CN111690618A - 一株分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

一株分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明公开了一株分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株11‑dhTX，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19169。将铝的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。此细胞株分泌的单克隆抗体，对铝具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为3.3 ng/mL），可实现对面粉中铝残留量的检测，为食品中铝残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。
背景技术
铝是人体非必需微量元素，虽然铝天然存在于食品中，但大多数食品中的铝含量低于5 mg/kg，JECFA认为，食品中使用的含铝添加剂是人类膳食铝暴露的主要来源。含铝添加剂广泛用于加工食品中，如作为蓬松剂用于面制品；作为固化剂用于加工海蜇；作为抗结剂用于食物配料粉中；还可作为色靛用于糖衣、糖果染色等，因此可能导致加工面制品、粉条、海蜇等食品中的铝含量超标，从这些食品中摄入的铝会在人体内不断累积并产生慢性毒性。摄入过量的铝将引起中枢神经功能紊乱，影响人的脑、肝、骨、肾、造血系统、免疫功能等。过量的铝会导致人体记忆力衰退、痴呆，还会抑制骨生长，导致骨软化症。
世界卫生组织和联合国粮农组织将铝确定为食品污染物并要求严加控制，我国规定生活饮用水中铝限量为0.2 mg/L，规定面制食品中铝的残留量小于等于100 mg/kg。
目前，国内外报道的铝的测定方法主要有分光光度法、荧光光度法、石墨炉原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法等。但这些方法的样品前处理过程复杂，实验周期长，不适合大量样本的快速检测。而基于单克隆抗体的酶联免疫分析方法（ELISA）则具有简单、灵敏、快捷和高通量的优点，因此建立一种高效的铝免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对铝的高特异性单克隆单体，目前国内外尚无关于铝的单克隆抗体的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株分泌抗铝单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对铝具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立铝的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株11-dhTX，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19169。
抗铝单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No. 19169的杂交瘤细胞株11-dhTX分泌产生。
所述抗铝单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中铝残留的分析检测。
本发明提供的分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株11-dhTX的制备基本步骤为：
（1）完全抗原Al-ITCBE-KLH的制备：铝抗原的合成方法是通过双功能偶联剂ITCBE 将重金属和载体蛋白偶联到一起。称取2 mL KLH(10 mg)溶液于无菌塑料瓶中，加入3 mL HBS溶液（0.1 M，pH 9.0）溶解。慢慢加入48.4 µL ITCBE(10 mg/mL) 的二甲基亚砜DMSO溶液，pH维持在9.0，室温搅拌反应24 h。ITCBE-KLH偶联成功后，逐滴加入0.5mg铝溶液（1mg/mL铝标准溶液），每加一滴随之滴加1 M NaOH使得溶液维持pH 8.0，室温反应6h。反应完毕用截留量3000的AmiconUltra-4Ultracel-3K 超滤离心管离心8000 rpm，时间20 min。每次超滤完毕后用3 mL HBS溶液（0.01 M，pH 7.4）溶解重悬。反复超滤3次，最终超滤完毕后,加入HBS溶液（0.01 M，pH 7.4）将偶联物洗出，得到蛋白终浓度为1 mg/mL的完全抗原Al-ITCBE-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
（2）小鼠的免疫：将铝完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100 μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50 μg/只；冲刺免疫不用佐剂，铝完全抗原直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25 μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得铝的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株11-dhTX。
（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
铝完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100 μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50 μg/只）用不完全弗氏佐剂，最后一次冲刺免疫用铝完全抗原（25 μg/只，不含佐剂）进行小鼠腹腔注射。取特异性高，IC50低的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过ic-ELISA法筛选细胞和三次亚克隆，得到一株高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株11-dhTX。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株11-dhTX分泌的单克隆抗体，对铝具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为3.3 ng/mL），可实现对猪肉、牛奶中铝残留量的检测，为食品中铝残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株11-dhTX，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19169。
附图说明
图1 11-dhTX单克隆抗体对铝的标准抑制曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将铝完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了针对铝具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。
实施例1 完全抗原Al-ITCBE-KLH的制备
完全抗原的合成：称取2 mL KLH(10 mg)溶液于无菌塑料瓶中，加入3 mL HBS溶液（0.1M，pH 9.0）溶解。慢慢加入48.4 µL ITCBE(10 mg/mL) 的DMSO溶液，pH维持在9.0，室温搅拌反应24 h。ITCBE-KLH偶联成功后，逐滴加入0.5 mg铝溶液（1 mg/mL铝标准溶液），每加一滴随之滴加1 M NaOH使得溶液维持pH 8.0，室温反应6h。反应完毕用截留量3000的AmiconUltra-4Ultracel-3K 超滤离心管离心8000 rpm，时间20 min。每次超滤完毕后用3mL HBS溶液（0.01 M，pH 7.4）溶解重悬。反复超滤3次，最终超滤完毕后,加入HBS溶液（0.01M，pH 7.4）将偶联物洗出，得到蛋白终浓度为1 mg/mL的完全抗原Al-ITCBE-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
实施例2 动物免疫
将铝完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100 μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50 μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25 μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制。
实施例3 细胞融合与筛选
（1）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞： 融合前 7-10 天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 ﹙1-4﹚×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min： 第1min，将1mL的PEG 4000 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，每30s内滴加1mL RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。 离心（800 rpm，10 min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清，2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基（HAT培养基），按照200μL/ 孔加到 96 孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
（2）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液（HT培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用铝为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对铝标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得铝单克隆抗体细胞株11-dhTX。
实施例4 单克隆抗体的制备与鉴定
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106 铝杂交瘤细胞11-dhTX，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体，置于-20℃保存。
单抗应用于铝的添加回收试验：
（1）包被：将包被原铝-BSA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体铝的IC50为：3.3 ng/mL，说明对铝有很好的灵敏度，可用于铝免疫分析检测。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
HBS 溶液：称取HEPES 2.383 g，KCl 0.2 g，NaCl 8.775 g溶于900mL 超纯水，以NaOH调pH至7.4，定容至1000 mL。
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (4)

1.一株分泌抗铝单克隆抗体的杂交瘤细胞株11-dhTX，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19169。
2.抗铝单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No. 19169的杂交瘤细胞株11-dhTX分泌产生。
3.铝完全抗原的制备方法，其特征在于：铝完全抗原通过双功能偶联剂ITCBE 将重金属和载体蛋白偶联到一起；称取2 mL、10mg KLH溶液于无菌塑料瓶中，加入3 mL、0.1 M，pH9.0的HBS溶液溶解；慢慢加入48.4 µL、10mg/mL ITCBE的DMSO溶液，pH维持在9.0，室温搅拌反应24h；ITCBE-KLH偶联成功后，逐滴加入0.5mg、1mg/mL的铝溶液，每加一滴随之滴加1 MNaOH使得溶液维持pH 8.0，室温反应6h；反应完毕用截留量为3000的超滤离心管离心8000rpm，时间20 min；每次超滤完毕后用3 mL、0.01 M，pH 7.4的HBS溶液溶解重悬；反复超滤3次，最终超滤完毕后，加入0.01 M，pH 7.4的HBS溶液将偶联物洗出，得到蛋白终浓度为1mg/mL的完全抗原Al-ITCBE-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
4.权利要求2所述抗铝单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中铝残留的分析检测。
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