CN111712511A - 澳瑞他汀e衍生物的白蛋白结合产物 - Google Patents

Abstract

本公开提供了澳瑞他汀E衍生物的白蛋白结合前药及其用途。

Description

澳瑞他汀E衍生物的白蛋白结合产物

本申请要求2017年11月30日提交的美国临时申请62/592,721的优先权，其全部公开内容通过引用并入本申请。

背景技术

低分子量抗癌药通常具有狭窄的治疗窗口，这限制了它们的临床疗效。这些低分子量化合物示出通过扩散渗透进入人体组织的高趋势，从而导致均匀的生物分布。因此，仅少量药物到达作用部位，并且由于分布在身体健康组织上，所述药物引起不良的副作用。

这些缺点对于那些具有高细胞毒性并且治疗窗口非常狭窄的药物尤其显著。澳瑞他汀类药物是基于微管蛋白结合肽的药物，代表性实例诸如多拉司他汀10、多拉司他汀15、澳瑞他汀PE、澳瑞他汀E或澳瑞他汀F表现出高细胞毒性作用。在临床1期和2期试验中，多拉司他汀10、多拉司他汀15和澳瑞他汀PE导致无法接受的全身毒性以及缺乏抗肿瘤活性，并因此停药。(E.A.Perez等人，Invest.New Drugs，23：257-261(2005)；M.von Mehren等人，Sarcoma，8：107-111(2004)；R.S.Marks等人，Am.J.Clin.Oncol.，26：336-337(2003))。

肿瘤学中的药物递送是一种潜在地增加高细胞毒性剂的狭窄治疗指数的方法。在大多数药物递送系统中，细胞毒性药物通过间隔物与载体结合，所述间隔物具有预定的断裂点，所述断裂点可使结合的药物在细胞靶点释放。(F.Kratz＝等人，ChemMedChem，3：20-53(2008))。

白蛋白或其药物缀合物在全身循环中表现出明显长的半衰期，半衰期长达19天。一种特别有吸引力的方法是开发具有高细胞毒性剂的前药，所述高细胞毒性剂与循环的血清白蛋白共价结合，所述血清白蛋白在投药后可作为大分子载体。由于1.)大分子透过恶性、感染或发炎组织的血管壁的通透性增强，加上完整的淋巴引流系统和2.)白蛋白结合蛋白在肿瘤内皮上和肿瘤间质中的表达，白蛋白药物缀合物将治疗有效物质转运至释放高细胞毒性剂的靶点(即肿瘤)。(US 7,387,771；F.Kratz，J.Control.Release，132：171-183(2008)；F.Kratz、U.Beyer，Drug Delivery，5：281-299(1998))。

但是，在设计具有高细胞毒性剂的药物递送系统时，应在保持药物载体的靶向特性，同时可控制的释放细胞毒性药物并且避免其在血液循环或系统中过早释放之间达到关键的平衡。酸敏感性药物递送系统应在血液中具有足够的稳定性，但仍允许药物以pH依赖的方式在肿瘤部位有效释放。(F.Kratz等人，ChemMedChem，3：20-53(2008))。

对于针对皮摩尔范围内的肿瘤细胞具有IC₅₀值的高细胞毒性药物，注入基于低分子量肽的澳瑞他汀，由于它们的水不溶性和非常窄的治疗窗口而不能投予，因此需要有效的药物递送和释放系统以实现这种高效药物更有效和受控的递送和释放。因此，本公开提供了可用于治疗恶性疾病的澳瑞他汀E衍生物的白蛋白结合前药的更有效和/或更耐受的药物组合物。

发明概述

本公开提供了具有式I或II的结构的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或异构体；

其中：

R’为H或-CH₃，

M为H或药学上可接受的抗衡离子；

Y不存在或选自任选取代的C₁-C₆烷基、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-C(O)-O-和-O-C(O)-；

R¹不存在或为任选取代的C₁-C₁₈烷基，其中在所述C₁-C₁₈烷基中任选地至多六个碳原子各自独立地被-OCH₂CH₂-取代；

X为H或选自卤素基团(例如：-F、-Cl、-Br或-I)、-NO₂、-NR²R³、-OR²、-NHCOR²和-OCOR²，其中R²和R³各自独立地选自H和C₁-C₄烷基；

TBG是硫醇结合基团，其选自任选取代的马来酰亚胺基、任选取代的卤代乙酰胺基、任选取代的卤代乙酸酯基、任选取代的吡啶硫基、任选取代的异硫氰酸酯基、任选取代的乙烯基羰基、任选取代的氮丙啶基、任选取代的二硫基和任选取代的乙炔基。

在一些实施例中，R’为-CH₃。在其他实施例中，R’为H。

在一些实施例中，TBG选自任选取代的马来酰亚胺基。

在一些实施例中，TBG是下式的马来酰亚胺基：

在一些实施例中，Y为-NH-C(O)-。

在一些实施例中，M为H⁺或Na⁺。

在一些实施例中，R¹为任选取代的C₁-C₅烷基。在一些实施例中，R¹为C₁-C₅烷基。

在一些实施例中，本公开提供具有式III的结构的化合物：

在其他实施例中，本公开提供具有式IV的结构的化合物：

本公开还提供了一种药物组合物，其包括本文公开的化合物和药学上可接受的载体。在一些实施例中，药学上可接受的载体选自增溶剂、包封剂和冻干保护剂中的一种或多种。在其他实施例中，药学上可接受的载体选自二甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精中的一种或多种。

在一些实施例中，药物组合物适合于静脉内投药。在一些实施例中，组合物在给患者静脉内投药时，在血液循环中与内源性白蛋白选择性地并原位快速地共价结合。在其他实施例中，组合物在给患者静脉内投药时，在血液循环中与内源性白蛋白半胱氨酸34的硫醇基选择性地并原位快速地共价结合。

本公开还提供了一种用于治疗患有选自以下的疾病的患者的方法：癌症、病毒性疾病、自身免疫疾病、急性或慢性炎性疾病以及由细菌、真菌和其他微生物引起的疾病，包括向有此需要的患者投予治疗有效量的本文公开的化合物或药物组合物。在一些实施例中，所述疾病是癌症，并且选自癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和黑素瘤。在一些实施例中，投药是静脉内投药。

本公开还提供了减少化合物的细胞毒性的方法，所述方法包括向有此需要的患者投予本文公开的化合物或药物组合物，其中与等效剂量的未修饰活性剂相比，投药导致细胞毒性的降低。

本公开进一步提供了增加肿瘤中化合物的代谢物浓度的方法，其包括向有此需要的患者投予本文公开的化合物或药物组合物，其中将所述增加与等效剂量的未修饰活性剂进行比较。

本公开提供了本文公开的用作药物的化合物。

本公开还提供了本文公开的用于治疗选自以下的疾病或病症的药物中的用途：癌症、病毒性疾病、自身免疫性疾病、急性或慢性炎症性疾病，以及由细菌、真菌或其他微生物引起的疾病。

本公开进一步提供了本文公开的化合物或组合物在制备用于治疗选自以下的疾病或病症的药物中的用途：癌症、病毒性疾病、自身免疫性疾病、急性或慢性炎症性疾病，以及由细菌、真菌或其他微生物引起的疾病。

附图简要说明

图1比较重构缓冲液中(50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.65，5％蔗糖(w/v)和2％2-羟丙基-β-环糊精(2-HPβCD(w/v))AE-Keto-Sulf07(分图(a))和AE-Keto-EMCH(分图(b))的稳定性。

图2比较重构缓冲液中(50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.65，5％蔗糖(w/v)和4％2-羟丙基-β-环糊精(2-HPβCD，(w/v))AE-Ester-Sulf07(分图(a))和AE-Ester-EMCH(分图(b))的稳定性。

图3示出了AE-Keto-Sulf07与人血浆中白蛋白的缀合。

图4示出了AE-Ester-Sulf07与人血浆中白蛋白的缀合。

图5示出了AE-Keto-Sulf07与人血浆中白蛋白的结合动力学。

图6示出了AE-Keto-Sulf07与小鼠血浆中白蛋白的结合动力学。

图7示出了AE-Keto-Sulf07与大鼠血浆中白蛋白的结合动力学。

图8示出了AE-Ester-Sulf07与人血浆中白蛋白的结合动力学。

图9示出了AE-Ester-Sulf07与小鼠血浆中白蛋白的结合动力学，直到达到药物的定量极限(LOQ)为止。

图10示出了AE-Ester-Sulf07与大鼠血浆中白蛋白的结合动力学，直到达到所述药物的(LOQ)为止。

图11示出了AE-Keto(pH 7.4(分图(a)和pH 4.1(分图(b))从人白蛋白结合的AE-Keto-Sulf07的pH依赖性释放。

图12示出了AE-Ester(pH 7.4(分图(a)和pH 4.1(分图(b))从人白蛋白结合的AE-Ester-Sulf07的pH依赖性释放。

图13示出了澳瑞他汀E和AE-Keto-Sulf07的抗肿瘤作用，与恶性黑色素瘤癌症模型A375中的对照组相比，起始肿瘤体积平均中位数约为134mm³。

图14示出了澳瑞他汀E和AE-Keto-Sulf07的抗肿瘤作用，与恶性黑色素瘤癌症模型A375中的对照组相比，起始肿瘤体积平均中位数约为332mm³。

图15示出了澳瑞他汀E和AE-Keto-Sulf07的抗肿瘤作用，与NSCLC异种移植模型LXFA737中的对照组相比，起始肿瘤体积平均中位数约为132mm³。

图16示出了澳瑞他汀E和AE-Keto-Sulf07的抗肿瘤作用，与NSCLC异种移植模型LXFA737中的对照组相比，起始肿瘤体积平均中位数约为330mm³。

图17示出了澳瑞他汀E和AE-Keto-Sulf07的抗肿瘤作用，与人卵巢癌模型A2780中的对照组相比，起始肿瘤体积平均中位数约为148mm³。

图18示出了澳瑞他汀E和AE-Keto-Sulf07的抗肿瘤作用，与人卵巢癌模型A2780中的对照组相比，起始肿瘤体积平均中位数约为351mm³。

图19示出了澳瑞他汀E和AE-Ester-Sulf07的抗肿瘤作用，与肾细胞癌模型RXF631中的对照组相比，起始肿瘤体积平均中位数约为140mm³。

图20示出了澳瑞他汀E和AE-Ester-Sulf07的抗肿瘤作用，与恶性黑色素瘤癌症模型A375中的对照组相比，起始肿瘤体积平均中位数约为332mm³。

图21示出了澳瑞他汀E和AE-Ester-Sulf07的抗肿瘤作用，与NSCLC异种移植模型LXFA737中的对照组相比，起始肿瘤体积平均中位数约为132mm³。

图22示出了澳瑞他汀E和AE-Ester-Sulf07的抗肿瘤作用，与人卵巢癌模型A2780中的对照组相比，起始肿瘤体积约为351mm³。

图23示出了AE-Ester-Sulf07的抗肿瘤作用，与人卵巢癌模型A2780中的对照组相比，起始肿瘤体积约为148mm³。

图24示出了冻干的澳瑞他汀制剂的加速降解，作为AE-Keto-Sulf07和AE-Keto-EMCH稳定性的比较。

图25示出了冻干的澳瑞他汀制剂的加速降解，作为AE-Ester-Sulf07和AE-Ester-EMCH稳定性的比较。

具体实施方式

除非本文另有定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文描述的与化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学和蛋白质化学的技术有关的命名法是本领域众所周知的和常用的。

本申请中提及的所有出版物、专利和公开的专利申请均通过引用特别地并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括其具体定义)为准。除非另有说明，否则应理解，本文公开的每个实施例可以单独使用或与本文公开的任何一个或多个其他实施例结合使用。

定义

在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或其变体，诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，将被理解为暗示包括所述整体(或组分)或整体(或组分)的组，但不排除任何其他整体(或组分)或整体(或组分)的组。

在整个申请中，在化合物或组合物被描述为具有、包括(including)或包括(comprising)特定组分的情况下，可以预期，此类化合物或组合物也可以基本上由所列举的组分组成或由所列举的组分组成。类似地，在将方法或过程描述为具有、包括(including)或包括(comprising)特定过程步骤的情况下，所述过程也可以基本上由所列举的过程步骤组成或由所列举的过程步骤组成。另外，应理解，只要本文所述的化合物、组合物和方法保持可操作性，步骤的顺序或执行某些动作的顺序就无关紧要。而且，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。

除非上下文另外明确指出，否则单数形式的“一种(a)”、“一种(an)”和“所述”包括复数。

术语“包括”用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可以互换使用。

除非上下文另外明确指出，否则本文所用的术语“或”应理解为意指“和/或”。

术语“药物”、“试剂”、“治疗剂”、“治疗活性剂”、“细胞毒性剂或药物”、“高细胞毒性剂或药物”或“治疗有效物质”用于意指任何化合物，其本身或在相关生物体内转化后会产生药理作用，并且因此也包括来自这些转化的衍生物。根据本公开的组合物的药物的药理作用只能是单一作用，例如：细胞抑制和/或细胞毒性作用，或广泛药理作用谱，诸如同时具有免疫抑制和消炎作用。

术语“患者”、“受试者”或“个体”可以互换使用，并且是指人类或非人类动物。这些术语包括哺乳动物，诸如人、灵长类、家畜(例如牛、猪)、伴侣动物(例如犬、猫)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中，患者或受试者是人类患者或受试者，诸如患有需要治疗的病状的人类患者。

术语“药物组合物”是指用于受试动物(包括人和哺乳动物)的适用于药物用途的组合物，例如，与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或溶剂组合。这种组合物还可以包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、保护剂和本领域众所周知的其他材料。在某些实施例中，药物组合物涵盖包括活性成分的组合物和由赋形剂、载体或稀释剂构成的惰性成分，以及任何两种或更多种成分的组合、络合或聚集，或一种或多种成分的分解，或一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用，而直接或间接产生的任何产品，因此，本公开的药物组合物涵盖通过将本公开的化合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂混合制成的任何组合物。

术语“药学上可接受的载体”是指可以与本文公开的治疗有效物质一起对患者投予并且不破坏试剂的药学活性的无毒载体。术语“赋形剂”是指在制剂或组合物中不是药学活性成分的添加剂。在某些实施例中，“药学上可接受的”物质适合与动物或人的细胞、组织或器官接触而没有过度的毒性、刺激、变态反应、免疫原性或其他不良反应，其剂量形式为：根据投药时间表，并具有合理的获益/风险比。在某些实施例中，作为药物组合物的组分的“药学上可接受的”物质另外与组合物的其他成分相容。在某些实施例中，术语“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的稀释剂”包括但不限于药学上可接受的非活性成分、材料、组合物和媒介物，诸如液体填充剂、固体填充剂、稀释剂、赋形剂、载体、溶剂和包囊材料。载体、稀释剂和赋形剂还包括所有药学上可接受的分散介质、包衣、缓冲剂、等渗剂、稳定剂、吸收延迟剂、抗微生物剂、抗菌剂、抗真菌剂、佐剂等。除了任何常规赋形剂、载体或稀释剂与活性成分不相容之外，本公开涵盖常规赋形剂、载体和稀释剂在药物组合物中的用途。参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams&Wilkins(Philadelphia，Pennsylvania，2005)；Handbook ofPharmaceutical Excipients，第5版，Rowe等人编写，The Pharmaceutical Press and theAmerican Pharmaceutical Association(2005)；Handbook of PharmaceuticalAdditives，第3版，Ash and Ash编写，Gower Publishing Co.(2007)；和PharmaceuticalPreformulation and Formulation，Gibson编写，CRC Press LLC(Boca Raton，Florida，2004)。

术语“药学上有效量”，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效治疗患者疾病的量，例如，对患有疾病(例如癌症)的患者的总体健康、生理反应或状况的治疗、治愈、抑制或改善等，产生有益和/或理想的改变。完全的治疗效果不一定通过一次剂量投药而发生，并且可能仅在一系列剂量投药后才发生。因此，可以通过一次或多次投药来投予治疗有效量。受试者所需的确切有效量将取决于例如受试者的体型、健康状况和年龄、疾病的性质和程度，选择用于投药的疗法或疗法的组合以及投药方式。技术人员可以通过常规实验容易地确定给定情况的有效量。技术人员将认识到，治疗癌症包括但不限于杀死癌细胞，防止新癌细胞的生长，引起肿瘤消退(肿瘤大小减小)，引起转移减少，改善患者的生命机能，改善患者的健康，减轻疼痛，改善食欲，改善患者的体重及其任何组合。术语“药学上有效量”，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”也指改善患者临床症状所需的量。本文所述的一种或多种治疗癌症的方法不应解释为或以其他方式限于“治愈”癌症。

如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括以某种方式逆转、减轻或阻止症状、临床体征和潜在的病理状况，以改善或稳定受试者的状况。如本文所用以及在本领域中众所周知的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果，包括临床结果的途径。有益或理想的临床结果可以包括但不限于缓解，改善或减缓与病状相关的一种或多种症状或病状的进展，例如，无论可检测还是不可检测的癌症，疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻以及缓解(无论是部分的还是全部的)。与未接受治疗的预期生存期相比，“治疗”还可能意味着生存期延长。示例性有益临床结果在本文中予以描述。

