CN111676223A - 一种无需诱导剂提高大肠杆菌中乙醇酸产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无需诱导剂提高大肠杆菌中乙醇酸产量的方法，属于生物工程领域。与前期已报道的生物合成法合成乙醇酸相比，本发明中所提到的乙醇酸发酵技术方案在没有添加诱导剂的情况下提高乙醇酸的产量。以葡萄糖为唯一碳源，pG‑1，pG‑2，pG‑3，pG‑4，pG‑5，pG‑6，pG‑7，pG‑8，pG‑9，pG‑10，pG‑11，pG‑12摇瓶发酵产量分别为2.42g/L，0.31g/L，0.208g/L，2.24g/L，3.02g/L，2.85g/L，1.53g/L，1.42g/L，1.18g/L，1.02g/L，0.85g/L，0.42g/L，pG‑5在发酵过程中获得最大的乙醇酸的产量，同时也获得最大产产率，为97％。通过发酵条件优化，pG‑5上罐发酵时产量达到15.53g/L。

Description

一种无需诱导剂提高大肠杆菌中乙醇酸产量的方法

技术领域

本发明涉及一种无需诱导剂提高大肠杆菌中乙醇酸产量的方法，属于生物工程领域。

背景技术

乙醇酸(Glycolic acid,glycolate)又称2-羟基乙酸，是最简单的α-羟基酸。近年来，乙醇酸广泛应用于纺织工业、医学工程材料、化学清洁等许多领域。

目前乙醇酸工业上主要采用化学合成来生产乙醇酸，但是该方法的产品收率并不高。此外，在乙醇酸的化学合成过程中需要加入大量的有毒有害的甲醛，并且整个生产过程对环境污染非常大。为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成乙醇酸的道路上，且做了大量的基础工作。目前报道的主要生物合成乙醇酸的方法有微生物酶催化法和全生物合成方法。主要的微生物酶催化法包括：利用微生物产腈水解酶水解乙醇腈产乙醇酸以及微生物产甘油氧化酶氧化乙二醇产乙醇酸。全生物合成乙醇酸的方法包括：利用乙二醇作为底物生产乙醇酸及利用大肠杆菌以葡萄糖为底物全生物合成乙醇酸。以葡萄糖为底物全生物合成乙醇酸具有底物廉价，操作简单，产品纯度高等突出优点。尽管研究人员已经在大肠杆菌中实现了利用葡萄糖全生物合成乙醇酸，但是该方法得到的乙醇酸产率较低，并且均需要昂贵的诱导剂进行生产，这无疑增加了生产的成本。

因而，有必要寻找一种提高乙醇酸产率且不需要添加诱导剂的制备方法，以此来节约生产成本、提高生产效率，从而更加适于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在不需添加诱导剂的情况下提高重组大肠杆菌中乙醇酸产量的方法，本发明所提供的方法可以以葡萄糖为底物全生物合成乙醇酸，不需加诱导剂提高乙醇酸产量，节约成本，适用于工业化生产。

本发明提供了组成型启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.2～12所示。

本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒含有所述启动子。

在本发明的一种实施方式中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的质粒的第1120～2040位核苷酸分别替换为如SEQ ID NO.2～12所示的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的构建方法为全质粒PCR。

本发明提供一种重组菌，含有所述的启动子或所述的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，以同时表达异柠檬裂合酶基因(aceA)、异柠檬酸脱氢酶基因激酶/磷酸酶(aceK)、乙醛酸还原酶基因(ycdW)的大肠杆菌MG1655(DE3)ΔldhAΔglcBΔaceBΔaldA为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述异柠檬裂合酶基因(aceA)的Gene ID为948517，异柠檬酸脱氢酶基因激酶/磷酸酶(aceK)的Gene ID为944797，乙醛酸还原酶基因(ycdW)的Gene ID为946431。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌MG1655(DE3)ΔldhAΔglcBΔaceBΔaldA，公开于菌株的构建记载于文献DengYu等《Balancing the carbon fluxdistributions between the TCA cycle and glyoxylate shunt to produce glycolateat high yield and titer in Escherichia coli》中。

