CN111671965A - 一种具有多重温度响应性的复合载药系统及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有多重温度响应性的复合载药系统及其制备方法与应用，涉及一种对多种药物进行控制释放的复合纳米纤维支架载药体系。本发明通过双针头静电纺丝技术制备了一种具有多重温度响应性的复合载药系统，作为人体病灶治疗的药物递送系统。该系统由两种具有不同温度刺激响应性的组分组成，可根据治疗目的将需要复合使用的药物分别负载在系统的两种组分中，再通过改变系统的温度来调节不同组分内的药物进行有差异的控制释放，可适用于需要多种用药需求的场景，以对人体病灶起到更好的治疗作用。同时本发明还公开载有姜黄素和酮康唑的双组分复合载药系统，以用作对真菌感染进行修复的伤口敷料，促进伤口的治愈，适于推广与应用。

Description

一种具有多重温度响应性的复合载药系统及其制备方法与 应用

技术领域

本发明属于复合纳米纤维支架载药体系领域，具体涉及一种对多种药物进行控制释放的复合纳米纤维支架载药体系，具体公开了一种具有多重温度响应性的复合载药系统及其制备方法与应用。

背景技术

药物递送系统能根据需要被输送药物的理化性质，采用合适的载体材料与药物结合，将其输送到人体内特定病灶位置，并有效控制药物释放进行治疗的系统。与传统给药方式相比，对药物具有控制释放的递药系统可以显著改善药物的溶解度和稳定性，而且还能有效控制药物的释放速率，提升药物的利用率，降低其毒副作用，以增强对病灶的治疗效果。药物递送系统通常是由生物医用载体材料跟药物组合而成，而递药系统的关键之处是运输药物的载体，它能改变药物进入人体的方式与在体内的分布情况。随着近些年来纳米技术的兴起，以及众多具有生物相容性且可生物降解的高分子聚合物的出现，将聚合物应用在递药系统中作为纳米药物载体越来越受到人们的关注。

现如今，对聚合物药物载体结构的研究主要集中在纳米颗粒、纳米微球、纳米胶束、水凝胶、脂质体及纳米纤维支架等，其形貌和性能可以根据治疗需要采用电喷雾、喷雾干燥、逐层自组装、去溶剂化、冷冻干燥和静电纺丝等方法制备得到。而通过静电纺丝技术制备的纳米纤维支架因为其具有高比表面积、高孔隙率、小尺寸及表面效应和优异的力学性能，已被广泛使用作为亲疏水药物的载体，并能通过纤维形貌、孔隙率以及聚合物组分的调整来延缓药物作用时间，控制负载药物的释放，提高药物分散度，以及对人体定点给药。

在众多刺激响应聚合物的研究与开发中，由于温度是自然界中普遍存在且易调控改变的环境因素，因此可将具有温度刺激响应聚合物作为载体应用到药物递送系统中。而其中的聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)是目前最被经常使用的一类温敏性聚合物，其低临界溶液温度(LCST为32℃)接近于人体生理体温，是一种理想的药物控释材料。基于PNIPAAm的具有温度刺激响应聚合物能负载药物，制备出诸如凝胶、胶束、纳米颗粒和纳米纤维等具有纳米尺度结构的药物载体，作为药物递送系统对药物进行精确控制释放，提升药物输送效率，达到特定治疗的功效。

随着药物递送系统技术的发展，负载单一药物的递药系统已不能很好满足临床医学上的应用，而负载两种甚至多种不同性质的药物、且在不同治疗阶段控制不同药物释放的多重药物递送系统，能应用在诸多需要多种药物联合用药的医学治疗中。选用合适的载体，在通过多种工艺方式将两种或两种以上具有不同性质的药物组合构建成的多重药物递送系统，能更好地发挥出药物之间的协同治疗作用。而静电纺丝方法由于其具有灵活的纺丝方式，且双针头静电纺丝技术可以很容易构建制备出多重药物递送系统，实现对药物的高效负载和程序性释放。同时将具有温度刺激响应性的纳米颗粒与纳米纤维相结合，可赋予载药纳米纤维对药物更精确控释的性能，从而拓宽其在生物医学组织工程支架、伤口敷料以及药物递送等方面的应用。

另外，传统制备载药纳米纤维的纺丝方法主要是将药物与基质聚合物一起混溶后电纺，或者对纤维表面进行改性修饰使药物能吸附或自组装加载上去。但这样的药物递送系统在释药初始阶段都会发生突释，而且水溶性相差很大的两种药物无法负载在同一基质的纳米纤维中，会限制一些特殊的生物医学应用。另一种具有亲疏水链段的温度刺激响应性聚合物，能在水溶液中自组装形成内核包裹疏水药物、外壳具有亲水结构并能稳定分散在水溶液中的具有核-壳结构的纳米胶束，可被作为药物载体而广泛应用在药物递送领域内。而将刺激响应性纳米胶束与纳米纤维结合形成复合纤维，能比传统单一组分的纤维具备控制释放药物的性能，从而扩宽其在生物医学的组织工程、伤口敷料以及药物递送等方面的应用。在众多的将纳米颗粒镶嵌到纳米纤维的方法中，将纳米颗粒与聚合物共混配制成稳定的纺丝液以进行静电纺丝，是最灵活方便制备纳米胶束/纳米纤维复合结构的方法。且在药物递送领域中，载药颗粒与纳米纤维的结合不仅可以增加药物控释途径，调控药物的释放，还可以抑制前期药物发生突释，可以满足在一些临床治疗中对药物双重负载的治疗需求。

