CN111732642A

CN111732642A - 免疫球蛋白结合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN111732642A
Application number: CN202010747812.8A
Authority: CN
Inventors: 江必旺; 程雷
Original assignee: Suzhou Nanomicro Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Nanomicro Technology Co ltd
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2040-07-30
Also published as: CN111732642B; WO2022021541A1

Abstract

本发明涉及免疫球蛋白分离纯化技术领域，具体而言，涉及一种免疫球蛋白结合蛋白及其应用。所述免疫球蛋白结合蛋白由葡萄球菌蛋白A的E、C和Z‑domain拼接得到，并意外获得了抗体载量的提升和耐碱特性，进而可用于免疫球蛋白的亲和层析。

Description

免疫球蛋白结合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及免疫球蛋白分离纯化技术领域，具体而言，涉及一种免疫球蛋白结合蛋白及其应用。

背景技术

随着生物技术的出现和发展，对疾病的预防和治疗发生了革命性的变革。如今的生物技术几乎渗透到我们生活的每一个角落，而在这其中针对于抗体的研究也成绩凸显。从多克隆抗体、单克隆抗体再到重组抗体，每一次技术的飞越都会给人们无限的惊喜。但是，像所有其他蛋白质药物一样，抗体的生产技术、生产规模以及纯化技术是制约抗体生产的重要技术环节。而抗体纯化技术又成为了关键，纯化技术的好与坏，规模的大与小，往往决定了一个抗体药物生产的生命力。

将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法，利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术。

亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。此法具有高效、快速、简便等优点。

葡萄球菌蛋白 A（staphylococcus protein A，SPA）含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域，它是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞壁中的一种组成蛋白，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，是医院中交叉感染中常见的一种化脓感染菌，菌体直径约为 0.8µm，呈小球型，因聚堆呈葡萄串型而得名。SPA能够结合很多哺乳动物IgG抗体（常常是Fc段），因而是最早应用于亲和层析并进行抗体纯化的蛋白之一。

但是，由于SPA其本身也是一种蛋白，因而在亲和吸附及洗脱时的理化性质要求较高，特别对碱性试剂的耐性较差，并且其结合抗体的载量也常常不甚理想。

发明内容

本发明涉及一种免疫球蛋白结合蛋白，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种蛋白多聚体，其含有两个或多个SEQID NO:1所示的重复单元。

本发明还涉及所述免疫球蛋白结合蛋白及蛋白多聚体相关的核酸、载体、宿主细胞及生产方法。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及一种亲和层析介质以及含有所述亲和层析介质的亲和层析分离装置，所述层析介质包括固相载体和接枝于所述固相载体上的配基；

所述配基为如上所述的免疫球蛋白结合蛋白或如上所述的蛋白多聚体。

本发明还涉及上述产品从液体介质分离或富集免疫球蛋白的用途。

所述免疫球蛋白结合蛋白由葡萄球菌蛋白 A的E、C和Z-domain拼接得到，并意外获得了抗体载量的提升和耐碱特性，进而可用于免疫球蛋白的亲和层析。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中纯化得到的蛋白多聚体的电泳图；

图2为本发明一个实施例中突变前G-Z-E-1的层析图谱；

图3为本发明一个实施例中突变后G-Z-E-2的层析图谱。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

免疫球蛋白结合蛋白可与免疫球蛋白的Fc段结合。

在本发明中，“免疫球蛋白”此技术术语是结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区（CDR区）的一切蛋白及蛋白片段，特别是包含Fc段的全长抗体或其变体。“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体。包含Fc段的变体是本领域所公知的，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。优选为IgG（IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）、IgA及IgM中的至少一种。此外，“免疫球蛋白”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。

“免疫球蛋白”的Fc段可以来自包括人类及所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物，优选哺乳动物，更优选为：猪、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠、及牛。

