CN111693445A - 检测痰液中免疫细胞的方法 - Google Patents

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CN111693445A CN202010508020.5A CN202010508020A CN111693445A CN 111693445 A CN111693445 A CN 111693445A CN 202010508020 A CN202010508020 A CN 202010508020A CN 111693445 A CN111693445 A CN 111693445A
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刘盼
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    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
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Abstract

本公开涉及一种检测痰液中免疫细胞的方法，该方法包括如下步骤：a、将待测痰液样品进行预处理，得到单细胞混合物；b、将所述单细胞混合物与单克隆抗体混合液混合，得到单细胞‑抗体混合液，采用流式细胞术检测所述单细胞‑抗体混合液中的免疫细胞水平，即为所述待测痰液样品中的免疫细胞水平；其中，所述单克隆抗体混合液中含有抗CD45的单克隆抗体、抗CD66b的单克隆抗体、抗CD14的单克隆抗体、抗CD3的单克隆抗体、抗CD4的单克隆抗体和抗CD8的单克隆抗体。上述技术方案操作简单，检测结果多样化，而且检测的精确度和灵敏度均较高。

Description

检测痰液中免疫细胞的方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种检测痰液中免疫细胞的方法。
背景技术
对痰液中的免疫细胞分类及各类免疫细胞的分布情况进行检测，有助于提示呼吸系统某些特征性疾病的诊断。例如，痰液中的中性粒细胞增多，表明受试者可能患有呼吸道炎症，如支气管炎、肺炎等；痰液中的酸性粒细胞增多，表明受试者可能患有慢性支气管哮喘、过敏性支气管炎、肺吸虫病、热带嗜酸粒细胞增多症等呼吸道疾病。
相关技术中，主要采用涂片染色和显微镜观察来检测痰液中的免疫细胞分类及各类免疫细胞的分布情况。然而，涂片染色和显微镜观察的操作繁琐，检测结果单一，且精确度和灵敏度较低。
发明内容
本公开的目的是提供一种检测痰液中免疫细胞的方法，以克服现有方法中存在的操作繁琐，检测结果单一，且精确度和灵敏度较低的问题。
为了实现上述目的，本公开提供一种检测痰液中免疫细胞的方法，该方法包括如下步骤：
a、将待测痰液样品进行预处理，得到单细胞混合物；
b、将所述单细胞混合物与单克隆抗体混合液混合，得到单细胞-抗体混合液，采用流式细胞术检测所述单细胞-抗体混合液中的免疫细胞水平，即为所述待测痰液样品中的免疫细胞水平；
其中，所述单克隆抗体混合液中含有抗CD45的单克隆抗体、抗CD66b的单克隆抗体、抗CD14的单克隆抗体、抗CD3的单克隆抗体、抗CD4的单克隆抗体和抗CD8的单克隆抗体。
可选地，所述单克隆抗体混合液中，所述抗CD45的单克隆抗体的浓度为0.1-0.3μg/μL，所述抗CD66b的单克隆抗体的浓度为0.05-0.15μg/μL，所述抗CD14的单克隆抗体的浓度为0.1-0.3μg/μL，所述抗CD3的单克隆抗体的浓度为0.1-0.2μg/μL，所述抗CD4的单克隆抗体的浓度为0.05-0.15μg/μL，所述抗CD8的单克隆抗体的浓度为0.15-0.30μg/μL。
可选地，相对于1重量份的所述待测痰液样品，所述单克隆抗体混合液的用量为0.1-0.2体积份。
可选地，步骤b中还包括将所述单细胞-抗体混合液于避光条件下静置10-20min的操作，然后再采用流式细胞术检测所述单细胞-抗体混合液中的免疫细胞水平。
可选地，步骤a中所述预处理包括消化处理和固液分离处理，则所述将待测痰液样品进行预处理，得到单细胞混合物，包括：
a01、将所述待测痰液样品进行消化处理，得到消化混合液；
a02、将所述消化混合液进行固液分离，得到所述单细胞混合物。
可选地，步骤a01中所述将所述待测痰液样品进行消化处理，得到消化混合液，包括：