因此，开发一种对多种药物进行控制释放的复合纳米纤维支架，即一种具有多重温度响应性的复合载药系统的制备方法就成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，而通过双针头静电纺丝技术制备了一种具有多重温度响应性的复合载药系统，以作为人体病灶治疗的药物递送系统。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有多重温度响应性的复合载药系统，所述复合载药系统是由组分I和组分II通过双针头静电纺丝制备的复合纳米纤维膜；其中，

组分I是以高分子聚合物作为基质形成的纳米纤维，且所述纳米纤维内部镶嵌负载有药物I并具有温度刺激响应性的纳米胶束；

组分II是由聚己内酯、具有温度刺激响应性的聚(N-异丙基丙烯酰胺)和药物II共混形成的复合纳米纤维。

优选的，所述高分子聚合物为溶于水并能形成稳定溶液，及具有良好纺丝性能的高分子材料；且所述高分子聚合物至少为明胶、胶原、透明质酸、蚕丝蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的一种。

优选的，所述复合纳米纤维膜中出现两种粗细不同的纳米纤维，且其是由两种粗细不同的纳米纤维相互交叉叠加组分，并通过戊二醛蒸汽交联增强纤维膜在水中的稳定性；

其中，载药系统中出现两种粗细不同的纳米纤维，是由于两种组分在进行静电纺丝时，纺丝性能不同造成的。且双针头静电纺丝同时对两种组分静电纺丝时不影响每种组分纳米纤维形成的外观形貌和纤维直径，这一结果与每种组分单独进行静电纺丝时的实验结果一致。以及在双针头静电纺丝制备载药复合纳米纤维膜时，较细组分I的纳米纤维的平均直径为230±50nm左右；较粗组分II的纳米纤维的平均直径为1167±240nm。

并且上述采用戊二醛交联多重载药系统内的组分I的聚乙烯醇(PVA)基质，目的是增强PVA的水稳定性，不至于将产品应用在水环境中时破坏组分I的纳米纤维结构。其中，交联可替代的化合物种类有：1、多元有机酸(例如：草酸、己二酸、顺丁烯二酸酐、柠檬酸、磺基琥珀酸、苯偏三酸酐等)；2、醇类化合物(例如：甲醇、乙二醇、对苯二甲醇等)。

此外，本申请一方面解决通过静电纺丝将单独高分子材料制备成的负载药物的纳米纤维载药系统，会出现药物突释等问题，以致不能对药物进行可控的释放以达到长期给药的治疗效果；另一方面解决目前采用单一材料和单一药物制备的药物递送系统，在一些需要多种药物复合使用的治疗场景中存在应用受限制问题。

上述本发明公开保护的系统负载的药物I和药物II适用于两种或多种具有能够复合协同起到治疗作用的药物，可应用于需要多种药物复合使用的治疗场景。

此外，需特别指出的是，本发明虽然采用双针头静电纺丝法制备两种组分的载药复合纳米纤维膜，但也能通过改进纺丝装置，增加多个针头，并配制多组纺丝液，电纺制备两种组分以上的载药纳米纤维膜。

进一步的，在纺丝液体积一定的情况下，所述载药复合纳米纤维膜的厚度可根据样品在金属接收装置上接受范围的大小来调节。且纤维膜的厚度在理论上只会对药物最终累计释放率产生一定影响，但这不会改变载药系统中各组分的温度刺激响应控制释放药物的性能，以及其对各组分药物进行有差异的控制释放也不会造成影响。

本发明的第二个目的在于，提供上述复合载药系统在制备真菌感染修复的伤口敷料及药物中的应用。

需要说明的是，本发明制备的具有多重温度响应性的复合载药系统，该系统由两种具有不同温度刺激响应性的组分组成，可根据治疗目的同时将两种或多种需要复合使用的药物分别负载在系统的两种组分中，再通过改变系统的温度来调节不同组分内的药物进行有差异的控制释放，可适用于需要多种用药需求的场景应用，以对人体病灶起到更好的治疗作用。本发明是以对伤口真菌感染进行修复作为一种具体的实际应用来进行实验研究，是众多应用场景的一种具体使用。本发明还可以对不同人体病灶的治疗来选择其他能起到联合用药达到治疗效果的药物，不局限于对本文所述的对特定治疗目的的特定应用。

具体的，本发明以伤口真菌感染的治疗作为其中的一种技术应用场景，在系统的不同组分中负载具有抗炎与可促进皮肤修复的姜黄素(Cur)和抗菌药酮康唑(KCZ)，通过双针头静电纺丝制备载有姜黄素和酮康唑的双组分双载药复合载药系统，用作对真菌感染进行修复的伤口敷料。该系统可通过调控温度来控制两种药物的释放，以满足治疗不同阶段对药物的需求，促进伤口的治愈。

