CN111699265B - 用于测量微生物生物质的改进方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于定量或定性测定样品中至少一种感兴趣的真菌的方法，其中使用了测定来源于真菌的酶活性的测定。此外，添加了优先抑制样品中潜在存在的其他细胞中的相应酶活性的酶抑制剂，以使来自这些其他细胞的假阳性酶活性测量最小化。还提供了一种试剂盒，其包含待测定的酶的底物和酶活性的抑制剂。此外，本发明还涉及一种用于测定包含其他生物质的样品中的真菌细胞的相对浓度/数量的方法。

Description

用于测量微生物生物质的改进方法
发明领域
本发明涉及微生物的检测，特别是真菌例如霉菌的检测。更具体地，本发明涉及用于检测真菌的改进方法，其中显著改善了所检测信号中的信噪比。
发明背景
国际专利公开WO 98/033934描述了一种通过测量样品中β-N-乙酰基己糖胺酶3.2.1.52(以下称为“NAHA”)的活性水平来定量真菌生物质的方法。已发现NAHA存在于菌丝和孢子中，并且具有可测量的活性。此外已显示，在不同类型的环境样品中，NAHA活性与真菌生物质具有良好的相关性。
可以快速测量作为环境样品中真菌生物质的标志物的NAHA活性，从而在数分钟而不是数天(其在使用传统培养方法时是典型的)的时间内提供结果。
当在基于培养基的方法中将真菌测量为菌落形成单位(CFU)时，一种孢子将原则上产生一个单菌落，而菌丝体样品(其本质上包含多个细胞)也将产生一个单菌落，因此也算作一个孢子。与孢子相比菌丝生长形式的这种固有的代表性不足是严重的，因为丝状真菌的生长由大约95-100％的菌丝组成。但是，NAHA活性以每个生物质单位大致相同的水平同时存在于菌丝和孢子中。这意味着NAHA活性的定量提供了总真菌生物质(即单个细胞的数量或浓度)的更准确的代表性测量；换句话说，NAHA活性与真菌生物质之间的相关性优于CFU与真菌生物质之间的相关性。
NAHA活性在所有丝状真菌中大量存在，但是与几乎所有其他酶活性一样，它并不是真菌独有的。因此，在某些情况下，使用NAHA活性作为定量真菌的工具可能会由于测量到的非真菌NAHA活性而导致真菌生物质的明显高估。
在例如如果样品包含室内尘埃时就是这种情况，该室内尘埃除真菌孢子外还可能包含花粉、宠物皮屑、人皮肤细胞和屋尘螨，所有这些都表现出一定程度的NAHA活性。
同样，从可能存在非真菌NAHA活性的植物表面或其他表面取样也存在高估真菌NAHA活性的相同风险。
血液样品中真菌的检测是另一个例子。人血含有NAHA活性，并且能够选择性抑制人NAHA活性的能力可以允许检测真菌NAHA活性的存在，因此使得真菌病的诊断筛选工具成为可能。
当基于酶活性测定其他特定的微生物群或物种时，可能会出现类似的问题。在感兴趣的不只是测定样品中微生物生物质的总量时，从被选为感兴趣的生物质子集的替代物的相似、同源或相同的酶测量的活性将构成测量的信号中的“噪声”，并能够产生大量的假阳性结果。
因此，需要在环境样品中进行与WO 98/033934中公开的测量以及WO 2005/083109中公开的测量相对应的测量时，能够减少来自“无关”微生物的竞争信号。
发明目的
本发明的实施方案的一个目的是基于样品中存在的真菌细胞的酶活性提供对测定真菌细胞(特别是在环境中)的改进。本发明的实施方案的另一个目的是提供一种用于真菌测定的测试试剂盒。
发明概述
本发明基于在专注于鉴定抑制剂的研究中的发现，所述抑制剂可以选择性地抑制其中要测定真菌(通常是霉菌)的系统中来自非真菌来源的NAHA的酶。
酶的活性可以被大量抑制剂竞争性或非竞争性地抑制。使用不同类型的抑制剂进行研究工作，本发明人鉴定了不同类型的酶抑制剂，它们在实验设置中显示对来自真菌的NAHA活性几乎没有抑制作用，但对来自许多非真菌来源的NAHA活性却显示出令人惊讶的强烈抑制作用。
已经令人惊讶地发现，NAHA活性的特异性抑制剂和酶活性的一般抑制剂都发挥相同的选择作用，即优先抑制细胞/生物体中的NAHA活性的能力，所述细胞/生物体会在基于NAHA的测量来测定真菌细胞时产生假阳性结果。
测试了金属离子，如Ag+、Hg+和Cu2+，以及更特异的NAHA抑制剂，即氮杂糖2-乙酰胺基-1,2-二脱氧野尻霉素(DNJNAc)。
β-N-乙酰基己糖胺酶的特异性抑制剂已经受到了广泛关注，主要是为了用于阐明β-N-乙酰基己糖胺酶在生物过程中的作用以及还用于开发治疗干预的工具。以前似乎没有考虑过在基于酶的真菌细胞测定中将这类抑制剂用作为信号增强剂的具体用途。
因此，在第一方面，本发明涉及一种用于定量或定性测定样品中的至少一种感兴趣的真菌的方法，所述方法包括将样品与底物接触或混合以产生反应混合物，并随后根据产生反应混合物之后反应混合物中底物的所测量的转化率评估所述样品中至少一种感兴趣的真菌的数量或浓度，其中
-底物可以被至少一种感兴趣的真菌产生的β-N-乙酰基己糖胺酶3.2.1.52(NAHA)和至少一种无关细胞产生的NAHA转化，以及
-在反应混合物中存在至少一种无关细胞产生的NAHA对底物的酶促转化的优先抑制剂。
在第二方面，本发明提供了一种用于测定感兴趣的真菌细胞的试剂盒，其包含
-底物，其可以通过感兴趣的真菌细胞以及无关细胞在NAHA中转化，
-无关细胞对底物的转化的至少一种抑制剂。
本发明第三方面涉及一种用于测定一个位置中至少一种感兴趣的真菌与同一位置中至少一种无关细胞相比的相对量的方法，其包括以下步骤：
1)使来自所述位置的样品与第一底物接触或混合以产生第一反应混合物，并随后测定在产生第一反应混合物后第一底物的转化率，
2)使来自所述位置的样品与第二底物接触或混合以产生第二反应混合物，并随后测定在产生第二反应混合物后第二底物的转化率，以及
3)通过计算在步骤1中测定的转化率与在步骤2中测定的转化率之间的比率来测定至少一种感兴趣的真菌的相对量，其中
-第一和第二底物可以被至少一种感兴趣的真菌产生的NAHA和至少一种无关细胞产生的NAHA转化，
-在第一反应混合物中存在至少一种无关细胞产生的NAHA对第一底物的酶促转化的优先抑制剂，和在第二反应混合物中不存在NAHA对第二底物的酶促转化的优先抑制剂。
附图说明
图1显示了各种样品中相对霉菌水平的百分比分布。
图2显示了来自被认为没有霉菌问题的位置(带“/”的阴影)和已知有霉菌问题的位置(带“\”的阴影)的样品中相对霉菌水平的百分比分布。
发明详述
定义
在本说明书和权利要求书中，“微生物”是单细胞生物(例如原核生物，例如细菌或古细菌，或单细胞真核生物，例如原生生物、原生动物、藻类、单细胞真菌，例如酵母或裂殖酵母)或可以是多细胞的生物(例如丝状真菌)。还包括的是微生物是在单细胞形式和多细胞形式之间切换的那些生物，即粘液霉菌，和某些真菌和藻类。根据本发明，特别感兴趣的是将本文公开的方法应用于真菌，特别是丝状真菌/霉菌。
“底物”是可以经历酶催化转化的物质。任何这样的转化都可以是感兴趣的，只要可以检测并区分底物和对底物的酶促作用的至少一种产物。例如，底物在特定测定中可能是不可检测的，而产物是可检测的，反之亦然；或者底物和产物两者可以在测定中是可检测的但也是可区分的。
在本文的上下文中，“反应混合物”是至少包含样品、底物和任选地优先抑制剂的混合物。取决于其中反应混合物是不可分割的部分的测定的精确设计，可以存在其他成分。
