CN111700917A - 一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供了一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，此产品含有保藏编号为GDMCC No.60736的干酪乳杆菌，此干酪乳杆菌可缓解特应性皮炎，具体体现在：显著降低特应性皮炎小鼠的搔抓次数；显著改善特应性皮炎小鼠行为学特征；显著改善特应性皮炎小鼠的耳朵肿胀程度；显著改善特应性皮炎小鼠皮肤病理症状；显著降低特应性皮炎小鼠血清IgE水平；显著降低特应性皮炎小鼠血清中IL‑4的水平，同时，提高特应性皮炎小鼠血清中IL‑10的水平，进而恢复特应性皮炎小鼠的Th1/Th2免疫反应平衡。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
特应性皮炎(Atopic Dermatitis，AD)是一种临床常见的慢性、复发性、炎症性皮肤病。全世界范围内特应性皮炎患病率呈逐渐上升趋势，近年来，特应性皮炎影响了全世界近1/3的儿童以及3％的成年人。特应性皮炎可引起反复发作的皮肤瘙痒症状，导致患者工作和生活受到较大的影响，极大地降低患者的生活质量。
随着遗传学和免疫学等深入研究发现，特应性皮炎的发生与遗传因素和环境因素的共同影响相关。其中，“卫生假说”是基于环境因素对患者免疫发育及调节的影响而提出的，其主张现代卫生保健和医疗措施为人们的日常生活提供了洁净的环境，从而降低了人们暴露于细菌的机会，进而导致人们免疫系统发育不完善、免疫系统易失衡，最终导致人们特应性皮炎患病率提高。
例如，Th1/Th2免疫反应中，Th2主要分泌白细胞介素4(IL-4)、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子，Th2型细胞因子能够促使B细胞增生，同时激免疫球蛋白IgE类抗体的产生，IgE类抗体与肥大细胞、嗜碱性粒细胞等炎症细胞结合会释放组胺、白三烯等过敏效应物质，从而诱发临床过敏反应症状；Th1细胞主要分泌IL-2、干扰素γ(IFN-γ)等Th1型细胞因子，Th1型细胞因子的分泌可以抑制Th2细胞形成。对于免疫系统正常的人群来说，环境中变应原通过皮肤屏障或进入肠道后，会被抗原呈递细胞识别，利用体液和细胞免疫反应，将与抗体结合的抗原物质形成的复合物通过吞噬细胞清除，使得Th1/Th2免疫反应保持正常。对于免疫系统发育不完善、免疫系统易失衡的人群来说，环境中变应原通过皮肤屏障或进入肠道后，则会诱发过度的体液和细胞免疫应答反应，从而导致Th1/Th2免疫反应失衡。
现阶段，尚不存在针对特应性皮炎的具有明确疗效的治疗药物，因此，目前主要是通过外用药物如糖皮质激素类药物，钙调神经磷酸酶抑制剂，外用抗微生物制剂，抗组胺药和抗炎症介质药物，免疫抑制剂等缓解特应性皮炎的症状。
但是，上述药物存在较大的不良反应，并且，多数患者对激素类药物存在顾虑，这些不仅给特应性皮炎治疗带来了极大的困难，同时，也给患者的生活带来了极大的困扰，此外，这些药物对于个别患者来说存在较差的耐受性。
因此，仍然需要一种药物或治疗方式，既不会给患者带来副作用，同时，也能够用于对抗过敏的发作和皮肤炎症的发展，缓解患者皮肤瘙痒、湿疹等症状，并且，还能够应用于各类别的患者，对患者具有良好的耐受性。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种可缓解特应性皮炎且无副作用的产品。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1073在制备预防和/或治疗特应性皮炎的产品中的应用，所述干酪乳杆菌CCFM1073已于2019年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60736。
本发明提供了一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，所述产品含有干酪乳杆菌CCFM1073；所述干酪乳杆菌CCFM1073已于2019年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60736。
本发明的一种实施方式中，所述产品中，干酪乳杆菌CCFM1073的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明的一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。
本发明的一种实施方式中，所述药品含有干酪乳杆菌CCFM1073、药物载体和/或药用辅料。
本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
本发明的一种实施方式中，所述赋形剂包含湿润剂和/或粘合剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含抛射剂、增溶剂、助溶剂和/或乳化剂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有干酪乳杆菌CCFM1073的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有干酪乳杆菌CCFM1073的固体饮料。
本发明的一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将干酪乳杆菌CCFM1073按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。