此外，本发明还请求保护上述具有多重温度响应性的复合载药系统的制备方法，也即通过双针头静电纺丝制备载有姜黄素和酮康唑的双组分双载药复合载药系统，具体步骤为：

(1)制备载药胶束：首先通过自由基聚合制备端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺)(P(NIPAAm-co-DMAAm))；随后以异辛酸锡(II)为催化剂，使丙交酯与P(NIPAAm-co-DMAAm)末端的羟基开环聚合成端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺)-b-聚丙交酯(P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PLA)两亲性嵌段共聚物；最终采用透析法制备载Cur胶束；

(2)制备PVA与载药胶束共混纺丝液：以PVA作为基质，与步骤(1)制备的所述载Cur胶束样品进行共混，制备一系列PVA：CurM不同质量比的共混纺丝液；

(3)制备PCL/PNIPAAm/KCZ纺丝液：首先将NIPAAm单体通过自由基聚合制备PNIPAAm；随后调整PCL和PNIPAAm的质量比，并将两者加入到氯仿和DMF组成的混合液中搅拌溶解均匀得到PCL/PNIPAAm混合液；最终将KCZ添加到所述PCL/PNIPAAm混合液中得到载有KCZ的PCL/PNIPAAm质量比不同的聚合物纺丝液；

(4)双针头静电纺丝制备双组分/双载药复合纳米纤维膜：采用双针头静电纺丝法对步骤(2)制备的共混纺丝液与步骤(3)制备的聚合物纺丝液进行电纺，制备双组分/双载药复合纳米纤维膜，即为所述具有多重温度响应性的复合载药系统。

需要说明的是，纳米胶束内核包裹药物可以保护其活性，显著增强疏水性药物的水溶性，降低药物毒副作用，并具有优异的生物相容性和生物可降解性。而且由于具有温度刺激响应性，能改变温度使得纳米胶束的结构破坏，从而将药物从胶束内部释放出来，达到主动控制释药的作用。

以及对不同环境因素(温度、pH、电磁场和光等)刺激而具有相应响应行为的聚合物，将其用作药物载体能对药物进行更加精确的控制释放，减少药物暴露时间并防止过早的释放，以降低耐药性的风险，因此将刺激响应聚合物应用在纳米药物控释系统中作为药物载体。

进一步的，所述步骤(2)中，共混纺丝液中PVA与CurM的质量比为(2～4)：1，且所述PVA在所述共混纺丝液中的质量体积比为10～12％(w/v)。

进一步的，所述步骤(3)中，PCL/PNIPAAm混合液中PCL与PNIPAAm的质量比为(1～4)：1，且所述PCL与PNIPAAm在所述聚合物纺丝液中的质量体积比为12～20％(w/v)；以及所述KCZ添加量为所述PCL/PNIPAAm混合液质量的10～25％。

进一步的，所述步骤(4)中，采用双针头静电纺丝的工艺参数如下所示：

工作电压为12～18kV，所述静电纺丝装置内针头到金属接收板的距离为12～18cm，以及纺丝液的流速为0.3～0.8mL/h。

需要说明的是，组分纺丝液浓度过高或过低都会影响到能否正常进行纺丝，以及能否得到形貌良好的纳米结构纤维；且直接对静电纺丝装置中的高压电源部件进行工作电压的调节，并控制电压范围在12～18kV之间，且电压过高或过低都会影响纳米结构纤维的形成；

此外，调节静电纺丝装置内针头到接收板的位置，通过测量工具确定接受距离，并控制距离范围在12～18cm之间，而接受距离过高或过低都会影响纳米结构纤维的形成；以及通过对静电纺丝装置中的微量注射泵进行设置调节，将纺丝液装入注射器内并放置在微量注射泵上，可调节纺丝液在电场中纺丝时的流速，控制纺丝液的流速范围在0.3～0.8mL/h之间，且纺丝液流速过高或过低都会影响纳米结构纤维的形成。

综上所述，本发明公开的采用双针头静电纺丝所选用的参数范围是在已报道的文献基础上进行参数范围的选择并进行实验探索，最终确定了对于本发明制备的多重载药系统的最佳纺丝参数条件是：纺丝电压为15kV，接受距离为15cm，两组分纺丝液推进速度均为0.5mL/h。

通过静电纺丝制备具有伤口修复作用的纳米纤维敷料，是生物医用纺织品领域的研究热点之一。传统的单一材料或单一药物的伤口修复敷料存在应用限制，而通过灵活便捷的静电纺丝技术制备出具有双组分或多组分的纳米纤维，可以使各组分之间实现优势互补，更好的提高纳米纤维敷料的综合功能性，而且多重载药更能满足伤口修复不同阶段对不同药物的需求。此外采用双针头对喷进行静电纺丝，其纺丝效果不会受到两种不同性质聚合物相互的影响，更能灵活制备满足临床治疗需求的纳米纤维敷料。