本发明提供一种无需诱导剂生产乙醇酸的方法，利用所述重组菌生产乙醇酸。

在本发明的一种实施方式中，以葡萄糖为底物。

在本发明的一种实施方式中，将OD₆₀₀为0.5～1.0的重组菌以体积比1～5％的量加入反应体系。

本发明提供一种提高乙醇酸产量的方法，以所述重组菌为发酵菌株，以葡萄糖为底物生产乙醇酸。

在本发明的一种实施方式中，将OD₆₀₀为0.1～1.0的重组菌以体积比1～5％的量加入反应体系。

本发明还保护所述启动子，或所述重组质粒，或所述重组菌，或所述无需诱导剂生产乙醇酸的方法，或提高乙醇酸产量的方法在制备乙醇酸中的应用。

本发明提供所述重组菌，或无需添加诱导剂生产乙醇酸的方法，或提高乙醇酸产量的方法在化工、化学领域制备乙醇酸中的应用。

本发明的有益效果：与化学法相比，生物法合成出来的乙醇酸更加方便回收，大大的减少了随环境的污染。与前期已报道的生物法合成乙醇酸相比，本发明中所提到的乙醇酸在没有添加任何诱导剂的情况下提高了乙醇酸的产量，节约了生产的成本，有益于工业化的生产应用。以葡萄糖为唯一碳源，使用M9培养基，pG-1，pG-2，pG-3，pG-4，pG-5，pG-6，pG-7，pG-8，pG-9，pG-10，pG-11，pG-12摇瓶发酵产量分别为2.42g/L，0.31g/L，2.08g/L，2.24g/L，3.02g/L，2.85g/L，1.53g/L，1.42g/L，1.18g/L，1.02g/L，0.85g/L，0.42g/L，pG-5在发酵的过程中获得最大的乙醇酸的产量，同时也获得最大产率(97％)。通过发酵条件优化，pG-5上罐发酵时产量达到15.53g/L。

附图说明

图1为乙醇酸合成途径图。

图2为pG-1摇瓶发酵生产图。

图3为pG-2，pG-3，pG-4，pG-5，pG-6，pG-7，pG-8，pG-9，pG-10，pG-11，pG-12摇瓶发酵生产图。

图4为pG-5上罐发酵生产图。

具体实施方式

表1实施例中所用引物

实施例1：重组质粒构建及重组大肠杆菌的获得。

pG1是由美国麻省理工大学Prather教授馈赠所得，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过引物pG-2F和pG-2R使用大连宝生物的高保真酶PrimerSTAR Max DNAPolymerase对pG1进行PCR，利用生工PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，后加入Dpn1去除原始pG1质粒模板。再次利用生工PCR产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化，纯化后加入大连宝生物的去磷酸化酶CIAP进行去磷酸化，最后使用T4连接酶进行16℃过夜连接，然后将连接产物转化进入JM109，涂板37℃过夜培养，待单菌落长出后菌落PCR，并送去sanger测序，测序正确的即为pG2重组质粒(将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列)。将pG2重组质粒转化进本实验室发表菌株MG1655(DE3)ΔldhAΔglcBΔaceBΔaldA(该菌株的构建记载于文献DengYu等《Balancing the carbon flux distributions between the TCA cycle and glyoxylateshunt to produce glycolate at high yield and titer in Escherichia coli》，公开日2018年)中，形成pG-2重组菌株。

按照同样的操作步骤即可获得pG3(其核苷酸序列为将如SEQ ID NO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列)，pG4(其核苷酸序列为将如SEQ ID NO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列)，pG5(其核苷酸序列为将如SEQ ID NO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQID NO.5所示的核苷酸序列)，pG6(其核苷酸序列为将如SEQ ID NO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列)，pG7(其核苷酸序列为将如SEQ IDNO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列)，pG8(其核苷酸序列为将如SEQ ID NO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列)，pG9(其核苷酸序列为将如SEQ ID NO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列)，pG10(其核苷酸序列为将如SEQ ID NO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列)，pG11(其核苷酸序列为将如SEQ ID NO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列)，pG12(其核苷酸序列为将如SEQ ID NO.1所示的第1120位～2040位核苷酸替换为如SEQID NO.12所示的核苷酸序列)重组质粒，及菌株pG-3，pG-4，pG-5，pG-6，pG-7，pG-8，pG-9，pG-10，pG-11，pG-12。