将所述待测痰液样品与消化液混合后静置10-20min，得到所述消化混合液，其中，所述消化液中含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和二硫苏糖醇。
可选地，所述消化液中，所述磷酸二氢钾的浓度为0.20-0.30g/L，所述磷酸氢二钠的浓度为1.0-2.0g/L，所述氯化钠的浓度为5-10g/L，所述氯化钾的浓度为0.1-0.3g/L，所述二硫苏糖醇的浓度为0.5-2g/L。
可选地，将所述待测痰液样品与所述消化液混合时，相对于1重量份的所述待测痰液样品，所述消化液的用量为0.1-0.2体积份。
可选地，步骤b中所述免疫细胞水平包括免疫细胞种类、每种免疫细胞的重量百分比和每种免疫细胞的计数。
可选地，步骤a中还包括对所述待测痰液样品进行称重的步骤，然后再对所述待测痰液样品进行预处理。
通过上述技术方案，本公开利用流式细胞术来检测痰液中的免疫细胞水平，操作简单；同时，利用上述的单克隆抗体混合液可以同时检测痰液中的白细胞、粒细胞、单核-巨噬细胞、T细胞、辅助性T-细胞和杀伤性T细胞的百分比和细胞计数，不仅检测结果多样化，而且检测的精确度和灵敏度均较高。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1为从FSC/SSC散点图中区分出细胞群“cells”的示意图；
图2为在细胞群“cells”内以CD45+/SSC散点图区分出白细胞群“Leukocytes”的示意图；
图3为在白细胞群“Leukocytes”内以CD66b/CD14散点图区分出淋巴细胞群、单核巨噬细胞群和粒细胞群的示意图；
图4为在淋巴细胞群“Lymphocytes”内以CD3+/FSC散点图区分出T细胞群“TCells”的示意图；
图5为在T细胞群“TCells”内以CD4/CD8散点图区分出辅助性T细胞群“Thcells”和杀伤性T细胞群“Tccells”的示意图；
图6是从FSC/FITC散点图中区分出区域内的计数微球的示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供一种检测痰液中免疫细胞的方法，该方法包括如下步骤：a、将待测痰液样品进行预处理，得到单细胞混合物；b、将所述单细胞混合物与单克隆抗体混合液混合，得到单细胞-抗体混合液，采用流式细胞术检测所述单细胞-抗体混合液中的免疫细胞水平，即为所述待测痰液样品中的免疫细胞水平；其中，所述单克隆抗体混合液中含有抗CD45的单克隆抗体、抗CD66b的单克隆抗体、抗CD14的单克隆抗体、抗CD3的单克隆抗体、抗CD4的单克隆抗体和抗CD8的单克隆抗体。
其中，在采用流式细胞术检测单细胞-抗体混合液中的免疫细胞水平之前，还包括加入计数微球和利用PBS重悬的步骤。计数微球用于痰液中各类免疫细胞的计数。
上述单克隆抗体混合液中含有的各单克隆抗体能够与痰液中免疫细胞细胞膜表面的相应抗体特异性结合，因此本公开的方法能够快速、精确、灵敏的检测痰液中的免疫细胞水平。其中，抗CD45的单克隆抗体用于特异性检测白细胞，抗CD66b的单克隆抗体用于特异性检测粒细胞，抗CD14的单克隆抗体用于特异性检测单核-巨噬细胞，抗CD3的单克隆抗体用于特异性检测T细胞，抗CD4的单克隆抗体用于特异性检测辅助性T细胞(Th)，抗CD8的单克隆抗体用于特异性检测杀伤性T细胞(Tc)。作为本公开的一个具体实施例，抗CD45的单克隆抗体可以为CD45-FITC单克隆抗体，抗CD66b的单克隆抗体可以为CD66b-PE单克隆抗体，抗CD14的单克隆抗体可以为CD14-APC单克隆抗体，抗CD3的单克隆抗体可以是CD3-PE-Cy7单克隆抗体，抗CD4的单克隆抗体可以是CD4-BV510单克隆抗体，抗CD8的单克隆抗体可以是CD8-AF700单克隆抗体。
通过上述技术方案，本公开利用流式细胞术来检测痰液中的免疫细胞水平，操作简单；同时，利用上述的单克隆抗体可以同时检测痰液中的白细胞、粒细胞、单核-巨噬细胞、T细胞、辅助性T-细胞和杀伤性T细胞的百分比和细胞计数，不仅检测结果多样化，而且检测的精确度和灵敏度均较高。
根据本公开，所述单克隆抗体混合液中各单克隆抗体的浓度可以在一定的范围内变化，例如，所述单克隆抗体混合液中，所述抗CD45的单克隆抗体的浓度为0.1-0.3μg/μL，所述抗CD66b的单克隆抗体的浓度为0.05-0.15μg/μL，所述抗CD14的单克隆抗体的浓度为0.1-0.3μg/μL，所述抗CD3的单克隆抗体的浓度为0.1-0.2μg/μL，所述抗CD4的单克隆抗体的浓度为0.05-0.15μg/μL，所述抗CD8的单克隆抗体的浓度为0.15-0.30μg/μL。