此外，所述载药胶束及PNIPAAm可以载有除本文Cur及KCZ之外的药物，并且运输药物的载体是相同的。对本发明选择其他药物进行负载制备复合载药系统的制备工艺是相同的，只要所选择的药物能稳定溶于制备纺丝液时所需要的化学试剂中，就可以采用本发明的方法对其他的药物进行负载制备多重复合载药系统。

进一步的，本发明公开保护的一种具有多重温度响应性的复合载药系统及其制备方法与其在制备真菌感染修复的伤口敷料及药物中的应用，具有如下技术目的：

(1)本发明制备两种载药组分，它们具有不同的温度刺激响应释放药物的性能，可通过改变温度来实现对两种药物进行有差异的可控释放，两种组分分别为下面的组分I和组分II，详细介绍如下：

组分I是通过将具有温度刺激响应性的两亲性嵌段共聚物制成载药纳米颗粒的载药系统，可以很好地对负载药物起到保护并能对药物进行控制释放。再将具有温度刺激响应的载药纳米颗粒与纳米纤维结合在一起，构建出载药复合纳米纤维的药物输送系统。载药纤维在温度低于LCST时，药物能很好保存在温敏性胶束内部，缓慢对外进行释放；而在温度高于LCST时会促使温敏性胶束结构破坏，进而使被包裹的药物释放出来，起到控制药物释放的治疗效果。

组分II是将具有温度刺激响应性聚合物、高分子基质和药物一同共混电纺，制备的复合纳米纤维载药系统可以通过改变温度使其高于或低于LCST，从而改变载药纤维亲疏水性能和物理形态。当温度低于LCST时，会促进药物的释放；而当温度高于LCST时会延缓药物对外释放。改变温度可以控制药物的释放速率，实现对药物的可控释放。

(2)本发明通过灵活便捷的静电纺丝技术，可以很容易构建制备出多重药物递送系统，实现对药物的高效负载和程序性释放。本发明能通过双针头静电纺丝制备负载有两种或多种药物的复合载药系统，其纺丝效果不会受到两种不同性质聚合物相互的影响，使得药物输送系统可同时提供两种或多种药物的输送和分阶段释放的能力，以满足人体病灶治疗不同阶段的药物需求，实现两种药物在治疗过程中的优势互补。并将上发明目的(1)中制备的组分I和组分II具有不同温度刺激响应机制的两种载药组分通过双针头静电纺丝结合，负载两种药物，制备出对每种药物都具有控制释放性能的双组分药物输送系统。

与现有技术相比，本发明公开保护的一种具有多重温度响应性的复合载药系统及其制备方法与应用，优点在于：

(1)本发明通过双针头静电纺丝技术实现了将两种具有不同温度刺激响应性能的载药纳米纤维结合成一个载药系统；

(2)本发明制备了两种具有不同温度刺激响应性能的载药组分，其中，组分I是以聚乙烯醇(PVA)高分子聚合物作为基质形成纳米纤维，纤维内部镶嵌负载有药物I的具有温度刺激响应性纳米胶束，该组分中胶束的LCST为41℃；组分II是由聚己内酯(PCL)、具有温度刺激响应性的聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)和药物2共混形成的复合纳米纤维，该组分中PNIPAAm的LCST为32℃；

(3)本发明可实现同时负载两种或多种能具有协同治疗效果的药物，制备成多重载药系统。本发明制备的多重载药系统可适用于任何需要多种药物协同治疗以达到治疗效果应用场景。本发明其中的一项实施例是以姜黄素和酮康唑作为模型药物，将该系统应用于其中一种真菌感染伤口修复的应用场景，通过温度调控释放相应药物以满足伤口不同修复阶段的治疗需求；

(4)本发明通过改变温度来调节多重载药系统中不同药物的差异释放，并同时阐述该系统对温度具有刺激响应释放药物的性能，具体表现为：复合载药系统在25℃时，组分II能快速地释放药物II，而组分I则会对药物I进行缓慢释放；而当温度达到人体正常体温37℃时，组分I和组分II会同时对药物I和药物II进行缓慢释放；而当调节温度为42℃大于人体正常体温时，系统中的组分I能快速释放药物I，而组分II则会延缓药物II的释放。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为端羟基P(NIPAAm-co-DMAAm)的合成步骤。

图2为端羟基P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PLA的合成步骤。

图3为PNIPAAm的聚合步骤。

图4为本发明的制备工艺流程图。

图5为双针头静电纺丝制备双组分双载药复合纳米纤维膜的形貌结构示意图。

图6为双组分双载药复合纳米纤维(PCM-@-PPN-3)的SEM图，其中图6(a)为PCM-@-PPN-3交联前；图6(b)为PCM-@-PPN-3交联6h后。

图7为双组分双载药复合纳米纤维(PCM-@-PPN-3)的激光共聚焦显微镜照片，其中图7(a)为明场；图7(b)为暗场下纤维内胶束中Cur被激发呈绿色荧光；图7(c)为暗场下纤维内KCZ被激发呈蓝色荧光；图7(d)为明、暗场的叠加图。