在一些实施方式中，“免疫球蛋白”也可以是融合蛋白。

“免疫球蛋白”优选为抗体药物，特别是单克隆抗体药物，药物的实例可以选自如下所示的抗体或它们组成的组：

抗GD2抗体3F8、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、ACZ885 (卡那单抗(canakinumab))、阿达木单抗（Adalimumab)、阿德木单抗（Adecatumumab)、阿非莫单抗（Afelimomab)、阿托珠单抗（Afutuzumab)、培化阿珠单抗（Alacizumab pegol)、阿仑单抗（Alemtuzumab)、喷替酸阿妥莫单抗（Altumomab pentetate)、麻安莫单抗（Anatumomabmafenatox)、安芦珠单抗（Anrukinzumab) (IMA-638)、阿泊珠单抗（Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗（Aselizumab)、阿替珠单抗(Atezolizumab)、阿托木单抗（Atorolimumab)、阿维单抗（Avelumab）、巴匹珠单抗（Bapineuzumab)、巴利昔单抗（Basiliximab)、巴土昔单抗（Bavituximab)、贝妥莫单抗（Bectumomab)、贝利木单抗（Belimumab)、桕替莫单抗（Bertilimumab)、贝索单抗（Besilesomab)、贝伐单抗（Bevacizumab)、比西单抗(Biciromab)、比伐单抗-DMl(Bivatuzumab mertansine)、兰妥莫单抗(Blinatumomab)、Brentuximab vedotin、Briakinumab、卡那单抗（Canakinumab)、美坎珠单抗（Cantuzumab mertansine)、卡罗单抗喷地妝（Capromab pendetide)、卡妥索单抗（Catumaxomab)、西利珠单抗（Cedelizumab)、培舍珠单抗（Certolizumabpegol)、西妥昔单抗（Cetuximab)、泊西他珠单抗（Citatuzumabbogatox)、西妥木单抗（Cixutumumab)、克立昔单抗（Clenoliximab)、Clivatuzumab tetraxetan、CNTO148 (戈利木单抗（golimumab))、CNTO 1275 (优特克单抗（ustekinumab))、可那木单抗（Conatumumab)、达西珠单抗（Dacetuzumab)、达克珠单抗（Daclizumab)、地诺单抗（Denosumab）、地莫单抗（Detumomab)、阿托度单抗（Dorlimomabaritox)、Dorlixizumab、度伐单抗（durvalumab）、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗（Edrecolomab)、依法珠单抗（Efalizumab)、依夫单抗（Efungumab)、艾西莫单抗（Elsilimomab)、培戈赖莫单抗(Enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(Epitumomabcituxetan)、依帕珠单抗（Epratuzumab)、厄利珠单抗（Erlizumab)、厄马索单抗(Ertumaxomab)、埃达珠单抗（Etaracizumab)、艾韦单抗（Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗（Faralimomab)、非维珠单抗（Felvizumab)、非扎奴单抗(Fezakinumab)、芬妥木单抗（Figitumumab)、芳妥珠单抗（Fontolizumab)、福拉韦单抗(Foravirumab)、夫苏木单抗（Fresolimumab)、力口利昔单抗（Galiximab)、GantenerumabΛ加维莫单抗（Gavilimomab)、吉妥珠单抗奥佐米星（Gemtuzumabozogamicin)、戈利木单抗（Golimumab)、戈利昔单抗（Gomiliximab)、Ibalizumab、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、伊戈伏单抗（Igovomab)、英西单抗（Imciromab)、英利昔单抗（Infliximab)、英妥木单抗（Intetumumab)、伊诺莫单抗（Inolimomab)、伊珠单抗奥佐米星（Inotuzumabozogamicin)、伊匹木单抗（Ipilimumab)、伊妥木单抗（Iratumumab)、凯利昔单抗（Keliximab)、拉贝珠单抗（Labetuzumab)、来金珠单抗（Lebrikizumab)、来马索单抗（Lemalesomab)、乐地单抗（Lerdelimumab)、来沙木单抗（Lexatumumab)、利韦单抗（Libivirumab)、林妥珠单抗（Lintuzumab)、鲁卡木单抗（Lucatumumab)、鲁昔单抗（Lumiliximab)、马帕木单抗（Mapatumumab)、马司莫单抗（Maslimomab)、马妥珠单抗（Matuzumab)、美泊利单抗（Mepolizumab)、美替木单抗（Metelimumab)、米拉珠单抗（Milatuzumab)、明瑞莫单抗（Minretumomab)、米妥莫单抗（Mitumomab)、莫罗木单抗（Morolimumab)、莫他珠单抗（Motavizumab)、莫罗单抗-CD3(Muromonab_CD3)、MY0-029 (司他莫单抗（stamulumab))、他那可单抗（Nacolomabtafenatox)、他那莫单抗(Naptumomabestafenatox)、那他珠单抗（Natalizumab)、奈巴库单抗（Nebacumab)、奈昔木单抗（Necitumumab)、奈瑞莫单抗（Nerelimomab)、尼妥珠单抗（Nimotuzumab)、纳武单抗（Nivolumab）、巯诺莫单抗（Nofetumomab merpentan)、奥瑞珠单抗（Ocrelizumab)、奥度莫单抗（Odulimomab)、奥法木单抗（Ofatumumab)、奥马珠单抗（Omalizumab)、莫奥珠单抗（Oportuzumabmonatox)、奥戈伏单抗（Oregovomab)、奥昔珠单抗（Otelixizumab)、帕昔单抗（Pagibaximab)JQ利珠单抗（Palivizumab)、帕木单抗（Panitumumab)、帕诺库单抗（Panobacumab)、帕考珠单抗（Pascolizumab)、派姆单抗（Pembrolizumab）、帕尼单抗（Pemtumomab)、培妥珠单抗（Pertuzumab)、培克珠单抗（Pexelizumab)、平妥莫单抗（Pintumomab)、普立昔单抗（Priliximab)、普立木单抗（Pritumumab)、PRO 140、雷韦单抗（Rafivirumab)、雷莫芦单抗（Ramucirumab)、雷珠单抗（Ranibizumab)、雷昔库单抗（Raxibacumab)、瑞加韦单抗（Regavirumab)、瑞利珠单抗（Reslizumab)、利妥木单抗（Rilotumumab)、利妥昔单抗（Rituximab)、罗妥木单抗（Robatumumab)、罗利珠单抗（Rontalizumab)、罗维珠单抗（Rovelizumab)、鲁利珠单抗（Ruplizumab)、沙妥莫单抗（Satumomab)、司韦单抗（Sevirumab)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗（Sifalimumab)、司妥昔单抗（Siltuximab）、西利珠单抗（Siplizumab)、苏兰珠单抗（Solanezumab)、索耐珠单抗（Sonepcizumab)、松妥珠单抗（Sontuzumab)、司他芦单抗（Stamulumab)、硫索单抗（Sulesomab)、他珠单抗（Tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗（Tadocizumab)、他利珠单抗（Talizumab)、他尼珠单抗（Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)、替非珠单抗（Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、替妥莫单抗（Tenatumomab)、替奈昔单抗（Teneliximab)、替利珠单抗（Teplizumab)、TGN1412、替西木单抗（Ticilimumab)、曲美木单抗（tremeIimumab)、替加珠单抗(Tigatuzumab)、TNX-355 (伊巴珠单抗（ibalizumab))、TNX-650、TNX-901 (他利珠单抗(talizumab))、托珠单抗(Tocilizumab)、托利珠单抗（Toralizumab)、托西莫单抗（Tositumomab)、曲妥珠单抗（Trastuzumab)、曲美木单抗（Tremelimumab)、西莫白介素单抗(Tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗（Tuvirumab)、乌珠单抗（Urtoxazumab)、优特克单抗（Ustekinumab)、伐利昔单抗（Vapaliximab)、维多珠单抗（Vedolizumab)、维妥珠单抗（Veltuzumab)、维帕莫单抗（Vepalimomab)、维西珠单抗（Visilizumab)、伏洛昔单抗（Volociximab)、伏妥昔单抗（Votumumab)、扎芦木单抗（Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、齐拉木单抗（Ziralimumab)以及阿佐莫单抗(Zolimomab aritox)。