根据本公开，步骤b中将所述单细胞混合物与单克隆抗体混合液混合时，以待测痰液样品的重量为基准，单克隆抗体混合液的用量可以在较大的范围内变化，例如，相对于1重量份的所述待测痰液样品，所述单克隆抗体混合液的用量为0.1-0.2体积份。在上述用量范围内，各单克隆抗体的数量足够充分结合各免疫细胞细胞膜表面的各类抗原，有助于提高检测结果的精确度。
优选地，步骤b中还包括将所述单细胞-抗体混合液于避光条件下静置10-20min的操作，然后再采用流式细胞术检测所述单细胞-抗体混合液中的免疫细胞水平。在该优选情况下，抗原和抗体能够在避光静置期间充分结合，进一步提高检测结果的精确度。
根据本公开，步骤a中所述预处理可以是领域内常规的，能分离出待测痰液样品中的单细胞混合物的方法均适用于本公开。优选情况下，步骤a中所述预处理包括消化处理和固液分离处理，则所述将待测痰液样品进行预处理，得到单细胞混合物，包括：a01、将所述待测痰液样品进行消化处理，得到消化混合液；a02、将所述消化混合液进行固液分离，得到所述单细胞混合物。
可选地，步骤a01中所述将所述待测痰液样品进行消化处理，得到消化混合液，包括：将所述待测痰液样品与消化液混合后静置10-20min，得到所述消化混合液，其中，所述消化液中含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和二硫苏糖醇。上述消化液中含有二硫苏糖醇组分，能够使得糖蛋白纤维丝之间交联的二硫键打开，从而能够溶解痰液并分散细胞。上述技术方案中，利用消化液对痰液中的细胞进行提取和分离，消化方式温和，能够保持细胞活性和细胞膜的完整性，并且不会对抗原抗体的特异性结合产生影响。
根据本公开，上述消化液中各组分的浓度可以在一定的范围内变化，例如，所述消化液中，所述磷酸二氢钾的浓度可以为0.20-0.30g/L，所述磷酸氢二钠的浓度可以为1.0-2.0g/L，所述氯化钠的浓度可以为5-10g/L，所述氯化钾的浓度可以为0.1-0.3g/L，所述二硫苏糖醇的浓度可以为0.5-2g/L。
根据本公开，将所述待测痰液样品与所述消化液混合时，待测痰液样品和消化液的用量配比可以在一定的范围内变化，例如，将所述待测痰液样品与所述消化液混合时，相对于1重量份的所述待测痰液样品，所述消化液的用量可以为0.1-0.2体积份。
可选地，步骤a02中将所述消化混合液进行固液分离，得到所述单细胞混合物，包括：将所述消化混合液与一定量的PBS混合后进行涡旋混匀，然后自然沉降2-5min，取上清液离心，离心所得沉淀即为所述单细胞混合物。上述固液分离操作的条件温和，有助于保持细胞活性和细胞膜的完整性。
根据本公开，步骤b中所述免疫细胞水平可以包括免疫细胞种类、每种免疫细胞的百分比和每种免疫细胞的计数。本公开的方法能够精确地测定痰液中各类免疫细胞的种类、所占百分比及其细胞计数，有助于准确评估受试者的呼吸道感染情况。
优选地，步骤a中还包括对所述待测痰液样品进行称重的步骤，然后再对所述待测痰液样品进行预处理。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
本公开实施例涉及的原料、试剂、仪器和设备，除有特殊说明外，均可通过购买获得。
本公开实施例中所使用的试剂来源如下表所示：
Figure BDA0002527249180000071
本公开实施例所使用的消化液中，各成分浓度为：磷酸二氢钾0.24g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L和二硫苏糖醇1g/L，该消化液于4℃保存备用。
本公开实施例所使用的单克隆抗体混合液中，各单克隆抗体的浓度为：CD45-FITC单克隆抗体用量为0.2μg/μL，CD66b-PE单克隆抗体用量为0.1μg/μL，CD14-APC单克隆抗体用量为0.2μg/μL，CD3-PE-Cy7单克隆抗体用量为0.15μg/μL，CD4-BV510单克隆抗体用量为0.1μg/μL，CD8-AF700单克隆抗体用量为0.25μg/μL。
实施例1
本实施例用于说明本公开的检测方法
1、待测痰液样品的采集
(1)采集方法：采集待测痰液样品时，先用清水漱口，用力咳出气管深处的痰液，注意勿混入鼻咽部分分泌物。咳痰时最好有医护人员在场，以指导病人正确咳痰。