可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的一种来对受试者“投予(Administering)”或“投予(administration)”一种物质、化合物或试剂。例如，可以通过静脉内、动脉内、皮内、肌内、腹膜内、皮下、眼内、舌下、口服(通过摄入)、鼻内(通过吸入)、脊髓内、脑内和经皮(通过吸收，例如通过皮肤导管)投予化合物或试剂。化合物或试剂还可以通过可再充电或可生物降解的聚合物装置或其他装置(例如贴剂和泵或制剂)适当地引入，所述装置提供化合物或试剂的延长、缓慢或受控释放。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行投药。在某些方面，投药包括直接投药(包括自我投药)和间接投药(包括开处方药的行为)两者。例如，如本文所用，指导患者自我投予药物或由另一人投予药物的医师，和/或向患者提供药物处方的医师正在对患者投予药物。当一种方法是涉及超过一种试剂或治疗方式的治疗方案的一部分时，本公开预期可以在相同或不同时间以及通过相同或不同的投药途径来投予所述试剂。对受试者投予物质、化合物或试剂的合适方法还取决于，例如受试者的年龄、在投药时受试者是活跃的还是不活跃的、在投药时受试者的认知能力是否受损、损伤的程度，以及化合物或试剂的化学和生物学特性(例如溶解度、消化率、生物利用度、稳定性和毒性)。

术语“取代的”是指具有在化学化合物主链的一个或多个碳原子上取代氢的取代基的部分。应理解，“取代”或“被......取代”包括隐含的条件，即这种取代是根据取代原子和取代基的允许化合价，并且所述取代产生稳定的化合物，例如，不会诸如通过重排、环化、消除等自发进行转化。如本文所用，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有允许的取代基。在广义方面中，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。对于合适的有机化合物，允许的取代基可以是一个或多个并且可以相同或不同。为了本公开的目的，杂原子(诸如氮)可以具有氢取代基，和/或本文描述的满足杂原子的化合价的有机化合物的任何允许的取代基。取代基可以包括本文所述的任何取代基，例如，卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(诸如硫代酸酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、烷硫基、酰氧基、磷酰基、磷酸盐、膦酸酯、氨基、酰胺基、胺基、亚胺基、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸盐、磺酸盐、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族(例如C₆-C₁₂芳基)或杂芳族(例如杂芳基)部分。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的情况可能会或可能不会发生，因此本申请包括发生这种情况的例子和未发生这种情况的例子。例如，短语“任选取代的”意指在给定原子上可以存在或可以不存在非氢取代基，并且因此，本申请包括其中存在非氢取代基的结构和其中不存在非氢取代基的结构。

除非特别说明为“未取代的”，否则本文中提及的化学部分应理解为包括取代的变体。例如，提及“烷基”基团或部分隐含地包括取代的和未取代的变体两者。化学部分上的取代基的实例包括但不限于卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(诸如硫代酸酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、烷硫基、酰氧基、磷酰基、磷酸盐、膦酸酯、氨基、酰胺基、胺基、亚胺基、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸盐、磺酸盐、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳基或杂芳基部分。

“芳基”指示在环中具有指定数量的碳原子，例如6至12或6至10个碳原子的芳族碳环。芳基可以是单环或多环的(例如，双环、三环的)。在一些情况下，多环芳基的两个环都是芳族的(例如萘基)。在其他情况下，多环芳基可以包括稠合到芳环的非芳族环(例如，环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基)，条件是多环芳基经由芳环中的原子与母体结构结合。因此，将1，2，3，4-四氢萘-5-基(其中所述部分通过芳族碳原子与母体结构结合)视为芳基，而不将1，2，3，4-四氢萘-1-基(其中所述部分通过非芳族碳原子与母体结构结合)不视为芳基。类似地，将1，2，3，4-四氢喹啉-8-基(其中所述部分通过芳族碳原子与母体结构结合)视为芳基，而不将1，2，3，4-四氢喹啉-1-基(其中所述部分通过非芳族氮原子与母体结构结合)视为芳基。然而，术语“芳基”不涵盖本文定义的“杂芳基”或与之重叠，不管其连接点(例如，喹啉-5-基和喹啉-2-基均为杂芳基)。

“杂芳基”指示包含指定数量的环原子(例如，5至12或5至10元杂芳基)的芳香环，所述指定数量的环原子由一个或多个选自N、O和S的杂原子(例如，1、2、3或4个杂原子)构成，其余的环原子为碳。5元杂芳基是具有5个环原子的杂芳基。6元杂芳基是具有6个环原子的杂芳基。杂芳基不包含相邻的S和O原子。在一些实施例中，杂芳基中的S和O原子的总数不超过2。在一些实施例中，杂芳基中的S和O原子的总数不超过1。除非另有指示，在化合价允许的情况下，杂芳基可以通过碳或氮原子与母体结构结合。例如，“吡啶基”包括2-吡啶基、3-吡啶基和4-吡啶基，并且“吡咯基”包括1-吡咯基、2-吡咯基和3-吡咯基。当氮存在于杂芳基环中时，在相邻原子和基团的性质允许的情况下，氮可以以氧化态(即，N⁺-O^-)存在。另外，当硫存在于杂芳基环中时，在相邻原子和基团的性质允许的情况下，它可以氧化态(即，S⁺-O^-或SO₂)存在。杂芳基可以是单环或多环的(例如，双环、三环的)。

在一些情况下，杂芳基是单环的。实例包括吡咯、吡唑、咪唑、三唑(例如，1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、1，3，4-三唑)、四唑、呋喃、异噁唑、噁唑、噁二唑(例如，1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、1，3，4-噁二唑)、噻吩、异噻唑、噻唑、噻二唑(例如，1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、1，3，4-噻二唑)、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪(例如，1，2，4-三嗪、1，3，5-三嗪)和四嗪。

术语“酰基”是本领域公认的，并且是指由通式烃基-C(O)-表示的基团，例如烷基-C(O)-。

术语“烷基”是指饱和脂肪族基的基团，包括直链烷基和支链烷基。在一些实施例中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链，C₁-C₃₀，对于支链，C₄-C₃₀)，并且在其他实施例中，具有20个或更少。在某些实施例中，烷基是低级烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和正戊基。而且，贯穿说明书、实例、权利要求使用的术语“烷基”旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”两者，后者是指在烃主链的一个或多个碳原子上具有取代氢的取代基的烷基部分。在某些实施例中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链，C₁-C₃₀；对于支链，C₃-C₃₀)。在一些实施例中，所述链在其主链中具有十个或更少的碳原子(C₁-C₁₀)。在其他实施例中，所述链在其主链中具有六个或更少的碳原子(C₁-C₆)。

术语“腙部分”或“腙”是指E和/或Z腙，例如，

腙部分的立体化学构型可以是E或Z。本文所用的术语腙，包括E和Z异构体两者。本文公开的腙部分通常以一种构型绘制，但是应理解，本公开可以包括E和/或Z两者。

在本说明书的不同地方，以组或范围公开了本公开的化合物的取代基。具体地意图，本公开包括这种组和范围的成员中的每一个和每个单独的子组合。例如，术语“C₁-C₆烷基”具体地旨在个别地公开甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基等。

“药学上可接受的盐”是适用于药物用途的化合物的盐，包括但不限于金属盐(例如钠、钾、镁、钙等)、酸加成盐(例如无机酸、羧酸等)和碱加成盐(例如氨水、有机胺等)。以游离形式作为碱存在的化合物的酸加成盐形式可以通过用适当的酸处理所述游离碱形式来获得，所述酸诸如无机酸，例如氢卤酸如盐酸或氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸，诸如像乙酸、羟基乙酸、丙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环酸、水杨酸、对氨基水杨酸、棕榈酸等(参见，例如，WO 01/062726。Berge等人列出的一些药学上可接受的盐，J.Pharm.Sci.，66：1-19(1977)，所述文献通过引用全文并入本文)。通过用适当的有机和无机碱处理，可以将包含酸性质子的化合物转化为其治疗活性的无毒碱加成盐形式，例如金属盐或胺盐。适当的碱盐形式包括例如铵盐、碱金属和碱土金属盐或离子，例如，锂、钠、钾、镁、钙盐等具有有机碱的盐，例如，N-甲基-D-葡萄糖胺、海巴明盐以及具有氨基酸的盐，诸如像精氨酸、赖氨酸等。相反，通过用适当的碱或酸处理，可以将所述盐形式转化为游离形式。化合物及其盐可以是溶剂化物的形式，所述溶剂化物包括在本公开的范围内。这种溶剂化物包括例如水合物、醇化物等(参见例如WO 01/062726)。

本公开还提供了包括一种或多种本公开的化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本公开的化合物或药物组合物可以在体外或体内使用。

本文所用的术语“异构体”包括但不限于互变异构体、顺式和反式异构体(E(异侧)，Z(同侧))、R-和S-对映异构体(与Pure Appl.Chem.(1976)，45，11-30中所述的规则一致地使用R和S表示法)、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、立体异构体、其外消旋混合物以及它们的其他混合物。所有这些异构体及其混合物都旨在包括在本公开中。互变异构体虽然未在本文所述的式中明确指出，但意图包括在本公开的范围内。

本公开的化合物

本公开的实施例提供具有式I或式II表示的结构的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或异构体，其中：

R’为H或-CH₃，

M选自H和药学上可接受的抗衡离子，诸如Na⁺、K⁺、NR₄ ⁺或NHR₃ ⁺，其中R选自H和C₁-C₄烷基，

Y不存在或选自任选取代的C₁-C₆烷基、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-C(O)-O-、和-O-C(O)-，

R¹不存在或为任选取代的C₁-C₁₈烷基，其中所述C₁-C₁₈烷基中的任选地至多六个碳原子各自独立地被-OCH₂CH₂-取代，

X为H或选自卤素基团(例如-F、-Cl、-Br或-I)、-NO₂、-NR²R³、-OR²、-NHCOR²和-OCOR²，其中R²和R³各自独立地选自H和C₁-C₄烷基，并且

TBG是硫醇结合基团，其选自任选取代的马来酰亚胺基、任选取代的卤代乙酰胺基、任选取代的卤代乙酸酯基、任选取代的吡啶硫基、任选取代的异硫氰酸酯基、任选取代的乙烯基羰基、任选取代的氮丙啶基、任选取代的二硫基和任选取代的乙炔基。

在一些实施例中，将式I或II结构的化合物配制为药物组合物，其任选地包含药学上可接受的载体，向生物体投予所述药物组合物，并使其在血液循环中与内源性白蛋白的半胱氨酸34的硫醇基选择性且原位快速地共价结合。

在一些实施例中，R’为-CH₃。在其他实施例中，R’为H。

在一些实施例中，硫醇结合基团TBG是马来酰亚胺基团：

在一些实施例中，高细胞毒性肽基药物是澳瑞他汀E，其衍生方式为包含羰基，所述羰基使得能够与包含酰肼部分的马来酰亚胺水溶性连接基形成酸敏感腙键。

在一些实施例中，本公开提供了药物组合物，其包括如本文公开的化合物和任选地药学上可接受的载体，其中药物组合物是静脉内投药的，并且在血液循环中与内源性白蛋白的半胱氨酸34的硫醇基团选择性且原位快速地共价结合。

在一些实施例中，在本文公开的白蛋白结合化合物中，高细胞毒性药物是澳瑞他汀E的含羰基的五肽衍生物，白蛋白结合部分是硫醇结合基团(TBG)，例如，马来酰亚胺基，在投药后迅速且选择性地与白蛋白的半胱氨酸34结合，并且酸敏感键是通式I和II的衍生的苯甲酰基键：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或异构体，其中：

R’为H或-CH₃，

M选自药学上可接受的抗衡离子，诸如Na⁺、K⁺、NR₄ ⁺或NHR₃，其中R选自H和C₁-C₄烷基，

Y不存在或选自任选取代的C₁-C₆烷基、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-C(O)-O-、和-O-C(O)-，

R¹不存在或为任选取代的C₁-C₁₈烷基，其中所述C₁-C₁₈烷基中的任选地至多六个碳原子各自独立地被-OCH₂CH₂-取代，

X为H或选自卤素基团(例如-F、-Cl、-Br或-I)、-NO₂、-NR²R³、-OR²、-NHCOR²和-OCOR²，其中R²和R³各自独立地选自H和C₁-C₄烷基，并且

TBG是硫醇结合基团，其选自任选取代的马来酰亚胺基、任选取代的卤代乙酰胺基、任选取代的卤代乙酸酯基、任选取代的吡啶硫基、任选取代的异硫氰酸酯基、任选取代的乙烯基羰基、任选取代的氮丙啶基、任选取代的二硫基和任选取代的乙炔基。

在一些实施例中，TBG被C₁-C₆烷基或卤素基团取代。在一些实施例中，TBG被甲基、-Cl或-Br取代。

二硫基可被硫代硝基苯甲酸(例如5′-硫代-2-硝基苯甲酸)作为可交换基团活化。马来酰亚胺或吡啶基二硫基可以适当地被烷基或上述水溶性基团取代。通常，硫醇结合基团具有蛋白质结合特性，即，其在生理环境中共价结合(“共价蛋白质结合基团”)至蛋白质表面上的特定氨基酸。在一些实施例中，马来酰亚胺基、卤代乙酰胺基、卤代乙酸酯基、吡啶基二硫代基、二硫化物基、乙烯基羰基、氮丙啶基和/或乙炔基与半胱氨酸的硫醇(-SH)基反应。

在一些实施例中，蛋白质结合基团是马来酰亚胺基

其与白蛋白的半胱氨酸34结合。

在一些实施例中，药物递送系统包含酸敏感的可裂解的腙部分。腙部分的裂解和药物释放的半衰期根据羰基衍生物的结构而变化。

在一些实施例中，在4.0-6.5的pH范围内结合白蛋白的药物释放的半衰期为约1.5小时至约80小时。

不受理论的约束，苯环包括一个吸电子基团，诸如连接到腙键邻位的磺酸基(-SO₃H)或磺酸盐基(-SO₃ ^-)，其稳定了腙部分，从而导致药物在酸性条件下缓慢且长时间的释放。

在一些实施例中，R’为-CH₃。在其他实施例中，R’为H。

在一些实施例中，存在Y和/或R¹。在一些实施例中，Y不存在。在一些实施例中，R¹不存在。在一些实施例中，Y和R¹都不存在。

在一些实施例中，Y选自甲基、乙基、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-C(O)-O-和-O-C(O)-。

在一些实施例中，R¹为任选取代的C₁-C₁₈烷基。在一些实施例中，R¹为任选取代的C₁-C₁₈烷基，其中所述C₁-C₁₈烷基中的一个碳原子被-OCH₂CH₂-取代。在一些实施例中，R₁为任选取代的C₁-C₁₈烷基，其中所述C₁-C₁₈烷基中的两个碳原子被-OCH₂CH₂-取代。在一些实施例中，R¹为任选取代的C₁-C₁₈烷基，其中所述C₁-C₁₈烷基中的三个碳原子被-OCH₂CH₂-取代。在一些实施例中，R¹为任选取代的C₁-C₁₈烷基，其中所述C₁-C₁₈烷基中的四个碳原子被-OCH₂CH₂-取代。在一些实施例中，R¹为任选取代的C₁-C₁₈烷基，其中所述C₁-C₁₈烷基中的五个碳原子被-OCH₂CH₂-取代。在一些实施例中，R¹为任选取代的C₁-C₁₈烷基，其中所述C₁-C₁₈烷基中的六个碳原子被-OCH₂CH₂-取代。

US6884869-B2(申请号：10/001,191，申请日，2001年11月1日)描述了抗体药物缀合物，其中式A和式B的化学结构的五肽衍生物如下所示：

将它们与含硫醇的抗体缀合。两种化合物均包含脂肪族6-马来酰亚胺基己酰基腙部分，所述部分对上述式A和式B的两种化合物具有最小的水溶性。实际上，两种前述化合物与抗体的缀合是通过仅在有机溶剂(即乙腈∶DMSO 9∶1混合物)的帮助下溶解化合物。单独使用有机溶剂配制适用的药物组合物，使其与血液中循环的白蛋白的半胱氨酸34原位偶联，即本文所述的药物递送方法是不可能的。因此，在一些实施例中，本发明的组合物不包括有机溶剂。

因此，发明了包括磺酸部分的芳族马来酰亚胺连接基，使得其对于白蛋白结合前药具有足够的水溶性，从而配制用于静脉内投药的药物组合物。一种这样的连接基是具有如下所示化学结构的5-(6-(2，5-二氧-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-(肼基羰基)-苯磺酸，缩写为Sulf07。

Sulf07的化学结构

根据以下合成方案中所述的途径A和/或途径B，制备了连接基Sulf07，5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-(肼基羰基)-苯磺酸。

方案1，途径A

方案2，途径B

实例1描述了根据途径A和B实现的新的合成方法和新型连接基Sulf07，5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-(肼基羰基)-苯磺酸的表征。

连接基Sulf07与以下物质反应：

AE-Ester为了分别获得式III(AE-Keto-Sulf07的缩写)和式IV(AE-Ester-Sulf07的缩写)的化合物：

实例2和3描述了AE-Keto-Sulf07(式III)和AE-Ester-Sulf07(式IV)的合成和表征。

AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07的结构分析表明，两个分子中都有两个部分(-SO₃H和-N(CH₃)₂基团)作为酸碱对存在，从而形成方案3和方案4中所述的两性离子。