扩增目的基因的PCR体系：模板pG15μL，引物pG-2F5μL，引物pG-2R5μL，Prime STARMax DNAPolymerase 250μL，ddH₂O至500μL。PCR反应条件：98℃10min，98℃30s，55℃30s，72℃1min30s(34个循环)，72℃10min。

PCR产物纯化则是使用上海生工生物工程股份有限公司的PCR产物纯化试剂盒，严格按照试剂盒操作，最终获得PCR产物。

用DpnI去除原始pG1质粒模板，体系条件：DpnI5μL，10×buffer5μL，PCR产物30μL，37℃2h，65℃10min。

酶切产物纯化则是使用上海生工生物工程股份有限公司的PCR产物纯化试剂盒，严格按照试剂盒操作，最终获得纯化产物。

用去磷酸化酶CIAP去磷酸化及酶连，体系条件：CIAP2μL，10×T4连接酶buffer 2μL，纯化产物16μL，37℃2h，65℃10min。反应结束后后加入T4连接酶2μL，15～20℃处理目7～10小时。

用酶连产物转化，包括，将上述连接反应液加入JM109化转感受态中冰上放置25～35min，40～42℃热激80～100s，加入SOC液体培养基，35～37℃摇床孵育0.8～1.2h，以45～55μg/mL涂布卡那抗性LB平板。

验证后完成重组质粒的构建：挑取菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接入LB液体培养基，培养12～16小时，利用质粒小提试剂盒提取质粒，得到重组质粒pG1，送去测序公司进行测序。

取测序正确的重组质粒pG1 2μL，加入到100μL的本实验室发表菌株MG1655(DE3)化转感受态中，混合均匀，冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mLSOC液体培养基，37℃摇床孵育1h，涂布卡那抗性平板(50μg/mL)。37℃培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证。并将验证正确的重组大肠杆菌接种于含有卡那抗性平板(50μg/mL)的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用15％的甘油冷冻保藏，备用。

本实施例中的菌株pG-2～12均以与上述相同的方法制备得到。

实施例2：重组大肠杆菌摇瓶发酵结果

(1)pG-1摇瓶发酵及结果分析

培养基：M9盐溶液+8g/L葡萄糖+2mM MgSO₄+0.1mM CaCl₂+50μg/ml硫酸卡那霉素。

种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、250r/min摇瓶过夜。

发酵条件：将过夜培养的种子液以2％的体积接种至50mL的M9发酵培养基中，使其初始OD₆₀₀为0.1，37℃、250r/min培养至OD₆₀₀为0.8左右时加入250ng/mLaTc(脱水四环素盐酸盐)诱导表达pG-1，改为30℃、250r/min培养。

结果分析：发酵过程中每4小时取一次样，10000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μM滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国Bio-Rad伯乐AminexHPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H₂SO₄，柱温为30℃，紫外检测器210nm。。pG-1乙醇酸产量为2.42g/L。

(2)pG-2，pG-3，pG-4，pG-5，pG-6，pG-7，pG-8，pG-9，pG-10，pG-11，pG-12摇瓶发酵及结果分析。

培养基：M9盐溶液+4g/L葡萄糖+2mM MgSO₄+0.1mM CaCl₂+50μg/mL硫酸卡那霉素。

种子液制备：甘油保藏的菌种接种于盛有50ml的LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、250r/min摇瓶过夜。

发酵条件：将过夜培养的种子液以2％的体积接种至50mL的M9发酵培养基中，使其初始OD₆₀₀为0.1，在37℃、250r/min培养至OD₆₀₀为0.8左右时不要加入任何诱导剂直接将温度改为30℃、250r/min培养。