本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂和菌体的质量比为2:1。
本发明的一种实施方式中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、占培养基总质量10％的脱脂乳、占培养基总质量0.5％的葡萄糖、占培养基总质量1.5％的胰蛋白胨以及占培养基总质量0.3％的酵母浸膏。
本发明的一种实施方式中，所述培养基的pH为6.8。
本发明的一种实施方式中，所述冻干保护剂包含100g/L的脱脂奶粉、100g/L的麦芽糊精以及10g/L的L-谷氨酸钠。
有益效果：
1、本发明提供了一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，此产品含有保藏编号为GDMCC No.60736的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1073，此干酪乳杆菌CCFM1073可缓解特应性皮炎，具体体现在：
(1)显著降低特应性皮炎小鼠的搔抓次数；
(2)显著改善特应性皮炎小鼠行为学特征；
(3)显著改善特应性皮炎小鼠的耳朵肿胀程度；
(4)显著改善特应性皮炎小鼠皮肤病理症状；
(5)显著降低特应性皮炎小鼠血清IgE水平；
(6)显著降低特应性皮炎小鼠血清中IL-4的水平，同时，提高特应性皮炎小鼠血清中IL-10的水平，进而恢复特应性皮炎小鼠的Th1/Th2免疫反应平衡。
2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，具有调节肠道健康的功效，因此，本发明的有效成分为干酪乳杆菌CCFM1073的产品对人体而言，相对健康，无副作用。
附图说明
图1：不同组别特应性皮炎小鼠的搔抓次数统计。
图2：不同组别特应性皮炎小鼠的行为学特征评估。
图3：不同组别特应性皮炎小鼠的耳朵厚度。
图4：不同组别特应性皮炎小鼠背部皮肤的病理症状。
图5：不同组别特应性皮炎小鼠血清中的IgE水平。
图6：不同组别特应性皮炎小鼠血清中的IL-4水平。
图7：不同组别特应性皮炎小鼠血清中的IFN-γ水平。
图8：不同组别特应性皮炎小鼠血清中的IL-10水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的葡萄糖与酵母浸膏购自国药集团化学试剂有限公司，胰蛋白胨购自英国OXOID公司，酶联免疫吸附测定试剂盒均购自南京森贝伽生物技术有限公司，鼠李糖乳杆菌GG(ATCC 53103)购自美国模式培养物集存库(ATCC)。
下述实施例中涉及干酪乳杆菌CCFM1073(记载于公开号为CN110643541A的专利申请文本中)已于2019年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.60736，无需再次进行专利程序上的保藏。
下述实施例中涉及的干酪乳杆菌1(CA1)和干酪乳杆菌2(CA2)是筛选获得的，筛选过程为：以来源于浙江杭州地区的健康人体粪便为样本，将样本经预处理后，在20％左右甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以含有0.05％半胱氨酸的0.9％生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在加了0.05％半胱氨酸的MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基(含0.05％半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株1和菌株2；提取菌株1和菌株2的基因组，将菌株1和菌株2的16S rDNA进行扩增和测序(由英潍捷基贸易有限公司进行)，将获得的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株1和菌株2均为干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌1(CA1)和干酪乳杆菌2(CA2)。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
下述实施例中涉及的干酪乳杆菌菌液和鼠李糖乳杆菌菌液的制备方法如下：
将干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌接入5mLMRS液体培养基(含0.5g/L半胱氨酸)中，于37℃厌氧培养24h，得到初代菌液；将初代菌液全部接入新鲜的MRS液体培养基(含0.5g/L半胱氨酸)中，于37℃厌氧培养24h，得到发酵液；将发酵液6000g离心15min，弃去液体，取下部沉淀菌体；将沉淀菌体用浓度为9g/L的生理盐水重悬至浓度为1×109CFU/mL，得到灌胃用干酪乳杆菌菌液或鼠李糖乳杆菌菌液。
实施例1：不同干酪乳杆菌对特应性皮炎小鼠搔抓次数的影响
取6周龄SPF(specific pathogen free)级C57BL/6雌性小鼠36只，随机分为6组，每组6只，6组分别为：空白组、模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组，其中，阳性参照组为灌胃鼠李糖乳杆菌GG的L.GG组，三组干酪乳杆菌实验组分别为灌胃干酪乳杆菌CCFM1073的CCFM1073组、灌胃干酪乳杆菌1的CA1组以及灌胃干酪乳杆菌2的CA2组。所有小鼠在SPF级屏障内饲养，自由饮食与饮水。
