆中的IL-4、IL-5、IL-9和IL-13细胞因子水平有显著影响，以及在IN施用后对IL-9和IL-13水平有显著影响。所有获得的结果指示，hBD2在屋尘螨/弗氏完全佐剂驱动的变应性哮喘小鼠模型中具有明显的抗炎作用。
肺是继肠道、肝脏和皮肤之后在GVHD中涉及的第四器官。此实施例证明，防御素不仅能够使免疫系统再平衡，而且可以关键地治疗或预防关键GVHD细胞因子IL-4、IL-5、IL-8、IL-9和IL-13的细胞因子风暴，细胞因子风暴是急性GVHD的标志。事实上，炎症性细胞因子释放或细胞因子风暴已被认为是急性GVHD发生和严重程度的主要中介物(Ball&Egeler,2008)。
实施例12.
序列
Figure BDA0002506992870000401
Figure BDA0002506992870000411
实施例13.
为了确定和评估在干细胞移植后急性移植物抗宿主病小鼠模型中口服hBD-2的预防性治疗的功效。
材料和方法
治疗方案：在第0天以至少4小时的间隔以4.5Gy(2x498秒)照射12只雌性BALB/c小鼠。收获骨髓：无菌地从2只雌性WT C57BL/6小鼠中收获后肢。去除骨骼肌并切除骺。用PBS冲洗骨骼内腔，使细胞沉淀并收集。T细胞的收获：将2只雌性WT C57BL/6小鼠的脾脏通过100μM细胞过滤器筛入PBS填充的平皿中。将细胞收集在PBS中，并转移至50mL离心管中并旋转沉淀。将细胞收集在1mL PBS中，并添加每个脾脏20μL CD4微珠+20μL CD8微珠，在4摄氏度下孵育20min。用PBS洗涤细胞并将其应用于MACS分离，以便阳性选择CD4+和CD8+细胞。对阳性选择的T细胞进行计数并收集。移植：第二次照射后，立即进行，在异氟烷麻醉下，所有WT BALB/c接受小鼠被i.v.注射5x1.000.000个BM细胞(50μL)至眼眶后静脉丛中。从第0天至第10天，经由小瓶口服管饲法每天以100μL PBS中1.2mg的hBD2/kg BW/天来治疗15只BALB/c小鼠。
从第0天至第10天，15只BALB/c小鼠经由口服管饲法每天接受媒介物100μL PBS。
测试：
在最初的7天中每日对小鼠称重，并监测其存活持续100天。
结果
媒介物组中的所有15只小鼠都在第35天以前死亡；而只有4只或低于30％的hBD2治疗的小鼠在第35天以前死亡，在第100天时仍有8只小鼠存活，p<0.0001(图47)。与PBS相比，hBD-2治疗的组的小肠、结肠和肝脏的组织学评分均高度在统计学上较低(图48)。经hBD2治疗的小鼠在骨髓移植后的前7天损失统计学上显著更少的重量，这表明肠道健康和肠道完整性得到改善(图49)。hBD2治疗可减少CD45+白细胞的浸润(图50中的FACS分析)；结肠固有层中的肠T细胞和髓样细胞浸润(图51a-c)。hBD2的预防性治疗还显示TNF-α和IL-6浓度降低以及IL-10浓度升高(图52a-c)。hBD-2治疗还显示出来自髓样细胞的IL-1β减少(图53a-c中脾脏的FACS分析)。脾脏的FACS分析还显示出中性粒细胞的数目减少(图54a)；Th1细胞因子的产生降低，尤其是TNF-α和IFN-γ(图54b-f)。结肠样品的微阵列分析显示，对比PBS，hBD-2治疗的组中的炎症、白细胞和髓样细胞迁移减少以及组织重塑减少(图55)。
结论
此实施例13证明了从干细胞移植之日起持续10天用hBD-2进行预防性治疗可显著降低死亡率并增加长期存活。
实施例14.