在一些实施方式中，所述免疫球蛋白结合蛋白的第25位氨基酸E替换为A，第27位氨基酸R替换为K。

突变后的氨基酸更容易洗脱。突变之前洗脱pH约为3.0，突变后洗脱pH约为3.5。

在一些实施方式中，所述免疫球蛋白结合蛋白的第46位氨基酸G替换为A。

将不耐碱的甘氨酸突变成丙氨酸，会更有利于维持所述免疫球蛋白结合蛋白的耐碱特性。

在一些实施方式中，所述蛋白多聚体含有4、5、6、7或8个所述重复单元。

在一些实施方式中，所述蛋白多聚体N端还具有末端偶联基团。

在一些实施方式中，所述末端偶联基团包含精氨酸和/或半胱氨酸。

容易理解，本发明还请求保护与所述免疫球蛋白结合蛋白或所述蛋白多聚体实质上相同的蛋白，这样的蛋白与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或至少约99％同一性的序列，且保留特异性结合免疫球蛋白的功能；更进一步的，这样的蛋白在0.5mol/L NaOH中25℃浸泡24h后仍然能够特异性结合免疫球蛋白并可后续将其洗脱，并可保持约56mg/ml的载量。

本发明还涉及核酸，其编码如上所述的免疫球蛋白结合蛋白或如上所述的蛋白多聚体。

本发明还涉及载体，其包含如上所述的核酸。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和其他表达控制元件（例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等）。

在一些实施方式中，本发明所述载体中还可以包含筛选所用的基因（例如抗生素抗性基因）、用于生成荧光蛋白的核酸等片段。荧光蛋白可以选择绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或红色荧光蛋白。

本发明还涉及宿主细胞，其包含如上所述的核酸或如上所述的载体。

术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞优选为原核细胞，更优选为大肠杆菌，例如E.coli BL（DE3）。

本发明还涉及生产如上所述的免疫球蛋白结合蛋白或如上所述的蛋白多聚体的方法，包括：

在合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞；以及

从培养基中或从所培养的细胞中回收如此产生的免疫球蛋白结合蛋白或蛋白多聚体。

本发明还涉及一种亲和层析介质，所述层析介质包括固相载体和接枝于所述固相载体上的配基；

在一些实施方式中，所述固相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、磁珠、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、琼脂糖、硅、陶瓷、环糊精、壳聚糖、角叉菜胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、印度胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、肝硫酯、明胶、聚氨酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇对苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的任一种，或任意几种形成的共聚物。

固相载体可以根据应用选择合适的形状，形式，材料和变型。该固相载体表面可以是基本平坦的或平面的。也可以是圆形等形状。该固相载体表面的形状包括但不限于孔，凹陷，柱，脊，通道，膜或类似物。固相载体优选表面基本平坦的颗粒物。颗粒物的形状优选为球形或者基本球形。

进一步的，所述固相载体可为无孔的，但优选包括一个或多个孔隙，更优选为多孔的网状结构，使大分子能自由通过。在一些实施方式中，孔径为300～5000 Å；在本发明中，“无孔”是指基体支持物没有明显可以测量到的孔，例如孔径 ≤20 Å。

在一些实施方式中，所述固相载体是可被活化的，活化的基本原理是利用中间化合物（例如CNBr）将固相载体表面的某些基团（如羟基等）进行覆盖并赋予载体表面新的化学基团（例如-CN），这样新的基团就可以与亲和配体进行共价的反应达到共价连接的目的。

因此，容易理解，固相载体的表面还可以被修饰有用于活化的基团，例如环氧基、氨基、醛、羟基、羧基、氧代基团和硫醇基团中的至少一种。修饰位点通常还包含具有这些相应化学官能团的衍生基团。

本发明还涉及亲和层析分离装置，其含有如上所述的亲和层析介质。

亲和层析分离装置可以为SPE固相萃取柱，带分离膜的离心管，分离膜（membranes），快速检测生物芯片（bio-chips），纤维束柱，整体柱及常规分析级或制备级层析色谱柱等。

本发明还涉及如上所述的亲和层析介质，或如上所述的亲和层析分离装置用于从液体介质分离或富集免疫球蛋白的用途。

在一些实施方式中，所述用途包括至少一步与碱性条件下处理所述亲和层析介质或所述亲和层析分离装置的步骤。

在一些实施方式中，碱性条件应当在0.5mol/L NaOH所提供的pH附近，例如7~14，或10~14，或12~14，或13~14，或13.5~14。碱性条件处理时间可以为24h以内，例如8h、16h或20h。