结果分析：发酵过程中每4小时取一次样，10000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μM滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐AminexHPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H₂SO₄，柱温为30℃，紫外检测器210nm。pG-2，pG-3，pG-4，pG-5，pG-6，pG-7，pG-8，pG-9，pG-10，pG-11，pG-12摇瓶发酵产量分别为0.31g/L，2.08g/L，2.24g/L，3.02g/L，2.85g/L，1.53g/L，1.42g/L，1.18g/L，1.02g/L，0.85g/L，0.42g/L。

实施例3：pG-5上罐发酵及结果分析

3L培养基：SOB培养基，成分为M9盐溶液+8g/L葡萄糖+2mM MgSO₄+0.1mM CaCl₂+50μg/ml硫酸卡那霉素。

种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50mL的LB液体培养基的250mL锥形瓶中，37℃、250rpm/min摇瓶过夜。次日取500μL菌液转接于60mLLB液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8时，接种于3L发酵罐中。

发酵条件：接种量为发酵液体积的2％，37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8左右时不需要加入任何诱导剂调节温度至30℃，搅拌转速400rpm，通气量1vvm，2M NaOH维持pH为6.8～7.2。待发酵培养基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加葡萄糖，以维持葡糖糖浓度在2g/L的速度进行补料，直至葡萄糖补加总量达到100g/L。

结果分析：发酵过程中每4h取一次样，10000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐AminexHPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H₂SO₄，柱温为30℃，紫外检测器210nm。发酵64.5小时，pG-5上罐发酵乙醇酸产量为15.53g/L，产率为0.27g/g葡萄糖(占理论产量的32.2％)，在72小时后达到的最大OD₆₀₀为14.34，而在发酵的过程中乙酸最大产量为0.61g/L。

表2 pG-5发酵罐实时发酵结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种无需诱导剂提高大肠杆菌中乙醇酸产量的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7812

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacgtccatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac 60

agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat 120

atttgccgct agcggagtgt atactggctt actatgttgg cactgatgag ggtgtcagtg 180

aagtgcttca tgtggcagga gaaaaaaggc tgcaccggtg cgtcagcaga atatgtgata 240

caggatatat tccgcttcct cgctcactga ctcgctacgc tcggtcgttc gactgcggcg 300

agcggaaatg gcttacgaac ggggcggaga tttcctggaa gatgccagga agatacttaa 360

cagggaagtg agagggccgc ggcaaagccg tttttccata ggctccgccc ccctgacaag 420

catcacgaaa tctgacgctc aaatcagtgg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 480

caggcgtttc cccctggcgg ctccctcgtg cgctctcctg ttcctgcctt tcggtttacc 540

ggtgtcattc cgctgttatg gccgcgtttg tctcattcca cgcctgacac tcagttccgg 600

gtaggcagtt cgctccaagc tggactgtat gcacgaaccc cccgttcagt ccgaccgctg 660

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggaa agacatgcaa aagcaccact 720

