CN111704652A - 一种抗光损伤皮肤保护活性多肽om-gl15及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗光损伤皮肤保护活性多肽OM‑GL15及其应用。所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM‑GL15的氨基酸序列为GLLSGHYGRASPVAC。本发明是源于臭蛙的皮肤分泌物中所获得的一种具有抵抗皮肤光损伤和氧化应激的天然活性多肽OM‑GL15，该多肽展示出明显的抵抗紫外线辐射及氧化应激给皮肤和细胞带来伤害的活性，表明OM‑GL15在保护皮肤免受紫外线照射导致的光损伤方面显示出潜在的应用前景。因此，抗光损伤皮肤保护活性多肽OM‑GL15可以被认为是开发抗紫外线药物的模板，并为进一步开发新型的抗急性光损伤修复药物奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15及其应用。
背景技术
皮肤是人体和外界环境之间的物理屏障，承担着诸多重要的生理功能，包括排汗、热感、痛觉等，此外皮肤保护着体内各种组织和器官，是最容易受损的器官。物理性、机械性、化学性和病原微生物性等因素均能造成皮肤破损，其中紫外线损伤是日常生活中最为常见的物理损伤之一。紫外线照射会造成诸多的有害影响，如皮肤红斑、黑色素的形成，并最终可能导致皮肤癌的发生。紫外光谱分为UVA（320-400nm）、UVB(280-320nm)和UVC（200-275nm），由于臭氧层的吸收几乎没有UVC会到达地球表面，UVB能到达皮肤表皮层，而UVA能到达皮肤真皮层。并且UVB可以在体内引起一系列的氧化应激和DNA损伤。研究表明，急性光损伤导致的皮肤损伤会通过P53、Casp-3和 Casp-9等途径参与细胞凋亡的调控，因此探索促光损伤修复药物参与调控这些细胞凋亡的途径，是目前研究促皮肤光损伤修复机制的重要内容。
正常情况下，皮肤对急性光损伤具有一定程度的自我修复作用，如：表皮增厚、DNA修复，以及一系列的抗氧化系统包括酶系统和非酶类因子。但是这些作用具有一定的自限性，为了应对皮肤光损伤，人们在化妆品中加入防晒剂，并开发抗氧化药物。在光损伤后的皮肤上局部施用抗氧化剂（作为化妆品中的药物或活性成分）引起了极大的关注。目前，使用最广泛的抗氧化损伤药物主要是低分子量的抗氧化剂，如维生素C，维生素E等。但是，这些抗氧化剂已经不能满足人们的需求，并且会对人体产生副作用。例如，长期大剂量口服VC可能导致腹泻和胃肠道疾病。许多抗氧化剂的应用受限是由于活性低，稳定性差，不能大规模合成。因此，开发新型抗氧化剂是极其重要的。多肽类药物自上世纪70年代赖氨加压素上市以来，到目前为止已经取得了很大的发展，一些多肽类药物已经成为患者的最佳选择并且已经取得商业上的巨大成功，如醋酸格拉替雷、艾赛那肽、特立帕肽等，而且进入临床的多肽类药物数量正逐年增加。目前国内外已经开展了大量的活性多肽挖掘工作，其中许多活性多肽已经得以报道，比如抗菌肽、镇痛肽、抗癌多肽等，然而关于来自动物抗氧化多肽的在光损伤中的应用的相关报道还极度稀缺，目前只有三个抗氧化多肽分子：AOP-P1、 抗氧化多肽OA-VI12和antioxidin-RL得以报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15；第二目的在于提供所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15的氨基酸序列为GLLSGHYGRASPVAC。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15在制备美容产品中的应用。
本发明研究了来自中国云贵高原地区的两栖动物臭蛙的皮肤分泌物中的抗氧化剂肽。该物种生活的海拔高度超过了2300 m，并经受强烈的紫外线照射，这导致了它们形成了一种强大的抗氧化剂系统来保护其皮肤免受紫外线的损伤。基于这些条件，本发明推测其皮肤中存在促进皮肤急性光损伤修复的多肽。在本次研究中，从臭蛙的皮肤分泌物中鉴定出了一种新的基因编码肽将其命名为OM-GL15，其序列为GLLSGHYGRASPVAC，分子量为1487.71 Da，实验结果表明其具有明显的自由基清除活性，包括清除ABTS+，DPPH。自由基会导致脂质过氧化，代谢产物异常蓄积，并最终导致细胞和组织中的氧化应激。因此，有理由推测其可用于降低动物体内的氧化应激和DNA损伤。更重要的是，OM-GL15在保护皮肤免受紫外线照射导致的光损伤方面显示出潜在的应用前景。 因此，其可以被认为是开发抗紫外线药物的模板，并为进一步开发新型的抗急性光损伤修复药物奠定了基础。