方案3

方案4

整合在连接基Sulf07上的磺酸部分以及两种澳瑞他汀前药AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07的两性离子特性为配制药物组合物提供了足够的水溶性，更重要的是，马来酰亚胺部分的高稳定性大大优于式A(AE-Keto-EMCH)和B(AE-Ester-EMCH)：

在US6884869-B2(申请号：10/001,191，申请日：2001年11月1日)中公开的方法。

为了与内源性白蛋白的半胱氨酸-34原位结合，马来酰亚胺基在7.4-7.6的pH范围内的生理条件下的稳定性是静脉内投药和有效结合血液中循环白蛋白的标准。

如图1和图2所示，与US6884869-B2中所述的两种化合物相比，即与AE-Keto-EMCH(式A的化合物)和AE-Ester-EMCH(式B的化合物)相比，AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07的马来酰亚胺部分对水解的稳定性得到了显着改善。在室温下在重构缓冲液(50mM磷酸钠pH 7.65，含有4％HPβCD和5％蔗糖)中孵育4小时后，相比于AE-Keto-EMCH的5.4％马来酰亚胺水解，AE-Keto-Sulf07的2.2％的马来酰亚胺水解，相比于AE-Ester-EMCH的11.0％马来酰亚胺水解，类似地AE-Ester-Sulf07的2.5％的马来酰亚胺水解。此外，Sulf07衍生物的活性药物成分(API)制剂在加速降解条件下(例如，在55℃下长达264小时)显示出出色的稳定性(图24和图25)，而EMCH衍生物的马来酰亚胺部分被迅速水解。最小的马来酰亚胺水解对于产品开发和生产至关重要，以确保定量的内源性白蛋白结合，从而限制循环中任何过早的游离药物释放并最大程度地提高临床效率。

AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07的水溶液的另一个优点是它们的生理pH值在6.8至7.5的范围内。

此外，两性离子API与药物可接受的载体(诸如Tween 80、2-羟丙基-β-环糊精)组合使用时，其溶解度和稳定性会提高，并且这可以促进药物组合物的配制。

AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07的药物制剂在血浆(人、小鼠和大鼠)中实现了非常快速的白蛋白结合(图5至10)。在人血浆中也证实了两种治疗剂结合白蛋白的特异性(图3至4)。

药物组合物

在一些实施例中，本公开提供了包括本文所述化合物的药物组合物。

投予患者的组合物中化合物的总量是最适合所述患者的量。本领域技术人员将理解，不同的个体可能需要不同总量的治疗有效物质。在一些实施例中，化合物的量是药学上有效量。技术人员将能够基于诸如像患者的年龄、体重和身体状况等因素来确定治疗患者所需的组合物中化合物的量。化合物的浓度取决于其在静脉内投药溶液中的溶解度以及可以投予的液体体积。例如，化合物在可注射组合物中的浓度可以为约0.1mg/mL至约50mg/mL。在一些实施例中，化合物的浓度可以在约0.1mg/mL至约40mg/mL的范围内。

本公开的药物组合物和试剂盒还可以包含稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、保护剂和本领域众所周知的其他材料。术语“药学上可接受的”是指不干扰活性成分的生物活性有效性的无毒材料。载体的特征将取决于投药途径。

组合物可以以多种常规方式投予。可以使用的示例性投药途径包括口服、肠胃外、静脉内、动脉内、皮肤、皮下、肌肉内、局部、颅内、眼眶、眼科、玻璃体内、心室内、囊内、脊髓内、脑池内、腹膜内、鼻内、气雾剂、中枢神经系统(CNS)投药或栓剂投药。在一些实施例中，组合物适合于肠胃外投药。这些组合物可以在例如腹膜内、静脉内或鞘内投药。在一些实施例中，在静脉内注射组合物。在一些实施例中，可以通过在包括例如醇、DMSO和/或聚乙二醇以及水和/或盐缓冲剂的重构液中重构冻干的化合物组合物来制备重构的制剂。这种重构可以包括加入重构液以及例如通过使混合物打旋或涡旋进行混合。接着通过将例如乳酸林格氏溶液、5％葡萄糖溶液、等渗盐水或合适的盐缓冲剂与所述制剂混合以制成可注射的组合物，可以使重构的制剂适合于注射。本领域技术人员将理解，投予治疗有效的物质制剂或组合物的方法将取决于诸如所治疗的患者的年龄、体重和身体状况以及所治疗的疾病或病状等因素。因此，技术人员将能够根据具体情况选择对患者最佳的投药方法。

在一些实施例中，本文公开的化合物和组合物用于治疗癌症、病毒性疾病、自身免疫疾病、急性或慢性炎性疾病以及由细菌、真菌或其他微生物引起的疾病。

在一些实施例中，本文公开的化合物可以用于制造用于治疗选自以下的疾病的药剂：癌症、病毒性疾病、自身免疫性疾病、急性或慢性炎症性疾病以及由细菌、真菌或其他微生物引起的疾病。

在一些实施例中，癌症是血液癌或实体瘤癌。在一些实施例中，所述癌症选自癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和黑色素瘤。

在一些实施例中，所述癌症是腺癌、葡萄膜黑色素瘤、急性白血病、听神经瘤、壶腹癌、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胰腺癌、结缔组织肿瘤、膀胱癌、支气管癌、非小细胞支气管癌、乳腺癌、伯基特氏淋巴瘤、子宫体癌、CUP综合征、结肠癌、小肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆囊癌、胆囊癌、子宫癌、宫颈癌、颈、鼻、耳肿瘤、血液肿瘤、毛细胞白血病、尿道癌、皮肤癌、神经胶质瘤、睾丸癌、卡波济肉瘤、喉癌、骨癌、大肠癌、头颈癌、结肠癌、颅咽管瘤、肝癌、白血病、肺癌、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、结肠癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、肾癌、肾细胞癌、少突胶质细胞瘤、食道癌、溶骨癌和骨癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、舌癌、卵巢癌或淋巴腺癌。

在一些实施例中，本公开提供了一种试剂盒，其包括如本文所述的化合物和药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。

在一些实施例中，组合物中可以包括一种或多种赋形剂。本领域技术人员应理解，任何一种赋形剂的选择都可能影响任何其他赋形剂的选择。例如，赋形剂的选择可以排除一种或多种其他的赋形剂的使用，这是因为赋形剂的组合会产生不希望的效果。本领域技术人员将能够凭经验确定组合物中包括哪些赋形剂(如果存在的话)。赋形剂可以包括但不限于助溶剂、增溶剂、缓冲剂、pH调节剂、膨胀剂、表面活性剂、包封剂、张度调节剂、稳定剂、保护剂和粘度调节剂。在一些实施例中，在组合物中包括药学上可接受的载体可能是有益的。

在一些实施例中，增溶剂可以包括在组合物中。增溶剂可用于增加组合物的任何组分(包括化合物或赋形剂)的溶解度。本文所述的增溶剂并非旨在构成详尽的清单，而是仅作为可用于组合物中的示例性增溶剂而提供。在某些实施例中，增溶剂包括但不限于乙醇、叔丁醇、聚乙二醇、甘油、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、环糊精，诸如二甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精及其组合，以及任何药学上可接受的盐和/或其组合。

组合物的pH可以是为制剂或组合物提供所需特性的任何pH。期望的特性可以包括例如化合物稳定性，相比于处于其他pH值的组合物增加的化合物的保留率，以及提高的过滤效率。在一些实施例中，组合物的pH值可以为约3.0至约9.0，例如约5.0至约7.0。在特定实施例中，组合物的pH值可以是5.5±0.1、5.6±0.1、5.7±0.1、5.8±0.1、5.9±0.1、6.0±0.1、6.1±0.1、6.2±0.1、6.3±0.1、6.4±0.1、6.5±0.1、6.6±0.1、6.7±0.1、6.8±0.1、6.9±0.1、7.0±0.1、7.1±0.1和7.2±0.1。

在一些实施例中，通过在组合物中包括一种或多种缓冲剂来缓冲pH可能是有益的。在某些实施例中，缓冲液可以具有例如约5.5，约6.0或约6.5的pKa。本领域技术人员应理解，可以基于其pKa和其他特性来选择适当的缓冲剂以包括在组合物中。缓冲剂是本领域众所周知的。因此，本文描述的缓冲剂并不旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于本公开的制剂或组合物中的示例性缓冲剂而提供。在某些实施例中，缓冲剂包括但不限于Tris，、Tris-HCl、磷酸钾、磷酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸钠、磷酸钠和磷酸钾的组合、Tris/Tris-HCl、碳酸氢钠、精氨酸磷酸酯、精氨酸盐酸盐、组氨酸盐酸盐、椰油酸酯、琥珀酸酯、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)、马来酸酯、bis-tris、磷酸盐、碳酸盐和任何药学上可接受的盐和/或其组合。

在一些实施例中，pH调节剂可以包括在组合物中。改变组合物的pH可以对例如化合物的稳定性或溶解性具有有益的作用，或者在制备适合于肠胃外投药的组合物时有用。pH调节剂是本领域众所周知的。因此，本文所述的pH调节剂并非旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于组合物中的示例性pH调节剂而提供。pH调节剂可以包括例如酸和碱。在一些实施例中，pH调节剂包括但不限于乙酸、盐酸、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠及其组合。

在一些实施例中，膨胀剂可以包括在组合物中。膨胀剂通常用于冻干的组合物中以增加组合物的体积并有助于组合物的可视化，特别是在冻干的颗粒难以看见的情况下。膨胀剂还可以帮助防止药物组合物的活性组分的喷出和/或帮助组合物的冷冻保护。膨胀剂是本领域众所周知的。因此，本文所述的膨胀剂并非旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于组合物中的示例性膨胀剂而提供。

示例性的膨胀剂可以包括碳水化合物、单糖、二糖、多糖、糖醇、氨基酸和糖酸及其组合。碳水化合物膨胀剂包括但不限于单糖、二糖、多糖碳水化合物、淀粉、醛糖、酮糖、氨基糖、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔洛糖、庚糖、葡萄糖、果糖、甲基α-D-吡喃葡萄糖苷、麦芽糖、内酯、山梨糖、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖，阿卓糖，古洛糖、艾杜糖、塔洛糖、赤藓糖、核糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、塔格糖葡萄糖胺、半乳糖胺、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、菊粉、果聚糖、岩藻依聚糖、卡拉胶、半乳糖醛固酮、果胶、直链淀粉、普鲁兰糖、糖原、支链淀粉、纤维素、石耳多糖、甲壳素、琼脂糖、角蛋白、软骨素、皮肤素、透明质酸、黄原胶、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐和乳糖。糖醇膨胀剂包括但不限于糖醇、肌醇、山梨糖醇和甘露糖醇。糖酸膨胀剂包括但不限于醛糖酸、糖醛酸、醛糖酸、葡糖酸、异抗坏血酸、抗坏血酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、神经氨酸、果胶酸和藻酸。氨基酸膨胀剂包括但不限于甘氨酸、组氨酸和脯氨酸。

在一些实施例中，表面活性剂可以包括在组合物中。表面活性剂通常降低液体组合物的表面张力。这可以提供有益的特性，诸如提高过滤的便捷性。表面活性剂也可以用作乳化剂和/或增溶剂。表面活性剂是本领域众所周知的。因此，本文所述的表面活性剂并不旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于本公开的制剂或组合物中的示例性表面活性剂而提供。可以被包括的表面活性剂包括但不限于山梨糖醇酯，诸如聚山梨酸酯(例如，聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80)、脂多糖、聚乙二醇(例如，PEG 400和PEG 3000)、泊洛沙姆(即，普流尼克)、环氧乙烷和聚环氧乙烷(例如，TritonX-100)、皂苷、磷脂(例如，卵磷脂)及其组合。

在一些实施例中，包封剂可以包括在组合物中。包封剂可以隔离分子并帮助稳定或增溶分子。包封剂是本领域众所周知的。因此，本文所述的包封剂并非旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于组合物中的示例性包封剂而提供。可以包括在组合物中的包封剂包括但不限于α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精及其组合(例如，α-环糊精、二甲基-α-环糊精、羟乙基-α-环糊精、羟丙基-α-环糊精、三甲基-α-环糊精、β-环糊精、二甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、三甲基-β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-γ-环糊精、羟乙基-γ-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、三甲基-γ-环糊精及其组合)。

在一些实施例中，张度调节剂可以包括在组合物中。当例如通过肠胃外投药来对患者投予组合物时，液体组合物的张力是重要的考虑因素。因此，张度调节剂可用于帮助使组合物适合于投药。张度调节剂是本领域众所周知的。因此，本文所述的张度调节剂并非旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于组合物中的示例性张度调节剂而提供。张度调节剂可以是离子性或非离子性的，包括但不限于无机盐、氨基酸、碳水化合物、糖、糖醇和碳水化合物。示例性无机盐可以包括氯化钠，氯化钾，硫酸钠和硫酸钾。示例性氨基酸是甘氨酸。示例性糖可以包括糖醇，诸如甘油、丙二醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、右旋糖和甘露醇。

在一些实施例中，稳定剂可以包括在组合物中。稳定剂有助于增加化合物在组合物中的稳定性。例如，这可以通过减少化合物的降解或防止其聚集而发生。不希望受理论所束缚，增强稳定性的机制可以包括将化合物与溶剂隔离或抑制治疗有效物质的自由基氧化。稳定剂是本领域众所周知的。因此，本文所述的稳定剂并非旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于组合物中的示例性稳定剂而提供。稳定剂可以包括但不限于乳化剂和表面活性剂。

在一些实施例中，保护剂可以包括在组合物中。保护剂是保护药学活性成分(例如治疗有效物质或化合物)免受不良状况(例如由冷冻或冻干或氧化引起的不稳定性)的试剂。保护剂可以包括例如冷冻保护剂、冻干保护剂和抗氧化剂。当组合物暴露于低于其冰点的温度时，冷冻保护剂可用于防止活性药物成分(例如，蒽环类化合物)的效力损失。例如，冷冻保护剂可以包括在重构的冻干制剂中，使得可以在稀释用于静脉内投药之前将制剂冷冻。冷冻保护剂是本领域众所周知的。因此，本文所述的冷冻保护剂并非旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于组合物中的示例性冷冻保护剂而提供。冷冻保护剂包括但不限于溶剂、表面活性剂、包封剂、稳定剂、粘度调节剂及其组合。冷冻保护剂可以包括例如二糖(例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖)、多元醇(例如，甘油、甘露醇、山梨糖醇和二甘醇)、二醇(例如，乙二醇、聚乙二醇和丙二醇)。

冻干保护剂可以用于稳定经受冻干的组合物的组分。例如，可以在重构之前用冻干保护剂冻干治疗有效物质。冻干保护剂是本领域众所周知的。因此，本文所述的冻干保护剂并非旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于组合物中的示例性冻干保护剂而提供。冻干保护剂包括但不限于溶剂、表面活性剂、包封剂、稳定剂、粘度调节剂及其组合。示例性冻干保护剂可以是例如糖和多元醇。海藻糖、蔗糖、葡聚糖和羟丙基-β-环糊精是冻干保护剂的非限制性实例。

抗氧化剂可以用于防止组合物的组分的氧化。氧化可能导致药品的聚集或对药品纯度或其效力的其他有害影响。抗氧化剂是本领域众所周知的。因此，本文所述的抗氧化剂并非旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于组合物中的示例性抗氧化剂而提供。抗氧化剂可以是例如抗坏血酸钠、柠檬酸盐、硫醇、偏亚硫酸氢盐及其组合。

在一些实施例中，粘度调节剂可以包括在组合物中。粘度调节剂改变液体组合物的粘度。因为粘度在容易过滤液体组合物方面起重要作用，所以这可能是有益的。可以在冻干和重构之前或重构之后过滤组合物。粘度调节剂是本领域众所周知的。因此，本文所述的粘度调节剂并非旨在构成详尽的清单，而仅仅是作为可用于组合物中的示例性粘度调节剂而提供。粘度调节剂包括溶剂、增溶剂、表面活性剂和包封剂。可以包括在组合物中的示例性粘度调节剂包括但不限于N-乙酰基-DL-色氨酸和N-乙酰基-半胱氨酸。

人肿瘤异种移植小鼠模型的抗肿瘤活性

结合白蛋白的前药AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07在肿瘤细胞系和裸鼠中几种人肿瘤异种移植模型中均表现出卓越的抗肿瘤活性，其中游离药物AE-Keto和AE-Ester的IC₅₀在皮摩尔范围内(分别为259和339μM，相当于130μM母体化合物AE的IC₅-参见实例4)，诱导了所评估的所有人肿瘤异种移植的部分和完全缓解(参见图13至23中的实例)。这包括起始体积约为130-170mm³的小肿瘤，以及起始体积高达约380mm³的大肿瘤。此外，在大多数情况下，使用白蛋白结合前药AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07的疗法会引起长期缓解，并且使相对肿瘤体积(RTV)减小。母体化合物澳瑞他汀E(AE)在测试模型中主要是无活性的，或仅示出有限的肿瘤抑制作用。实例5和图13至23中详细描述了荷瘤小鼠模型中的实验程序和结果。