图8为PVA/CurM-4复合纳米纤维(PCM-1)、PCL/PNIPAAm/KCZ复合纳米纤维(PPN-3)和双组分双载药复合纳米纤维(PCM-@-PPN-3)的红外光谱图。

图9为PVA/CurM复合纳米纤维(PCM-1)、PCL/PNIPAAm/KCZ复合纳米纤维(PPN-3)和双组分双载药复合纳米纤维(PCM-@-PPN-3)的X射线衍射曲线。

图10为双组分双载药复合纳米纤维(PCM-@-PPN-3)在25℃、37℃和42℃下的药物累计释放曲线，其中图10(a)为Cur累计释放曲线；图10(b)为KCZ累计释放曲线。

图11为PVA/CurM复合纳米纤维膜(PCM-1)的药物释放示意图。

图12为PCL/PNIPAAm/KCZ复合纳米纤维膜(PPN-3)的药物释放示意图。

具体实施方式

下面将结合说明书附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

本发明实施例内容先介绍了各项关键原料的制备流程；然后介绍了不同配比的两种组分纺丝液的制备流程；最后选取最优的两种组分的纺丝液，通过双针头静电纺丝制备出具有温敏性的多重复合载药系统。详细流程如下：

(一)两种组分纺丝液的配制

1、PVA/CurM组分纺丝液的配制

1.1端羟基P(NIPAAm-co-DMAAm)的聚合

通过自由基聚合制备端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺)(P(NIPAAm-co-DMAAm))。首先分别称取提纯后的NIPAAm单体20g、DMAAm单体4.37g、作为链转移剂的β-疏基乙醇172.5mg和作为引发剂的过氧化苯甲酰(BPO)89.2mg，一起溶解到80ml四氢呋喃(THF)中，通氮气鼓泡20min使溶液脱去；然后将脱气后的混合溶液在氮气保护下，加热到85℃回流反应8h；接着将反应液倒入正己烷：乙醚(体积比2:1，v/v)溶液中沉淀得到白色沉淀；最后将沉淀物放置在真空干燥箱40℃下真空干燥，得到产物P(NIPAAm-co-DMAAm)，样品编号为：PN-co-DM。合成步骤见图1。

1.2P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PLA的合成

以异辛酸锡(II)为催化剂，使丙交酯与P(IPAAm-co-DMAAm)末端的羟基开环聚合成端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺)-b-聚丙交酯(P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PLA)两亲性嵌段共聚物。首先将1.188g的P(NIPAAm-co-DMAAm)、1.513g的丙交酯和0.3ml的异辛酸锡(II)一起加入10mL的甲苯中，在150℃下反应聚合24h；然后将反应液倒入正己烷：乙醚(体积比2:1，v/v)溶液中沉淀得到白色沉淀；最后将沉淀物放置在真空干燥箱40℃下真空干燥，得到两亲性嵌段共聚物P(NIPAAm-co-DMAA)-b-PLA样品编号为：PN-co-DM-PLA。合成步骤见图2。

1.3载Cur胶束的制备

采用透析法制备载Cur胶束：将50mg的PN-co-DM-PLA溶解到10ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，再加入8mg的Cur，磁力搅拌均匀。将混合均匀的溶液装入已预处理过的透析袋(截留分子量为8000～14000)中，20℃下在去离子水内透析48h。透析结束后，使用孔径为400nm的微滤膜过滤得到纳米级胶束溶液。最后使用冷冻干燥机将溶液冻干完全，得到黄色蓬松状的载Cur胶束(CurM)冻干粉。

1.4 PVA与载药胶束共混纺丝液的制备

以PVA作为基质，与上述制备的载Cur胶束样品进行共混，制备一系列PVA：CurM不同质量比(4:1～2:1)的纺丝液，PVA/CurM纺丝液的具体制备过程如下：

(1)称取0.5g的PVA加入到2.5mL的去离子水中，加热至70℃下搅拌使其溶解均匀，然后冷却至室温待用，聚合物水溶液中PVA的浓度为20％(w/v)。

(2)分别准确称取0.125g～0.25g的CurM胶束冻干粉，完全溶于2.5mL的去离子水中，配制载药胶束水溶液。

(3)将载药胶束溶液加入PVA水溶液中，室温下磁力搅拌均匀，配制成PVA：CurM质量比为4:1～2:1的纺丝液，其中PVA在混合溶液中的质量体积比始终为10％(w/v)。配制5mL的纺丝溶液，其中PVA：CurM质量比为4:1和2:1的纺丝液成分配料表如表1所示：

表1不同比例的PVA/CurM纺丝液配料表

2 PCL/PNIPAAm/KCZ组分纺丝液的配制

2.1 PNIAAm聚合物的制备

将NIPAAm单体通过自由基聚合制备PNIPAAm。首先将4.960g的NIPAAm单体和0.086g的四甲基乙二胺(TEMED)一同放入装有100mL去离子水的锥形瓶内溶解均匀，通入氮气30min对溶剂进行脱气；然后再加入0.155g作为引发剂的过硫酸钾(KPS)到溶液中，密封锥形瓶后室温下静止放置24h进行反应；反应结束后将溶液加热到70℃，快速搅拌加热1h之后将白色沉淀产物过滤出来，最后放置在真空干燥箱内70℃干燥24h，最终得到产物PNIPAAm。合成步骤见图3。

