CN111721937A

CN111721937A - 人附睾蛋白4免疫比浊试剂盒

Info

Publication number: CN111721937A
Application number: CN202010228696.9A
Authority: CN
Inventors: 果玮; 刘瑶; 刘希
Original assignee: Beijing Strong Biotechnologies Inc
Current assignee: Beijing Strong Biotechnologies Inc
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2040-03-27
Also published as: CN111721937B

Abstract

本申请涉及人附睾蛋白4免疫比浊试剂盒。所述试剂盒采用包被有人附睾蛋白4抗体的胶乳，与待测人附睾蛋白4发生连锁反应，引起浊度明显变化，从而能够通过光透射强度或光散射强度检测该变化；通过标准曲线得出样本中目标检测物人附睾蛋白4的浓度。本申请还提供一种改进的包被方法，在抗体包被过程中加入稳定剂使得所得包被有抗体的胶乳颗粒具有更好的稳定性。本申请的试剂盒灵敏度高、稳定性好、可适用于全自动生化分析仪。

Description

人附睾蛋白4免疫比浊试剂盒

本申请要求2019年3月29日提交的中国专利申请201910248493.3的优先权。

技术领域

本申请属于医学、免疫体外诊断领域，涉及一种胶乳颗粒增强型人附睾蛋白4检测试剂盒。

背景技术

人附睾蛋白4一种分子量较小的酸性的、显示分泌蛋白特性的多肽，属于一种蛋白酶抑制剂，在组织免疫系统中发挥着极其重要的作用。

卵巢癌是女性生殖系统常见的肿瘤之一，尽管其发病率低于子宫颈癌和子宫体癌而位居第三，而死亡率却高居首位约2/3的卵巢癌患者初诊时已属晚期，治疗效果差，行剖腹探查术中发现卵巢癌肿瘤局限于卵巢的仅占30％，5年生存率20％至36.1％。因此，采取有效的诊断方法，在手术前确定患者是否具有卵巢恶性肿瘤的高风险性至关重要CA125是目前卵巢癌应用最广泛的肿瘤标志物，但其在卵巢癌早期敏感性较低，部分卵巢良性肿瘤患者也出现非特异性升高，而人附睾蛋白4(HE4)是一种新的卵巢癌标志物，在卵巢癌早期诊断方面具有较高特异性和敏感性，近年来国外多中心研究表明利用CA125和人附睾蛋白4的检测值建立的卵巢癌风险预测模(ROMA)可用于评估绝经前和绝经后的盆腔肿瘤妇女患有上皮细胞型卵巢癌风险。

人附睾蛋白4与CA125相似，超过80％的卵巢上皮癌患者的血清人附睾蛋白4升高，人附睾蛋白4在所有卵巢子宫内膜样腺癌93％的卵巢浆液性腺癌及50％的卵巢透明细胞癌中高表达多项研究表明人附睾蛋白4在鉴别女性盆腔包块良恶性优于CA125，并有研究显示在确诊卵巢癌前1年，即可检测出人附睾蛋白4血清水平的变化，其可能成为用于卵巢癌早期筛查的工具。2010年美国食品与药品管理局(FDA)已批准人附睾蛋白4用于诊断及监测晚期卵巢上皮癌和复发的卵巢癌。

目前仅有少数研究中心将人附睾蛋白4用于临床，且在参考区间上各研究结果未达成一致。有报道，绝经前女性在内的人附睾蛋白4中位数为89pmol/L，绝经后为128pmol/L，所有女性的人附睾蛋白4中位数为115pmol/L，妊娠期女性较低，并随年龄增加而升高。另有报道将70pmol/L及150pmol/L作为人附睾蛋白4的阳性阈值。

CA-125一直是监测卵巢癌的基本指标，但并非所有患者CA-125都升高，CA-125在疾病早期也不一定会显著提高，且CA-125还可在非癌症状况中出现升高。基于CA-125的以上缺点，医学界一直致力于寻找敏感性和特异性更高的肿瘤标志物。