治疗方法

本文所述的化合物和组合物可用于多种临床应用。

本文所述的化合物和组合物可以诱导延长或长期抑制肿瘤的生长。在某些实施例中，对肿瘤生长的延长或长期抑制没有体重减轻或任何骨髓毒性或仅有边缘性骨髓毒性。

在一些实施例中，本公开提供了一种用于治疗恶性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者投予治疗有效量的包含本文所述化合物的药物组合物。例如，一些实施例包括用于治疗患有选自以下的疾病的患者的方法：癌症、病毒性疾病、自身免疫性疾病、性或慢性炎症性疾病，以及由细菌、真菌和其他微生物引起的疾病，所述方法包括：向有此需要的患者投予治疗有效量的根据本公开的化合物。

本公开提供了治疗患者的病症或疾病的方法，所述病症或疾病选自癌症、病毒性疾病、自身免疫性疾病、急性或慢性炎症性疾病，以及由细菌、真菌或其他微生物引起的疾病，所述方法包括：向患者投予本文所述的化合物或药物组合物。

在一些实施例中，癌症是血液癌或实体瘤癌。在一些实施例中，所述癌症选自癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或黑色素瘤。

在一些实施例中，癌症是腺癌、葡萄膜黑色素瘤、急性白血病、听神经瘤、壶腹癌、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胰腺癌、结缔组织肿瘤、膀胱癌、支气管癌、非小细胞支气管癌、乳腺癌、伯基特氏淋巴瘤、子宫体癌、CUP综合征、结肠癌、小肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胆囊癌、胆囊瘤癌、子宫癌、宫颈癌、颈、鼻、耳肿瘤、血液肿瘤、毛细胞白血病、尿道癌、皮肤癌、神经胶质瘤、睾丸癌、卡波济肉瘤、喉癌、骨癌、大肠癌、头颈癌、结肠癌、颅咽管瘤、肝癌、白血病、肺癌、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、结肠癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、肾癌、肾细胞癌、少突胶质细胞瘤、食道癌、溶骨癌和骨癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、舌癌、卵巢癌或淋巴腺癌。

一些实施例包括增加化合物在肿瘤中的代谢物的浓度的方法，其包括投予根据本公开的化合物。

变型和修改

在不脱离本公开的精神和范围的情况下，本领域技术人员将想到本文所述内容的变型，修改和其他实施方式。因此，本公开不限于前面的描述或下面的实施例。

范例

现在总体上描述了本公开的各个方面，通过参考以下实施例，将更容易理解这些方面，包括这些实施例仅出于说明本公开的某些特征和实施例的目的，而并非旨在进行限制。

等效实例

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能确定，本文所述的化合物，组合物及其使用方法的许多等效实例。这样的等效实例被认为在本公开的范围内。

实施例

化合物的制备和分析的材料和方法

除非另有说明，所有反应均在氮气惰性气氛下进行。除非另有说明，否则使用市售试剂而无需进一步纯化。购买的无水溶剂为无水形式(二氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃等)，所有使用的其他溶剂均为试剂级或HPLC或LCMS级。

在适用的情况下，通常将玻璃器皿和搅拌棒在110℃的烤箱中干燥至少12小时，然后在使用前在氮气气氛中冷却。所有其他反应均在用橡胶隔垫密封的圆底烧瓶中进行。使用塑料注射器或玻璃移液管转移液体试剂。使用涂有聚四氟乙烯的磁力搅拌棒磁力搅拌反应。使用旋转蒸发仪KNF RC 600和Heidolph Hei-VAP在减压条件下浓缩有机溶液。

使用预装的

SNAP Ultra和SNAP Ultra C18快速硅胶柱，使用

Isolera^TMOne和

Isolera^TMSL(大规模)快速纯化系统，进行快速柱色谱分析。

使用带有

mic-D电极的pH计WTW Inolab 7310在室温下测量溶液的pH值。

除非另有说明，否则使用配备SPD-M20A光电二极管阵列检测器的ShimadzuNexera XR HPLC系统进行高效液相色谱(HPLC)，并在220nm处进行监测。

使用液相色谱结合质谱(LCMS)在Bruker Amazon SL或Thermo Fisher LCQ优势质谱仪(电喷雾电离，ESI)上收集低分辨率质谱(LRMS)。使用液相色谱-电喷雾电离和飞行时间质谱仪(ESI-TOF)，在来自Bruker的micrOTOF仪器上记录了高分辨率质谱(HRMS)。元素分析是在带有C、H和S的红外检测器并带有用于N的热导检测器(TCD)的

CHNSMacro上进行的。

使用Martin Christ Alpha或Epsilon 2-4LSCplus冷冻干燥机进行冻干。

使用带有转子A-4-81的Eppendorf5810 R离心机，230V/50-60Hz，冷藏的条件下，进行离心。

使用离子色谱法测量三氟乙酸(TFA)含量，并使用Karl Fischer(KF)库仑法测量水含量。

在环境温度下，在400MHz光谱仪上记录核磁共振(NMR)光谱：Bruker Avance400Ultrashield(¹H谱在400MHz记录，¹³C谱在100MHz记录)。质子化学位移的所有值均以百万分率(δ)表示，并参考DMSO-d₆中的氘代质子(δ2.50)。碳子化学位移的所有值均以百万分率(δ)表示，并参考DMSO-d₆中的碳共振(δ39.52)。NMR数据表示如下：化学位移、多重性(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，p＝五重峰，m＝多重峰，br＝宽峰，dd＝双二重峰，td＝双三重峰)、偶合常数＝J(Hz＝赫兹)和积分。

HPLC方法

方法1：连接基中间体和最终产物Sulf07纯度的HPLC方法。色谱柱：PhenomenexKinetex Polar C18(150x 4.6mm，2.6μm，

)，梯度：流动相A：95∶5 醋酸铵10mM pH 7.0∶乙腈，流动相B：95∶5，乙腈∶醋酸铵10mM pH 7.0。B相的洗脱梯度：0-2.5分钟：0％，2.5-18分钟：0-45％，18-20分钟：45-75％，20-24分钟：75％，24-26分钟：75％-0％，26-30分钟：0％，30分钟：方法结束，流速＝1.0mL/min。

方法2：实例2和实例3的HPLC方法。色谱柱：Phenomenex Kinetex Polar C18(150x4.6mm，2.6μm，

)，梯度：流动相A：95∶5 乙酸铵10mM pH 7.0∶乙腈，流动相B：95∶5，乙腈∶乙酸铵10mM pH 7.0。B相的洗脱梯度：0-0.5分钟：30％，0.5-9分钟：30-95％，9-11分钟：95％，11-12.5分钟：95-30％，12.5-15分钟：30％，15分钟：方法结束，流速＝1.0mL/min。

方法3：用于连接基中间体和终产物Sulf07的LCMS方法。色谱柱：PhenomenexKinetex Polar C18(150x 2.1mm，2.6μm，

)，梯度：流动相A：95∶5 乙酸铵10mM pH 7.0∶乙腈，流动相B：95∶5，乙腈∶乙酸铵10mM pH 7.0。B相的洗脱梯度：0-2.5分钟：0％，2.5-18分钟：0-45％，18-20分钟：45-75％，20-24分钟：75％，24-26分钟：75％-0％，26-30分钟：0％，30分钟：方法结束。流速＝0.4mL/min。

方法4：实例2和实例3的LCMS方法。色谱柱：Phenomenex Luna OmegaPolar C18(50x 2.1mm，1.6μm，

)，梯度：流动相A：99.9∶0.1 水∶甲酸，流动相B：99.9∶0.1 乙腈∶甲酸。B相的洗脱梯度：0-0.5分钟：20％，0.5-3.5分钟：20-100％，3.5-5.0分钟：100％，5.0-5.5分钟：100-20％，5.5-7.0分钟：20％，7分钟：方法结束。流速＝0.4mL/min。

方法5：用于血浆结合实验的LCMS方法。色谱柱：Phenomenex Kinetex Polar C18(50x 2.1mm，2.6μm，

)，梯度：流动相A：95∶5 乙酸铵10mM pH 7.0∶乙腈，流动相B：95∶5，乙腈∶乙酸铵10mM pH 7.0。B相的洗脱梯度：0-1.0分钟：0％，1.0-7.0分钟：0-75％，7.0-7.5分钟：75-90％，7.5-8.5分钟：90-0％，8.5-10.0分钟：0％，10分钟：方法结束，流速＝0.4mL/min。

方法6：用于血浆结合的疏水结合色谱法(HIC)。色谱柱：MabPac HIC-20(250x4.6mm，5μm，

)，梯度：流动相A：1.5M(NH₄)₂SO₄，20mM Na₂HPO₄ pH 8.0，流动相B：20mMNa₂HPO₄ pH 8.0和20％异丙醇。B相的洗脱梯度：0-2.0分钟：0％，2.0-10.0分钟：0-50％，10.0-13.0分钟：50-60％，13.0-17.0分钟：60-100％，17.0-20.0分钟：100％，20.0-25.0分钟：100-0％，25.0-30.0分钟：0％，30分钟：方法结束，流速＝1mL/min。

方法7：HPLC法测定白蛋白药物缀合物的pH稳定性曲线。色谱柱：PhenomenexAerisWP C18(250x 4.6mm，3.6μm，宽孔)，梯度：流动相A：20mM pH 8.0的Tris缓冲液，流动相B：90％乙腈UHPLC和10％水。B相的洗脱梯度：0-0.5分钟：25％，0.5-2.5分钟：25-35％，2.5-16.0分钟：35-85％，16.0-17.0分钟：85-95％，17.0-20.0分钟：95％，20.0-25.0分钟：95-25％，25.0-30.0分钟：25％，30分钟：方法结束，流速＝1.0mL/min。

方法8：加速降解的API制剂的HPLC方法。色谱柱：Phenomenex Kinetex Polar C18(150x 4.6mm，2.6μm，

)，梯度：流动相A：95∶5 乙酸铵10mM pH 7.0∶乙腈，流动相B：95∶5，乙腈∶乙酸铵10mM pH 7.0。B相的洗脱梯度：0-2.5分钟：20％，0.5-9分钟：20-75％，9-11分钟：75％，11-12.5分钟：75-20％，12.5-15分钟：20％，15分钟：方法结束，流速＝1.0mL/min。

方法9：根据途径C制备的用于连接基中间体和终产物Sulf07纯度的HPLC方法。色谱柱：Phenomenex Kinetex Polar C18(150x 4.6mm，2.6μm，

)，梯度：流动相A：水中的0.1％三氟乙酸，流动相B：乙腈中的0.1％三氟乙酸，H₂O中的三氟乙酸，流动相B：乙腈中的0.1％的三氟乙酸。B相的洗脱梯度：0-5.5分钟：1％，5.5-20分钟：1-40％，20-22分钟：40-65％，22-24分钟：65％，24-27分钟：65％-1％，27-30分钟：1％，30分钟：方法结束，流速＝1.0mL/min。

方法10：由根据途径C获得的连接基Sulf07制备的AE-Keto-Sulf07纯度的HPLC方法。Kinetex Polar C18色谱柱(2.6μm，

150mm x 4.6mm)，梯度：流动相A：95∶5 乙酸铵5mM pH 7.0∶甲醇，流动相B：95∶5 甲醇∶乙酸铵5mM pH 7.0。B相的洗脱梯度：0-2.5分钟：60％，2.5-18分钟：60-80％，18-22分钟：80-95％，22-26分钟：95％，26-30分钟：方法结束。流速＝1.0mL/min。柱温箱：37℃。

实例1

如下所述制备Sulf07，5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1/Z-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-(肼基-羰基)-苯磺酸)，并根据途径A在方案1中显示。

方案1，途径A

4-硝基-2-磺基苯甲酸的合成(A)

在10秒内向搅拌的高锰酸钾(72g，460mmol，4.5当量，Sigma Aldrich)Millipore水溶液(450mL)中加入4-硝基-2-磺酸水合物(26g，102mmol，1.0当量，Aber)Millipore水溶液(100mL)。将所得的紫色混合物在115℃下搅拌5小时，此时间后变为褐色。HPLC(方法1，220nm)证实5小时后反应完成。将反应混合物冷却至室温。通过在硅藻土垫上抽滤除去反应过程中形成的棕色固体，用Millipore水溶液(300mL)洗涤，将棕色/黄色滤液在40℃减压下浓缩至125mL，用5M HCl溶液缓慢酸化，直到形成白色悬浮液(约pH为1)。然后将白色悬浮液在100℃加热直至获得澄清溶液，将其在冰浴中静置10分钟，直到形成白色固体。通过使用多孔滤器(孔径4)抽滤获得白色固体。然后将白色固体在高真空下干燥10小时以得到A。收率：18g，72％。HPLC(方法1，220nm)的纯度>95％。C₇H₄NO₇S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：245.98。实测值：245.83。

4-氨基-2-磺基苯甲酸的合成(B)

将4-硝基-2-磺基苯甲酸A(13g，51mmol，1.0当量)的Millipore水溶液(75mL)悬浮液搅拌并加热回流(120℃)直至完全溶解。在所述温度下，加入乙酸(7.2mL，SigmaAldrich)，然后加入铁粉(9.5g，180mmol，3.5当量，Sigma Aldrich)，在10分钟内分批加入(约1g/1.0min)避免放热反应。然后将反应混合物在回流下搅拌1小时。在此期间，形成棕色固体，HPLC分析(方法1，220nm)证实反应已完成。通过在硅藻土垫上直接抽滤除去棕色固体(当仍较热时)，并进一步用热水(3x 50mL)洗涤。然后将滤液通过Whatman滤纸(11μm)过滤。将得到的滤液在50℃减压浓缩至约100mL的体积。逐滴加入浓盐酸(约1mL/2.0分钟)直至达到pH 1，并沉淀出白色/黄色固体。将悬浮液在4℃下放置1小时。使用多孔滤器(孔径4)通过抽滤收集固体，并在高真空下干燥10小时，得到B，为白色固体。收率：9g，81％。HPLC(方法1，220nm)的纯度>95％。C₇H₄NO₅S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：216.00。实测值：216.16。

6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯或EMC-C1的合成(C)

在室温下和在氮气气氛下，使用滴液漏斗在30分钟(约1mL/2min)内向6-马来酰亚胺基酸(EMC)(33g，156mmol，1.0当量，Alfa Aesar)的无水二氯甲烷(150mL)溶液中搅拌加入草酰氯(15mL，171mmol，1.1当量，Sigma Aldrich)。注意：在加入过程中观察到有气体逸出。将反应在室温搅拌5小时。在反应期间，反应溶液的颜色变为深黄色，HPLC分析(方法1，220nm)证实5小时后反应完成。在40℃减压除去溶剂，得到油，将其在高真空下干燥过夜，得到固化的化合物。用刮刀将得到的浅褐色固体粉碎，并在高真空下干燥20小时，得到C，为黄色微晶固体。所述化合物无需进一步纯化即可用于下一步反应。收率：34g，95％。HPLC(方法1，220nm)的甲酯纯度>95％，C_nH₁₆NO₄(作为甲酯)[M+H]⁺的LRMS-ESI(m/z)计算值：226.10。实测值：225.97。

4-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-磺基苯甲酸的合成(D)

在氮气气氛下，将B(18.5g，85mmol，1.0当量)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(300mL)中。将溶液用冰浴冷却，并搅拌10分钟以达到4℃。然后，使用滴液漏斗在1小时内(约1mL/3.5min)将4-甲基吗啉(18.69mL，170mmol，2.0当量，Sigma Aldrich)滴加到冷却的溶液中。加入完成后，混合物变为黑褐色，并使用滴液漏斗在1小时内向所述黑褐色混合物中滴加(约0.5g/min)C(29.28g，127mmol，1.5当量)的无水N，N-二甲基甲酰胺溶液(200mL)。使反应混合物逐渐温热至室温过夜，然后在室温下搅拌10小时。如HPLC(方法1，220nm)所示，反应完全转化后，将反应溶液分配在8×50mL Falcon管中，并在10℃和4.000rpm下离心20分钟。除去上清液，将固体重悬于每管10mL的N，N-二甲基甲酰胺中，并再次在10℃和4.000rpm下离心20分钟。合并所有上清液，并在50℃减压浓缩3小时，得到浅橙色固体(收率：34g，HPLC纯度(方法1，220nm)为66％)。将所述固体重悬于甲醇(250mL)中，转移至8×50mL Falcon管中，并在10℃和4.000rpm下离心20分钟。除去上清液，并将固体重新悬浮在每管5mL的甲醇中，并再次在10℃和4.000rpm下离心20分钟。合并所有固体，并在高真空下干燥24小时，以获得D，为结晶黄色固体。收率：24g，37％。HPLC的纯度为(方法1，220nm)97％。C₁₇H₁₇N₂O₈S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：409.08。实测值：409.13。

2-(2-(叔丁氧基-羰基)肼-1-羰基)-5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己氨基)苯磺酸的合成或受BOC保护的连接基(E)