本发明是源于臭蛙的皮肤分泌物中所获得的一种具有抵抗皮肤光损伤和氧化应激的天然活性多肽OM-GL15，该多肽展示出明显的抵抗紫外线辐射及氧化应激给皮肤和细胞带来伤害的活性，表明OM-GL15在保护皮肤免受紫外线照射导致的光损伤方面显示出潜在的应用前景。因此，抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15可以被认为是开发抗紫外线药物的模板，并为进一步开发新型的抗急性光损伤修复药物奠定了基础。
附图说明
图1为本发明抗光损伤多肽OM-GL15的体外自由基DPPH、ABTS+清除率图；
图2为本发明抗光损伤多肽OM-GL15减轻了UVB照射导致的动物皮肤红斑，水肿和晒伤细胞的形成图；
图3为本发明抗光损伤多肽OM-GL15对动物皮肤的弹性和水分影响图；
图4为本发明抗光损伤多肽OM-GL15减轻了UVB照射导致的动物表皮细胞的凋亡图；
图5为本发明抗光损伤多肽OM-GL15减轻了UVB照射导致的动物表皮氧化应激反应图；
图6为本发明抗光损伤多肽OM-GL15减轻了UVB照射导致的动物表皮的DNA损伤图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15的氨基酸序列为GLLSGHYGRASPVAC。
本发明所述的抗皮肤光损伤活性多肽OM-GL15的鉴定步骤：
A、收集活体泽蛙皮肤（物料a）；
B、提取总RNA，并用按标准程序纯化mRNA，用智能cDNA文库构建试剂盒合成cDNA；
C、利用聚合酶链反应技术得到产物b，并将产物b用DNA凝胶提取试剂盒回收，克隆到大肠杆菌活性细胞中，构建特异性cDNA文库。
D、用ABI 433A肽合成器通过固相合成法合成目标物抗皮肤光损伤保护活性多肽OM-GL15。
本发明所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15的应用为所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15在制备美容产品中的应用。
本发明所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15的应用为所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15在制备保护皮肤免受光损伤产品中的应用。
本发明所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15的应用为所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15在制备抗光损伤化妆品、保健食品和药品中的应用。
实施例1
1. 样品收集和动物护理
臭蛙被分笼安置于容器中，可供其自由充分饮食。容器被放置于实验室中12/12小时明暗循环空调室中。实验前用去离子水清洗泽蛙皮肤表面后，通过快速捣毁延髓处死泽蛙、剥离其皮肤，快速浸入到预先准备好的液氮中保存，待下一步实验。
2. cDNA克隆
将剥离的皮肤置于液氮中研磨至粉末，并用RNAiso（TaKaRa，大连，中国）提取总RNA。并用mRNA纯化试剂盒（Stratagene，加拿大）按标准程序纯化mRNA。用cDNA文库构建试剂盒（Clontech，大连，中国）合成cDNA文库。通过聚合酶链式反应（PCR技术）在94°C下进行2分钟，然后在92°C下进行30个10秒的循环，在50°C下进行30秒的循环，在72°C下进行40秒的循环，所得产物用DNA凝胶提取试剂盒（Bioteke，北京，中国）回收，然后连接到pMD19-T载体（TaKaRa，大连，中国）中。最后，利用42℃热刺激法将PCR产物克隆到大肠杆菌DH5a活性细胞中，构建特异的cDNA文库。从每个特定的cDNA文库中随机选择插入量大于300 bp的30个克隆，在ABI 3730 XL DNA测序仪（美国加利福尼亚应用生物系统公司）上进行DNA测序。
3. 肽一级结构测定
DNA测序结果回后，通过生物信息学手段，在NCBI数据里进行数据比对，确定其成熟肽序列。
4. OM-GL15对小鼠皮肤光损伤的保护活性