“优先抑制剂”是这样一种物质，其在测定所规定的条件(化学和物理条件以及持续时间)下，将无关细胞对底物的转化抑制至这样的程度，以使得在与不存在抑制剂的情况下相比，被至少一种感兴趣的真菌转化的底物与被无关细胞转化的底物之间的比率在测量转化的时间点得到增加。因此，即使事实上抑制剂能够与来自无关细胞的NAHA相比抑制真菌NAHA至相同或更高的程度，也认为该抑制剂对无关细胞NAHA是优先的；例如，如果抑制剂在无关细胞中充分发挥其对NAHA抑制作用所需的时间短于感兴趣的真菌细胞中所需的时间，则该抑制剂将在与包含真菌和无关细胞两者的样品混合后的一段时间内仅有效抑制无关细胞中的NAHA，因此，在此时间窗口内，NAHA对底物的转化将基本上限于真菌NAHA所施加的转化。
“无关细胞”是来自任何类型的生物体的这样的细胞，当测定感兴趣的微生物时，其不是测定所感兴趣的。通常，无关细胞将是生物体的那个细胞或那些细胞，其在正常情况下存在于样品材料中，但是由于与在真菌细胞中寻求检测的那些酶等同的酶的存在，它们可能会产生假阳性结果，即“噪音”。
在本文中，“样品”取自可能包含感兴趣的微生物的任何源材料。因此，样品可以例如是空气样品、灰尘样品、土壤样品、从干或湿表面收集的样品、来自液体材料诸如水的样品。
本发明的具体实施方案
如上所述，本发明第一方面涉及一种用于定量或定性测定样品中的至少一种感兴趣的真菌的方法，该方法包括使样品与底物接触或混合以产生反应混合物，并随后根据产生反应混合物之后反应混合物中底物的所测量的转化率评估所述样品中至少一种感兴趣的真菌的数量或浓度，其中
-底物可以被至少一种感兴趣的真菌产生的β-N-乙酰基己糖胺酶3.2.1.52(NAHA)和至少一种无关细胞产生的NAHA转化，以及
-在反应混合物中存在至少一种无关细胞产生的NAHA对底物的酶促转化的优先抑制剂。
通常，至少一种感兴趣的真菌是含有NAHA的真菌颗粒，例如菌丝或孢子、菌丝碎片或具有小于1μm的尺寸的菌丝微片段形式的丝状真菌细胞，因为本文描述的方法已经作为WO 98/033934中公开的真菌检测技术的一种变型实施，但是本发明的实践不限于测定丝状真菌。本发明已经证明真菌对NAHA活性的一些非特异性和特异性抑制剂的抑制作用较不敏感，而怀疑含有真菌的样品中假阳性信号的潜在来源(特别是诸如花粉和屋尘螨的来源)更加敏感。但是，更可能的是还存在由任何感兴趣的微生物和产生假阳性信号的微生物构成的其他“对”，其中可以实现本文公开的选择性抑制作用(一个实例可以是液体样品中的藻类与细菌)。
通常，真菌细胞的测定是通过检测转化产物(即检测来自产物的信号的增加)或检测底物(即检测来自底物的信号的减少)来进行的(此外，可以检测这两种物质)。这意味着NAHA驱动的转化的产物是可检测的和/或其中未转化的底物是可检测的。出于灵敏度考虑，优选仅检测转化的产物(在大多数情况下，将存在剩余的底物以确保一级酶促反应，其中只有负责降解的酶的浓度影响转化率)，并且在这种情况下，很难测定底物浓度的变化。
任何可以方便地检测到的信号可用于测量转化产物或底物的量。通常，可检测的产物和/或底物是有色的、发光的、荧光的、生色的、酶活性的或是捕获剂例如抗体或特异性受体的特异性结合伴侣。由于易于通过光度法测量荧光的变化，因此特别优选可检测的底物和/或产物是荧光的，并且在将底物添加至样品之后测量荧光的变化。在这种情况下，优选在约30分钟的时间段内，例如在将底物添加至样品之后的一个或几个时间点，间歇地或连续地测量荧光。是否需要在将底物添加到样品后的一个或几个时间点测量荧光，取决于实际情况和测试所需的精度：如果使用多个时间点，则可以获得荧光变化曲线并因此可以估计最大转化率(特别是当存在大量剩余的底物以使得转化底物的酶以最大速度运行并且曲线是线性时的转化率)。
约30分钟的时间段可以在很大范围内变化，并且例如如果已知要测量的真菌细胞的量在定义的范围内或者测定的物理条件对反应速度产生限制等，可以对该时间段进行调整。本领域技术人员将能够容易地适应特定的测定，从而选择真菌细胞和底物之间的反应的优化的时间段(这是校准给定测定的简单任务)。要注意的是，在抑制剂由于其抑制1)至少一种感兴趣的真菌中和2)假阳性细胞中的NAHA所需的时间不同而表现出差别抑制的情况下，这引入可以允许的反应时间的上限，这由在至少一种感兴趣的真菌和无关细胞中对NAHA的抑制作用达到相同或相似水平之前所花费的时间来设定。
通常，与至少一种感兴趣的真菌对底物的转化的抑制相比，抑制剂优先抑制至少一种无关细胞对底物的转化。如实施例中所示，使用标准化测定和精心选择的抑制剂浓度提供无关细胞中的NAHA活性的优先抑制，其是真菌酶活性的至少10倍。换句话说，比率(AMI1/AMI0)/(AMN1/AMN0)>1，其中AMI1和AMI0分别是在添加和不添加抑制剂的情况下至少一种感兴趣的真菌中NAHA的转化率(活性)，并且AMN1和AMN0分别是添加和不添加抑制剂的情况下无关细胞中NAHA的转化率。比率通常>2、>3、>4、>5、>6、>6、>7、>8、>9、>10、>15或甚至>20。下面在实施例2中(其中在24.5μM抑制剂的抑制剂浓度时比率为约7)和实施例1中(其中在100μM的抑制剂浓度时比率为约5.5)提供了一个实例。
要注意的是，对于本发明的方法的给定实际应用，必须测定本发明中使用的给定抑制剂的确切浓度；参见实施例。这是因为必须以一定浓度施加抑制剂，该浓度至少在无关细胞中可有效抑制NAHA。但是，必须针对不同浓度的靶NAHA(这可以反映在各种类型的采样设置中真菌和竞争性细胞的各种预期和实际浓度)滴定可用于本发明的不同抑制剂的有效浓度，并且进一步地，两种不同抑制剂的有效浓度相对于相同浓度的NAHA也将相互独立。然而，对于大多数应用(即测定室内环境中的霉菌侵染)，可以基于广泛样品中无关细胞的已知浓度的知识来确定这种有效浓度。最后，通常将以比所测定的最小有效浓度至少略微过量的浓度使用抑制剂，以确保充分抑制出乎意料的较高浓度的无关细胞。
本发明中使用的底物(特别是用于检测丝状真菌)是可以被β-N-乙酰基己糖胺酶3.2.1.52(NAHA)转化的底物。然而，对于其他应用，可以考虑使用其他特征性酶，这取决于将要测定的确切生物体。同样，NAHA并不是将有可能在真菌测定的等效方法中使用的唯一酶，因此导致使用对其他真菌酶特异的底物。
当被NAHA转化时，底物或转化产物中的可检测部分方便地是4-甲基伞形酮或其荧光可检测衍生物。这样的衍生物的例子是当被NAHA转化时的4-甲基伞形酮或其荧光可检测的衍生物，例如选自以下的甲基伞形基衍生物：4-甲基伞形基-β-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-吡喃糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，吲哚基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-吡喃糖苷，4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，β-三氟甲基伞形基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，N-甲基-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，5-碘-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖，4-甲基伞形基-β-D-N,N'-二乙酰基壳二糖苷，4-甲基伞形基-7-(6-磺基-2-乙酰胺基-2-脱氧)-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基α-D-岩藻糖苷；4-甲基伞形基β-D-岩藻糖苷，4-甲基伞形基α-D-葡糖苷，4-甲基伞形基-7-(6-磺基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷)，4-甲基伞形基-N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基β-D-乳糖苷，4-甲基伞形基-N-乙酰胺基半乳糖苷，4-甲基伞形基β-D-吡喃甘露糖苷，4-甲基伞形基α-D-吡喃甘露糖苷，4-甲基伞形基β-D-木糖苷，试卤灵-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷，9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(DDAO)和DDAO的N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷低聚衍生物。