实验共计四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组分别灌胃鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌CCFM1073、干酪乳杆菌1、干酪乳杆菌2菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，空白组和模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模前一天，将小鼠背部毛发利用剃发器剃去，剃去面积为2.5cm×2.5cm；造模第1天，利用50μL浓度为0.5％(v/v)的DNFB(2,4-二硝基氟苯)溶液涂搽模型组、阳性参照组和实验组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％(v/v)的DNFB溶液涂搽模模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照。
实验结束前后，将小鼠单独放置，观察10min内小鼠前爪搔抓耳部、头部，后爪搔抓躯干、背部，嘴啃咬全身各部位的次数，连续搔抓算作1次，以每组小鼠搔抓次数的平均数表示，统计结果见图1。
由图1可知，干酪乳杆菌CCFM1073可显著降低特应性皮炎小鼠的搔抓次数，且效果远优于鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌1和干酪乳杆菌2。
实施例2：不同干酪乳杆菌对特应性皮炎小鼠行为学指标的影响
取6周龄SPF(specific pathogen free)级C57BL/6雌性小鼠36只，随机分为6组，每组6只，6组分别为：空白组、模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组，其中，阳性参照组为灌胃鼠李糖乳杆菌GG的L.GG组，三组干酪乳杆菌实验组分别为灌胃干酪乳杆菌CCFM1073的CCFM1073组、灌胃干酪乳杆菌1的CA1组以及灌胃干酪乳杆菌2的CA2组。所有小鼠在SPF级屏障内饲养，自由饮食与饮水。
实验共计四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组分别灌胃鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌CCFM1073、干酪乳杆菌1、干酪乳杆菌2菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，空白组和模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模前一天，将小鼠背部毛发利用剃发器剃去，剃去面积为2.5cm×2.5cm；造模第1天，利用50μL浓度为0.5％(v/v)的DNFB(2,4-二硝基氟苯)溶液涂搽模型组、阳性参照组和实验组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％(v/v)的DNFB溶液涂搽模模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照。
实验结束前后，对小鼠行为学指标进行观察评估，行为学指标包括行为状态，活跃程度，情绪反应，兴奋程度，以及饮食，饮水，睡眠，大小便，叫声，皮肤毛发，胡须，眯眼等状态，其中，胡须和眯眼评分为0(不正常)和1(正常)，其余指标均为1-5分，对应从小到大，或对应从减弱到亢奋(具体可参考文献：温晓文.培土清心颗粒对特应性皮炎样小鼠模型的免疫干预研究[D],广州中医药大学,2016)，评估结果见图2。
由图2可知，模型组小鼠行为学指标与空白组小鼠相比显著下降，说明造模会导致模型组小鼠的行为学转变为抑制状态；干酪乳杆菌CCFM1073可显著改善特应性皮炎小鼠的行为学指标，而鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌1和干酪乳杆菌2则无此效果。
实施例3：不同干酪乳杆菌对特应性皮炎小鼠耳朵厚度的影响
取6周龄SPF(specific pathogen free)级C57BL/6雌性小鼠36只，随机分为6组，每组6只，6组分别为：空白组、模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组，其中，阳性参照组为灌胃鼠李糖乳杆菌GG的L.GG组，三组干酪乳杆菌实验组分别为灌胃干酪乳杆菌CCFM1073的CCFM1073组、灌胃干酪乳杆菌1的CA1组以及灌胃干酪乳杆菌2的CA2组。所有小鼠在SPF级屏障内饲养，自由饮食与饮水。
实验共计四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组分别灌胃鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌CCFM1073、干酪乳杆菌1、干酪乳杆菌2菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，空白组和模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模前一天，将小鼠背部毛发利用剃发器剃去，剃去面积为2.5cm×2.5cm；造模第1天，利用50μL浓度为0.5％(v/v)的DNFB(2,4-二硝基氟苯)溶液涂搽模型组、阳性参照组和实验组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％(v/v)的DNFB溶液涂搽模模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照。
造模结束后处死小鼠，然后利用数显螺旋测微尺测定小鼠的耳朵厚度，检测结果见图3。