在一些实施方式中，所述液体介质为包含免疫球蛋白的样品或它们经过稀释后的溶液。任何包含免疫球蛋白的样品均可以用在本发明中。包含免疫球蛋白的样品可以包含例如细胞培养物（特别是细胞培养物上清）、血液提取物（特别是血清提取物）以及腹水（例如大鼠、小鼠、兔、羊、马、牛、骆驼等动物的腹水）。作为实例，可以在搅动罐生物反应器中在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达抗体。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1蛋白多聚体的制备

工程菌表达：

本实验所有的基因合成工作，均委托南京金斯瑞完成，表达菌株E.coli BL（DE3）。

本实施例所制备的蛋白多聚体为六段重复，其单体通过将E-domain、C-domain以及Z-domain的部分片段拼接后得到：

E-domain

AQHDEAQQNA FYQVLNMPNL NADQRNGFIQ SLKDDPSQSA NVLGEAQKLN DSQAPK

D-domain

ADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK

A-domain

ADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPK

B-domain

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK

C-domain

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK

Z-domain

VDNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLNEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK

所得单体的序列为：

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDP SQSA NVLGEAQKLN DSQAPK（SEQ IDNO:1）

蛋白多聚体（C-Z-E-1）序列为：

MADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDP SQSA NVLGEAQKLN DSQAPK

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDP SQSA NVLGEAQKLN DSQAPK

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDP SQSA NVLGEAQKLN DSQAPKCK

为进一步提高耐碱特性，将不耐碱的甘氨酸突变成丙氨酸，所得蛋白多聚体（C-Z-E-2）序列为：

MADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDP SQSA NVLAEAQKLN DSQAPK

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDP SQSA NVLAEAQKLN DSQAPK

ADNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDP SQSA NVLAEAQKLN DSQAPKCK

同时设计C-Z-A的六段重复序列及D-E的六段重复序列作为对比序列：

C-Z-A

VDNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANVLAEAQK LNDSQAPK

六段重复序列

MVDNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANVLAEAQK LNDSQAPK

VDNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANVLAEAQK LNDSQAPK

VDNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANVLAEAQK LNDSQAPKCK

D-E

ADAQQNNFNKDQQSAFYEILHLPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSA NVLAEAQKLN DSQAPK

六段重复序列

MADAQQNNFNKDQQSAFYEILHLPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSA NVLAEAQKLN DSQAPK

ADAQQNNFNKDQQSAFYEILHLPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSA NVLAEAQKLN DSQAPK

ADAQQNNFNKDQQSAFYEILHLPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSA NVLAEAQKLN DSQAPKCK

备注：同样把不耐碱的甘氨酸突变成丙氨酸

1.质粒的转化：

1) 取0.03ml感受态细胞转和4ng质粒DNA混匀，置冰浴30min。

2) 将 Ep管置于42℃水浴中热冲击2分钟，立即置于冰上1分钟。

3) 在 Ep管中加70u1 LB培养基混匀，37℃培养30min。

4) 涂在含适当浓度抗生素的LB平板上。

5) 37℃培养过夜，长出的菌斑既为阳性克隆。

2.细菌发酵：

1) 配置两个50ml的LB培养基的小摇瓶，放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃，30min灭菌。灭菌结束冷却后于超净台上加入经除菌过滤的抗生素。挑平板培养的单克隆菌，接入小摇瓶中，放置于摇床培养，摇床设定37℃，250rpm。培养约8小时后待用。

2) 7L发酵罐的培养基配置完成后，pH电极校准后，把pH电极和溶氧电极装到发酵罐上，连同罐体一同放入灭菌锅灭菌。补料配置好后同样放入灭菌锅灭菌。

3) 把灭好菌的发酵罐跟搅拌电机连接好后，用蠕动泵先打入100g补料，用氨水调节pH至7.0，然后设置初始通气和搅拌，待溶氧数值稳定后，溶氧校100%。

4) 取小摇瓶培养的菌100UL，用无菌注射器从接种口接种到发酵罐内，溶氧自控设定为40%，打开搅拌和溶氧联动，开始培养。待自动培养到溶氧开始快速上升时开始补料，并开始通入氧气，此时关闭搅拌和溶氧联动并打开氧气和溶氧联动，补料5小时后加入IPTG诱导，诱导至补料全部消耗完。