在氮气气氛下向D(17g，41.4mmol，1.0当量)的无水N，N-二甲基甲酰胺(350mL)溶液中加入N-(3-二甲基氨基-丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)(8.72g，45.5mmol，1.1当量，Roth)和羟基苯并三唑(HOBt)(6.15g，45.5mmol，1.1当量，Sigma Aldrich)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后加入肼基甲酸叔丁酯(7.12g，53.9mmol，1.3当量，Sigma Aldrich)，溶液从透明的黄色变成红色。将反应混合物在室温搅拌过夜。此时间之后，通过HPLC(方法1，220nm)确认反应完全转化。在40℃减压下除去溶剂，然后在室温高真空下继续进行1小时，得到紫棕色油，将其用具有两个预装SNAP Ultra 340g柱的闪蒸纯化系统纯化。使用线性梯度系统在60柱体积从100％二氯甲烷至90％/10％二氯甲烷/甲醇进行纯化。合并含有所需产物的试管，并在40℃减压干燥1小时，再在高真空下干燥6小时，得到E，为泡沫状黄色固体。收率：9g，17.1mmol，42％。HPLC(方法1，220nm)＞95％。C₂₂H₂₇N₄O₉S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：523.16。实测值：523.15。

连接基Sulf07，5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-(肼基-羰基)苯磺酸的合成

将黄色E(10.2g，19.4mmol，1.0当量)的无水二氯甲烷(30mL)溶液冷却至4-5℃，在30分钟内向其中滴加(约1mL/2.0min)三氟乙酸(15mL，Roth)。加入后，冷浴除去，并留下反应混合物，在室温下搅拌3小时。此后，通过HPLC(方法1，220nm)确认反应完成。将反应混合物逐滴倒入6个Falcon管中，每个管包括约35mL冷二乙醚。立即形成白色沉淀。将试管在4℃下静置3小时。将Falcon管在10℃和4000rpm下离心20分钟后，除去上清液，并将固体重新悬浮在每个管中的5mL乙醚中，并再次离心(4000rpm，20min，10℃)。再次除去上清液，收集固体，并在高真空下干燥20小时，得到连接基Sulf07，为白色微晶固体。收率：10g，23.6mmol，96％。HPLC(方法1，220nm)＞95％。C₁₇H₂₁N₄O₇S[M+H]⁺的LRMS-ESI(m/z)计算值：425.11。实测值：425.07。C₁₇H₁₉N₄O₇S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：423.11。实测值：423.12。C₁₇H₂₁N₄O₇S[M+H]⁺的HRMS-ESI(m/z)计算值：425.1125。实测值：425.1125。C₁₇H₁₉N₄O₇S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：423.0978。实测值：423.0980。

通过1H NMR确认了5-6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-(肼基-羰基)苯磺酸，Sulf07的结构：¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.94(s，1H；C1-NH)，10.27(s，1H；C8-NH)，8.01(d，J＝2.2Hz，1H；C4-CH)，7.93(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H；C6-CH)，7.68(d，J＝8.4Hz，1H；C7-CH)，7.00(s，2H；C15-CH，C16-CH)，3.40(t，J＝7.0Hz，2H；C13-CH₂)，2.32(t，J＝7.4Hz，2H；C9-CH₂)，1.60(p，J＝7.5Hz，2H；C10-CH₂)，1.52(p，J＝7.2Hz，2H；C12-CH₂)，1.26(q，J＝8.8Hz，2H；C11-CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆)δ172.20(C8)，171.54(C14，C17)，167.59(C1)，145.73(C5)，142.09(C3)，134.90(C15，C16)，132.09(C7)，123.79(C2)，119.44(C6)，117.47(C4)，37.42(C13)，36.65(C9)，28.22(C12)，26.21(C11)，24.90(C10).C₁₇H₂₁N₄O₇S的元素分析计算值；C，45.71；H，4.26；N，11.85；S，6.78。实测值：C，46.2917；H，4.4836；N，12.8879；S，6.7886。TFA含量＜2％(w/w)。

Sulf07，5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-(肼基-羰基)苯磺酸，其是按照以下方法制备的，并按照途径B在方案2中显示。

方案2，途径B

5-氨基-2-(2-(叔丁氧基-羰基)肼-1-羰基)苯磺酸的合成(F)

向4-氨基-2-磺基苯甲酸B(50.00g，230.20mmol，1.00当量)的无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF，1000mL)悬浮液中，5分钟内加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，40.20mL，29.75g，230.20mmol，1.00当量)。然后加入EDC-HCl(48.54mg，253.21mmol，1.10当量)，并将混合物在23℃下搅拌30分钟。然后加入肼基甲酸叔丁酯(33.46g，253.18mmol，1.10当量)，并将混合物加热至70℃并搅拌2小时。加入第二部分EDC-HCl(24.31g，126.68mmol，0.55当量)和肼基甲酸叔丁酯(16.76mg，126.68mmol，0.55当量)，并将反应混合物在70℃下继续搅拌14小时。将反应冷却至23℃，并通过

545(100g)过滤。

545用700mL甲醇另外洗涤。滤液在减压下浓缩，并通过使用七个预装的SNAP Ultra 340g滤芯的快速纯化系统纯化。使用线性梯度系统，从100％二氯甲烷至70％二氯甲烷/30％甲醇进行纯化，得到题述化合物F，为白色固体。收率：32.50g，98.09mmol，42.6％，HPLC(方法1，220nm)＞97％。C₁₂H₁₆N₃O₆S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：330.08。实测值：330.17。

N-乙基-N-异丙基丙-2-铵2-(2-(叔丁氧基羰基)肼-1-羰基)-5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-)己酰胺基)苯磺酸盐(E)的合成

向F(26.97g，81.40mmol，1.00当量)的无水二甲基乙酰胺(110mL)和无水四氢呋喃(THF，275mL)的混合物溶液中，在室温下，分批加入6-马来酰亚胺己酰氯C(26.60g，115.82mmol，1.42当量)的无水四氢呋喃(165mL)溶液。将澄清的反应溶液在室温搅拌10分钟。然后在搅拌下将反应混合物加入两个2L锥形烧瓶中，每个锥形烧瓶均包括二异丙醚(1100mL)和DIPEA(10.15mL)。一旦油沉降，小心地倒出上清液，并用二异丙醚(2×100mL)洗涤油，将其溶于甲醇中，合并，并在高真空下除去溶剂。通过使用六个预装的SNAP Ultra340g滤芯的快速纯化系统纯化所得油。使用线性梯度系统，从100％二氯甲烷至80％二氯甲烷/20％甲醇进行纯化，得到题述化合物E，为白色固体。收率：24.00g，36.71mmol，45.1％，HPLC(方法1，220nm)＞95％。C₂₂H₂₇N₄O₉S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：523.15。实测值：523.30。

5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-(肼基-羰基)苯磺酸(Sulf07)的合成

在1小时内向E(21.00g，32.12mmol，1.00当量)的二氯甲烷(150mL)冷溶液(4℃)中加入三氟乙酸(25.00mL，37.25g，326.70mmol，10.17当量)。然后使反应逐渐加热(超过30分钟)至室温，并搅拌1小时。将反应混合物在0℃下，1小时内经由分液漏斗滴加到含有二异丙醚(1.4L)的2L锥形烧瓶中。将所得白色固体通过

多孔烧结漏斗过滤，并依次用二氯甲烷(2×1000mL)和二异丙醚(2×1000mL)洗涤。固体在烧结漏斗中在室温下干燥过夜。在高真空下于25℃进一步干燥2小时。获得为白色固体的最终产物Sulf07。收率：13.58g，32.00mmol，99.6％，HPLC(方法1，220nm)>96％。C₁₇H₁₉N₄O₇S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：423.10。实测值：423.21。

Sulf07，5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-(肼基-羰基)苯磺酸，按照途径C如下所述制备并显示在方案2中。

方案2，途径C

5-氨基-2-(2-(叔丁氧基羰基)肼-1-羰基)苯磺酸的合成(F)

向B(30.00g，138.12mmol，1.00当量)的无水乙腈(600mL)的悬浮液中加入三乙胺(41.93g，57.76mL，414.37mmol，3.00当量)，并将混合物搅拌10分钟。之后，加入肼基甲酸叔丁酯(27.38g，207.19mmol，1.50当量)，并将混合物冷却至-35℃。在所述温度下，在1小时内滴加丙基膦酸酐溶液T3P(114.27g，106.79mL，179.56mmol，50％乙酸乙酯溶液，1.3当量)。将反应在-35℃下搅拌2小时。使混合物加热至室温，并通过

545(100g)过滤。

用乙腈(500mL)另外洗涤。合并两种滤液并浓缩至250mL。将溶液均等地分成6份，并在减压下除去溶剂。将各部分溶于含有1％Et₃N的二氯甲烷(50mL)中，并在带有预装SNAP Ultra340g色谱柱的Biotage Isolera^TMOne快速纯化系统上通过NP快速色谱进行纯化，使用7倍柱体积的DCM(含1％NEt₃)从2％至12％甲醇(含1％NEt₃)逐步梯度。然后，合并所有部分的纯化馏分，减压除去溶剂，并将固体在高真空下干燥，得到题述化合物F，为灰白色固体。收率：53.25g，108.0mmol，78.2％(在DMSO-d₆中的NMR显示存在1.6当量的三乙胺)。HPLC(方法9，220nm)＞99％。C₁₂H₁₆N₃O₆S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：330.08。实测值：330.08。

N-乙基-N-异丙基丙烷-2-铵-2-(2-(叔丁氧基羰基)肼-1-羰基)-5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-)己酰胺基)苯磺酸盐(E)的合成

向F(45.00g，91.24mmol，1.00当量)和6-马来酰亚胺基己酸(19.27g，91.24mmol，1.00当量)的混合物中，在室温下分批加入乙腈(450mL)，三乙胺(13.85g，19.08mL，136.86mmol)和T3P(43.55g，40.70mL，136.86mmol，50％乙酸乙酯溶液)。将所述溶液在室温搅拌24小时。减压除去溶剂。然后通过使用七个预装的SNAP Ultra 340g柱的快速纯化系统，在2％甲醇至15％甲醇的二氯甲烷溶液中进行线性梯度洗脱，纯化粗产物，得到题述化合物E，为灰白色固体。收率：30.55g，53.5％(在DMSO-d₆中的NMR显示存在1.1当量的三乙胺)。HPLC(方法9，220nm)＞99％。C₂₂H₂₇N₄O₉S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：523.15。实测值：523.26。

5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-2-(肼基-羰基)苯磺酸(Sulf07)的合成

在15分钟内向E(10.00g，15.98mmol，1.00当量)的二氯甲烷冷悬浮液(4℃)(50mL)中加入三氟乙酸(18.22g，12.31mL，159.81mmol，10.17当量)。将混合物在4℃下进一步搅拌15分钟，然后使其逐渐加热至室温并搅拌150分钟。经由分液漏斗将反应混合物滴加到甲基叔丁基醚，MTBE(400mL)和二氯甲烷(200mL)的搅拌溶液中。将所得白色固体通过

多孔烧结漏斗过滤，并且依次用二氯甲烷(2×150mL)和MTBE(1×50mL)、MeOH(1×50mL)和再加入MTBE(2×150mL)洗涤。固体在烧结漏斗中在室温下干燥过夜，持续10分钟。在25℃在高真空下继续干燥18小时。获得为黄色固体的最终产物Sulf07。收率：5.786g，13.63mmol，98.7％，HPLC(方法9，220nm)＞96％。C₁₇H₁₉N₄O₇S[M-H]^-的LRMS-ESI(m/z)计算值：423.10。实测值：422.95。

实例2

化合物AE-Keto-Sulf07，2-(2-((R)-2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N，3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-1-苯基亚丙基)肼-1-羰基)-5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)苯磺酸，如下所述合成并显示在方案5中。

方案5

(S)-1-(((S)-1-(((3R，4S，5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((IR，2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((R)-1-氧代-1-苯基丙烷-2-基)氨基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧庚基-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-N，N，3-三甲基-1-氧代丁-2-铵2，2，2-三氟乙酸盐(AE-Keto TFA盐)的合成

途径A：根据专利US6884869-B2的改进方法进行合成

在氮气气氛下，将氯铬酸吡啶鎓(PCC)(382mg，1.772mmol，1.5当量，SigmaAldrich)加入到澳瑞他汀E TFA盐(1000mg，1.183mmol，Levena Biopharma)的无水二氯甲烷(30mL)溶液中。将反应混合物在室温搅拌17小时。LC-MS(方法4，正模式)显示了原料的完全转化。将反应混合物用25mL二氯甲烷稀释，并用盐水(3×20mL)洗涤。将水相用二氯甲烷(20mL)萃取一次。将合并的有机相在40℃减压蒸发。将残留物溶于7.5mL乙腈中，并使用预装的SNAP Ultra C1830g柱通过RP快速色谱法纯化，在16倍柱体积上使用从2％到40％乙腈(+0.1％TFA)的水溶液(+0.1％TFA)逐步梯度洗脱。合并纯产物级分，在40℃减压除去乙腈，并将残余溶剂冻干，得到白色固体。收率：530mg，53％。RP-HPLC(方法2，220nm)：＞95％。C₄₀H₆₈N₅O₇[M+H]⁺的LRMS-ESI(m/z)计算值：730.51。实测值：730.34。

途径B：使用与聚合物结合的氧化剂进行合成

将IBX-聚苯乙烯(1.13g，4.5当量，1.34mmol，负载1.18mmol/g，MerckNovabiochem)悬浮在无水二氯甲烷(7.5mL)中，并在室温下轻轻搅拌15分钟。加入溶于无水二氯甲烷(5mL)中的AE TFA盐(250mg，295.51μmol，Sage Chemical Co.)，并将混合物在室温下轻轻搅拌。21小时后，通过HPLC(方法2，220nm)观察到原料完全转化为产物。通过在折叠滤纸(等级3hw，Sartorius)上过滤除去树脂，用二氯甲烷洗涤，并将合并的滤液在40℃减压蒸发至干。将油状残余物与乙醚一起研磨，形成灰白色沉淀，将其在高真空下干燥，得到泡沫状灰白色固体。收率：171mg，69％，HPLC(方法2，220nm)＞99％。C₄₀H₆₈N₅O₇[M+H]⁺的LRMS-ESI(m/z)计算值：730.51。实测值：730.69；C₄₀H₆₆N₅O₇[M-H]^-的计算得值：728.50。实测值：728.79。

2-(2-((R)-2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N，3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-1-苯基亚丙基)肼-1-羰基)-5-(6-(2，5-二氧-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)苯磺酸(AE-Keto-Sulf07)的合成

合成1：在氮气下，将AE-KetoTFA盐(200mg，236.96μmol)溶解在无水乙醇(6mL)中，然后加入分子筛(0.3nm珠，3A)。加入溶于无水二甲基亚砜(1.5mL)中的Sulf07(201mg，473.92μmol，2当量)。在室温搅拌黄色溶液。在24和44小时后，获取用于HPLC/LC-MS分析的样品(方法2和4，220nm)。转化后(44小时后85％)，混合物通过0.2μm PVDF针筒式过滤器过滤，减压除去大部分乙醇。逐滴加入3mL的200mM磷酸钠pH 7.2，直到溶液的pH约为6。通过预装SNAP Ultra C1830g柱的RP快速色谱法纯化溶液(约5mL)，使用16倍柱体积从2％到50％乙腈的水溶液逐步梯度洗脱。通过HPLC(方法2，220nm)分析产物级分，合并纯级分，在减压下除去乙腈，并将残余溶液冻干，得到灰白色蓬松固体。收率：113mg，42％，熔点：＞105℃。HPLC(方法2，220nm)＞95％。C₅₇H₈₆N₉O₁₃[M+H]⁺的LRMS-ESI(m/z)计算值：1136.61。实测值：1136.76；C₅₇H₈₄N₉O₁₃[M-H]^-的计算值：1134.59。实测值：1135.09。¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ11.21(2x s，1H)，10.09(2x s，1H)，8.66(d，J＝8.3Hz，1H)，8.20(2x d，J＝8.4Hz，1H)，7.84-7.69(m，2H)，7.50-7.41(m，1H)，7.35-7.21(m，5H)，6.98(s，2H)，4.96-4.84(m，1H)，4.77-4.60(m，1H)，4.56(td，J＝8.6，2.2Hz，1H)，4.03-3.92(m，1H)，3.61-3.52(m，1H)，3.51-3.41(m，2H)，3.38(t，J＝7.0Hz，2H)，3.35-3.32(m，1H)，3.20(m，7H)，3.02(2x s，3H)，2.61(2x s，6H)，2.47-2.37(m，1H)，2.26(t，J＝7.4Hz，2H)，2.22-2.04(m，3H)，2.04-1.91(m，1H)，1.88-1.63(m，3H)，1.62-1.43(m，7H)，1.37-1.27(m，4H)，1.27-1.19(m，2H)，1.06(d，J＝6.6Hz，2H)，0.98(d，J＝6.6Hz，1H)，0.96-0.88(m，8H)，0.87-0.81(m，5H)，0.80-0.73(m，5H).¹³CNMR(101MHz，DMSO-d₆)δ172.67，172.38，172.26，171.47，171.45，171.13，171.10，168.76，168.52，166.64，166.23，164.82，164.61，156.63，155.75，144.76，144.68，140.27，140.14，134.46，133.00，131.89，131.79，128.78，128.56，128.40，128.31，127.66，127.61，127.10，120.25，118.66，118.56，116.47，116.34，85.45，81.38，77.69，76.74，71.91，60.94，60.20，58.57，58.16，57.05，55.07，54.48，54.39，49.25，48.86，47.18，46.24，43.58，43.12，41.50，41.44，37.15，36.96，36.15，35.01，31.83，31.57，30.04，29.94，27.77，26.68，26.64，25.76，25.39，25.27，24.52，24.50，24.29，23.17，19.30，19.28，18.85，18.62，18.57，18.48，18.20，17.17，16.92，15.58，15.51，15.23，14.96，10.43，10.25。注意：由于溶液中存在构象异构体，一些¹H-NMR信号被分成两个不同的信号。因此，¹³C-NMR光谱中的峰值高于AE-Keto-Sulf07预期的碳数。