ggcagcagcc actggtaatt gatttagagg agttagtctt gaagtcatgc gccggttaag 780

gctaaactga aaggacaagt tttggtgact gcgctcctcc aagccagtta cctcggttca 840

aagagttggt agctcagaga accttcgaaa aaccgccctg caaggcggtt ttttcgtttt 900

cagagcaaga gattacgcgc agaccaaaac gatctcaaga agatcatctt attaatcaga 960

taaaatattt gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg 1020

cgatataggc gccagcaacc gcacctgtgg cgccggtgat gccggccacg atgcgtccgg 1080

cgtagaggat ctgctcatgt ttgacagctt atcctcgagt taagacccac tttcacattt 1140

aagttgtttt tctaatccgc atatgatcaa ttcaaggccg aataagaagg ctggctctgc 1200

accttggtga tcaaataatt cgatagcttg tcgtaataat ggcggcatac tatcagtagt 1260

aggtgtttcc ctttcttctt tagcgacttg atgctcttga tcttccaata cgcaacctaa 1320

agtaaaatgc cccacagcgc tgagtgcata taatgcattc tctagtgaaa aaccttgttg 1380

gcataaaaag gctaattgat tttcgagagt ttcatactgt ttttctgtag gccgtgtacc 1440

taaatgtact tttgctccat cgcgatgact tagtaaagca catctaaaac ttttagcgtt 1500

attacgtaaa aaatcttgcc agctttcccc ttctaaaggg caaaagtgag tatggtgcct 1560

atctaacatc tcaatggcta aggcgtcgag caaagcccgc ttatttttta catgccaata 1620

caatgtaggc tgctctacac ctagcttctg ggcgagttta cgggttgtta aaccttcgat 1680

tccgacctca ttaagcagct ctaatgcgct gttaatcact ttacttttat ctaatctaga 1740

catcattaat tcctaatttt tgttgacact ctatcgttga tagagttatt ttaccactcc 1800

ctatcagtga tagagaaaag tgaaaatcca tatgactagt agatcctcta gagtcgacta 1860

agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg 1920

tcttcacgct agcaaagagg agaaaagatc ttccctatca gtgatagaga ttgacatccc 1980

tatcagtgat agagatactg agcaccctag gtttctccat acccgttttt ttgggctagc 2040

gaattccaac gcttttcggg agtcagtatg gatatcatct tttatcaccc aacgttcgat 2100

acccaatggt ggattgaggc actgcgcaaa gctattcctc aggcaagagt cagagcatgg 2160

aaaagcggag ataatgactc tgctgattat gctttagtct ggcatcctcc tgttgaaatg 2220

ctggcagggc gcgatcttaa agcggtgttc gcactcgggg ccggtgttga ttctattttg 2280

agcaagctac aggcacaccc tgaaatgctg aacccttctg ttccactttt tcgcctggaa 2340

gataccggta tgggcgagca aatgcaggaa tatgctgtca gtcaggtgct gcattggttt 2400

cgacgttttg acgattatcg catccagcaa aatagttcgc attggcaacc gctgcctgaa 2460

tatcatcggg aagattttac catcggcatt ttgggcgcag gcgtactggg cagtaaagtt 2520

gctcagagtc tgcaaacctg gcgctttccg ctgcgttgct ggagtcgaac ccgtaaatcg 2580

tggcctggcg tgcaaagctt tgccggacgg gaagaactgt ctgcatttct gagccaatgt 2640

cgggtattga ttaatttgtt accgaatacc cctgaaaccg tcggcattat taatcaacaa 2700

ttactcgaaa aattaccgga tggcgcgtat ctcctcaacc tggcgcgtgg tgttcatgtt 2760

gtggaagatg acctgctcgc ggcgctggat agcggcaaag ttaaaggcgc aatgttggat 2820

gtttttaatc gtgaaccctt accgcctgaa agtccgctct ggcaacatcc acgcgtgacg 2880

ataacaccac atgtcgccgc gattacccgt cccgctgaag ctgtggagta catttctcgc 2940

accattgccc agctcgaaaa aggggagagg gtctgcgggc aagtcgaccg cgcacgcggc 3000

tactaaacca ccacataact atggagcatc tgcacatgaa aacccgtaca caacaaattg 3060

aagaattaca gaaagagtgg actcaaccgc gttgggaagg cattactcgc ccatacagtg 3120

cggaagatgt ggtgaaatta cgcggttcag tcaatcctga atgcacgctg gcgcaactgg 3180

gcgcagcgaa aatgtggcgt ctgctgcacg gtgagtcgaa aaaaggctac atcaacagcc 3240

tcggcgcact gactggcggt caggcgctgc aacaggcgaa agcgggtatt gaagcagtct 3300

atctgtcggg atggcaggta gcggcggacg ctaacctggc ggccagcatg tatccggatc 3360

agtcgctcta tccggcaaac tcggtgccag ctgtggtgga gcggatcaac aacaccttcc 3420

gtcgtgccga tcagatccaa tggtccgcgg gcattgagcc gggcgatccg cgctatgtcg 3480

attacttcct gccgatcgtt gccgatgcgg aagccggttt tggcggtgtc ctgaatgcct 3540

ttgaactgat gaaagcgatg attgaagccg gtgcagcggc agttcacttc gaagatcagc 3600

tggcgtcagt gaagaaatgc ggtcacatgg gcggcaaagt tttagtgcca actcaggaag 3660