2.2 PCL/PNIPAAm/KCZ纺丝液的制备

PCL/PNIPAAm/KCZ纺丝液制备：首先调整PCL和PNIPAAm的质量比(w/w)为4:1～1:1，将两者加入到氯仿(CHCl₃)和DMF体积比为3:2(v/v)的混合溶液中搅拌溶解均匀，聚合物在混合溶液中总的浓度为20％(w/v)；然后在将与PCL/PNIPAAm聚合物总质量比为10％和25％(w/w)的KCZ分别添加到PCL/PNIPAAm不同质量比的纺丝液中，磁力搅拌溶解均匀，保持聚合物在CHCl₃/DMF混合溶液中总的浓度为20％(w/v)；最后得到载有KCZ的PCL/PNIPAAm质量比不同的(4:1～1:1)聚合物纺丝液。

PCL/PNIPAAm/KCZ纺丝液具体制备工艺如下：

(1)KCZ浓度为10％，PCL/PNIPAAm质量比为3:1的纺丝液制备：5mL的氯仿/DMF混合溶液(氯仿为3mL、DMF为2mL)中，首先加入0.75g的PCL和0.25g的PNIPAAm，完全溶解；然后再加入0.1g的KCZ到溶液中溶解均匀；最后得到纺丝液。

(2)KCZ浓度为25％，PCL/PNIPAAm质量比为3:1的纺丝液制备：5mL的氯仿/DMF混合溶液(氯仿为3mL、DMF为2mL)中，首先加入0.75g的PCL和0.25g的PNIPAAm，完全溶解；然后再加入0.25g的KCZ到溶液中溶解均匀；最后得到纺丝液。

(3)配制5mL的纺丝溶液，PCL和PNIPAAm质量比为(4:1、3:1、1:1)的成分配料表如表2所示：

表2不同比例的PCL/PNIPAAm/KCZ纺丝液配料表

(二)双针头静电纺丝制备双组份/双载药复合纳米纤维膜

采用双针头静电纺丝法对上述制备的一系列纺丝液进行电纺，制备双组份/双载药复合纳米纤维膜。不同组分进行双针头静电纺丝样品组分配比表如表3所示，其中样品PCM-@-PPN-3的具体制备例子步骤如下：

将上述样品编号为PCM-1和PPN-3的纺丝液分别装入5mL的注射器中，并分别与内径为0.7mm的不锈钢的平头针头相连，固定在能调节流速的微量注射泵上；将用于收集样品的铝箔纸铺在已接地的金属接收板上，然后将连接不同纺丝液注射器的两个平头针头平行固定在电场中，并调节好平头针头到接收板之间的距离为15cm；在两个针头与接收板之间施加15kV的高压电场下进行静电纺丝；接收板以恒定速度旋转收集样品；两组纺丝液的推进速度都为0.5mL/h。全程在室温和避光的环境下进行静电纺丝，并在纺丝结束后将收集得到的双组份/双载药复合纳米纤维膜放置在真空干燥箱内充分干燥，以除去未挥发完全的溶剂。本发明的工艺流程图如图4所示，本发明的实施例制备的双组分双载药复合纳米纤维膜的形貌结构示意图如图5所示。

表3制备电纺纳米纤维样品的组分配比表*

*两针头内径都为0.7mm；纺丝电压为15kV；接受距离为15cm；两组分纺丝液推进速度都为0.5mL/h。

其中，采用双针头静电纺丝制备双组分双载药复合纳米纤维膜具体制备工艺流程参见附图4所示，且双针头静电纺丝制备双组分双载药复合纳米纤维膜的形貌结构示意图参见附图5所示。

通过静电纺丝制备具有伤口修复作用的纳米纤维敷料，是生物医用纺织品领域的研究热点之一。传统的单一材料或单一药物的伤口修复敷料存在应用限制，而通过灵活便捷的静电纺丝技术制备出具有双组分或多组分的纳米纤维，可以使各组分之间实现优势互补，更好的提高纳米纤维敷料的综合功能性，而且多重载药更能满足伤口修复不同阶段对不同药物的需求。采用双针头对喷进行静电纺丝，其纺丝效果不会受到两种不同性质聚合物相互的影响，更能灵活制备满足临床治疗需求的纳米纤维敷料。

为了进一步验证本发明公开保护技术方案的可行性及其达到的技术效果，发明人还进行了如下实验：

实验一：分别选择PVA/CurM和PCL/PNIPAAm/KCZ两种温敏性组分性能最佳的样品PCM-1与PPN-3，采用双针头静电纺丝法使两组分结合，制备双组分双载药复合纳米纤维膜(PCM-@-PPN-3)。该复合纳米纤维膜具有两种粗细不同且交叉互穿的纳米纤维形貌，其中较粗的是PCL/PNIPAAm/KCZ组分形成的纤维，较细的是PVA/CurM组分形成的纤维，如图6(a)所示。电纺后的双组分双载药复合纳米纤维膜采用戊二醛交联处理6h，能增强系统在水中的稳定性，各组分纤维间没有很明显融合交联，能保持良好的纤维形貌，如图6(b)所示。