特别优选的是选自4-甲基伞形基-β-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷和4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖苷的甲基伞形基衍生物。
如实施例中所示，抑制剂可以是特异性以及非特异性NAHA抑制剂。非特异性抑制剂是例如金属离子，例如选自Ag+、Hg2+和Pb2+的离子。特异性NAHA抑制剂的例子是2-乙酰胺基-1,2-二脱氧野尻霉素，但是本领域已知的其他特异性NAHA抑制剂同样适用。
如实施例中所述，本发明中利用的优先抑制的可能原因之一是待测试的生物体(例如真菌细胞)不允许该抑制剂以与无关细胞相同的速度接近NAHA(出于这个原因并且作为预防措施，优选的是在底物与样品接触之前不使抑制剂与样品接触)。因此，可以在与样品接触之前将底物和抑制剂混合，或可以将它们基本上同时添加至样品。
然而，根据本发明，可以在添加底物之前将抑制剂添加至样品，只要这基本上不会对测定中针对的NAHA活性的优先抑制产生负面影响。换句话说，优先抑制剂可以
-在产生反应混合物之前与底物混合或接触，或
-在产生反应混合物时与底物同时添加至样品，或
-在产生反应混合物之前添加至样品。
在这3种情况的后一种情况下，优选在产生反应混合物之前最多2小时将抑制剂添加至样品，例如在产生反应混合物之前最多115分钟，最多100分钟，最多105分钟，最多100分钟，最多95分钟，最多90分钟，最多85分钟，最多80分钟，最多75分钟，最多70分钟，最多65分钟，最多60分钟，最多55分钟，最多50分钟，最多45分钟，最多40分钟，最多35分钟，最多30分钟，最多25分钟，最多20分钟，最多15分钟，最多10分钟和最多5分钟。
在第一方面的实践中，通常基于在包括已知浓度的所考虑的真菌细胞的标准品上进行的一系列校准测量来测定真菌细胞水平。替代地，校准是基于从已知表现出至少一种感兴趣的真菌的各种水平的污染的环境中获得的经验数据。
如实施例中所示，在本发明第一方面的实践中，已证明使用非常不同的NAHA抑制剂(特异性抑制剂和更一般性的酶抑制剂)都是成功的。此外，如本文中所讨论的，这些抑制剂与真菌细胞的长时间温育具有如下效果：来自真菌细胞的NAHA活性以类似于抑制非真菌NAHA的方式被抑制。
这导致本发明人得出结论，能够以更一般的方式应用通过以类似于针对NAHA抑制所描述的方式使用抑制剂来增强微生物测定的特异性的原理，这也被认为是本发明的一部分。至少，本文的数据提供了有力的证据，证明真菌细胞数量/浓度的任何测定(其依赖于在与测定无关的其他细胞中具有对应物的真菌酶的活性的测定)可以通过在测定过程中加入酶活性的抑制剂来变得更加特异性。之所以如此，是因为所提供的实验数据强烈表明，酶活性的任何抑制剂在真菌细胞中与测试样品中的无关细胞相比接近与之相互作用的酶时将会“延迟”。换言之，本发明似乎证明，由于某些未知的原因，许多物质(例如本文中测试的各种抑制剂)在无关细胞中接近其靶标酶与其在真菌细胞中的接近相比更容易，而抑制的特异性酶则具有较小的相关性。
因此，这打开了本发明的非常广泛的方面，其可以描述为用于定量或定性测定样品中的至少一种感兴趣的真菌的方法，所述方法包括将样品与底物接触或混合以产生反应混合物，并随后根据产生反应混合物之后反应混合物中底物的所测量的转化率评估所述样品中至少一种感兴趣的真菌的数量或浓度，其中
-底物可以被至少一种感兴趣的真菌产生的酶和至少一种无关细胞产生的竞争性酶转化，并且
-反应混合物中存在所述酶和竞争性酶对底物的酶促转化的优先抑制剂。
因此，关于执行方法的方式上文在第一方面中描述的未直接与NAHA及其底物相关的所有实施方案均适用于此更广泛的方面。技术人员将能够为选择的可用于真菌细胞选择的酶选择合适的底物，并且还能够选择这种酶的特异性抑制剂(记住，非特异性抑制剂例如银离子和其他非特异性抑制剂在任何此类测定中将具有广泛的适用性。
第二方面：本发明的试剂盒
还如上所述，作为第二方面本发明还提供了一种用于测定感兴趣的真菌细胞的试剂盒，其包含
-底物，其可以通过感兴趣的真菌细胞以及无关细胞在NAHA中转化，
-无关细胞对底物的转化的至少一种抑制剂。
底物和抑制剂均优选如上所详述的。因此，在本发明第一方面的上下文中已经提出的本文涉及底物和抑制剂的任何公开内容在细节上作必要修改后都涉及本发明第二方面。
除底物和抑制剂外，试剂盒还可包含以下中的一种或多种：
-用于收集待测试的样品的工具，
-用于使样品、底物和抑制剂反应的反应容器，
-用于保持/存储含有底物和/或在与样品反应后转化的底物的液体的容器，例如比色皿。
在某些情况下，试剂盒还可包含用于检测转化的底物和/或底物的检测装置或检测试剂。
在本发明的试剂盒中，底物和抑制剂通常存在于包含在单个容器中的单一溶液中，但是它们也可以在单个容器中的不同隔室中或在分开的容器中彼此分开。后者例如是克服如果抑制剂和底物相互作用使得其一者或两者可能在储存过程中变得不太稳定而可能产生的问题的方法。
本发明第三方面–微生物的相对测定
如从上文明显的是，本发明第一方面的方法(以优选的方式)鉴定(至少在一段时间内)不太易受到存在于反应混合物中的NAHA抑制剂的抑制作用影响的那些真菌(通常是丝状真菌，例如霉菌)。还如上所述，如果反应混合物中不存在抑制剂，则通过底物转化方法例如上述现有技术的方法测定至少一种真菌可以由于与考虑的测定无关的细胞中存在的NAHA对底物的转化而可能导致假阳性结果。
本发明人现已发现，如果对来自相同位置(例如同一房间或建筑物)的样品并行进行两种测量类型，则两次测量之间的比率可以提供所测量的细胞总量中微生物的相对量的清楚指示，并且还提供了其可能来源的存在的定性指示。
在实践中，用本发明第一方面的方法(以及现有技术的方法)检查的位置可能在清洁和通风方面经历高度变化的条件：通过从怀疑被侵染的位置收集样品测定真菌(如致敏霉菌)的存在。然而，如果这样的位置每天有效地通风几次，或者最近已经进行了广泛的清洁，则在获得的样品中来源于霉菌的材料的存在将很少，并且根据本发明第一方面或根据现有技术方法进行的测量可能会提供错误的印象，即该位置没有被霉菌侵染。但是，通过评估能够转化测定中使用的NAHA底物的细胞总数中的霉菌的相对量，即使在大部分可测量的细胞和霉菌已被去除(例如由于通风或清洁)的位置，也可以鉴定出侵染的存在。
从实施例3中可以明显看出，在来自被认为没有霉菌侵染的位置和其中霉菌被认为是一个问题的位置的样品中可测量的霉菌的相对量之间通常存在明显的区别。一般而言，除非霉菌的绝对量超出被认为可以接受的阈值，否则提供用于显示相对霉菌量小于约35％的测量的位置通常不被认为被霉菌侵染。因此，借助本发明，现在可以提供对某个位置的霉菌侵害状态进行更详细的分析：