目前仍无能够从无症状妇女中早期检测出卵巢癌的可靠方法，只有不到20％的卵巢癌在未扩散至卵巢外前被发现。导致此现象的原因之一是卵巢癌的症状十分不典型。因此，常规体检、盆腔检查、家族史及其他危险因素对卵巢癌的检出都有重要价值。

联合检测人附睾蛋白4和CA-125可以通过信息互补，从而为卵巢癌的疗效和复发提供更好的监测系统。患者以治疗前的人附睾蛋白4和CA-125含量为基线，在治疗期间再进行定期检测，这样获得的系列数据可显示该指标升高或下降变化趋势，比单独检测一次得到的结果更可靠。联合检测两种肿瘤标志物在诊断卵巢癌中有较高的特异度及敏感度获益，敏感度较单一检测CA125提高了33.1％，较人附睾蛋白4提高了3.5％。对Ⅰ期卵巢癌，人附睾蛋白4作为单一肿瘤标志物优于CA125，而在Ⅱ至Ⅳ期卵巢癌中，CA125与人附睾蛋白4都会升高。

人附睾蛋白4的测定通常采用免疫放射分析(IRMA)法、酶联免疫分析(ELISA)法、化学发光法(CLIA)与电化学发光免疫分析(ECLIA)法。目前主流的检测方法是化学发光法，化学发光法灵敏度高、特异性强，但试剂必须使用配套仪器，通用性较差。试剂及配套仪器价格昂贵，检测通量小，不适用于基层医院，且对患者经济带来交大负担。

因此，很有必要开发一种可定量的、适用于全自动生化分析仪的人附睾蛋白4试剂。目前现有技术中还没有人附睾蛋白4胶乳免疫比浊试剂，该领域需要一种灵敏度高，生产工艺稳定的胶乳免疫比浊试剂来降低检测成本，提高检测速度。

发明内容

根据本申请的一些实施方案，提供了一种人附睾蛋白4胶乳增强免疫比浊试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂；

所述第一试剂包含：

20mM至200mM，pH 6至9的缓冲液、

50mM至500mM离散剂、

20mM至300mM盐离子、

按w/v计0.05％至10％稳定剂、

按w/v计0.1％至10％促聚剂、

按w/v计0.05％至5％表面活性剂、

按w/v计0.5％至5％阻断剂、

按w/v计0.05％至5％防腐剂；

所述第二试剂包含：

20mM至200mM，pH 6至9的缓冲液、

按w/v计0.02％至1％结合有人附睾蛋白4抗体的胶乳颗粒、

10μg/ml至100μg/ml人附睾蛋白4抗体、

按w/v计0.5％至10％稳定剂、

按w/v计0.05％至5％表面活性剂、

按w/v计0.05％至5％防腐剂。

在一些实施方案中，所述缓冲液选自以下的一种或其组合：甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、Hepes缓冲液、PIPES缓冲液，磷酸盐缓冲液、柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液。

在一些实施方案中，所述第一试剂中的缓冲液和所述第二试剂中的缓冲液是相同的、或不同的。

在一些实施方案中，所述离散剂选自以下的一种或其组合：硫氰酸钾、氯化胆碱。

在一些实施方案中，所述盐离子选自以下的一种或其组合：氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、硫酸镁。

在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下的一种或其组合：牛血清白蛋白、酪蛋白、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸盐、组氨酸盐、葡萄糖酸盐、蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖。

在一些实施方案中，所述促聚剂选自以下的一种或其组合：PEG2000、PEG4000、PEG8000、PEG12000、PEG20000。

在一些实施方案中，所述阻断剂选自以下的一种或其组合：小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠血清。

在一些实施方案中，所述表面活性剂选自以下的一种或其组合：聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基酰胺丙基甜菜碱、聚氧乙烯高级醇醚、月桂醇、胆酸钠、聚山梨酯20、聚山梨酯80。