由图3可知，干酪乳杆菌CCFM1073可显著降低特应性皮炎小鼠耳朵的厚度，且效果远优于鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌1和干酪乳杆菌2。
实施例4：不同干酪乳杆菌对特应性皮炎小鼠皮肤病理症状的影响
取6周龄SPF(specific pathogen free)级C57BL/6雌性小鼠36只，随机分为6组，每组6只，6组分别为：空白组、模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组，其中，阳性参照组为灌胃鼠李糖乳杆菌GG的L.GG组，三组干酪乳杆菌实验组分别为灌胃干酪乳杆菌CCFM1073的CCFM1073组、灌胃干酪乳杆菌1的CA1组以及灌胃干酪乳杆菌2的CA2组。所有小鼠在SPF级屏障内饲养，自由饮食与饮水。
实验共计四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组分别灌胃鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌CCFM1073、干酪乳杆菌1、干酪乳杆菌2菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，空白组和模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模前一天，将小鼠背部毛发利用剃发器剃去，剃去面积为2.5cm×2.5cm；造模第1天，利用50μL浓度为0.5％(v/v)的DNFB(2,4-二硝基氟苯)溶液涂搽模型组、阳性参照组和实验组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％(v/v)的DNFB溶液涂搽模模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照。
造模结束后取血并处死小鼠，取小鼠背部脱毛区皮肤进行组织病理学分析，通过对小鼠背部皮肤组织病理学切片进行苏木精-伊红染色，然后通过职业技术人员进行组织病理评分，评分结果见图4。
由图4可知，空白组小鼠背部皮肤表皮细胞结构正常，表皮各层未见炎症反应；造模组小鼠背部皮损病理学呈明显炎症増生性改变，淋巴细胞和浆细胞浸润，同时背部皮肤糜烂，存在纤维组织增生；L.GG组小鼠背部皮肤表皮局部不完整且存在少量炎症，推测皮肤有破溃、结痂等病理症状；CCFM1073组小鼠背部皮肤表皮各层无较严重的炎症反应；CA1组和CA2组小鼠皮肤存在显著的纤维组织增生症状以及炎症，推测皮肤存在明显的破溃、结痂等病理症状。说明，干酪乳杆菌CCFM1073可显著改善特应性皮炎小鼠皮肤病理症状，且效果远优于鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌1和干酪乳杆菌2。
实施例5：不同干酪乳杆菌对特应性皮炎小鼠血清总IgE水平的影响
取6周龄SPF(specific pathogen free)级C57BL/6雌性小鼠36只，随机分为6组，每组6只，6组分别为：空白组、模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组，其中，阳性参照组为灌胃鼠李糖乳杆菌GG的L.GG组，三组干酪乳杆菌实验组分别为灌胃干酪乳杆菌CCFM1073的CCFM1073组、灌胃干酪乳杆菌1的CA1组以及灌胃干酪乳杆菌2的CA2组。所有小鼠在SPF级屏障内饲养，自由饮食与饮水。
实验共计四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组分别灌胃鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌CCFM1073、干酪乳杆菌1、干酪乳杆菌2菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，空白组和模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模前一天，将小鼠背部毛发利用剃发器剃去，剃去面积为2.5cm×2.5cm；造模第1天，利用50μL浓度为0.5％(v/v)的DNFB(2,4-二硝基氟苯)溶液涂搽模型组、阳性参照组和实验组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％(v/v)的DNFB溶液涂搽模模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照。
造模结束后取血并处死小鼠，取小鼠血清，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定血清总IgE水平，测定结果见图5。
由图5可知，模型组小鼠血清中IgE的水平显著高于空白组小鼠；干酪乳杆菌CCFM1073可显著降低特应性皮炎小鼠血清IgE水平，且效果远优于鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌1和干酪乳杆菌2。
实施例6：不同干酪乳杆菌对特应性皮炎小鼠Th1/Th2免疫反应的影响
取6周龄SPF(specific pathogen free)级C57BL/6雌性小鼠36只，随机分为6组，每组6只，6组分别为：空白组、模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组，其中，阳性参照组为灌胃鼠李糖乳杆菌GG的L.GG组，三组干酪乳杆菌实验组分别为灌胃干酪乳杆菌CCFM1073的CCFM1073组、灌胃干酪乳杆菌1的CA1组以及灌胃干酪乳杆菌2的CA2组。所有小鼠在SPF级屏障内饲养，自由饮食与饮水。