ctattcagaa actggtcgcg gcgcgtctgg cagctgacgt gacgggcgtt ccaaccctgc 3720

tggttgcccg taccgatgct gatgcggcgg atctgatcac ctccgattgc gacccgtatg 3780

acagcgaatt tattaccggc gagcgtacca gtgaaggctt cttccgtact catgcgggca 3840

ttgagcaagc gatcagccgt ggcctggcgt atgcgccata tgctgacctg gtctggtgtg 3900

aaacctccac gccggatctg gaactggcgc gtcgctttgc acaagctatc cacgcgaaat 3960

atccgggcaa actgctggct tataactgct cgccgtcgtt caactggcag aaaaacctcg 4020

acgacaaaac tattgccagc ttccagcagc agctgtcgga tatgggctac aagttccagt 4080

tcatcaccct ggcaggtatc cacagcatgt ggttcaacat gtttgacctg gcaaacgcct 4140

atgcccaggg cgagggtatg aagcactacg ttgagaaagt gcagcagccg gaatttgccg 4200

ccgcgaaaga tggctatacc ttcgtatctc accagcagga agtgggtaca ggttacttcg 4260

ataaagtgac gactattatt cagggcggca cgtcttcagt caccgcgctg accggctcca 4320

ctgaagaatc gcagttctaa gcaacaacaa ccgttgctga ctgtaggccg gataaggcgt 4380

tcacgccgca tccggcaatc ggtgcacgat gcctgatgcg acgcttgcgc gtcttatcat 4440

gcctacagcc gttgccgaac gtaggctgga taaggcgttt acgccgcatc cggcaattct 4500

ctgctcctga tgagggcgct aaatgccgcg tggcctggaa ttattgattg ctcaaaccat 4560

tttgcaaggc ttcgatgctc agtatggtcg attcctcgaa gtgacctccg gtgcgcagca 4620

gcgtttcgaa caggccgact ggcatgctgt ccagcaggcg atgaaaaacc gtatccatct 4680

ttacgatcat cacgttggtc tggtcgtgga gcaactgcgc tgcattacta acggccaaag 4740

tacggacgcg gcatttttac tacgtgttaa agagcattac acccggctgt tgccggatta 4800

cccgcgcttc gagattgcgg agagcttttt taactccgtg tactgtcggt tatttgacca 4860

ccgctcgctt actcccgagc ggctttttat ctttagctct cagccagagc gccgctttcg 4920

taccattccc cgcccgctgg cgaaagactt tcaccccgat cacggctggg aatctctact 4980

gatgcgcgtt atcagcgacc taccgctgcg cctgcgctgg cagaataaaa gccgtgacat 5040

ccattacatt attcgccatc tgacggaaac gctggggaca gacaacctcg cggaaagtca 5100

tttacaggtg gcgaacgaac tgttttaccg caataaagcc gcctggctgg taggcaaact 5160

gatcacacct tccggcacat tgccattttt gctgccgatc caccagacgg acgacggcga 5220

gttatttatt gatacctgcc tgacgacgac cgccgaagcg agcattgttt ttggctttgc 5280

gcgttcttat tttatggttt atgcgccgct gcccgcagcg ctggtcgagt ggctacggga 5340

aattctgcca ggtaaaacca ccgctgaatt gtatatggct atcggctgcc agaagcacgc 5400

caaaaccgaa agctaccgcg aatatctcgt ttatctacag ggctgtaatg agcagttcat 5460

tgaagcgccg ggtattcgtg gaatggtgat gttggtgttt acgctgccgg gctttgatcg 5520

ggtattcaaa gtcatcaaag acaggttcgc gccgcagaaa gagatgtctg ccgctcacgt 5580

tcgtgcctgc tatcaactgg tgaaagagca cgatcgcgtg ggccgaatgg cggacaccca 5640

ggagtttgaa aactttgtgc tggagaagcg gcatatttcc ccggcattaa tggaattact 5700

gcttcaggaa gcagcggaaa aaatcaccga tctcggcgaa caaattgtga ttcgccatct 5760

ttatattgag cggcggatgg tgccgctcaa tatctggctg gaacaagtgg aaggtcagca 5820

gttgcgcgac gccattgaag aatacggtaa cgctattcgc cagcttgccg ctgctaacat 5880

tttccctggc gacatgctgt ttaaaaactt cggtgtcacc cgtcacgggc gtgtggtttt 5940

ttatgattac gatgaaattt gctacatgac ggaagtgaat ttccgcgaca tcccgccgcc 6000

gcgctatccg gaagacgaac ttgccagcga accgtggtac agcgtctcgc cgggcgatgt 6060

tttcccggaa gagtttcgcc actggctatg cgccgacccg cgtattggtc cgctgtttga 6120

agagatgcac gccgacctgt tccgcgctga ttactggcgc gcactacaaa accgcatacg 6180

tgaagggcat gtggaagatg tttatgcgta tcggcgcagg caaagattta gcgtacggta 6240

tggggagatg cttttttgag gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttggctg 6300

ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg 6360

tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc 6420

gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt 6480

agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt 6540

ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt 6600

tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca 6660

ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc 6720

ttttgtttat ttttctaaat actgcagtgg gcttacatgg cgatagctag actgggcggt 6780

tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta aggttgggaa 6840

gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc 6900

aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca 6960

cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 7020

aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 7080

tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc 7140

gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 7200

aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 7260

tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 7320

ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 7380

ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 7440

cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca 7500

tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 7560

ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 7620

tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 7680

tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct aataagggga 7740

tcttgaagtt cctattccga agttcctatt ctctagaaag tataggaact tcgaagcagc 7800

tccagcctac ac 7812

<210> 2

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgacaatta atcatccggc tcgtaaatgt gtggaattgt gagcagataa caatttcaca 60

caggaaacag acc 73

<210> 3

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgacaattt atcatccggc tcttataatg tgtggaattg cgggcggata acaatttcac 60

acaggaaacg gacc 74

<210> 4

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgacaatta atcatccggc tcgtatagtg tgtggaattg tgagcggata caatttcacg 60

caggaaacaa acc 73

<210> 5

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgacaatta atcatccggc tcgtatagta tgcggaattg tgggcggata acactttcac 60

acaggaaaca gacc 74

<210> 6

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgacaatta atcatccggc tagtataatg tgtggaattg tgggcggata acaatttcac 60

acaggaaaca gacc 74

<210> 7

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg cgtggaattg tgggcggata gcattttcac 60

acaggaaaca gacc 74

<210> 8

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttgacaatta atcatccggc ccgtataatg tgtggaattg tgagtggata acaatttcac 60

acaggaaaca gacc 74

<210> 9

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttgacaatta atcatccggc tcgtatactg tgtggaattg tgggcagata acaatttcac 60

acaggaaaca gacc 74

<210> 10

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttgacaatta atcatccggc tctataatgt gtggaattgc gggcggataa caatttcaca 60

caggaaacag acc 73

<210> 11

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg taagcggata acaatttcac 60

acaggaaaaa gacc 74

<210> 12

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagtggata acaatttcac 60

acaggaaaca gacg 74

Claims (10)

1.组成型启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2～12所示。

2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求1所述启动子。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的质粒的第1120～2040位核苷酸替换为如SEQ ID NO.2～12所示的核苷酸序列。

4.一种重组菌，其特征在于，含有权利要求1所述的启动子或权利要求2或3所述的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，以同时表达异柠檬裂合酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因激酶/磷酸酶、乙醛酸还原酶基因的大肠杆菌为宿主。

6.一种无需诱导剂生产乙醇酸的方法，其特征在于，利用权利要求4或5所述重组菌生产乙醇酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以葡萄糖为底物生产乙醇酸。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将OD₆₀₀为0.1～1.0的重组菌以体积比1～5％的量加入反应体系。

9.一种提高乙醇酸产量的方法，其特征在于，以权利要求4或5所述重组菌为发酵菌株，以葡萄糖为底物生产乙醇酸。

10.权利要求1所述启动子，或权利要求2或3所述重组质粒，或权利要求4或5所述重组菌，或权利要求6～9任一所述方法在制备乙醇酸中的应用。

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