合成2：在氮气下的25mL圆底烧瓶中，将AE-Keto(150mg，0.177mmol，1.0当量)和得自途径C的Sulf07(93mg，0.213mmol，1.2当量)溶解于无水EtOH(225μL)和无水DMSO(225μL)的混合物中。在室温下超声处理5分钟后，完全溶解。加入活化的分子筛，并将所得黄色悬浮液在室温下搅拌，并通过HPLC分析检查进展。22小时后，将反应混合物转移至2mLEppendorf管中，将反应小瓶用600μLDMSO-EtOH(1∶1)洗涤两次，并将合并的部分离心。将固体与上清液分离。通过向上清液中加入45μL MTBE沉淀产物。将白色悬浮液离心，并丢弃所得上清液。目标化合物的纯化在配备有AQ C18球形20-35μm 100A 40gr色谱柱的IsoleraOne系统(Biotage AB，Upsala，瑞典)上进行，梯度为2％至50％的水/乙腈。冻干后，获得题述化合物，为灰白色固体。收率80mg，40％。HPLC(方法10，220nm)＞97％。根据先前报道的NMR和LC-MS分析。

实例3

2-(2-(1-(4-(((1S，2R)-2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4R，5S)-4-((S)-2-((R)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N，3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-1-苯基丙氧基)羰基)苯基)亚乙基肼-1-羰基)-5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)苯磺酸，化合物AE-Ester-Sulf07的合成如下所述并显示在方案6中。

方案6

(1S，2R)-2-((3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5R)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N，3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-1-苯基丙基4-乙酰基苯甲酸酯(AE-Ester)的合成

根据专利US6884869-B2的改进方法进行合成

存在分子筛(0.3nm珠，

)，向澳瑞他汀E TFA盐(1.0g，1.18mmol，1.0当量，Levena Biopharma)和4-乙酰基苯甲酸(198mg，1.42mmol，1.2当量，Acros Organics)的无水二氯甲烷(18mL)溶液中，加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP，244mg，2.36mmol，2.0当量，Carbolution)和N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC，186μL，1.42mmol，1.2当量，SigmaAldrich)。将混合物在室温搅拌5小时。通过HPLC(方法2，220nm)监测反应进程，显示转化为期望的产物，转化率为81％。进一步加入DIC(155μL，1.18mmol，1.0当量，Sigma Aldrich)，并将混合物在室温下搅拌18小时，此后HPLC显示98％的反应转化为所需产物。在合成不同批次的化合物期间，已经注意到，当使用来自新打开的瓶子的新鲜DIC时，不需要第二次加入。通过折叠滤纸(等级3hw，Sartorius)将分子筛和精细形成的沉淀物(DIC副产物)滤出，并将所得的澄清黄色溶液用HCl(0.1M，15mL)洗涤一次。将水层用二氯甲烷(15mL)反萃取一次，然后将有机层合并，用盐水(15mL)洗涤一次，并用硫酸钠干燥。将所述溶液在40℃减压浓缩，得到黄色油，然后将其溶于最小量的二氯甲烷(5mL)中。加入过量的乙醚(50mL)以产生白色固体。将混合物在2-4℃下放置30分钟，然后通过离心分离固体。重复沉淀步骤3次，并将白色粉末在减压下干燥。收率：706mg，68％。通过HPLC的纯度(方法2，220nm)98％。C₄₉H₇₅FN₅O₉[M+H]⁺的LRMS-ESI(m/z)计算值：879.20。实测值：878.70。

2-(2-(1-(4-(((1S，2R)-2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4R，5S)-4-((S)-2-((R)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N，3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-1-苯基丙氧基)羰基)苯基)亚乙基)肼-1-羰基)-5-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)苯磺酸(AE-Ester-Sulf07)的合成

在分子筛(0.3nm珠，

)的存在下，将Sulf07(164mg，0.31mmol，1.1当量)的无水二甲基亚砜(2mL)溶液加入到AE-Ester(243mg，0.28mmol，1.0当量)的无水乙醇(8mL)溶液中。加入对甲苯磺酸(10.5mg，0.05mmol，0.2当量)以催化反应，然后在室温下搅拌反应。也可以使用TFA代替对甲苯磺酸。通过HPLC(方法2，220nm)监测反应，显示15小时后完全转化。通过折叠滤纸(3hw，Sartorius)过滤，从反应溶液中除去分子筛和形成的细小沉淀。用过量的甲基叔丁基醚(60mL)沉淀溶液，并将混合物在2-4℃下放置30分钟。然后通过离心分离沉淀物以获得黄色粘性固体。将黄色粘性固体溶解在甲醇/二氯甲烷3/7(10mL)中，并将溶液注入带有预装SNAP Ultra 25g滤芯的快速纯化系统中。在17柱体积中，使用100％二氯甲烷至60％二氯甲烷/40％甲醇的逐步梯度，在正相上进行纯化。使用17柱体积，从100％二氯甲烷至60％二氯甲烷/40％甲醇逐步梯度，在正相上进行纯化。合并含有产物的管并在高真空下干燥。收率：162mg，45％收率。通过RP-HPLC(方法2，220nm)的纯度为96％。C₆₆H₉₃N₉O₁₅S[M+H]⁺的LRMS-ESI(m/z)计算值：1285.58。实测值：1282.40。¹HNMR(400 MHz，DMSO-d₆)δ12.24(d，J＝5.3Hz，1H)，10.21(s，1H)，9.20(2x br.s，1H)，8.32-7.90(m，8H)，7.74-7.71(dd，J＝8.5，2.7Hz，1H)，7.41-7.27(m，5H)，7.00(s，2H)，6.13-6.02(2x d，J＝5.0Hz，1H)，4.80-4.51(m，2H)，4.41-4.23(m，1H)，4.09-3.55(m，3H)，3.54-3.37(t，J＝7.0Hz，3H)，3.27-3.17(m，8H)，3.00(s，2H)，2.88-2.63(m，5H)，2.37-2.30(m，6H)，2.22-1.80(m，4H)，1.75-1.48(m，7H)，1.42-1.22(m，6H)，1.18-1.11(m，3H)，1.10-1.04(m，3H)，1.00-0.74(m，20H).¹³CNMR(101MHz，DMSO)δ172.93，172.65，171.44，170.94，168.61，168.49，164.59，164.52，164.24，164.16，149.20，144.83，143.05，142.96，140.71，137.97，137.78，134.30，132.25，129.43，129.38，129.31，129.21，128.39，128.31，126.49，126.44，126.35，125.72，118.77，116.77，85.20，81.26，77.65，77.04，76.84，60.82，60.12，58.59，58.03，57.01，48.35，47.76，47.15，46.03，43.60，42.99，36.89，36.11，31.64，29.89，29.73，27.70，26.56，25.70，25.33，25.04，24.42，24.04，23.03，19.16，18.63，18.44，18.37，15.50，15.47，15.29，15.14，13.88，13.84，10.19，10.04。注意：由于溶液中存在构象异构体，一些¹H-NMR信号被分成两个不同的信号。因此，¹³C-NMR光谱中的峰值高于AE-Ester-Sulf07的预期碳数。

AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07的人血清白蛋白缀合物在pH 7.4和pH 4.1时的pH依赖性释放(图11和12)

在无水DMSO中将结合白蛋白的澳瑞他汀的Sulf07衍生物制备为2mM的储备溶液。

在pH 7.4下释放：将442.4μL的1000μM还原型人血清白蛋白(881μM游离半胱氨酸-34)和727.6μL PBS缓冲液(4mM磷酸钠pH 7.4和150mM NaCl)加入密封的HPLC小瓶中，并在37℃下孵育30分钟。孵育30分钟后，将130μL适当的DMSO药物储备溶液加入到预孵育的小瓶中，以产生200μM的澳瑞他汀药物溶液和300μM的白蛋白溶液(游离半胱氨酸-34)。使混合物在37℃下反应10分钟，然后通过HPLC分析(方法7，20μL进样)。1小时后重复注射，然后每小时一次直至24小时。

在pH 4.1下释放：将408.5μL的1000μM还原型人血清白蛋白(881μM游离半胱氨酸-34)和539.4μL的水加入到密封的HPLC小瓶中，并在37℃下孵育30分钟。在另一个小瓶中，将190μL乙酸钠缓冲液50mM pH 3.0和24.7μL 1M HCl在37℃下孵育30分钟。孵育30分钟后，将120μL适当的DMSO药物储备溶液加入到预孵育的小瓶中，以产生白蛋白药物缀合物。孵育10分钟后，加入132μL乙酸钠缓冲溶液，以产生200μM澳瑞他汀药物衍生物溶液和300μM白蛋白溶液(游离半胱氨酸34)。通过HPLC直接分析所得溶液(方法7)。1小时后重复从小瓶中注射，然后每小时进行一次直至24小时。

通过HPLC测定游离药物的释放百分比，并具有游离药物的校准曲线(200μM，100μM，50μM，25μM和12.5μM)，即AE-Keto用于AE-Keto-Sulf07，AE-Ester用于AE-Ester-Sulf07。使用DMSO作为溶剂制备药物储备溶液，并在进行HPLC分析之前，用磷酸盐缓冲剂(4mM磷酸钠pH 7.4和150mM NaCl)稀释10倍。药物释放的计算基于AUC：254nm处的AE-Keto和310nm处的AE-Ester(局部UV最大值)。pH值从7.4更改为4.1时，AE-Ester的释放百分比高于AE-Keto的百分比(比较图11和12)。

AE-Keto-Sulf07和AE-Keto-EMCH的重构稳定性(图1)

将结合白蛋白的AE-Keto药物衍生物在含有5％蔗糖(w/v)和2％2-羟丙基-β-环糊精(2-HPβCD)的50mM磷酸钠缓冲液pH 7.6中重构。两种药物均以1277μM(相当于4.5mg/kg小鼠异种移植剂量)的浓度重构，通过HPLC(方法2，254nm)确认了两种药物的溶解。通过HPLC在室温下在240分钟内每隔15分钟监测重构药物的稳定性，以分析马来酰亚胺水解和API损失。AE-Keto-Sulf07比AE-Keto-EMCH更稳定(见图1)。

AE-Ester-Sulf07和AE-Ester-EMCH的重构稳定性(图2)

将结合白蛋白的AE-Ester衍生物在含有5％蔗糖(w/v)和4％2-HPβCD的50mM磷酸钠缓冲液pH 7.6中重构。两种药物均以655μM(相当于2.4mg/kg小鼠异种移植剂量)的浓度重构，通过HPLC(方法2，310nm)确认了两种药物的溶解。通过HPLC在室温下在240分钟内每隔15分钟监测重构药物的稳定性，以分析马来酰亚胺水解和API损失。AE-Ester-Sulf07比AE-Ester-EMCH更稳定(请参见图2)。

澳瑞他汀-Sulf07衍生物在人血浆、大鼠血浆和CD1小鼠血浆中的结合动力学(图5至10)。

从-80℃的储存器中取出CD1小鼠血浆和Sprague Dawley大鼠血浆，使其达到室温。将解冻的血浆在13.6kRPM下离心60秒，将上清液通过过滤针(5μm)过滤，然后通过0.45μm CA膜过滤。

全血取自健康的人类志愿者(EDTA收集管)，通过以3000RPM的速度旋转3分钟将血浆与红细胞分离。然后在献血后2小时内直接使用血浆。每个结合实验使用360μL适当的血浆。

所有结合实验均一式三份进行。使用EppendorfThermomixer C在37℃孵育血浆。孵育30分钟后，将40μL合适的结合白蛋白的澳瑞他汀-Sulf07衍生物溶解在其重构溶液中，并加入到血浆中。15秒、2分钟、4分钟、8分钟和15分钟后取样(40μL)(5个样品)。

立即将样品加入160μL乙腈(含有4μg/mL的‘MMAE作为内标)中，涡旋振荡1分钟。

将溶液移液到冲击等离子沉淀板中(摇动60秒)，并通过真空过滤到96孔板上。使用MRM MS2阴性模式(多反应监测)通过LCMS定量(方法5，30μL进样)确定剩余药物。母体离子：澳瑞他汀F(Mass-744.8)，AE-Keto-Sulf07(Mass-1135.1)和AE-Ester-Sulf07(Mass-1283.2)。通过将AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07的AUC与每种化合物的LCMS生成的校准曲线进行比较，确定结合百分比。

程序：澳瑞他汀-Sulf07衍生物与人血清白蛋白的半胱氨酸34的结合特异性(图3至4)。

将结合白蛋白的澳瑞他汀-Sulf07衍生物在50mM磷酸钠缓冲液pH 7.6和含有2-HPβCD的5％蔗糖中重构。2％HPβCD浓度分别用于重构AE-Keto-Sulf07和4％AE-Ester-Sulf07。两种药物均以1mg/mL的浓度重新配制(AE-Ester-Sulf07780μM，AE-Keto-Sulf07880μM)。

从-80℃的存储器中取出人血浆，使其达到室温。将解冻的血浆在13.6kRPM下离心60秒，将上清液通过过滤针(5μm)过滤，然后通过0.45μm CA膜过滤。每个结合实验使用180μL适当的血浆。使用EppendorfThermomixer C在37℃孵育血浆。孵育30分钟后，加入20μL适当的结合白蛋白的澳瑞他汀-Sulf07衍生物。使白蛋白结合药物在37℃下在血浆中反应5分钟。5分钟后，通过HPLC疏水相互作用色谱法(HIC，方法6，250nm)直接分析溶液，以证实与白蛋白位点特异性缀合和白蛋白药物缀合物的形成。

冻干澳瑞他汀制剂的加速降解：EMCH和Sulf07稳定性的比较(图24至25)。

将API溶解在冻干缓冲液中，所述冻干缓冲液包括2-HPβCD、10mM柠檬酸钠pH6.2、50％叔丁醇(V/V)。对于AE-Keto衍生物，使用2％(w/v)2-HPβCD溶解浓度为1.27mM的AE-KetoAPI；对于AE-Ester衍生物，使用4％(w/v)2-HPβCD溶解浓度为1.05mM的API。使用Acrodisc Fluorodyne II注射器过滤器(0.2μm)无菌过滤溶解的API。将无菌溶液移液至冻干瓶中，然后使用橡胶塞将其部分密封。随后将小瓶放入冷冻干燥器中冻干。开始主要干燥2小时后，将小瓶在-40℃的冷冻干燥机架子上冷冻2小时。主要干燥运行26小时，参数：架子温度-20℃，真空度0.0048mbar。主要干燥后，开始最终干燥。最终干燥运行16小时，参数：架子温度20℃，真空度0.0047mbar。最后干燥完成后，将小瓶真空密封。

使用带有板插入物(Smartblock)和盖的EppendorfThermomixer C，将密封的小瓶在55℃下孵育。在选定的时间点(t：0、46、94、166和264小时)将样品移出并溶解在无水DMSO中。通过HPLC测定API的稳定性(方法8，AE-Keto衍生物为254nm，AE-Ester衍生物为310nm)。通过与时间0的每个API的AUC进行比较，确定每个时间点的马来酰亚胺水解百分比。AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07比各自的EMCH衍生物AE-Keto-EMCH和AE-Ester-EMCH更稳定(请参见图24和图25)。

实例4

针对一组肿瘤细胞系评估澳瑞他汀E、AE-Keto和AE-Ester的一般程序。

IC₅₀测定

将样品作为药物级DMSO的冷冻储备溶液提供给Charles River DiscoveryResearch Services Germany GmbH(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德国)。实验的每一天，将冷冻的分装试样储备溶液解冻。随后的连续稀释使用中间稀释板用完整的RPMI 1640细胞培养基实现。然后将取自中间稀释板的10μL转移至细胞培养板的140μL/孔。以0.003nM至100nM的半对数增长，以10种浓度一式三份用测试化合物处理细胞96小时。

通过使用CellTiter-

细胞生存力测定(Promega，Mannheim，德国)在一组6种选定的人类癌细胞系中测试化合物。IC值报告为IC₅₀绝对值，对于所有测试的细胞系，以测试化合物的IC₅₀值的几何平均值的形式获得。

所使用的细胞系是LXFL 1674L(从患者来源的异种移植物在Charles RiverDiscovery Research Services Germany GmbH建立)、SW-620(由NCI，Bethesda，MD，USA提供)、CAL-27(购自DSMZ，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，Braunschweig，德国)、RKO、MDA-MB-468和SK-OV-3(来自ATCC，美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，美国)。DSMZ通过STR(短串联重复序列)分析和基于PCR的DNA指纹分析方法证明了所有细胞系的真实性。通常细胞系每周传代一次或两次，并在培养物中维持多达20代。细胞在37℃的潮湿环境中，在5％CO₂的RPMI 1640培养基(25mM HEPES，含L-谷氨酰胺，Biochrom，Berlin，德国)中加入10％(v/v)胎牛血清(Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德国)和0.1mg/mL庆大霉素(Life Technologies，Karlsruhe，德国)。根据制造商的说明使用CellTiter-