1)如果霉菌的总浓度高于根据本发明第一方面所测量的可接受的阈值，则可以得出结论，存在霉菌侵染并且必须对其进行处理。
2)如果霉菌的总浓度低于可接受的阈值水平，则根据本发明第三方面的霉菌的相对量的测量将能够提供关于可能的霉菌侵染问题的信息，例如如果霉菌活性的相对量被证明是≥45％，则根据本发明第一方面的即使较小或低的测量也将反映由于例如频繁和广泛的通风或频繁和广泛的清洁而无法检测到的霉菌的局部来源。换言之，本发明第三方面的方法使得能够检测可能被其他因素诸如通风和清洁掩盖的霉菌的隐藏来源。对于提供≥36％到<45％范围内的值的测量，由于无法得出有关霉菌侵染的明确结论，通常必须进一步研究。
在未抑制的反应混合物提供而抑制的反应混合物没有提供非常高的读出的情况下，出现可以通过第三方面的方法提供的第三信息。这提供了样品位置没有被霉菌侵染但是“无关”细胞的数量很高的信息。这可以例如触发对样品位置进行彻底清洁或消毒的建议。
可以基于已针对标准样品进行校准的底物转化率方便地进行样品中至少一种感兴趣的真菌的测量以及总(可测量的)生物质的测量，使得来自每种类型的测量的转化率可以被转换为分别表示微生物浓度和总细胞浓度的数字。如上所述，针对标准品进行校准的替代方法是在具有至少一种感兴趣的真菌的相对良好确定的水平的位置中进行测量，并将这些初始测量值用作校准值。
因此，如上所述，本发明第三方面涉及一种用于测定一个位置中至少一种感兴趣的真菌与同一位置中至少一种无关细胞相比的相对量的方法，其包括以下步骤：
1)使来自所述位置的样品与第一底物接触或混合以产生第一反应混合物，并随后测定在产生第一反应混合物后第一底物的转化率，
2)使来自所述位置的样品与第二底物接触或混合以产生第二反应混合物，并随后测定在产生第二反应混合物后第二底物的转化率，以及
3)通过计算在步骤1中测定的转化率与在步骤2中测定的转化率之间的比率来测定至少一种感兴趣的真菌的相对量，其中
-第一和第二底物可以被至少一种感兴趣的真菌产生的NAHA和至少一种无关细胞产生的NAHA转化，
-在第一反应混合物中存在至少一种无关细胞产生的NAHA对第一底物的酶促转化的优先抑制剂，和在第二反应混合物中不存在NAHA对第二底物的酶促转化的优先抑制剂。
为了确保样品反映相同比例的真菌细胞和无关细胞，所测试的两个样品方便地是取自该位置的相同原始样品的等分试样。
“位置”通常是室内环境，并且可以是单个房间，也可以是整个房子，其中在多个采样点收集样品例如空气样品或表面样品。
通常，以与执行本发明第一方面的方法相同的方式执行本发明第三方面的步骤1。换句话说，与样品类型、待测定的微生物、底物的选择、测量细节等有关的所有考虑事项均在作必要的修改后适用于第一方面的步骤1，并在用于执行本发明第一方面的工具和措施不涉及抑制剂的使用的程度下，关于本发明第一方面的实施方案的细节也在作必要的修改后适用于第三方面的方法中的第二步骤。
因此，在本发明第三方面中，方便但非必要的是第一底物和第二底物是相同的：因为每种底物的转化率通常通过针对相关标准样品的校准转换为细胞浓度的指示，所以在本发明的实践中，为了获得有意义和有用的结果，并非绝对必要的是两种底物是相同的，但是在实践中，在整个测试中使用相同的试剂更为方便。
与本发明第一方面一样，在重要的实施方案中，至少一种感兴趣的真菌选自菌丝或孢子形式的丝状真菌(霉菌)。
如在第一方面中的情况一样，由NAHA转化的产物是否可检测和/或其中未转化的底物是否可检测是一个选择问题，这意味着可以通过测量转化的产物的量的增加和/或底物的量的减少来测量转化。通常最方便的是测量转换的产物的量的增加，因为信号的相对变化(尤其是初始地)比测量底物量的减少要高得多。
还如在第一方面中的情况一样，可检测的产物和/或可检测的底物可以是有色的、发光的、荧光的、生色的、酶活性的或是捕获剂的特异性结合伴侣。优选的是，可检测的底物和/或产物是荧光的，并且在将底物添加至样品之后测量荧光的变化。可以间歇地或连续地测量荧光，优选在约30分钟的时间段内测量，是否需要在将底物添加至样品之后的一个或几个时间点测量荧光取决于实际情况和测试所需的精度：如果使用多个时间点，则可以获得荧光变化曲线并因此可以估计最大转化率(即，当存在大量剩余的底物以使得转化底物的NAHA以最大速度运行并且曲线是线性时的转化率)。
此外，在本发明第三方面的实施方案中，与至少一种感兴趣的微生物的转化的抑制相比，所述优先抑制剂优先抑制至少一种无关细胞对底物的转化。
在第三方面的优选实施方案中，可以通过β-N-乙酰基己糖胺酶3.2.1.52(NAHA)转化底物。
特别优选的底物是当被NAHA转化时释放4-甲基伞形酮或其荧光可检测的衍生物的底物。此类衍生物的实例选自当被NAHA转化时的4-甲基伞形酮或其荧光可检测的衍生物，例如选自以下的甲基伞形基衍生物：4-甲基伞形基-β-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-吡喃糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，吲哚基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-吡喃糖苷，4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，β-三氟甲基伞形基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，N-甲基-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，5-碘-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖，4-甲基伞形基-β-D-N,N'-二乙酰基壳二糖苷，4-甲基伞形基-7-(6-磺基-2-乙酰胺基-2-脱氧)-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基α-D-岩藻糖苷；4-甲基伞形基β-D-岩藻糖苷，4-甲基伞形基α-D-葡糖苷，4-甲基伞形基-7-(6-磺基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷)，4-甲基伞形基-N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基β-D-乳糖苷，4-甲基伞形基-N-乙酰胺基半乳糖苷，4-甲基伞形基β-D-吡喃甘露糖苷，4-甲基伞形基α-D-吡喃甘露糖苷，4-甲基伞形基β-D-木糖苷，试卤灵-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷，9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(DDAO)和DDAO的N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷低聚衍生物。
特别优选的是选自4-甲基伞形基-β-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷和4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖苷的甲基伞形基衍生物。
如在第一方面中一样，抑制剂可以是特异性和非特异性NAHA抑制剂。非特异性抑制剂是例如金属离子，例如选自Ag+、Hg2+和Pb2+的离子。具体的NAHA抑制剂的例子是2-乙酰胺基-1,2-二脱氧野尻霉素，但是本领域已知的其他具体的NAHA抑制剂同样适用。