育养22g雌性昆明小鼠，将它们随机分为7组，每组3只小鼠。首先，我们使用剃须刀将小鼠的背部皮肤区域（2×3 cm2）进行去毛，然后，除正常组外均使用UVB灯（TL20 W / 12，Philips，Holland）进行UVB照射。为了建立急性光损伤模型，照射强度为 2J/cm2。用紫外线辐射计（TM-213，Tenmars，Taiwan，China）监测照射强度。将溶解在蒸馏水（ddH2O）中，并配制成10 nM，100 nM和1μM的三种不同浓度。 UVB照射后，立即用1mL以下试剂涂在小鼠背部的照射区域。溶剂对照组（ddH2O）涂抹ddH2O，阳性对照组（VC）涂抹10μM VC，OM-GL15（10 nM）组涂抹10 nM OM-GL15，OM-GL15（100 nM）组涂抹100 nM OM-GL15和OM-GL15（1μM）组涂抹1μM OM-GL15。对照组（Control）和模型组（UVB）不涂抹。 24小时后，对小鼠背部皮肤进行拍照，并使用Mior智能屏显肌肤测试仪对小鼠背部皮肤进行水分和弹性的测试，然后将所有小鼠麻醉并安乐死以进行下一步的实验。
H&E染色：皮肤组织在4%多聚甲醛中固定24-48小时，从70%至100%无水乙醇中再水化，然后在二甲苯中再次溶解，最后在石蜡中包埋。为了进行组织学分析，组织样品被切成6μm厚的切片，用H&E试剂盒（Solarbio，北京，中国）染色。
TUNEL染色：我们使用TUNEL染色试剂盒（KeyGEN，中国南京）检测晒伤的细胞（凋亡的上皮细胞）。 在显微镜下找到五个不同的视野来计数阳性细胞并计算凋亡指数，取平均数。凋亡指数=（阳性表皮细胞数/所有表皮细胞数）×100％。
测量脂质过氧化物（LPO）和丙二醛（MDA）含量：首先，我们准确称量0.1g皮肤组织，然后按重量（g）：体积（ml）= 1：9的比例加入生理盐水，冰水浴匀浆，最后2500转/分，离心10分钟，取上清液检测LPO（LPO检测试剂盒，南京建城生物工程学院，中国南京）和MDA（MDA检测试剂盒，南京建城生物工程学院，中国南京）的变化水平。
测量8-OHdG含量：首先，我们准确称量0.1g皮肤组织，然后按重量（g）：体积（ml）=1：9的比例加入预冷的PBS，冰水浴匀浆，最后5000转/分，离心10分钟，取上清液检测8-OHdG（8-OHdG ELISA试剂盒，上海江莱生物，中国上海）的变化水平。
结果如下列图片所示，具体说明如下：如图1所示，抗光损伤修复活性多肽OM-GL15在体外有明显的自由基DPPH、ABTS+清除活性。经UVB照射后，与Control组相比，UVB组的皮肤出现大量红斑。但是，给药后，OM-GL15（1μM）组的皮肤红斑明显减少与Control组相似；OM-GL15（100 nM）和VC组的红斑也有所减少，但与Control组相比仍有一定差距，但OM-GL15（10 nM）组红斑没有明显减小。 HE染色后，在显微镜下观察到，在UVB照射后，小鼠的表皮层被严重破坏，并且在表皮下产生了大量晒伤的细胞。但是，OM-GL15（1μM）组的表皮完整性接近于Control组，表皮下几乎没有晒伤的细胞。OM-GL15（100 nM）和VC组的表皮也几乎完整，但仍可观察到少量的晒伤细胞，但在OM-GL15（10 nM）组的表皮中仍观察到大量的晒伤细胞。总而言之，OM-GL15（1μM）组的促进急性皮肤光损伤修复的作用最好（图2）。UVB照射会改变小鼠皮肤的弹性和水分，相对于UVB组，OM-GL15（1μM）组可以改善皮肤弹性和水分（图3）。UVB照射会导致小鼠皮肤表皮层细胞凋亡，经TUNEL染色发现，我们可以看到OM-GL15（1μM）组的凋亡细胞基本消失，并且OM-GL15（100nM）和VC组也可见凋亡细胞明显减少，与Control组相比仍有一定差距，但是OM-GL15（10 nM）组仍然有大量的凋亡细胞。总之，OM-GL15（1μM）组抑制细胞凋亡的效果最好（图4）。UVB照射会通过产生过多的活性氧（ROS）而导致氧化应激。LPO是氧化应激的主要产物。我们通过测量LPO和MDA（LPO的副产物）的变化水平，来评估OM-GL15对UVB照射导致的氧化应激的影响。 结果表明，与Control组相比，UVB组小鼠皮肤中LPO和MDA的表达明显增加，而ddH2O组和UVB组之间没有显着差异。 但是用药后，与UVB相比，VC组，OM-GL15（10nM），OM-GL15（100nM）和OM-GL15（1μM）组的表达均明显降低。 总之，OM-GL15可以降低LPO和MDA的表达，减轻了UVB照射导致的氧化应激（图5）。