在一些实施方案中，所述防腐剂选自以下的一种或其组合：叠氮钠、叠氮锂、PC300、烷基糖苷、MIT、对羟基苯甲酸、硫柳汞。

在一些实施方案中，其中所述人附睾蛋白4抗体源自：鼠、兔、羊、禽、骆驼科。

在一些实施方案中，所述人附睾蛋白4抗体包含第一人附睾蛋白4单克隆抗体和第二人附睾蛋白4单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述第一人附睾蛋白4单克隆抗体和所述第二人附睾蛋白4单克隆抗体靶向两种不同的人附睾蛋白4表位。

在一些实施方案中，所述第一人附睾蛋白4单克隆抗体和所述第二人附睾蛋白4单克隆抗体的物质的量之比是0.5:1至2:1，优选1:1。

在一些实施方案中，所述胶乳颗粒的平均粒径是250nm至400nm，优选250nm。

在一些实施方案中，所述胶乳颗粒是羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。

在一些具体的实施方案中，提供了一种人附睾蛋白4胶乳增强免疫比浊试剂盒，其中：

所述第一试剂包含：

所述第二试剂包含：

在一些实施方案中，提供了一种包被胶乳颗粒的方法，其包括步骤：

1)在含有稳定剂的第一溶液中，提供抗体；

2)在第二溶液中，提供胶乳颗粒；

3)在存在交联剂的条件下，将所述第一溶液和所述第二溶液接触，在28℃至40℃孵育0.5h至1.5h，获得包被有抗体的胶乳颗粒；优选地，将所述第一溶液和所述第二溶液接触，在37℃孵育1h；

4)任选地，对所述包被有抗体的胶乳颗粒进行封闭；

5)任选地，洗涤所述颗粒。

在一些实施方案中，步骤1)和步骤2)能够互换顺序或并行。

在一些实施方案中，所述第一溶液pH为7.0至8.0。

在一些实施方案中，所述第二溶液pH为5.5至7.0。

在一些实施方案中，所述交联剂选自：EDC、CMC、NHS、DSS、硫代-EMCS、EMCS、SMCC、硫代-SMCC或MBS。

在一些实施方案中，所述稳定剂在所述第一溶液中的浓度为按w/v计0.1％至2％。

在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下的一种或组合：氨基修饰的PPG、PEG、聚四氢呋喃醚二醇、BSA、吐温20、吐温80；优选1％至2％聚四氢呋喃醚二醇。

在一些具体的实施方案中，所述方法包括步骤：

1)在含有2％聚四氢呋喃醚二醇的pH 7.5缓冲液中，提供抗体；

2)在含有15μg/ml至25μg/ml EDAC的pH 6.0缓冲液中，提供平均粒径250nm至400nm的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒；

3)将步骤1)和步骤2)的所得溶液混合，在37℃孵育2小时；

4)加入封闭剂，在37℃孵育1小时；

5)收获包被有抗体的胶乳颗粒。

在一些实施方案中，提供了一种包被有抗体的胶乳颗粒，其是通过本申请的方法获得。

在一些实施方案中，提供了一种检测试剂，其包含通过本申请的包被方法获得的包被有抗体的胶乳颗粒。

附图说明

图1.本申请试剂盒和市售产品的相关性。

具体实施方式

实施例1.对照包被方法

将0.5％聚苯乙烯胶乳(250nm)溶液加入4.5ml 0.05M缓冲液(pH6.0)和20μg/mlEDAC，配制成胶乳颗粒混合液，于37℃静置1小时；

两种人附睾蛋白4抗体(各自包被)，用5ml 0.05M HEPES缓冲液(pH7.5)稀释后立即加入到上述缓冲液中，在37℃反应2小时；

加入1％封闭剂，搅拌1小时终止反应；

用100mM的缓冲液(pH7.0)洗涤，离心去上清，洗涤3次；

两种包被的胶乳颗粒，按照下述制备例中的期望比例混合，用保存缓冲液重悬胶乳微球使之分散成白色胶乳悬浮液；

其中，所述保存缓冲液的组成：

实施例2.测试包被方法1

两种人附睾蛋白4抗体(各自包被)，用5ml 0.05M HEPES缓冲液(pH7.5)稀释，再将稳定剂(2％聚四氢呋喃醚二醇)加入抗体中，充分混匀后加入前述胶乳颗粒混合液中，在37℃反应2小时；