如在实施例中提到的，本发明中利用的优先抑制的可能原因之一是要检测的至少一种真菌不允许该抑制剂以与无关细胞相同的速度接近NAHA(出于这个原因并且作为预防措施，优选的是在底物与样品接触之前不使抑制剂与样品接触)。因此，可以在与样品接触之前将底物和抑制剂混合，或者可以将它们基本上同时添加至样品。
然而，根据本发明第三方面，可以在步骤1中在添加底物之前将抑制剂添加至样品，只要这基本上不会对测定中针对的NAHA活性的优先抑制产生负面影响。换句话说，优先抑制剂可以
-在产生反应混合物之前与底物混合或接触，或
-在产生反应混合物时与底物同时添加至样品，或
-在产生反应混合物之前添加至样品。
在这3种情况的后一种情况下，优选在产生反应混合物之前最多2小时将抑制剂添加至样品，例如在产生反应混合物之前最多115分钟，最多100分钟，最多105分钟，最多100分钟，最多95分钟，最多90分钟，最多85分钟，最多80分钟，最多75分钟，最多70分钟，最多65分钟，最多60分钟，最多55分钟，最多50分钟，最多45分钟，最多40分钟，最多35分钟，最多30分钟，最多25分钟，最多20分钟，最多15分钟，最多10分钟和最多5分钟。
与本发明第一方面一致，第三方面也具有较宽泛的形式，这是因为发现所利用的优先抑制是由于真菌细胞的特征而引起的，该特征明显减慢了抑制剂接近其酶靶标的速度(参见上文中第一方面的描述的最后部分中的解释)。可以将第三方面的这种较宽泛的形式描述为一种用于测定一个位置中至少一种感兴趣的真菌与同一位置中至少一种无关细胞相比的相对量的方法，其包括以下步骤：
1)使来自该位置的样品与第一酶底物接触或混合以产生第一反应混合物，并随后测定在产生第一反应混合物后第一酶底物的转化率，
2)使来自该位置的样品与第二酶底物(可能与第一底物相同)接触或混合以产生第二反应混合物，并随后测定在产生第二反应混合物后第二酶底物的转化率，以及
3)通过计算在步骤1中测定的转化率与在步骤2中测定的转化率之间的比率来测定至少一种感兴趣的真菌的相对量，其中
-第一和第二底物可以被至少一种感兴趣的真菌产生的酶和至少一种无关细胞产生的酶转化，
-在第一反应混合物中存在至少一种真菌和至少一种无关细胞产生的酶对第一底物的酶促转化的优先抑制剂，而在第二反应混合物中不存在这种优先抑制剂。
因此，关于执行方法的方式，上文针对本发明第三方面所述的未直接与NAHA及其底物相关的所有实施方案均适用于此更宽泛的形式。技术人员将能够为选择的可用于真菌细胞选择的酶选择合适的底物，并且还能够选择这种酶的特异性抑制剂(记住，非特异性抑制剂例如银离子和其他非特异性抑制剂在任何此类测定中将具有广泛的适用性。
实施例1
Ag+作为NAHA抑制剂
为了测定不同样品中的NAHA活性，采用了WO 98/033934中的技术：将包含干燥或冷冻干燥的生物体的样品添加到含有浓度为20μM的4-甲基伞形基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷的缓冲溶液中。反应时间取决于环境温度以及根据先前在各种温度下针对真菌NAHA活性开发的反应时间/温度数据表而变化，并且在23℃下为30分钟。在反应时间内形成的荧光在经校准的荧光计中监控。
在先导实验中，浓度为10μM的Ag+表现出草花粉和螨Lepidoglyphus中NAHA活性的几乎完全抑制。另一方面，Ag+对三种测试真菌(链格孢属的某些种(Alternaria spp.)、枝顶孢属的某些种(Acremonium spp.)和枝孢属的某些种(Cladosporium spp.))中的NAHA活性没有显著影响。
Hg+(10μM)具有类似的作用，对真菌具有高抑制作用和对真菌NAHA活性具有较小的抑制作用(但大于Ag+)。另一方面，浓度为500μM的Cu2+没有显示任何或仅显示非常轻微的对来自所有来源的NAHA活性的抑制作用。
根据这些结果以及由于Hg+的较高毒性，决定在以后的工作中仅关注Ag+的作用。进行了将不同浓度的AgNO3添加到分析底物的实验。此外，在干燥或冷冻干燥的材料上进行了实验，其中预期存在完整和破碎的细胞。表1显示了增加浓度的Ag+对非真菌生物质来源中NAHA活性的影响，表2显示了对来自真菌生物质来源的NAHA的影响。
结果证实，酶活性的水平取决于Ag+的浓度，但即使在400μM时，仍保留了高百分比的真菌NAHA活性，而非真菌来源仅保留对照的平均13％。平均而言，测定底物中100μM浓度的Ag+导致非真菌NAHA活性降低82％，并且导致真菌NAHA活性零到非常低的降低。因此，使用Ag+提供假阳性信号的显著减少，从而导致酶活性测量的特异性的增加。进而，特异性的增加(伴随着真菌NAHA活性的检测的灵敏度的微小损失)提供测定准确性的出人意料的增加。
表1：不同浓度的AgNO3浓度对来自不同来源的NAHA活性的影响。酶测定运行30分钟。对照(无Ag+的测定)用作100％活性。
表2：不同浓度的AgNO3浓度对来自不同真菌的NAHA活性的影响。
实施例2
2-乙酰胺基-1,2-二脱氧野尻霉素(DNJNAc)作为抑制剂
进行类似于实施例1中的实验，但是代替使用非特异性抑制剂，研究了不同浓度的DNJNAc对各种含生物质样品中NAHA活性的影响。表3显示了在非真菌生物质的样品中观察到的效果，表4a和4b显示了在具有真菌生物质的样品中观察到的效果。
这些表中显示的结果证明，酶活性的水平取决于DNJNAc的浓度。在测试的最高浓度(196μM)下，保留了平均60％的真菌NAHA活性，而非真菌来源仅保留了对照的平均5％。在测定底物中DNJNAc浓度为24.5μM时，保留了平均11％的非真菌活性，而真菌NAHA的平均值为83％。
表3：测定底物中不同浓度的DNJNAc对来自非真菌来源的NAHA活性的影响。
表4a：测定底物中不同浓度的DNJNAc对来自真菌来源的NAHA活性的影响。
表4b：测定底物中不同浓度的DNJNAc对来自真菌来源的NAHA活性的影响。
实施例1和2的结果的讨论
为了获得抑制的选择性，NAHA抑制剂的浓度很重要：如果使用过高的浓度，则真菌和非真菌的NAHA活性都会被抑制。但是实施例表明存在抑制剂浓度的窗口，其中真菌NAHA活性仅被轻微抑制，而非真菌NAHA活性几乎被完全抑制；换句话说，在一定浓度的抑制剂下，非真菌NAHA活性被优先抑制。
令人惊讶的是，使用非特异性酶抑制剂(例如银和汞离子)以及使用更特定类型的NAHA抑制剂(例如DNJNAc)均可获得这种选择性作用。可以预料的是，银/汞将与基于糖基的底物类似物(例如DNJNAc)不同地起作用。
这些实验还没有揭示出参与优先抑制的机制。这些实验是用全细胞/生物培养物而不是纯化的酶(其通常用于特异性抑制实验)进行的。但是，有可能的是，对Ag+和Hg+观察到的令人惊讶的非特异性抑制作用可能是由于与其他类型的生物质相比，在真菌中抑制剂与NAHA酶的物理接触上存在延迟。这得到以下发现的支持，即在酶测定之前将Ag+添加到真菌培养物中导致与其他类型的生物质的抑制一致的真菌NAHA活性的完全抑制。
实施例3
样品中相对霉菌存在的测定
通过比较平行样品(空气或表面灰尘)中在具有和不具有NAHA抑制剂(例如DNJNAc)的情况下的NAHA活性，可以提供3个问题的答案：1)样品中霉菌的定量数量/水平(在存在抑制剂的情况下的测量)；2)(微)生物的定量数量/水平(在不存在抑制剂的情况下的测量)；和3)通过计算霉菌水平在一般微生物水平中所占的比例来获得相对霉菌水平。
从有或没有霉菌问题的建筑物中获得样品。根据用于积极空气采样的以下方案使用积极空气采样。
积极空气采样方案
样品体积：150-300l