为了确定和评估在干细胞移植后急性移植物抗宿主病小鼠模型中口服hBD-2对比环孢霉素的预防性治疗的功效。
材料和方法
治疗方案：在第0天以至少4小时的间隔以4.5Gy(2x498秒)照射20只雌性BALB/c小鼠。收获骨髓：无菌地从2只雌性WT C57BL/6小鼠中收获后肢。去除骨骼肌并切除骺。用PBS冲洗骨骼内腔，使细胞沉淀并收集。T细胞的收获：将2只雌性WT C57BL/6小鼠的脾脏通过100μM细胞过滤器筛入PBS填充的平皿中。将细胞收集在PBS中，并转移至50mL离心管中并旋转沉淀。将细胞收集在1mL PBS中，并添加每个脾脏20μL CD4微珠+20μL CD8微珠，在4摄氏度下孵育20min。用PBS洗涤细胞并将其应用于MACS分离，以便阳性选择CD4+和CD8+细胞。对阳性选择的T细胞进行计数并收集。移植：第二次照射后，立即进行，在异氟烷麻醉下，所有WT BALB/c接受小鼠被i.v.注射5x1.000.000个BM细胞(50μL)至眼眶后静脉丛中。从第0天至第10天，用1.2mg hBD2/kg BW/天(n＝7)；在第0、3、6和9天用50mg环孢霉素/kg BW(n＝7)、或每天100μL PBS经由口服管饲法(n＝6)，来治疗20只BALB/c小鼠。
测试：
在研究期间以定期的间隔称重小鼠，并监测存活持续90天。
结果
PBS治疗的小鼠中除一个外的所有小鼠均在第90天以前死亡，而hBD-2治疗的动物中仅1只在第90天以前死亡(p＝0.03，图56)，环孢霉素治疗的动物中有3只动物已死亡(p＝0.16，图56)。与PBS治疗的小鼠相比，hBD2和环孢霉素治疗的小鼠在骨髓移植后损失了统计学上显著更少的重量，这表明肠道健康和肠道完整性得到改善(图57)。
结论
此实施例14用于证明从干细胞移植之日起持续10天用hBD-2预防性治疗至少与使用环孢霉素的标准抗GVHD治疗相当地降低了死亡率。
实施例15.
为了确定和评估在干细胞移植后急性移植物抗宿主病小鼠模型中口服HD5的预防性治疗的功效。
材料和方法
治疗方案：在第0天以至少4小时的间隔以4.5Gy(2x498秒)照射22只雌性BALB/c小鼠。收获骨髓：无菌地从2只雌性WT C57BL/6小鼠中收获后肢。去除骨骼肌并切除骺。用PBS冲洗骨骼内腔，使细胞沉淀并收集。T细胞的收获：将2只雌性WT C57BL/6小鼠的脾脏通过100μM细胞过滤器筛入PBS填充的平皿中。将细胞收集在PBS中，并转移至50mL离心管中并旋转沉淀。将细胞收集在1mL PBS中，并添加每个脾脏20μL CD4微珠+20μL CD8微珠，在4摄氏度下孵育20min。用PBS洗涤细胞并将其应用于MACS分离，以便阳性选择CD4+和CD8+细胞。对阳性选择的T细胞进行计数并收集。移植：第二次照射后，立即进行，在异氟烷麻醉下，所有WT BALB/c接受小鼠被i.v.注射5x1.000.000个BM细胞(50μL)至眼眶后静脉丛中。从第0天至第10天，用1.2mg HD5/kg BW/天；1.2mg的hBD-2/kg BW/天；或每天100μL PBS，经由口服管饲法来治疗22只BALB/c小鼠。
测试：
监测存活持续60天。
结果
8只PBS治疗的小鼠中有6只已在第60天以前死亡，而8只HD5治疗的动物中有2只已死亡(p＝0.06，图58)，而在hBD-2治疗的动物中在第60天以前无一死亡(p＝0.008，图58)。
结论
该实施例15用于证明从干细胞移植之日起持续10天用HD5或hBD-2进行预防性治疗可显著降低死亡率。
实施例16.