加入1％封闭剂，搅拌1小时终止反应；

用100mM的缓冲液(pH7.0)洗涤，离心去上清，洗涤3次；

其中，所述保存缓冲液的组成同上。

实施例3.测试包被方法2

两种人附睾蛋白4抗体(各自包被)，用5ml 0.05M HEPES缓冲液(pH7.5)稀释，再将稳定剂(2％BSA)加入抗体中，充分混匀后加入前述胶乳颗粒混合液中，在37℃反应2小时；

加入1％封闭剂，搅拌1小时终止反应；

用100mM的缓冲液(pH7.0)洗涤，离心去上清，洗涤3次；

其中，所述保存缓冲液的组成同上。

制备例

制备例1：试剂盒1

按照以下组成制备试剂，并组装成试剂盒。

第一试剂：

第二试剂：

其中，胶乳颗粒为实施例2制备的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒；两株抗体比例为0.5：1。

制备例2：试剂盒2

按照以下组成制备试剂，并组装成试剂盒。

第一试剂：

第二试剂：

其中，胶乳颗粒为实施例2制备的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒，两株抗体比例为1：1。

制备例3：试剂盒3

按照以下组成制备试剂，并组装成试剂盒。

第一试剂：

第二试剂：

其中，胶乳颗粒为实施例2制备的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒，两株抗体比例为2：1。

制备例4：试剂盒4

按照以下组成制备试剂，并组装成试剂盒。

第一试剂：

第二试剂：

其中，胶乳颗粒为实施例3制备的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒，两株抗体比例为1：1。

制备例5：试剂盒5(即，对照试剂盒)

按照以下组成制备试剂，并组装成试剂盒。

第一试剂：

第二试剂：

其中，胶乳颗粒为实施例1制备的羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒，两株抗体比例为1：1。

测试例

测试例1.与市售化学发光试剂相关性

结果参见图1和表1。

表1.相关性(试剂盒2)

测试例2.精密度

表2.精密度(试剂盒2)

测试例3.线性

表3.线性(试剂盒3)

测试例4.包被方法对稳定性的影响

按照制备例2和制备例5配制试剂盒后，将其放置37℃温箱，放置3天和7天进行定标并测定血清。

37℃放置7天后，制备例2的吸光度变化及样本测值变化均优于制备例5的对照试剂盒。

表4.稳定性对比

Claims

1.一种人附睾蛋白4胶乳增强免疫比浊试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂；

所述第一试剂包含：

20mM至200mM，pH 6至9的缓冲液、

50mM至500mM离散剂、

20mM至300mM盐离子、

按w/v计0.05％至10％稳定剂、

按w/v计0.1％至10％促聚剂、

按w/v计0.05％至5％表面活性剂、

按w/v计0.5％至5％阻断剂、

按w/v计0.05％至5％防腐剂；

所述第二试剂包含：

20mM至200mM，pH 6至9的缓冲液、

按w/v计0.02％至1％结合有人附睾蛋白4抗体的胶乳颗粒、

10μg/ml至100μg/ml人附睾蛋白4抗体、

按w/v计0.5％至10％稳定剂、

按w/v计0.05％至5％表面活性剂、

按w/v计0.05％至5％防腐剂。

2.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4胶乳增强免疫比浊试剂盒，其中：

所述缓冲液选自以下的一种或其组合：甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、Hepes缓冲液、PIPES缓冲液，磷酸盐缓冲液、柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液；

