CN111671917A - 一种石蒜碱纳米粒、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种石蒜碱纳米粒、其制备方法及应用。纳米粒由药物溶解或包裹于含有乳化剂的高分子载体材料而制得；所述药物为石蒜碱；所述载体材料为外消旋聚乳酸。配比如下：油相与内水相的体积之比2:1～5:1；载体与药物质量之比2.5:1～5:1。所制备的纳米粒的外观呈现出澄明的蓝色，纳米粒溶液所特有的外观特征就是具有蓝色乳光，所制备的纳米粒达到纳米级别，平均粒径96.3±5.1nm，PDI(多分散指数)为0.141±0.020(PDI值越小说明溶液中的纳米粒的粒径分散越均匀稳定)，通过离心加速实验检验无沉淀破乳的情况；释放24h后，纳米粒累计释放率达到98.99％，拟合Ritger‑Pappas模型(R＝0.9327)与此释放机制最匹配。经过优化所得到的纳米粒的处方和工艺符合要求，体外缓释效果明显。

Description

一种石蒜碱纳米粒、其制备方法及应用
技术领域
本发明内容属于医药技术领域。涉及一种石蒜碱纳米粒及其制备方法和性质，纳米粒采用乳化溶剂挥发法制备，可用于诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，抑制和阻断细胞的周期和介导细胞自我吞噬等方面，并且具有靶向性，减少肿瘤治疗的毒副作用。
背景技术
提取石蒜科植物石蒜的鳞茎于是得到中药石蒜。这种传统药用的植物石蒜，有着悠远的临床应用历史。《图经本草》是最早发现的它的药理作用，主要用于“敷肿毒”。石蒜碱是由日本人森岛库太分离了石蒜科植物石蒜的鳞茎后首次提取发现的，石蒜碱盐酸盐则称为盐酸石蒜碱，外观是针状晶体。最近几十年来，众多研究石蒜植物的文章阐明了石蒜碱具有诱导肿瘤细胞生长的药理作用。石蒜碱抑制肿瘤生长主要机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成、抑制和阻断细胞的周期和介导细胞自我吞噬等途径。
然而，在癌症的治疗中，传统的给药途径使药物分散到全身，浓度高，毒性大，副作用强。由于纳米颗粒在肿瘤血管中具有很强的渗透性，纳米粒携带药物后靶向作用可定位肿瘤组织释放的药物可以清除肿瘤细胞，减少药物全身分布，减少药物的副作用，并降低毒性。纳米粒的粒径在10～100nm之间，药物可以溶解或者包裹于高分子材料当中。在药剂学中，纳米粒具有特殊的医疗价值：首先，药物制成纳米粒会遮掩药物本身的性质，从而改善药物在体内的不良反应；其次，作为口服制剂，可避免生物类的药物的失活；最后，作为粘膜给药载体，纳米粒会附着于给药部位，大大延长给药时间且提高药效。纳米粒常用的给药载体有聚酯类、两亲性嵌段共聚物以及聚氰基丙烯酸烷酯类。纳米粒的制备方法多种多样，主要有如下的方法：天然高分子凝聚法；乳化聚合法；液中干燥法；自乳化法；乳化溶剂挥发法等。将纳米粒的载体材料进行不同程度的修饰，可实现定位与缓控释给药，常见的修饰有：长循环纳米粒、表面电荷修饰纳米粒、免疫纳米粒、温度敏感型纳米粒和pH敏感型纳米粒等。
长期以来，石蒜碱作为抗癌药物常常制成注射剂，注射剂虽然有起效快的特点，但是依从性较差，同时价格昂贵，质量要求高，生产风险大。此时，具有疗效好，依从性高且用药风险较低的口服石蒜碱纳米粒应运而生。据报道，纳米粒可以透过胃肠黏膜系统，从而进入完整的血液循环。药物被纳米粒保护，不受胃肠道的酶或酸的破坏。
同时，巨噬细胞会将载药纳米粒当做异物吞噬，纳米粒集中在网状内皮系统中的靶点处，如肝脏以及与配体、抗体和酶底物连接的靶点处，随后到达目标靶组织靶器官的载药纳米粒，可依据载体材料或处方比例的不同从而改变药物释放速率。药物释放速率可通过调节载体材料的类型或处方比例来控制。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种石蒜碱纳米粒、其制备方法及应用。
本发明所制备的纳米粒粒径均一可控，体内外稳定性好，能提高肿瘤治疗的疗效，且具有靶向性，减少毒副作用。本发明还提供了该纳米粒的制备方法，其制备条件温和，制备工艺重现性好。
本发明提供的方案如下：