口服施用的防御素(HD5和hBD-2)的抗微生物作用。
方法：
通过FISH对粘蛋白进行免疫染色和细菌定位
如前所述，将粘液免疫染色与荧光原位杂交(FISH)配对，以便分析细菌在肠粘膜表面的定位。简言之，将没有粪便材料的结肠组织(近端结肠、距盲肠第二厘米)放在甲醇-卡诺氏固定溶液(60％甲醇，30％氯仿，10％冰醋酸)中，在室温下放置最少3小时。然后将组织在甲醇中洗涤2x30min，乙醇中洗涤2x15min，乙醇/二甲苯(1:1)中洗涤15分钟和二甲苯中洗涤2x15min，然后以垂直方向包埋在石蜡中。进行5μm的切片，并通过在60℃下预热10min，随后在60℃下的二甲苯10min，二甲苯10min和99.5％乙醇10min来脱蜡。用EUB338探针(5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’，使用Alexa 647进行5'标记)在50℃过夜进行杂交步骤，所述探针在杂交缓冲液(20mM Tris–HCl，pH 7.4，0.9M NaCl，0.1％SDS，20％甲酰胺)中稀释至最终浓度为10μg/mL。在洗涤缓冲液(20mM Tris–HCl，pH 7.4，0.9M NaCl)中洗涤10min并在PBS中洗涤3x10分钟后，使用PAP笔(Sigma-Aldrich)在切片周围标记，并在4℃下添加封闭溶液(在PBS中的5％胎牛血清)持续30分钟。将粘蛋白-2一抗(兔H-300,Santa CruzBiotechnology,Dallas,TX,USA)以1：1500稀释于封闭溶液中，并在4℃下应用过夜。在PBS中洗涤3x10分钟后，含有1:1500稀释的抗兔Alexa 488二抗、1μg/mL的鬼笔环肽-四甲基罗丹明B异硫氰酸盐(Sigma-Aldrich)和10μg/mL的Hoechst 33258(Sigma-Aldrich)的封闭溶液应用于切片持续2h。在PBS中洗涤3x10min后，使用持久抗褪色固定介质固定载玻片(LifeTechnologies,Carlsbad,CA,USA)。使用具有软件Zen 2011 7.1版的Zeiss LSM 700共聚焦显微镜进行观察。此软件用于确定细菌与上皮细胞单层之间的距离以及粘液厚度。
结果：
观察到肠壁和细菌群之间的裂解区具有高度统计学上的显著差异。对于喂食低脂肪饮食和西方饮食的小鼠来说，距离很小，而HD5尤其是hBD-2对距离有深远的影响(图59)。
结论
此实验证明，在小鼠中口服施用的人HD5和hBD-2在小鼠的上皮表面上发挥其微生物群调节作用，就像它们是由小鼠自身的上皮细胞产生的，而不是不是像口服施用后所预期的那样主要在肠腔中产生的。
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Asp His Tyr Asn Cys Val Ser Ser Gly Gly Gln Cys Leu Tyr Ser Ala
1 5 10 15
Cys Pro Ile Phe Thr Lys Ile Gln Gly Thr Cys Tyr Arg Gly Lys Ala
20 25 30
Lys Cys Cys Lys
35
<210> 2
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala Ile Cys His
1 5 10 15
Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys Gln Ile Gly Thr Cys Gly Leu
20 25 30
Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro
35 40
<210> 3
<211> 45
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly Gly
1 5 10 15
Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Ile Gly Lys
20 25 30
Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys
35 40 45
<210> 4
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Glu Leu Asp Arg Ile Cys Gly Tyr Gly Thr Ala Arg Cys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Cys Arg Ser Gln Glu Tyr Arg Ile Gly Arg Cys Pro Asn Thr Tyr Ala
20 25 30
Cys Cys Leu Arg Lys
35
<210> 5
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg
20 25 30
<210> 6
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser
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Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu
20 25 30
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala Ile Cys His Pro Val Phe Cys
1 5 10 15
Pro Arg Arg Tyr Lys Gln Ile Gly Thr Cys Gly Leu Pro Gly Thr Lys
20 25 30
Cys Cys Lys Lys Pro
35

Claims (33)

1.一种用于预防或治疗已接受或即将接受同种异体造血干细胞移植的患者中的急性移植物抗宿主病的方法，该方法包括向所述患者施用至少一种哺乳动物防御素，所述哺乳动物防御素来自β-防御素和α-防御素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述防御素选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7和序列变体，该序列变体与所述SEQ ID NO相差少于5个，诸如少于4个，例如少于3个，例如少于2个氨基酸。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物防御素选自hBD2、HD5、HD6、hBD1、截短的hBD2、hBD3和hBD4。