任选地，所述第一试剂中的缓冲液和所述第二试剂中的缓冲液是相同的、或不同的。

3.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4胶乳增强免疫比浊试剂盒，其中：

所述离散剂选自以下的一种或其组合：硫氰酸钾、氯化胆碱；

所述盐离子选自以下的一种或其组合：氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、硫酸镁；

所述稳定剂选自以下的一种或其组合：牛血清白蛋白、酪蛋白、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸盐、组氨酸盐、葡萄糖酸盐、蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖；

所述促聚剂选自以下的一种或其组合：PEG2000、PEG4000、PEG8000、PEG12000、PEG20000；

所述阻断剂选自以下的一种或其组合：小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠血清；

所述表面活性剂选自以下的一种或其组合：聚氧乙烯烷基醚硫酸盐、烷基酰胺丙基甜菜碱、聚氧乙烯高级醇醚、月桂醇、胆酸钠、聚山梨酯20、聚山梨酯80；

所述防腐剂选自以下的一种或其组合：叠氮钠、叠氮锂、PC300、烷基糖苷、MIT、对羟基苯甲酸、硫柳汞。

4.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4胶乳增强免疫比浊试剂盒，其中所述人附睾蛋白4抗体源自：鼠、兔、羊、禽、骆驼科；

优选地，所述人附睾蛋白4抗体包含第一人附睾蛋白4单克隆抗体和第二人附睾蛋白4单克隆抗体；

优选地，所述第一人附睾蛋白4单克隆抗体和所述第二人附睾蛋白4单克隆抗体靶向两种不同的人附睾蛋白4表位；

所述第一人附睾蛋白4单克隆抗体和所述第二人附睾蛋白4单克隆抗体的物质的量之比是0.5:1至2:1，优选0.5:1、1:1、1.5:1或2：1。

5.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4胶乳增强免疫比浊试剂盒，其中：所述胶乳颗粒的平均粒径是250nm至400nm，优选250nm；

优选地，所述胶乳颗粒是羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。

6.根据权利要求1所述的人附睾蛋白4胶乳增强免疫比浊试剂盒，其中：

所述第一试剂包含：

所述第二试剂包含：

7.一种包被胶乳颗粒的方法，其包括步骤：

1)在含有稳定剂的第一溶液中，提供抗体；

2)在第二溶液中，提供胶乳颗粒；

3)在存在交联剂的条件下，将所述第一溶液和所述第二溶液接触，在28℃至40℃孵育0.5h至1.5h，获得包被有抗体的胶乳颗粒；

优选地，将所述第一溶液和所述第二溶液接触，在37℃孵育1h；

4)任选地，对所述包被有抗体的胶乳颗粒进行封闭；

5)任选地，洗涤；

步骤1)和步骤2)能够互换顺序或并行；

所述第一溶液pH为7.0至8.0；

所述第二溶液pH为5.5至7.0；

所述交联剂选自：EDC、CMC、NHS、DSS、硫代-EMCS、EMCS、SMCC、硫代-SMCC或MBS；

所述稳定剂在所述第一溶液中的浓度为按w/v计0.1％至2％；

所述稳定剂选自以下的一种或组合：氨基修饰的PPG、PEG、聚四氢呋喃醚二醇、BSA、吐温20、吐温80；优选1％至2％聚四氢呋喃醚二醇；

所述抗体源自：鼠、兔、羊、禽、骆驼科；

优选地，所述胶乳颗粒的平均粒径是250nm至400nm，优选250nm；

优选地，所述胶乳颗粒是羧基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒。

8.根据权利要求7所述的包被胶乳颗粒的方法，其中：

1)在含有2％聚四氢呋喃醚二醇的pH 7.5缓冲液中，提供抗体；

3)将步骤1)和步骤2)的所得溶液混合，在37℃孵育2小时；

4)加入封闭剂，在37℃孵育1小时；

5)收获包被有抗体的胶乳颗粒。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的人附睾蛋白4胶乳增强免疫比浊试剂盒，其中所述包被有人附睾蛋白4抗体的胶乳颗粒是通过权利要求7或8所述的方法获得。