实验二：图7是双组分双载药复合纳米纤维(PCM-@-PPN-3)在明场、暗场和明暗场叠加的激光共聚焦显微镜照片。在明场(图7(a))中，能观察到具有两种良好形貌且连续的纳米纤维，其中纤维较细的为PVA/CurM组分纳米纤维(PCM-1)，较粗的为PNIPAAm/PCL/KCZ组分纳米纤维(PPN-3)。两种纳米纤维都呈圆柱状，粗细均匀且表面光滑，这与在扫描电镜中观察到的一致。图7(b)是Cur在暗场下被激发后发出绿色的荧光，并且荧光能随着纤维轴不连续的分布。图7(c)是KCZ在暗场下被激发后发出蓝色的荧光，并且荧光能随着纤维轴连续的分布，这表明KCZ能很好的分布在纳米纤维的内部。图7(d)为明场和暗场图片的叠加，也能很好观察到Cur和KCZ在纤维内部的分布情况。

实验三：PVA/Cur-M(PCM-1)复合纳米纤维、PCL/PNIPAAm/KCZ(PPN-3)复合纳米纤维和双组分双载药复合纳米纤维(PCM-@-PPN-3)的红外光谱图如图8所示。在样品PPN-3复合纳米纤维的红外谱图中，有PCL的特征峰1728cm^-1(C＝O)；PNIPAA的特征峰3319cm^-1(N-H的伸缩振动)、1548.7cm^-1(酰胺II峰)；KCZ的特征峰1514cm^-1(苯环振动)，并且也能在PCM-@-PPN-3双组分复合纳米纤维的红外光谱图中观察到。在PCM-1复合纤维的红外谱图中，在1645.1cm^-1和1546cm^-1处能明显观察到酰胺I带(O＝C)的伸缩振动峰和亚胺基(-NH)的弯曲振动峰，这两处为载药胶束内酰胺键(O＝C-NH)的特征吸收峰。由于PCM-1与PPN-3具有相同的官能团，主要特征峰类似，因此在PCM-@-PPN-3双组分复合纳米纤维的红外光谱图中类似位置出峰。但是，因为有两种组分的复合纳米纤维存在，两种组分每个特征吸收峰的强度不同，因此在双组分复合纳米纤维的红外光谱图中的特征吸收峰的强度也与单独组分的特征吸收峰强度不同。以上分析也证明了双组分复合纳米纤维是PVA/Cur-M和PCL/PNIPAAm/KCZ复合纳米纤维结合的产物。

实验四：PVA/CurM复合纳米纤维(PCM-1)、PCL/PNIPAAm/KCZ复合纳米纤维(PPN-3)和双组分双载药复合纳米纤维(PCM-@-PPN-3)的XRD衍射谱图如图9所示。PCM-1和PPN-3载药复合纳米纤维的x射线衍射图都是宽而平缓的衍射带，但PPN-3的x射线衍射图在21.4°、23.88°处有属于PCL的窄而尖锐的特征峰。而在双组分双载药复合纳米纤维(PCM-@-PPN-3)的x射线衍射图中，则在21.4°、23.88°处的特征峰强度相较于PPN-3载药复合纳米纤维的特征峰强度要弱，这表明了两种组分能相互交织在一起形成了双组分的纳米纤维结构。

实验五：双组分双载药复合纳米纤维在25℃时(温度小于PCL/PNIPAAm/KCZ和PVA/CurM组分的LCST)能快速释放KCZ，但会缓慢释放Cur；而当温度达到人体正常体温37℃时(温度大于PCL/PNIPAAm/KCZ组分的LCST、小于PVA/CurM组分的LCST)，则会转换为同时对KCZ和Cur进行缓慢释放；而当调节温度大于人体正常体温在42℃时(温度大于PCL/PNIPAAm/KCZ和PVA/CurM组分的LCST)，复合纳米纤维能快速释放Cur，并进一步延缓KCZ的药物释放。其中，Cur和KCZ两种药物的累计释放率曲线图如图10所示。

实验六：组分内的PVA具有良好的亲水性能，能为伤口修复提供一个湿润的微环境，有利于细胞的吸附增殖，促进伤口修复；而PCL能维持整个敷料结构的稳定性。

且本发明以真菌感染伤口为应用背景，制备负载Cur和KCZ的具有温度刺激响应性的双组分双载药复合纳米纤维作为伤口修复的敷料，不仅能针对性的治疗伤口，而且能根据治疗目的来通过温度来灵活调控不同药物的释放，可在不同修复阶段释放相应药物对伤口起到促进治愈的作用。

实验七：两种组分的释药机理

(1)载Cur胶束复合纳米纤维膜的药物释放如图11所示。载有Cur的胶束镶嵌在PVA纳米纤维中，因为胶束受到环境温度变化会产生刺激响应变化，所以在温度大于胶束的LCST(41℃)时胶束结构会被破坏，使得内部药物容易扩散释放出来。