实验共计四周：第一周为小鼠适应期；第二周开始灌胃直至实验结束，阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组分别灌胃鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌CCFM1073、干酪乳杆菌1、干酪乳杆菌2菌液，以0.2mL菌液(单次灌胃活菌总量为1×109CFU)/只/次的剂量进行灌胃，空白组和模型组不进行菌液干预，仅灌胃等量生理盐水作为对照；第三周到第四周为造模期，造模前一天，将小鼠背部毛发利用剃发器剃去，剃去面积为2.5cm×2.5cm；造模第1天，利用50μL浓度为0.5％(v/v)的DNFB(2,4-二硝基氟苯)溶液涂搽模型组、阳性参照组和实验组小鼠右耳处进行皮损致敏与激发，第5天、第8天、第11天、第14天利用20μL浓度为0.2％(v/v)的DNFB溶液涂搽模模型组、阳性参照组和三组干酪乳杆菌实验组小鼠右耳处，空白组小鼠右耳仅涂等量搽丙酮/橄榄油基质溶液作为对照。
造模结束后取血并处死小鼠，取小鼠血清，通过酶联免疫吸附测定试剂盒测定血清IL-4、IFN-γ、IL-10的水平，测定结果见图6-8。
由图6-8可知，与空白组小鼠相比，模型组小鼠的Th1/Th2免疫反应平衡明显被破坏；干酪乳杆菌CCFM1073可显著降低特应性皮炎小鼠血清中IL-4的水平，同时，提高特应性皮炎小鼠血清中IL-10的水平，进而恢复特应性皮炎小鼠的Th1/Th2免疫反应平衡，而鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌1和干酪乳杆菌2几乎无此效果。
实施例7：含有干酪乳杆菌CCFM1073的固体饮料的制备
将干酪乳杆菌CCFM1073接入5mLMRS液体培养基(含0.5g/L半胱氨酸)中，于37℃厌氧培养24h，得到初代菌液；将初代菌液全部接入新鲜的MRS液体培养基(含0.5g/L半胱氨酸)中，于37℃厌氧培养24h，得到发酵液；将发酵液6000g离心15min，弃去液体，取下部沉淀菌体；将沉淀菌体用浓度为9g/L的生理盐水洗涤3～5次后，6000g离心15min，弃去液体，取下部沉淀菌泥；将沉淀菌泥用浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(1×1010CFU菌体/g冻干保护剂)，得到重悬液；将重悬液用真空冷冻干燥机冻干，得到干酪乳杆菌CCFM1073菌粉；将含有1×109CFU干酪乳杆菌CCFM1073的干酪乳杆菌CCFM1073菌粉同麦芽糊精进行混合，使得干酪乳杆菌CCFM1073菌粉和麦芽糊精总质量为1克，得到富含干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1073的固体饮料。
取10克上述含有干酪乳杆菌CCFM1073的固体饮料，用生理盐水复溶，定容到20mL，每只小鼠每天灌胃0.2mL，连续三周，可有效缓解小鼠特应性皮炎病理症状以及恢复Th1/Th2免疫的平衡，具有良好的改善特应性皮炎的作用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在制备预防和/或治疗特应性皮炎的产品中的应用，其特征在于，所述干酪乳杆菌已于2019年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60736。
2.一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述产品含有干酪乳杆菌；所述干酪乳杆菌已于2019年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60736。
3.如权利要求2所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述产品中，干酪乳杆菌的活菌数为不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
4.如权利要求2或3所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述产品为食品或药品。
5.如权利要求4所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述药品含有干酪乳杆菌、药物载体和/或药用辅料。
6.如权利要求5所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
7.如权利要求5或6所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
8.如权利要求5-7任一项所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述药品的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
9.如权利要求4所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有干酪乳杆菌的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有干酪乳杆菌的固体饮料。
10.如权利要求9所述的一种用于预防和/或治疗特应性皮炎的产品，其特征在于，所述发酵剂的制备方法为将干酪乳杆菌按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到发酵剂。
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