流速：10-20l/min。理想流速为20l/min，最小流速为10(注意流速并用于计算样品体积)。用于清洁的质量控制的最小流速为15l/min(225l采样体积)。
采样时间：15分钟(总是)。
采样高度：约1.5米
过滤器：仅使用MM-空气过滤器(MCE过滤器孔径，0.8μm)。
过滤器方向：取下整个盖子，并将其开口朝上放置。
安全性：房间里的每个人都应该使用呼吸保护装置。
房间面积：在至多60平方米的房间中一个样品。在更大的房间中，采集若干样品。
采样前，应关闭所有窗户至少6个小时。注意是否有正在运行机械通风、除湿机、空气净化器或类似设备。
1.设置泵和三脚架。
2.给予过滤器一个ID，并将其放在管上。
3.将一个计时器设置为2分钟，并将另一个设置为15分钟。
4.戴好呼吸防护装置。
5.现在使用Makita鼓风机(速度设置3)在任何表面上以约2米的距离吹气。从天花板开始，然后是墙壁，最后以家具和地板结束。不要短距离吹气以从几乎是最近清洁的容器中的释放尘埃(例如，散热器的薄板之间)。在20平方米的房间中使用鼓风机约2分钟，然后从该房间外推/内插到更小或更大的房间。
6.吹完后，启动秒表(2分钟)。
7.当秒表发出信号时，取下过滤器的盖子(不仅仅是蓝色的塞子)，然后启动气泵和计时器(15分钟)。
8.调节流速20l/min。
9.当计时器发出信号时，停止泵并将盖子放回过滤器上。
在爆喷和启动空气泵之间引入2分钟的暂停，以避免受到已被吹起的大灰尘球的影响。如果连续采集几个样品，或者如果空气中有很多颗粒，则泵可能变得非常热，从而影响流速。因此，在采样期间定期检查流速是否正确。注意，如果泵变得非常热，它们通常具有关闭其的机制。与该方案的差异可能影响采样效率，这意味着无法应用结果类别。
在室温下存储时，必须在采样日后的1周内对空气样品进行分析。始终建议在采样后尽快分析样品。
实验性
如上所述，采集了许多平行的双样品，随后分析了NAHA活性；对于每组双样品，在底物溶液中使用DNJNAc作为添加剂来分析一个样品，而另一个不使用DNJNAc进行分析。
在不具有DNJNAc和其他抑制剂的情况下分析的样品代表了显示NAHA活性的室内细胞材料；真菌、尘螨、花粉、狗和猫皮屑等以及人皮肤鳞屑的所有来源的NAHA活性。如实施例2所示，在存在DNJNAc的情况下分析的样品代表真菌。通过比较来自两个平行样品的结果，计算霉菌的相对量或相对霉菌水平/指数为在具有DNJNAc的情况下的NAHA活性除以在不具有DNJNAc的情况下的NAHA活性。因此，两个并行样品提供了三段信息：1)霉菌的水平，2)普通多孔材料的水平，和3)霉菌与普通多孔材料的相对水平。
图1显示了在样品中测量的相对霉菌水平的分布：84.4％的样品具有30％或更低的相对霉菌水平(白色条形)。13％的样品具有高于30％和低于或等于45％的相对霉菌水平(水平阴影条形)，而2.6％具有高于45％的相对霉菌水平(交叉阴影条形)。
表4显示了来自被视为非问题建筑物(与霉菌问题和水损害有关)的18个建筑物的不同房间的空气样品中的在添加和不添加DNJNAc到酶反应中的情况下的NAHA活性。相对霉菌指数计算为在具有DNJNAc的情况下的NAHA活性除以在不具有DNJNAc的情况下的NAHA活性。
表4
表5显示了来自其中看见一定水平的霉菌问题的不同房间的空气样品中的在添加和不添加DNJNAc到酶反应中的情况下的NAHA活性。相对霉菌指数计算为在具有DNJNAc的情况下的NAHA活性除以在不具有DNJNAc的情况下的NAHA活性。
表5
NAHA活性 相对
房间 不具有 具有 霉菌
建筑物 类型 DNJNAc DNJNAc 水平％
19 厨房1 960 702 73
20 厨房 2996 2796 93
20 浴室 2147 1773 83
20 休息室 1230 1053 82
20 卧室 1375 1044 56
20 大厅 2133 1693 79
21 卧室2 2760 1542 56
22 温室 1093 698 64
22 杂物室 5560 5036 91
23 储藏室 1373 889 65
23 卧室 3140 2007 64
24 厨房 2324 2071 89
图2显示了从表4和表5中的数据发现的相对霉菌水平的分布：良好分离了被认为没有霉菌问题/水损害的房间/建筑物和已经认识到霉菌问题的那些房间/建筑物，除了一个离群值以外(在图2中用箭头标记)。针对该特定离群值的相对霉菌指数引起了可能存在迄今尚未引起注意、但是未被测量员公开的霉菌源的怀疑。

Claims (42)

1.一种用于定量或定性测定可能含有来自非真菌来源的β-N-乙酰基己糖胺酶3.2.1.52(NAHA)的样品中的真菌细胞的方法，所述方法包括将样品与底物接触或混合以产生反应混合物，并随后根据产生反应混合物之后反应混合物中底物的所测量的转化率评估所述样品中真菌细胞的数量或浓度，其中
-所述底物能够被所述真菌细胞产生的NAHA和被非真菌的NAHA转化，以及
-在所述反应混合物中存在表现出优先抑制非真菌的NAHA对所述底物的酶促转化的抑制剂；
其中所述表现出优先抑制的抑制剂是选自Ag+、Hg2+和Pb2+的金属离子，或者是2-乙酰胺基-1,2-二脱氧野尻霉素。
2.一种用于测定一个位置中至少一种真菌细胞与同一位置中至少一种非真菌细胞相比的相对量的方法，其包括以下步骤：
1)使来自所述位置的样品与第一底物接触或混合以产生第一反应混合物，并随后测定在产生第一反应混合物后第一底物的转化率，
2)使来自所述位置的样品与第二底物接触或混合以产生第二反应混合物，并随后测定在产生第二反应混合物后第二底物的转化率，以及
3)通过计算在步骤1中测定的转化率与在步骤2中测定的转化率之间的比率来测定真菌细胞的相对量，其中
-第一底物和第二底物能够被真菌细胞产生的NAHA和来自非真菌来源的NAHA转化，
-在第一反应混合物中存在表现出优先抑制来自非真菌来源的NAHA对第一底物的酶促转化的抑制剂，和在第二反应混合物中不存在表现出优先抑制来自非真菌来源的NAHA对第二底物的酶促转化的抑制剂；
其中表现出优先抑制的抑制剂是选自Ag+、Hg2+和Pb2+的金属离子，或者是2-乙酰胺基-1,2-二脱氧野尻霉素。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一底物和第二底物是相同的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述真菌细胞是含有NAHA的真菌颗粒。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中被NAHA转化的产物是可检测的，或者其中未转化的底物是可检测的，或者其中被NAHA转化的产物和未转化的底物是可检测的。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过测量转化产物的量的增加或底物的量的减少来测量转化率，或者其中通过测量转化产物的量的增加和底物的量的减少来测量转化率。
7.根据权利要求5所述的方法，其中可检测的产物或可检测的底物是有色的、发光的、荧光的、生色的、酶活性的或是捕获剂的特异性结合伴侣，或者其中可检测的产物和可检测的底物是有色的、发光的、荧光的、生色的、酶活性的或是捕获剂的特异性结合伴侣。