5) 发酵液离心后得到菌泥，冷冻保存。

3. 配基纯化：

1）菌体的溶解：按菌体（湿重）：菌体破碎液=1:10（kg：L）将菌体溶解于菌体破碎液中，至无可见的块状菌体

2）破菌：使用高压均质机破碎已溶解的菌体，破碎压力800±100bar，破碎次数2次

3）第一次去除杂蛋白：将已破碎的菌体pH调节至2.0±0.2，离心后收集离心上清液

4）第二次去除杂蛋白：将第一次离心的上清液pH调节至4.2±0.1，离心后收集离心上清液

5）UNiGEl 80SP层析：

上样液处理：将第二次离心的上清液pH调节至4.1±0.05，使用0.45μm的滤膜过滤

上样：将过滤后的上样液上样，上样体积流速（20ml/min）

上样后平衡：A液冲洗3CV以上至UV280值趋平

洗杂：洗杂液冲洗2CV

洗脱：洗脱液液冲洗，起峰收集：UV280值50±10mAU~50±10mAU

再生：B液冲洗2CV以上至UV280值趋平

CIP：1M NaOH清洗10分钟

水洗：纯化水清洗2CV

保存：10mM NaOH冲洗至少1CV

缓冲液配方：

实施例2Protein A亲和填料的制备

活化

1.准确量取300ml 2mol/L NaOH溶液，将溶液与抽干后的200g PMMA微球充分混合后倒入反应釜中，打开搅拌电机设定转速200rpm，设定水浴锅温度40℃，密封反应30min。

2.准确量取125ml二甲基甲酰胺与75ml 1,4-丁二醇缩水甘油醚入反应釜中，密封反应2.5h。

3. 取下反应釜，将微球混合物倒入抽滤漏斗中抽干，并用2CV去离子水清洗。再分别用2CV酒精与去离子水清洗，抽干至不滴水。

偶联

1. 准确称取活化后的微球10g，置于洗净干燥过的锥形瓶中。

2. 称取配基0.3g，使用12.8ml缓冲液充分溶解。在微球中加入一定量的硫酸钠固体使其终浓度为1-1.5 mol/L，将蛋白液与硫酸钠加入装有10g微球的锥形瓶中并充分混匀。

3. 使用5mol/L NaOH与50%磷酸调节微球混合物pH值到8.5（误差在0.1左右），往锥形瓶中通入过量氮气后用封口膜封好锥形瓶并放入摇床中，设定摇床温度37℃，转速180rpm，反应10-15h。

封尾

1. 将偶联后的微球倒入抽滤瓶中并用2CV去离子水洗涤，将微球转移至锥形瓶中，加入适量与微球同体积的0.2mol/L Na₂CO₃，加入终浓度1%-10%的巯基甘油，调节pH到9.0后，反应4 h-8h。

2. 反应后的球分别使用2CV去离子水与2CV0.1-0.5M NaOH洗涤，抽干后保存在20%乙醇中，放入4℃冰箱保存备用。

实施例3 Protein A亲和填料的制备

耐碱性测试

对键合好的微球进行载量测量前期需要进行准备工作：

1、配制缓冲液：缓冲液的配制方法为150 mm NaCl和20 mm PB， pH值为7.0。配制好缓冲液后，需要用滤膜进行过滤，过滤之后方可使用。

2、配制抗体：正常配制抗体的比例为抗体（多抗）：缓冲液=1:24。用体积适合的量筒量取10ml抗体置于烧杯中，然后量取190ml的过滤后的缓冲液加入烧杯中，混合均匀，然后用注射器注入上样环中，并且排空上样环中的气泡。