(2)送检时间：及时送检，若不能及时送检，可暂时冷藏保存，但不能超过24h。
(3)标本容器：采用专用容器采集痰液。
(4)采集时间：细胞学检查以上午9-10时采集深咳的痰液最好。
2、单细胞混合物的提取分离
(1)对采集到的待测痰液样品进行称重并记录，精确到0.1g；
(2)按照1g待测痰液样品对应4mL消化液的比例，将待测痰液样品与适量消化液混合，得到第一混合液；
(3)将第一混合液于2000rpm的条件下涡旋混匀，然后于室温下静置孵育15min，得到第二混合液，即为消化混合液；
(4)吸取第二混合液250μL(相当于50μg待测痰液样品)置于洁净流式管中进行涡旋振荡混匀，然后自然沉降2min，得到第三混合液；
(5)吸取第三混合液的上清液至另一洁净流式管中，于500g条件下离心5min，弃上清，所得沉淀即为单细胞混合物。
3、免疫细胞水平检测
(1)按照每50μg待测痰液样品对应5μL单克隆抗体混合液的比例，取适量的单克隆抗体混合液与上述单细胞混合物混合，涡旋混匀，并于室温下避光静置孵育15min，得到单细胞-抗体混合液；
(2)将计数微球涡旋震荡1min以使计数微球重悬混匀，然后吸取50μL计数微球与上述单细胞-抗体混合液混匀，并加入450μLPBS重悬，然后于4℃保存，2h内上机，每管收集20000个细胞。
检测结果如图1-图6所示，其中，图1为从FSC/SSC散点图中区分出细胞群“cells”的示意图；图2为在细胞群“cells”内以CD45+/SSC散点图区分出白细胞群“Leukocytes”的示意图；图3为在白细胞群“Leukocytes”内以CD66b/CD14散点图区分出淋巴细胞群、单核巨噬细胞群和粒细胞群的示意图，其中，CD14-/CD66b-为淋巴细胞群“Lymphocytes”，CD14+/CD66b-为单核巨噬细胞群“Monocytes”，CD14-/CD66b+为粒细胞群“Granulocytes”；图4为在淋巴细胞群“Lymphocytes”内以CD3+/FSC散点图区分出T细胞群“TCells”的示意图；图5为在T细胞群“TCells”内以CD4/CD8散点图区分出辅助性T细胞群“Thcells”和杀伤性T细胞群“Tccells”的示意图，其中，CD4+/CD8-为辅助性T细胞群“Thcells”，CD4-/CD8+为杀伤性T细胞群“Tccells”；图6是从FSC/FITC散点图中区分出区域内的计数微球的示意图。
其中，采用下式计算目标细胞计数：
Figure BDA0002527249180000091
使用绝对计数微球计数法，得到七个细胞群的计数和阳性百分比，如表1所示。
表1
细胞种类 百分比％ 细胞计数cells/g
白细胞 89.9％ 8.2×10<sup>5</sup>
粒细胞 48.0％ 4.0×10<sup>5</sup>
单核-巨噬细胞 14.9％ 1.2×10<sup>5</sup>
淋巴细胞 2.4％ 1.9×10<sup>4</sup>
T细胞 88.9％ 1.1×10<sup>4</sup>
辅助性T细胞 32.8％ 3.5×10<sup>3</sup>
杀伤性T细胞 50.8％ 5.4×10<sup>3</sup>
由表2可以看出，本公开的方法能够简单、快速、准确地检测出痰液中的免疫细胞种类、所占百分比及细胞计数。
对比例
本对比例利用涂片染色法检测痰液中的免疫细胞
1、痰液涂片制作
将1g待测痰液样品与4mL消化液混合，涡旋混匀，室温下静置反应10分钟。用吸管吸取消化产物后滴加1滴于载玻片上，用盖玻片沿液滴边缘轻轻推开液滴，使细胞平铺于载玻片上，等待载玻片上的样本自然干燥。
2、免疫细胞检测
向干燥后的载玻片上滴加瑞氏染液，静置3分钟；滴加等量超纯水，轻轻晃动玻片，使超纯水与瑞氏染液混匀，静置5分钟；水洗、吸干、镜检。其中，在显微镜视野中，组织细胞胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。
3、检测结果判定
中性粒细胞：圆形，胞核呈蓝色，染色质呈块状，着色深；成熟的中性粒细胞核多为分叶状，一般可分为2-5叶，常见3叶，幼稚的中性粒细胞核呈杆状；胞质中含颗粒量多、细小、均匀、呈紫红色。
单核细胞：胞体大，呈圆形或椭圆形；胞核形态多样，可呈卵圆形、肾形或马蹄形，核常偏位，染色质颗粒细而松散，着色浅；胞质胞质较多，呈弱嗜碱性，常染成蓝色，内含细小的嗜天青颗粒。
淋巴细胞：呈圆形或卵圆形，大小不等；胞核呈圆形，一侧常有小凹陷，染色深；胞质较少，环绕核周围呈一窄带，呈蔚蓝色。