4.根据权利要求13所述的方法，其中所述防御素是hBD2、截短的hBD2或HD5。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述防御素包含在一种组合物中，其中所述组合物包含一种以上防御素，诸如两种防御素，诸如三种防御素，诸如四种防御素，诸如五种防御素。
6.根据权利要求15所述的方法，其中所述两种防御素是hBD2和HD5。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中向所述患者施用所述防御素是在同种异体造血干细胞移植的当天开始的。
8.根据前述权利要求1-6中任一项所述的方法，其中当同种异体造血干细胞移植后GVDH的症状出现时，开始向所述患者施用所述防御素。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中持续施用防御素直至所述患者不存在由同种异体造血干细胞移植引起的症状，诸如持续至少一周，例如至少两周，诸如至少三周，例如至少4周，诸如至少2个月，例如至少3个月、至少4个月、至少6个月。
10.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述组合物是药物组合物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物防御素进一步包含至少一种额外的部分，该部分选自细胞穿透肽(CPP)、白蛋白结合部分(ABM)、可检测部分(Z)和半衰期延长肽。
12.根据权利要求18所述的方法，其中所述额外的部分是半衰期延长肽。
13.根据权利要求18所述的方法，其中所述半衰期延长肽选自由能够结合以下物质的分子组成的组：新生儿Fc受体(FcRn)、转铁蛋白、白蛋白(HAS)、
Figure FDA0002506992860000021
或PEG、高氨基酸聚合物(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)或弹性蛋白样肽(ELP)、透明质酸、带负电荷的高唾液酸化肽诸如绒毛膜促性腺激素(CG)β-链的羧基末端肽(CTP)、人IgG和CH3(CH2)nCO-，其中n为8至22。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物防御素与益生元、益生菌、色氨酸、短链脂肪酸、糖皮质激素、环孢霉素、抗TNF-α、整合素、抗生素、免疫抑制剂、排泄物移植物、辐射或这些的组合联合施用。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每日剂量介于每天0.1与10mg防御素/kg之间，诸如介于0.5与5mg防御素/kg之间，诸如介于1与2mg防御素/kg之间，诸如1.2mg防御素/kg。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述防御素一天至少一次施用，诸如一天至少两次，诸如一天至少三次，诸如一天至少四次，诸如一天五次，或连续施用。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用是口服、颊、舌下、直肠、阴道、气管内、肺内、鼻内、颅内、皮下、静脉内、皮肤或经皮的。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用是口服、皮下、肺内或皮肤/经皮的。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肺内、气管内或鼻内施用是通过吸入器、雾化器或汽化器进行的。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者具有一种或多种选自以下的症状：重度肠和肝脏炎症(例如，以腹痛、恶心、呕吐和黄疸为特征)以及粘膜防御丧失、细胞因子风暴、体重减轻、败血症、皮疹、瘙痒和发红。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述症状中的一种或多种在治疗后得到改善。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗降低死亡率并增加长期存活。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗通过使组织细胞因子产生正常化而使免疫系统再平衡并预防或治疗细胞因子风暴。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过使肠中粘膜防御或髓过氧化物酶活性正常化而治疗肠通透性和败血症。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中呼吸系统并发症、肺活量、肺炎症和败血症被治疗。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中组织学上的肺炎症、支气管周围和血管周围的炎症以及炎症细胞向支气管肺泡灌洗液中的迁移被减少。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中肺和皮肤的炎症和纤维化，诸如闭塞性细支气管炎和硬皮病，被治疗或预防。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中基因丰富度、门数、细菌的存在、细菌的丰度和/或短链脂肪酸的产生和/或丁酸盐的产生是增加的，和/或其中从所述患者的肠道或肺微生物群产生的乙酸盐是减少的。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者的肠或肺或皮肤中的正常微生物群被成熟、维持或稳定化。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者的肠或肺中的别样棒菌属(Allobaculum)、Alloprevotella、阿克曼菌属(Akkermansia)、巴恩斯氏菌(Barnesiella)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、毛螺菌属(Lachnospira)、罗氏菌属(Rothia)和韦永氏球菌属(Veillonella)的丰度被增加。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者的食物摄取和体重被增加。
32.一种供根据前述权利要求中任一项所述的治疗方法中使用的防御素多肽。
33.防御素多肽在制备用于治疗如前述权利要求中任一项定义的病症的药物中的用途。
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