3、装柱：测试所使用的柱子为1 ml PP柱，先对微球进行匀浆，把微球匀浆到合适的水溶比，让匀浆液看起来既不很粘稠，也不很稀，然后用滴管缓慢滴入柱管中，柱管下端用注射器缓慢抽取，让球缓慢沉积，沉积到1 ml左右的时候，停止滴入，然后放入上筛板，并用柱塞塞紧。然后把装好的柱子用亲和A液进行平衡，当UV线平，且数值不变的时候，平衡结束。

4、测载量：仪器SCG 抗体浓度：2.15mg/ml 流速：0.2ml/min

测量结束后，把载量图保存起来，然后用0.5mol氢氧化钠通入柱子中，通入碱的体积大概在30ml，通过碱之后，把柱子放在25℃恒温箱中，保存24h，24h之后，再用同一抗体再次进行测其载量，洗脱的pH均为3.0。

在上述条件下检测将甘氨酸突变成丙氨酸对G-Z-E六聚体载量的影响，突变前G-Z-E-1的层析图谱如图2所示，突变后G-Z-E-2的层析图谱如图3所示。从图2中可以看出，突变前，碱处理后载量约为碱处理前的74%。图3中可以看出，突变后载量碱处理后载量约为碱处理前的94%。即突变后G-Z-E六聚体对碱处理的抗性大大提升。

在上述条件下针对C-Z-E-2组合、C-E-A组合、D-E组合的测量数值如下表所示（10%DBC）：

注：碱处理是微球在0.5mol/L NaOH中25℃浸泡24h后的多抗的10%DBC（动态载量）结果与未浸泡微球载量的比值。

为使抗体更容易洗脱，将第25位氨基酸E替换为A，第27位氨基酸R替换为K：

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测试方法按照实施例3进行，不同之处仅在于，将洗脱的pH由3.0变为3.5。

由上可知，突变后的C-Z-E-3更容易被洗脱，但耐碱性和载量几乎未发生改变。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州纳微科技股份有限公司

<120> 免疫球蛋白结合蛋白及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

Claims

1.一种免疫球蛋白结合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白结合蛋白，其特征在于，其第25位氨基酸E替换为A，第27位氨基酸R替换为K。

3.根据权利要求1或2所述的免疫球蛋白结合蛋白，其特征在于，其第46位氨基酸G替换为A。

4.一种蛋白多聚体，其特征在于，含有两个或多个权利要求1所述的免疫球蛋白结合蛋白重复单元。

5.根据权利要求4所述的蛋白多聚体，其特征在于，含有4、5、6、7或8个所述重复单元。

6.根据权利要求4或5所述的蛋白多聚体，其特征在于，其N端还具有末端偶联基团。

7.根据权利要求6所述的蛋白多聚体，其特征在于，所述末端偶联基团包含精氨酸和/或半胱氨酸。

8.核酸，其特征在于，其编码权利要求1~3任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或权利要求4~7任一项所述的蛋白多聚体。

9.载体，其特征在于，其包含权利要求8所述的核酸。

10.宿主细胞，其特征在于，其包含根据权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的载体。

11.生产权利要求1~3任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或权利要求4~7任一项所述的蛋白多聚体的方法，其特征在于，包括：

在合适的培养条件下培养权利要求10所述的宿主细胞；以及

12.一种亲和层析介质，其特征在于，所述层析介质包括固相载体和接枝于所述固相载体上的配基；

所述配基为权利要求1~3任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白或权利要求4~7任一项所述的蛋白多聚体。

13.根据权利要求12所述的亲和层析介质，其特征在于，所述固相载体选自皂土、玻璃微球、石英微球、磁珠、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、琼脂糖、硅、陶瓷、环糊精、壳聚糖、角叉菜胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、印度胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、肝硫酯、明胶、聚氨酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇对苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的任一种，或任意几种形成的共聚物。

14.亲和层析分离装置，其特征在于，其含有权利要求12～13任一项所述的亲和层析介质。

15.权利要求12~13任一项所述的亲和层析介质，或权利要求14所述的亲和层析分离装置用于从液体介质分离或富集免疫球蛋白的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述液体介质选自细胞培养物、腹水或血液提取物，或它们经过稀释后的溶液。