(2)PCL与PNIPAAm溶解在CHCl₃/DMF混合溶剂体系中进行静电纺丝，由于PNIPAAm比PCL更易溶于DMF，在纺丝形成纤维的过程中，PNIPAAm组分随着DMF的蒸发更易向外层迁移，而PCL组分则保留在内层。因此在相分离的作用下形成了外层为具有温度刺激响应性的PNIPAAm组分，内层为PCL的核-壳结构纳米纤维，如图12所示。当T<LCST(32℃)时，外壳的PNIPAAm与周围环境水分子结合，类似水凝胶的结构，内部空间比较大，有利于药物向外扩散；而当T>LCST(32℃)时，外壳的PNIPAAm会收缩覆盖在内核的PCL层上，形成一层致密膜，从而覆盖住纳米纤维的孔隙，阻碍药物从纤维内部向外的扩散。

综上所述，本发明通过双针头静电纺丝技术制备了一种具有多重温度响应性的复合载药系统，作为人体病灶治疗的药物递送系统。该系统由两种具有不同温度刺激响应性的组分组成，可根据治疗目的同时将两种或多种需要复合使用的药物分别负载在系统的两种组分中，再通过改变系统的温度来调节不同组分内的药物进行有差异的控制释放，可适用于需要多种用药需求的场景，以对人体病灶起到更好的治疗作用。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种具有多重温度响应性的复合载药系统，其特征在于，所述复合载药系统是由组分I和组分II通过双针头静电纺丝制备的复合纳米纤维膜；其中，

组分I是以高分子聚合物作为基质形成的纳米纤维，且所述纳米纤维内部镶嵌负载有药物I并具有温度刺激响应性的纳米胶束；

组分II是由聚己内酯、具有温度刺激响应性的聚(N-异丙基丙烯酰胺)和药物II共混形成的复合纳米纤维。

2.根据权利要求1所述的一种具有多重温度响应性的复合载药系统，其特征在于，所述高分子聚合物为溶于水并能形成稳定溶液，及具有良好纺丝性能的高分子材料；且所述高分子聚合物至少为明胶、胶原、透明质酸、蚕丝蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种具有多重温度响应性的复合载药系统，其特征在于，所述复合纳米纤维膜是由两种粗细不同的纳米纤维相互交叉叠加组分，并通过蒸汽交联增强纤维膜在水中的稳定性。

4.一种如权利要求1-3任一所述的具有多重温度响应性的复合载药系统的应用，其特征在于，所述复合载药系统在制备真菌感染修复的伤口敷料及药物中的应用。

5.一种如权利要求1-3任一所述的具有多重温度响应性的复合载药系统的制备方法，其特征在于，通过双针头静电纺丝制备载有姜黄素和酮康唑的双组分双载药复合载药系统，具体步骤为：

(1)制备载药胶束：首先通过自由基聚合制备端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺)(P(NIPAAm-co-DMAAm))；随后以异辛酸锡(II)为催化剂，使丙交酯与P(NIPAAm-co-DMAAm)末端的羟基开环聚合成端羟基聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺)-b-聚丙交酯(P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PLA)两亲性嵌段共聚物；最终采用透析法制备载Cur胶束；

(2)制备PVA与载药胶束共混纺丝液：以PVA作为基质，与步骤(1)制备的所述载Cur胶束样品进行共混，制备一系列PVA：CurM不同质量比的共混纺丝液；

(3)制备PCL/PNIPAAm/KCZ纺丝液：首先将NIPAAm单体通过自由基聚合制备PNIPAAm；随后将PCL和PNIPAAm加入到氯仿和DMF组成的混合液中搅拌溶解均匀得到PCL/PNIPAAm混合液；最终将KCZ添加到所述PCL/PNIPAAm混合液中得到载有KCZ的PCL/PNIPAAm质量比不同的聚合物纺丝液；

(4)双针头静电纺丝制备双组分/双载药复合纳米纤维膜：采用双针头静电纺丝法对步骤(2)制备的共混纺丝液与步骤(3)制备的聚合物纺丝液进行电纺，制备双组分/双载药复合纳米纤维膜，即为所述具有多重温度响应性的复合载药系统。

6.根据权利要求5所述的一种具有多重温度响应性的复合载药系统的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，共混纺丝液中PVA与CurM的质量比为(2～4)：1，且所述PVA在所述共混纺丝液中的质量体积比为10～12％(w/v)。

7.根据权利要求5所述的一种具有多重温度响应性的复合载药系统的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PCL/PNIPAAm混合液中PCL与PNIPAAm的质量比为(1～4)：1，且所述PCL与PNIPAAm在所述聚合物纺丝液中的质量体积比为12～20％(w/v)；以及所述KCZ添加量为所述PCL/PNIPAAm混合液质量的10～25％。

8.根据权利要求5所述的一种具有多重温度响应性的复合载药系统的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用双针头静电纺丝的工艺参数如下所示：

工作电压为12～18kV，所述静电纺丝装置内针头到金属接收板的距离为12～18cm，以及纺丝液的流速为0.3～0.8mL/h。

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