可见，利用涂片染色法仅能大体分辨出痰液中的中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，而且无法准确检测每种细胞的所占百分比和细胞计数。然而，本公开利用单克隆抗体混合液和流式细胞术可以同时检测痰液中的白细胞、粒细胞、单核-巨噬细胞、T细胞、辅助性T-细胞和杀伤性T细胞的百分比和细胞计数，不仅检测结果多样化，而且检测的精确度和灵敏度均较高。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种检测痰液中免疫细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
a、将待测痰液样品进行预处理，得到单细胞混合物；
b、将所述单细胞混合物与单克隆抗体混合液混合，得到单细胞-抗体混合液，采用流式细胞术检测所述单细胞-抗体混合液中的免疫细胞水平，即为所述待测痰液样品中的免疫细胞水平；
其中，所述单克隆抗体混合液中含有抗CD45的单克隆抗体、抗CD66b的单克隆抗体、抗CD14的单克隆抗体、抗CD3的单克隆抗体、抗CD4的单克隆抗体和抗CD8的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体混合液中，所述抗CD45的单克隆抗体的浓度为0.1-0.3μg/μL，所述抗CD66b的单克隆抗体的浓度为0.05-0.15μg/μL，所述抗CD14的单克隆抗体的浓度为0.1-0.3μg/μL，所述抗CD3的单克隆抗体的浓度为0.1-0.2μg/μL，所述抗CD4的单克隆抗体的浓度为0.05-0.15μg/μL，所述抗CD8的单克隆抗体的浓度为0.15-0.30μg/μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，相对于1重量份的所述待测痰液样品，所述单克隆抗体混合液的用量为0.1-0.2体积份。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤b中还包括将所述单细胞-抗体混合液于避光条件下静置10-20min的操作，然后再采用流式细胞术检测所述单细胞-抗体混合液中的免疫细胞水平。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述预处理包括消化处理和固液分离处理，则所述将待测痰液样品进行预处理，得到单细胞混合物，包括：
a01、将所述待测痰液样品进行消化处理，得到消化混合液；
a02、将所述消化混合液进行固液分离，得到所述单细胞混合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤a01中所述将所述待测痰液样品进行消化处理，得到消化混合液，包括：
将所述待测痰液样品与消化液混合后静置10-20min，得到所述消化混合液，其中，所述消化液中含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和二硫苏糖醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述消化液中，所述磷酸二氢钾的浓度为0.20-0.30g/L，所述磷酸氢二钠的浓度为1.0-2.0g/L，所述氯化钠的浓度为5-10g/L，所述氯化钾的浓度为0.1-0.3g/L，所述二硫苏糖醇的浓度为0.5-2g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述待测痰液样品与所述消化液混合时，相对于1重量份的所述待测痰液样品，所述消化液的用量为0.1-0.2体积份。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述免疫细胞水平包括免疫细胞种类、每种免疫细胞的重量百分比和每种免疫细胞的计数。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤a中还包括对所述待测痰液样品进行称重的步骤，然后再对所述待测痰液样品进行预处理。
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Citations (6)

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