细胞活力测定法。简而言之，从指数相培养物中收获细胞，进行计数并以4,000-10,000个细胞/孔的细胞密度接种在96孔平底微量滴定板中，具体取决于细胞系的生长速率。在24小时的恢复期后，允许细胞恢复指数生长，然后加入10μL培养基(六个对照孔/板)或含测试化合物的培养基。将化合物以10个浓度一式三份以半对数增量应用，直至100nM，并连续处理细胞96小时。细胞处理四天后，加入20μL/孔CellTiter-

试剂。在长达4小时的温育期后，使用Enspire多模式读板器测量荧光(FU)(激发λ＝531nm，发射λ＝615nm)。IC₅₀值是使用GraphPad Prism生物分析软件(San Diego，CA，美国)确定的。

在六个测试的肿瘤细胞系中观察到具有S形浓度-效应曲线的浓度依赖性活性。AE-Keto的几何平均IC₅₀值为259±0.11μM，AE-Ester为399±0.19μM。与高效药物MMAE(171±0.10μM)和AE(130±0.05μM)相比，AE-Keto和AE-Ester衍生物在皮摩尔范围内具有相似的细胞毒性。

实例5

在患者源性肿瘤异种移植模型中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物的一般程序。

来自Charles River Discovery Research Services Germany GmbH的雌性免疫缺陷NMRI裸鼠，在异氟烷麻醉下用人源性肿瘤在左侧皮下植入单侧肿瘤植入物，直到肿瘤可触及并达到所需的体积。

将动物饲养在笼子中，笼子内的温度保持在25±1℃，相对湿度为45-65％，换气速度为每小时60倍。将小鼠保持在14小时光照/10小时黑暗的人造光照周期下。用来自EnvigoRMS SARL的高压灭菌的Teklad Global 19％蛋白质挤压饲料(T.2019S.12)，并采用每周更换两次的无菌过滤和酸化(pH 2.5)自来水喂养动物。随意提供饲料和水。在治疗之前，考虑组肿瘤体积的中位数和平均值，将动物随机分组(每组7-8只小鼠)。每天在工作日对动物进行例行两次监测，在周六和周日每天进行例行监测。从第0天开始，每周两次对动物称重。个体动物的相对体重(RBW)通过将第X天的个体绝对体重(BW_x)除以随机化当天的个体体重乘以100％来计算。在随机化当天(第0天)使用卡尺进行二维测量来确定肿瘤体积然后每周两次。根据以下方程式计算肿瘤体积：

肿瘤体积[mm³]＝1[mm]×w²[mm²]×0.5，其中“1”是肿瘤的长度，“w”是肿瘤的宽度。计算第X天单个肿瘤的相对体积(RTV_x)，通过将第X天(Tx)上各个肿瘤的绝对个体肿瘤体积[mm³]除以随机化当天同一肿瘤的绝对个体肿瘤体积乘以100％。在动物福利政策允许的范围内应用时间表。在肿瘤体积>2000mm³(单侧)时终止单个小鼠。为了评估抗肿瘤功效的统计学意义，进行非参数Kruskal-Wallis检验，然后使用Dunn方法进行成对比较，从而比较测试组和对照组的各个RTV，在测试组中达到最低T/C值的日期，其中T/C[％]＝(RTV_x治疗组中位数/RTV_x对照组中位数)x 100。只有在相关组中至少有50％的最初随机化的动物还活着时才进行统计分析。在同一天进行测试组之间的比较。按照惯例，p值≤0.05表示抑制肿瘤的重要性。使用GraphPad Prism生物分析软件进行统计计算(San DiegoCalifornia美国，www.graphpad.com)。

在剂量发现研究和细胞系派生肿瘤异种移植模型中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物的一般程序。

来自法国Janvier的雌性免疫缺陷NMRI裸鼠在皮下接种缓冲液/基质胶(1∶1)中培养的5x10⁶-10⁷癌细胞，直到肿瘤可触及并达到所需的体积(用于异种移植研究)。

将动物关在笼子中(Macrolon II型金属丝网)，温度保持在22±1℃，相对湿度为50±10％，换气速度为每小时60倍。将小鼠保持在12小时光照/12小时黑暗的人造光照周期下。用高压灭菌的SsniffNM(Soest，德国)，并采用每周更换两次的无菌过滤和酸化(pH4.0)自来水喂养动物。随意提供饲料和水。在治疗之前，将动物随机分组(在剂量发现研究中每组3-4只小鼠，在异种移植研究中每组7-8只小鼠)，考虑组肿瘤体积的中位数和平均值。在实验开始时和实验期间每天两次检查动物的健康。使用的标识：耳标和笼标签。从第0天开始，每周对动物称重两到三次，每组的平均体重与以百分比表示的初始值相关，以计算体重变化(BWC)。在随机化当天(第0天)用卡尺进行二维测量来确定肿瘤直径，然后每周两次或三次。根据以下方程式计算肿瘤体积：

肿瘤体积[mm³]＝1[mm]×w²[mm²]×0.5，其中“1”是肿瘤的长度，“w”是肿瘤的宽度。计算第X天单个肿瘤的相对体积(RTV_x)，通过将第X天(Tx)上各个肿瘤的绝对个体肿瘤体积[mm³]除以随机化当天同一肿瘤的绝对个体肿瘤体积乘以100％。在动物福利政策允许的范围内应用时间表。在肿瘤体积＞1500mm³(单侧)或观察到溃疡时终止单个小鼠。用Mann-Whitney U-test进行统计比较。

澳瑞他汀E和与白蛋白结合的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07和AE-Ester-Sulf07的剂量发现研究。

储备溶液的制备如下：

1)每组3只小鼠，随机分组当天平均体重26g：在第0、6、13、20天每周一次，连续4周的剂量为0.3、0.6或1.2mg/kg的澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35-1.41mg/kg＝7.1-28.3μg/20g小鼠。样品制备：在50mL小瓶中称量8.5mg，溶于30.0mL25/75叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0中；根据最终所需的最终剂量，在2mL小瓶中分装0.2-0.8mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。注射当天，将冻干的样品用0.8mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％的丙二醇-pH 7.0重构。

2)每组3只小鼠，随机分组当天平均体重26g：每周两次，连续4周的剂量为1.2和2.4mg/kg的AE-Keto-Sulf07(AE当量)＝1.94-3.87mg/kg＝38.7和77.4μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量11.0mg，将其溶于14.2mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0中；根据最终所需的最终剂量，在2mL小瓶中分装0.4-0.8mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。注射当天，将冻干的样品用0.8mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

3)每组3只小鼠，随机分组当天平均体重26g：每周两次，连续4周的剂量为1.2、1.6或2.0mg/kg的AE-Ester-Sulf07(AE当量)＝2.18-3.64mg/kg＝43.7-72.8μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量19.2mg，将其溶于26.3mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0中；根据最终所需的最终剂量，在2mL小瓶中分装0.48-0.8mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用0.8mL的50mM磷酸钠缓冲液，5％的Tween 80-pH 7.6重构。

4)每组4只小鼠，随机分组当天平均体重23g：每周两次，连续4周的剂量为2.0、2.2和2.4mg/kg的AE-Ester-Sulf07(AE当量)＝3.64-4.37mg/kg＝72.8-87.3μg/20g小鼠和在第0、7、14、21天每周一次，连续4周的剂量为4.0、4.4和4.8mg/kg的AE-Ester-Sulf07(AE当量)＝7.28-8.73mg/kg＝145.6-174.7μg/20g小鼠。样品制备：在50mL小瓶中称量56.0mg，将其溶于32.0mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0中；根据最终所需的最终剂量，在2mL小瓶中分装0.33-0.8mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用0.8mL的50mM磷酸钠缓冲液、2％Tween 80-pH 7.6重构。

1.2和0.6mg/kg剂量的澳瑞他汀E分别显示出高毒性，并且在第一次和第二次注射后均无动物存活。0.3mg/kg剂量耐受良好。在后来的研究中，发现每两周注射0.3mg/kg的AE，可以耐受四周(总共八次注射)，因此，所述剂量被用作异种移植研究的最大耐受剂量(MTD)。

每两周注射一次共八次AE-Keto-Sulf07的所有测试剂量均耐受良好。在后来的异种移植研究中，在相同的投药方案下，所述药物的剂量增加至6.5mg/kg，这导致一只小鼠体重减轻最多，而另一只小鼠的健康状况一般恶化，五次注射后必须停止治疗，而不是计划的八次。因此认为所述剂量高于MTD，因此选择4.5mg/kg作为安全剂量。

最初测试AE-Ester-Sulf07的最高剂量为2.0mg/kg，每周两次，持续四周，没有明显的毒性迹象。由于后来在异种移植研究中观察到皮肤刺激，再次进行了第二次剂量发现研究，每周两次，连续四周的剂量为2.0、2.2和2.4mg/kg与每周只注射一次，剂量加倍为4.0、4.4和4.8mg/kg比较。没有观察到体重变化，但是在所有组中9-14天后出现皮肤刺激。高剂量可引起较早，更频繁的皮肤刺激。副作用似乎是可逆的，因为治疗结束后刺激开始痊愈。每周一次接受4.0mg/kg治疗的组显示出最低的副作用，而其他组之间没有观察到显着差异。

肿瘤异种移植模型中澳瑞他汀E及其结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物的评估标准。

根据肿瘤体积的减少(所选天数与第0天相比，肿瘤体积的百分比)确定每种药物的功效：与初始肿瘤体积相比，完全缓解＜10％；部分缓解＞10-50％；轻微缓解＞50-75％；疾病稳定＞75-125％；进行性疾病＞125％。

在人恶性黑色素瘤癌症模型A375-小肿瘤中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07(图13)。

如细胞系衍生异种移植模型的一般步骤所述，对人恶性黑色素瘤癌症模型A375中的澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07进行了评估。

储备溶液的制备如下：

1)7只小鼠，平均体重29g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数135mm³：在第0、6、9、13、16、19天每周两次，连续3周投药的剂量为0.3mg/kg澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35mg/kg＝7.1μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量2mg，将其溶解在28.3mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖中-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

2)7只小鼠，平均体重28g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数137mm³：在第0、6、9、13、16、19天每周两次，连续3周投药的剂量为3.0mg/kg AE-Keto-Sulf07(AE当量)＝5.32mg/kg＝106.3μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重19.2mg，将其溶于19.0mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

黑色素瘤异种移植模型A 375中的肿瘤生长发育显示，相对于澳瑞他汀E 0.3mg/kg剂量，化合物AE-Keto-Sulf07在3.0mg/kg剂量下具有统计学意义的抗肿瘤功效，两者均每周两次共注射六次(从第27天到第37天，p＜0.01)。用澳瑞他汀E治疗的小鼠达到稳定的疾病状态，直到第21天，此后肿瘤又开始生长。相比之下，AE-Keto-Sulf07治疗组的小鼠实现了长期的肿瘤消退，显示从第19天到研究结束的第37天完全缓解(最终肿瘤体积1mm³)。

与对照组相比，AE-Keto-Sulf07治疗组的小鼠体重增长仅略有降低，但未观察到副作用。

在人类恶性黑色素瘤癌症模型A375-大肿瘤中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07(图14)。

如细胞系衍生异种移植模型的一般步骤所述，对人恶性黑色素瘤癌症模型A375中的澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07进行了评估。

储备溶液的制备如下：

1)7只小鼠，平均体重28g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数310mm³：在第1、6、9、13、16天每周两次，连续3周投药的剂量为0.3mg/kg的澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35mg/kg＝7.1μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量2mg，将其溶解在28.3mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖中-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

2)7只小鼠，平均体重27g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数331mm³：在第1、6、9、13、16天每周两次，连续3周投药的剂量为6.5mg/kg的AE-Keto-Sulf07(AE当量)＝11.52mg/kg＝230.4μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量28.0mg，将其溶解在12.2mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖中-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的50mM磷酸钠缓冲液、2％Tween 80-pH 7.6重构。

还对患有较大恶性黑色素瘤A375肿瘤(-320mm³)的小鼠测试了化合物AE-Keto-Sulf07的抗肿瘤功效，证明所述药的功效不仅限于小肿瘤。与以0.3mg/kg剂量的澳瑞他汀E治疗组相比，以6.5mg/kg的AE-Keto-Sulf07治疗的小鼠在抗肿瘤效果方面有统计学上显著的改善，两者均每周两次注射五次(从第9天到第33天，p＜0.01)。澳瑞他汀E表现出最初的稳定疾病，直到第14天才稳定生长，而AE-Keto-Sulf07治疗组的小鼠从第19天到研究结束的第37天记录的完全缓解，在第28天(最后一次治疗后的第12天)达到最小肿瘤体积1mm³，在研究结束时达到约14mm³，尽管起始肿瘤中位数相对较大，但仍可产生长期疗效。

AE-Keto-Sulf07导致了短暂的体重减轻(在第21天达到13％的体重)，由于一般情况恶劣，不得不处死两只小鼠。

在人非小细胞肺癌模型LXFA737-小肿瘤中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07(图15)。

如患者来源异种移植模型的一般程序中所述，对人非小细胞肺癌模型LXFA737中的澳瑞他汀E和与白蛋白结合的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07进行了评估。

储备溶液的制备如下：

1)7只小鼠，平均体重27g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数137mm³：在第0、4、7、11、14、18、21、25天每周两次，连续4周投药的剂量为0.3mg/kg的澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35mg/kg＝7.1μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量2mg，将其溶解在28.3mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖中-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

2)7只小鼠，平均体重26g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数128mm³：在第0、4、7、11、14、18、21、25天每周两次，连续4周投药的剂量为4.5mg/kgAE-Keto-Sulf07(AE当量)＝7.98mg/kg＝159.5μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重38mg，将其溶于23.8mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的50mM磷酸钠缓冲液、2％2-羟丙基-β-环糊精2-HPβCD-pH 7.6重构。

3)7只小鼠，平均体重27g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数130mm³：在第0、4、7、11、14、18、21、25天每周两次，连续4周投药的剂量为4.5mg/kgAE-Keto-Sulf07(AE当量)＝7.98mg/kg＝159.5μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重38mg，将其溶于23.8mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 6.；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的50mM磷酸钠缓冲液、2％Tween 80-pH 7.6重构。

NSCLC异种移植模型LXFE737中的肿瘤生长发育显示，化合物AE-Keto-Sulf07在4.5mg/kg时(在Tween 80和2-HPβCD缓冲液中)具有显著的抗肿瘤功效，均优于0.3mg/kg的澳瑞他汀E每周两次投药8次，其统计学上显著性(在第56天和63天p＜0.01)。澳瑞他汀E治疗组的肿瘤仅暂时处于稳定疾病状态(从第21天到第42天)，并且在治疗结束后明显增长。相反，用AE-Keto-Sulf07治疗的小鼠在第28天达到了完全的肿瘤缓解，治疗结束后3天，使肿瘤体积降至无法测量的水平，直到第74天研究结束(与使用的缓冲液无关)，从而产生了长期的抗肿瘤作用。

体重变化与对照组相比显示，AE-Keto-Sulf07治疗组的部分毒性增加。在第32天，记录到最大体重减轻(-7％)，对于2-HPβCD，没有其他毒性迹象，而当在Tween 80中使用这种药物时，由于一般的恶劣条件，不得不处死两只小鼠。

在人非小细胞肺癌模型LXFA737-大肿瘤中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07(图16)。

如患者来源异种移植模型的一般程序中所述，对人非小细胞肺癌模型LXFA737中的澳瑞他汀E和与白蛋白结合的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07进行了评估。

储备溶液的制备如下：

1)8只小鼠，平均体重26g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数324mm³：在第1、5、8、12、15、19、22、26天每周两次，连续4周投药的剂量为0.3mg/kg的澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35mg/kg＝7.1μg/20g小鼠。样品制备：在100mL小瓶中称量3mg，将其溶解在43.3mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖中-pH 7.0；在4mL小瓶中分装2.4mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用2.4mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

2)8只小鼠，平均体重28g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数342mm³：在第1、5、8、12、15、19、22、26天每周两次，连续4周投药的剂量为4.5mg/kgAE-Keto-Sulf07(AE当量)＝6.99mg/kg＝139.7μg/20g小鼠。样品制备：在100mL小瓶中称重51mg，将其溶于36.5mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，3％2-HPβCD-pH 6.2；在4mL小瓶中分装2.4mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用2.4mL的50mM磷酸钠缓冲液、5％蔗糖-pH 7.6重构。

NSCLC异种移植模型LXFE737中的肿瘤生长发育显示，化合物AE-Keto-Sulf07在4.5mg/kg时的抗肿瘤功效优于澳瑞他汀E在0.3mg/kg时，两者每周两次投药8次，具有统计学意义(第28天的p＜0.01)。澳瑞他汀E治疗组的肿瘤未显示任何活性，而使用AE-Keto-Sulf07治疗的小鼠在第15天达到部分肿瘤缓解，直到研究结束的第59天，从而产生了长期的抗肿瘤作用。