8.根据权利要求6所述的方法，其中可检测的产物或可检测的底物是有色的、发光的、荧光的、生色的、酶活性的或是捕获剂的特异性结合伴侣，或者其中可检测的产物和可检测的底物是有色的、发光的、荧光的、生色的、酶活性的或是捕获剂的特异性结合伴侣。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中可检测的底物或产物是荧光的，并且其中在将底物添加至样品之后测量荧光的变化，或者其中可检测的底物和产物是荧光的，并且其中在将底物添加至样品之后测量荧光的变化。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其中间歇地或连续地在30分钟的时间内测量荧光。
11.根据权利要求7或8所述的方法，其中在将底物添加至样品之后的一个或几个时间点测量荧光。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中相比于抑制所述真菌细胞对底物的转化，所述抑制剂表现出优先抑制所述非真菌的NAHA对底物的转化。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述底物在被NAHA转化时释放4-甲基伞形酮或其荧光可检测的衍生物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述衍生物选自：4-甲基伞形基-β-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-吡喃糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，吲哚基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-吡喃糖苷，4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，β-三氟甲基伞形基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，N-甲基-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，5-碘-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖，4-甲基伞形基-β-D-N,N'-二乙酰基壳二糖苷，4-甲基伞形基-7-(6-磺基-2-乙酰胺基-2-脱氧)-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基α-D-岩藻糖苷；4-甲基伞形基β-D-岩藻糖苷，4-甲基伞形基α-D-葡糖苷，4-甲基伞形基-7-(6-磺基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷)，4-甲基伞形基-N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基β-D-乳糖苷，4-甲基伞形基-N-乙酰胺基半乳糖苷，4-甲基伞形基β-D-吡喃甘露糖苷，4-甲基伞形基α-D-吡喃甘露糖苷，4-甲基伞形基β-D-木糖苷，试卤灵-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷，9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(DDAO)和DDAO的N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷低聚衍生物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述DDAO的N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷低聚衍生物是4-甲基伞形基-β-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷或4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖苷。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表现出优先抑制的抑制剂是2-乙酰胺基-1,2-二脱氧野尻霉素。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表现出优先抑制的抑制剂
-在产生反应混合物之前与底物混合或接触，或
-在产生反应混合物时与底物同时添加至样品，或
-在产生反应混合物之前添加至样品。
18.根据权利要求17所述的方法，其中如果在产生反应混合物之前将表现出优先抑制的抑制剂添加至样品，则在产生反应混合物之前最多2小时将表现出优先抑制的抑制剂添加至样品。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多115分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
20.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多110分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
21.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多105分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
22.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多100分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
23.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多95分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
24.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多90分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
25.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多85分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
26.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多80分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
27.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多75分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
28.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多70分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
29.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多65分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