UVB照射后，小鼠的表皮DNA中会形成8-OHdG，这是DNA损伤的标志物。 因此，我们使用ELISA试剂盒检测小鼠皮肤中8-OHdG的变化水平，来评估OM-GL15对UVB照射导致的DNA损伤的影响。 与Control组相比，UVB组的8-OHdG的表达明显增加；与UVB组相比，ddH2O组和P14（10nM）组之间没有显着差异。 但是，VC，OM-GL15（100nM）和OM-GL15（1μM）组的8-OHdG表达显着降低。 总之，OM-GL15（100nM）和OM-GL15(1μM）组可以有效减轻UVB照射导致的DNA损伤（图6）。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明医科大学
<120> 一种抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15及其应用
<130> 2020
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 抗光损伤皮肤保护活性多肽（OM-GL15）的氨基酸序列
<400> 1
Gly Leu Leu Ser Gly His Tyr Gly Arg Ala Ser Pro Val Ala Arg
1 5 10 15
Claims (4)
1.一种抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15，其特征在于所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15的氨基酸序列为GLLSGHYGRASPVAC。
2.一种权利要求1所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15的应用，其特征在于所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15在制备美容产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15的应用，其特征在于所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15在制备保护皮肤免受光损伤产品中的应用。
4.根据权利要求2所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15的应用，其特征在于所述的抗光损伤皮肤保护活性多肽OM-GL15在制备抗光损伤化妆品、保健食品和药品中的应用。
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| 张心平: "一种新型促皮肤急性光损伤修复活性肽的功能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
| 沈鹏等: "林蛙皮多肽凝胶制剂对兔皮肤损伤的修复作用", 《吉林农业大学学报》 * |
| 谢纯: "两栖动物源抗氧化钛OS-LL11可以抵御UVB辐射造成的小鼠皮肤损伤", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112480209A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-03-12 | 昆明学院 | 一种抗皮肤光损伤保护活性多肽rl-pl9及其应用 |
| CN112574282A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-03-30 | 昆明学院 | 一种抗氧化损伤皮肤保护活性多肽rl-pp10及其应用 |
| CN113683662A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-11-23 | 四川大学 | 一种防护紫外皮肤损伤的多肽 |
| CN114644705A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-06-21 | 云南民族大学 | 一种防护皮肤急性光损伤活性多肽及其应用 |
| CN114644705B (zh) * | 2022-03-25 | 2023-11-17 | 云南民族大学 | 一种防护皮肤急性光损伤活性多肽及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111704652B (zh) | 2022-04-22 |
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