没有副作用。

在人卵巢癌模型A2780-小肿瘤中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07(图17)。

如细胞系衍生异种移植模型的一般程序中所述，对人卵巢癌模型A2780中的澳瑞他汀E和与白蛋白结合的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07进行了评估。

储备溶液的制备如下：

1)7只小鼠，平均体重27g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数147mm³：在第1、4、8、11、15、18、22、25天每周两次，连续4周投药的剂量为0.3mg/kg的澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35mg/kg＝7.1μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量2mg，将其溶解在28.3mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖中-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

2)7只小鼠，平均体重27g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数153mm³：在第1、4、8、11、15、18、22、25天每周两次，连续4周投药的剂量为3.0mg/kgAE-Keto-Sulf07(AE当量)＝5.32mg/kg＝106.3μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重51.0mg，将其溶于28.8mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装0.72mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的50mM磷酸钠缓冲液、2％Tween 80-pH 7.6重构。

3)7只小鼠，平均体重25g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数141mm³：在第1、4、8、11、15、18、22、25天每周两次，连续4周投药的剂量为5.0mg/kgAE-Keto-Sulf07(AE当量)＝8.86mg/kg＝177.2μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重51.0mg，将其溶于28.8mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的50mM磷酸钠缓冲液、2％Tween 80-pH 7.6重构。

卵巢癌模型A2780中的肿瘤生长发育显示，与0.3mg/kg剂量的澳瑞他汀E相比，3.0和5.0mg/kg的化合物AE-Keto-Sulf07具有统计学上显著的优越抗肿瘤功效，每周两次注射八次(从第7天到第29天，p＜0.01)。用澳瑞他汀E治疗的小鼠没有任何抗肿瘤作用，并且肿瘤的生长与对照组相比相当。然而，从第9天到研究结束的第60天，AE-Keto-Sulf07疗法引起部分缓解，对于较低剂量，从第23天到第35天短暂完全缓解，对于较高剂量，从第25天到第51天短暂完全缓解，从而导致长期肿瘤消退，与剂量无关。

AE-Keto-Sulf07治疗组在首次治疗后造成了约2％的短暂体重减轻。在第35天发现高剂量组的一只小鼠死亡，而对于一般的恶劣条件，则必须在第42天处死低剂量组的一只。

在人卵巢癌A2780模型-大肿瘤中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07(图18)。

如细胞系衍生异种移植模型的一般程序中所述，对人卵巢癌模型A2780中的澳瑞他汀E和与白蛋白结合的澳瑞他汀E衍生物AE-Keto-Sulf07进行了评估。

储备溶液的制备如下：

1)8只小鼠，平均体重28g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数341mm³：在第1、4、8、11、15、18、22、25天每周两次，连续4周投药的剂量为0.3mg/kg的澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35mg/kg＝7.1μg/20g小鼠。样品制备：在100mL小瓶中称量3.7mg，将其溶解在52.3mL50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.5mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.5mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

2)8只小鼠，平均体重28g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数378mm³：在第1、4、8、11、15、18、22、25天每周两次，连续4周投药的剂量为4.5mg/kgAE-Keto-Sulf07(AE当量)＝6.99mg/kg＝139.7μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重40.0mg，将其溶于28.6mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.5mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.5mL的50mM磷酸钠缓冲液、2％2-HPβCD-pH 7.6重构。

还对携带人卵巢癌模型A2780较大肿瘤(约360mm³)的小鼠测试了化合物AE-Keto-Sulf07的抗肿瘤功效。与以0.3mg/kg的澳瑞他汀E相比，以4.5mg/kg的剂量投药具有统计学上的显著优越的抗肿瘤作用，两者每周两次注射八次(从第22天到第40天，p＜0.001)。用澳瑞他汀E治疗的小鼠未达到任何抗肿瘤作用，相反，用AE-Keto-Sulf07治疗的小鼠从第26天起直到研究结束至第103天显示出完全缓解，达到了长期的肿瘤消退，就像在较小的肿瘤中已经观察到的那样。

与对照组相比，AE-Keto-Sulf07处理的小鼠的体重增长仅略有减少。

在人肾细胞癌模型RXF631-小肿瘤中对澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Ester-Sulf07的初步评估(图19)

如患者异种移植模型的一般程序中所述，对人肾细胞癌模型RXF631中的澳瑞他汀E和与白蛋白结合的澳瑞他汀E衍生物AE-Ester-Sulf07进行了初步评估。

储备溶液的制备如下：

1)7只小鼠，平均体重25g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数138mm³：在第1、5、8、12、15、19、22、26天每周两次，连续4周投药的剂量为0.3mg/kg的澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35mg/kg＝7.1μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量2mg，将其溶解在28.3mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

2)7只小鼠，平均体重26g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数141mm³：在第1、5、8、12、15、19、26天每周两次，连续4周投药的剂量为2.2-3.0mg/kgAE-Ester-Sulf07(AE当量)＝4.00mg/kg＝80.1μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重15.7mg，将其溶于19.6mL50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的50mM磷酸钠缓冲液、2％Tween 80-pH 7.6重构。

肾细胞癌模型RXF631中的肿瘤生长发育显示，在以2.2mg/kg剂量投药的化合物AE-Ester-Sulf07(剂量在注射第15和19天暂时增加至3.0mg/kg)与以0.3mg/kg剂量的澳瑞他汀E相比，具有统计学上显著的优异抗肿瘤功效，每周两次分别注射八次和七次(p＜0.05)。澳瑞他汀E直到约40天都达到了稳定的疾病状态，然后稳定生长直至研究结束。相比之下，AE-Ester-Sulf07治疗可从第24天到第53天完全缓解，达到最小1mm³的肿瘤体积和长期效果。

AE-Ester-Sulf07在第31天达到引起了至少9％的短暂体重减轻。从第17天开始，还观察到由于咬伤和刮伤引起的伤口。两只小鼠死亡，一只小鼠因一般恶劣条件而被处死(第20、43和66天)。

在人恶性黑色素瘤癌症模型A375-大肿瘤中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Ester-Sulf07(图20)。

如细胞系衍生异种移植模型的一般程序中所述，对人恶性黑色素瘤癌症模型A375中的澳瑞他汀E和与白蛋白结合的澳瑞他汀E衍生物AE-Ester-Sulf07进行了评估。

根据RXF631异种移植模型的投药经验，储备溶液的制备如下：

1)7只小鼠，平均体重28g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数310mm³：在第1、6、9、13、16天每周两次，连续3周投药的剂量为0.3mg/kg的澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35mg/kg＝7.1μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量2mg，将其溶解在28.3mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖中-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

2)7只小鼠，平均体重29g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数371mm³：在第1、6、9、13、16天每周两次，连续3周投药的剂量为2.4mg/kgAE-Ester-Sulf07(AE当量)＝4.37mg/kg＝87.3μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重12.6mg，将其溶于14.4mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的50mM磷酸钠缓冲液、2％Tween 80-pH 7.6重构。

3)7只小鼠，平均体重31g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数355mm³：在第1、6、9、13、16天每周两次，连续3周投药的剂量为2.4mg/kg AE-Ester-Sulf07(AE当量)＝4.37mg/kg＝87.3μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重12.6mg，将其溶于14.4mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的50mM磷酸钠缓冲液、4％2-HPβCD-pH 7.6重构。

黑色素瘤异种移植模型A375中的肿瘤生长发育显示，与以0.3mg/kg剂量的澳瑞他汀E相比，以2.4mg/kg剂量的化合物AE-Ester-Sulf07(独立于重构缓冲液，2％Tween 80或4％2-HPβCD)具有统计学上显著的抗肿瘤作用，每周两次注射五次(从第9天到第33天，p＜0.01)。澳瑞他汀E治疗显示出最初的稳定疾病，直到第14天为止，肿瘤稳定生长。但是，采用分别用2％的Tween 80和4％的2-HPβCD重构的AE-Ester-Sulf07处理的小鼠从第16天到研究结束第37天几乎完全缓解，在第23天达到最小4mm³，在第26天达到最小1mm³，尽管实验开始时肿瘤体积中位数很大。

对照组相比，没有发现明显的体重变化，但是从第9天开始观察到由于咬伤和抓挠引起的伤口。Bepanthen治疗改善了受伤小鼠的健康。在AE-Ester-Sulf07 2％Tween 80治疗组中，只有一只小鼠因一般恶劣条件而被处死。

在人非小细胞肺癌模型LXFA737-小肿瘤中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Ester-Sulf07(图21)。

如患者异种移植模型的一般程序中所述，人非小细胞肺癌模型LXFA737中的澳瑞他汀E和与白蛋白结合的澳瑞他汀E衍生物AE-Ester-Sulf07进行了评估。

储备溶液的制备如下：

1)7只小鼠，平均体重27g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数137mm³：在第0、4、7、11、14、18、21、25天每周两次，连续4周投药的剂量为0.3mg/kg的澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35mg/kg＝7.1μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量2mg，将其溶解在28.3mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.2mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

2)7只小鼠，平均体重27g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数126mm³：在第0、4、7、11、14、18、21、25天每周两次，连续4周投药的剂量为2.4mg/kg AE-Ester-Sulf07(AE当量)＝4.37mg/kg＝87.3μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重31mg，将其溶于28.5mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装0.96mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.2mL的50mM磷酸钠缓冲液、4％2-HPβCD-pH 7.6重构。

NSCLC异种移植模型LXFE737中的肿瘤生长发育显示，化合物AE-Ester-Sulf07在2.4mg/kg时的抗肿瘤功效优于澳瑞他汀E在0.3mg/kg时，两者每周两次投药8次，具有统计学意义(第56和63天的p＜0.05)。澳瑞他汀E治疗组的肿瘤从第21天到第42天仅暂时停留在疾病稳定的状态并在治疗结束后显著增长。相反，用AE-Ester-Sulf07治疗的小鼠在第21天达到了完全的肿瘤缓解，使肿瘤体积降至无法测量的水平，直到第74天研究结束，从而产生了长期的抗肿瘤作用。

在研究过程中，由于体重减轻和皮肤损伤相结合，必须对五只小鼠实施安乐死。

在人卵巢癌模型A2780-大肿瘤中评估澳瑞他汀E和结合白蛋白的澳瑞他汀E衍生物AE-Ester-Sulf07(图22)。

如细胞系衍生异种移植模型的一般程序中所述，对人卵巢癌模型A2780中的澳瑞他汀E和与白蛋白结合的澳瑞他汀E衍生物AE-Ester-Sulf07进行了评估。

储备溶液的制备如下：

1)8只小鼠，平均体重28g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数341mm³：在第1、4、8、11、15、18、22、25天每周两次，连续3周投药的剂量为0.3mg/kg的澳瑞他汀E TFA盐(AE当量)＝0.35mg/kg＝7.1μg/20g小鼠。样品制备：在100mL小瓶中称量3.7mg，将其溶解在52.3mL50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.5mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.5mL的10mM磷酸钠缓冲液、20％丙二醇-pH 7.0重构。

2)8只小鼠，平均体重27g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数403mm³：在第1、4、8、11、15、18、22、25天每周一次，连续4周投药的剂量为1.9mg/kgAE-Ester-Sulf07(AE当量)＝3.46mg/kg＝69.2μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称重36.5mg，将其溶于26.4mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装0.75mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.5mL的50mM磷酸钠缓冲液、2％2-HPβCD-pH 7.6重构。

剂量为1.9mg/kg的AE-Ester-Sulf07，与剂量为0.3mg/kg澳瑞他汀E相比，在卵巢癌模型A2780中显示出优异的抗肿瘤功效，二者均每周两次注射八次(第37天至第40天为p＜0.001)。用澳瑞他汀E处理的小鼠没有达到任何抗肿瘤作用。但是，用AE-Ester-Sulf07治疗的小鼠从第19天到第51天显示部分缓解，从第54天直到研究结束在第103天显示完全缓解，从而导致长期的肿瘤消退。

与对照组相比，AE-Ester-Sulf07处理的小鼠没有体重减轻的迹象，但是由于肿瘤坏死，不得不将四只动物从研究中删除。

在人卵巢癌模型A2780-小肿瘤中评估结合白蛋白的澳瑞他E衍生物化合物AE-Ester-Sulf07(图23)。

如细胞系衍生异种移植模型的一般步骤所述，对人卵巢癌模型A2780中的白蛋白结合的澳瑞他汀E衍生物AE-Ester-Sulf07进行了评估。

储备溶液的制备如下：

1)8只小鼠，平均体重27g，随机分组当天肿瘤体积平均中位数174mm³：在第1、8、15、22天每周一次，连续4周投药的剂量为3.8mg/kg的AE-Ester-Sulf07(AE当量)＝6.67mg/kg＝133.4μg/20g小鼠。样品制备：在30mL小瓶中称量25.6mg，将其溶解在19.2mL 50/50叔丁醇/10mM磷酸钠缓冲液，5％蔗糖-pH 7.0；在4mL小瓶中分装1.5mL。将小瓶在-40℃下冷冻1小时，并在-20℃下冻干约36小时，然后塞上塞子。在注射当天，将冻干的样品用1.5mL的50mM磷酸钠缓冲液、6％2-HPβCD-pH 7.6重构。

AE-Ester-Sulf07也已在相同的卵巢癌模型A2780中进行了测试，所述模型具有较小的肿瘤和不同的投药方案，以减少药物对小鼠皮肤的副作用。每周一次，连续四次以3.8mg/kg的剂量投药AE-Ester-Sulf07，与对照组相比，再次显示出统计学上显著改善的抗肿瘤效果(从第7天到第14天，p＜0.01)。在新的投药方案中用AE-Ester-Sulf07处理的小鼠从第12天到第35天达到部分缓解，从第39天到研究结束到第70天达到完全缓解。三只经AE-Ester-Sulf07处理的小鼠体重减轻，必须在第59天处死。

Claims (24)

1.一种具有式I或式II结构的化合物：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或异构体；

其中：

R’为H或-CH₃，

M为H或药学上可接受的抗衡离子；

Y不存在或选自任选取代的C₁-C₆烷基、-NH-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-C(O)-O-和-O-C(O)-；

R¹不存在或为任选取代的C₁-C₁₈烷基，其中在所述C₁-C₁₈烷基中任选地至多六个碳原子各自独立地被-OCH₂CH₂-取代；

X为H或选自卤素基团(例如：-F、-Cl、-Br或-I)、-NO₂、-NR²R³、-OR²、-NHCOR²和-OCOR²，其中R²和R³各自独立地选自H和C₁-C₄烷基；

TBG是硫醇结合基团，其选自任选取代的马来酰亚胺基、任选取代的卤代乙酰胺基、任选取代的卤代乙酸酯基、任选取代的吡啶硫基、任选取代的异硫氰酸酯基、任选取代的乙烯基羰基、任选取代的氮丙啶基、任选取代的二硫基和任选取代的乙炔基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中R’为-CH₃。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中TBG选自任选取代的马来酰亚胺基。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中TBG是下式的马来酰亚胺基：

5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中Y为-NH-C(O)-。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中M为H⁺或Na⁺。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中R¹为任选取代的C₁-C₅烷基。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中R¹为C₁-C₅烷基。

9.根据权利要求1所述的化合物，其具有式III的结构：

10.根据权利要求1的化合物，其具有式IV的结构：

11.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，以及药学上可接受的载体。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体选自增溶剂、包封剂和冻干保护剂中的一种或多种。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括二甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精中的一种或多种。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物适合于静脉内投药。

15.根据权利要求143所述的药物组合物，其中，所述组合物在给患者静脉内投药时，在血液循环中与内源性白蛋白选择性地并原位快速地共价结合。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物在给患者静脉内投药时，在血液循环中与内源性白蛋白半胱氨酸34的巯基选择性地并原位快速地共价结合。

17.一种用于治疗患有选自以下疾病的患者的方法：癌症、病毒性疾病、自身免疫性疾病、急性或慢性炎症性疾病，以及由细菌、真菌和其他微生物引起的疾病，包括向有此需要的患者投予治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的化合物或根据权利要求11至16中任一项所述的药物组合物。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病是选自癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和黑素瘤的癌症。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述投药是静脉内投药。

20.一种降低化合物的细胞毒性的方法，其包括向有此需要的患者投予根据权利要求1至10中任一项的化合物或根据权利要求11至16中任一项的药物组合物，其中与等效剂量的未修饰活性剂相比，所述投药导致细胞毒性的降低。

21.一种增加肿瘤中化合物代谢物浓度的方法，其包括向有此需要的患者投予根据权利要求1至10中任一项所述的化合物或根据权利要求11至16中任一项所述的药物组合物，其中将所述增加与等效剂量的未修饰的活性剂进行比较。

22.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其用作药物。

23.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其用于治疗选自以下的疾病或病症：癌症、病毒性疾病、自身免疫性疾病、急性或慢性炎症性疾病，以及由细菌、真菌或其他微生物引起的疾病。

24.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物或根据权利要求11至16所述的组合物在制备用于治疗选自以下的疾病或病症的药物中的用途：癌症、病毒性疾病、自身免疫性疾病、急性或慢性炎症性疾病，以及由细菌、真菌或其他微生物引起的疾病。

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