30.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多60分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
31.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多55分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
32.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多50分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
33.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多45分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
34.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多40分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
35.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多35分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
36.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多30分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
37.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多25分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
38.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多20分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
39.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多15分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
40.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多10分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
41.根据权利要求18所述的方法，其中在产生反应混合物之前最多5分钟添加表现出优先抑制的抑制剂。
42.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述真菌细胞是菌丝或孢子、菌丝碎片或具有小于1μm的尺寸的菌丝微片段形式的丝状真菌细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109824743B (zh) * 2019-03-04 2021-11-23 大连医科大学 一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光探针及其应用
US11752232B2 (en) * 2020-12-03 2023-09-12 Gholam Hossein Zereshkian Personalized forced air purifier
US20220364973A1 (en) * 2021-05-13 2022-11-17 Honeywell International Inc. In situ fluid sampling device and method of using the same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6921635B1 (en) * 1997-08-20 2005-07-26 Bio Merieux Culture and identification media specific of different species of Candida and analysis methods
WO2005083109A1 (en) * 2004-03-01 2005-09-09 Mycometer Aps Measuring contamination

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69834319T2 (de) 1997-02-04 2007-04-12 Aps Mycometer Methode zur selektiven bestimmung der biomasse von pilzen
AU2008273946A1 (en) * 2007-07-09 2009-01-15 Microsens Medtech Limited Detection of micro-organisms based on their NAD-dependent DNA ligase activity
CN201400688Y (zh) * 2009-03-10 2010-02-10 郑州安图绿科生物工程有限公司 一种阴道炎联检卡
GB0906643D0 (en) * 2009-04-17 2009-06-03 Wilson Stuart M Detection of bacteria and fungi
US20130266977A1 (en) * 2010-02-16 2013-10-10 President And Fellows Of Harvard College Methods and systems for detection of microbes
JP6585052B2 (ja) * 2013-09-05 2019-10-02 ユニヴァーシティ・オブ・ワシントン・スルー・イッツ・センター・フォー・コマーシャリゼーション Ｍｐｓ ｉ、ｉｉ、ｉｉｉａ、ｉｉｉｂ、ｉｖａ、ｖｉ、およびｖｉｉをスクリーニングするための試薬および方法
US10774363B2 (en) * 2015-09-25 2020-09-15 Woundchek Laboratories (Us), Inc. Methods of prediction of wound healing

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6921635B1 (en) * 1997-08-20 2005-07-26 Bio Merieux Culture and identification media specific of different species of Candida and analysis methods
WO2005083109A1 (en) * 2004-03-01 2005-09-09 Mycometer Aps Measuring contamination

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