本发明的目的之一在于提供一种盐酸石蒜碱纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将外消旋聚乳酸作为载体材料溶于二氯甲烷中，成为油相，即O相；将盐酸石蒜碱溶解于水中成为内水相，即W1相；
(2)在O相中加入乳化剂A混匀后，超声下滴加到W1相中，制成初乳W1/O；
(3)将乳化剂B溶于水中制成外水相，即W2相；
(4)将初乳W1/O于超声下滴加到W2相中得到W1/O/W2相；
(5)将W1/O/W2相中的有机溶剂挥干，得到固化的纳米粒。
进一步，所述步骤(1)中载体材料外消旋聚乳酸的数均分子量为5000～30000，可用于装载药物，载体材料与药物质量之比2.5:1～5:1。优选的，载体材料与药物质量之比2.5:1。
外消旋聚乳酸可通过化学偶联肿瘤特异性靶向因子实现肿瘤靶向，肿瘤特异性靶向因子为叶酸、乳铁蛋白、乳铁蛋白受体单链抗体、转铁蛋白、转铁蛋白受体单链抗体、甲胎蛋白(AFP)受体单抗、RGD肽或各种癌细胞的单克隆抗体等。左旋聚乳酸降解慢，力学强度大；而外消旋聚乳酸制成的产品生物相容性好，包裹石蒜碱后能够有效阻滞石蒜碱的释放，靶向到肿瘤细胞后，持续缓慢地释放药物以杀死肿瘤细胞。
载体材料可负载的抗肿瘤药物作为抗肿瘤靶向药物，抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西他赛、羟基喜树碱、阿霉素、丝裂霉素、他莫昔芬、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环磷酰胺、或铂类药物(顺铂、卡铂或奥沙利铂)等临床常用的抗肿瘤药物。
进一步，所述步骤(2)中，乳化剂A为W/O型乳化剂，包括司盘-80、司盘-20、司盘-40、司盘-60、司盘-65和司盘-85。
进一步，所述步骤(2)中，初乳W1/O中O相与W1相体积比为2:1～5:1。优选的，初乳W1/O中O相与W1相体积比为2:1。
进一步，所述步骤(2)中所述超声由超声细胞破碎仪提供，功率为100～250W，超声时间1～10分钟。
进一步，所述步骤(3)中，乳化剂B为O/W型乳化剂，包括SDS、波洛沙姆188、吐温类和卖泽类乳化剂，W2相中乳化剂B的浓度为1～10wt％。优选的，W2相中乳化剂B为SDS，浓度为2wt％。
进一步，所述步骤(4)中超声处理1～10分钟，超声功率设为30～100W。
本发明的目的之二在于提供利用上述方法制备的石蒜碱纳米粒，由内向外依次为W1相、O相和W2相。所述纳米粒粒径范围为96.3±5.1nm，多分散指数PDI＝0.141±0.020。通过离心加速实验检验通过无沉淀破乳的情况；释放24h后，纳米粒累计释放率可达到98.99％。
本发明的目的之三在于提供上述石蒜碱纳米粒在诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，抑制和阻断细胞的周期和介导细胞自我吞噬方面的应用。
石蒜碱抑制肿瘤生长主要机制是通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成、抑制和阻断细胞的周期和介导细胞自我吞噬等途径。然而，在癌症的治疗中，传统的给药途径使药物分散到全身，浓度高，毒性大，副作用强。由于纳米颗粒在肿瘤血管中具有很强的渗透性，纳米粒携带药物后靶向作用可定位肿瘤组织释放的药物可以清除肿瘤细胞，减少药物全身分布，减少药物的副作用，并降低毒性。外消旋聚乳酸包裹石蒜碱制备的纳米粒，通过外消旋聚乳酸的阻滞作用，还可以起到药物缓慢释放的长效作用，药物释放完毕后逐渐降解。
本发明的有益效果：
(1)载体材料选用外消旋聚乳酸，具有生物相容性好，易于与靶向因子偶联等优点，通过选择适宜的分子量，可以调控其力学性能、降解时间等，从而制备力学性能适宜(韧性好、抗压性适中)、稳定性好、和药物释放速率适宜的纳米粒；
(2)粒心填充物选用盐酸石蒜碱，其可溶于水，并在乳化剂的作用下包裹于外消旋聚乳酸当中，并在超声作用下聚集为纳米粒，增强对于肿瘤血管的渗透能力；
(3)与常规石蒜碱制剂相比，纳米粒具有相应的靶向性，提高了生物利用度，并减少了毒副作用；
(4)采用乳化溶剂挥发方法可以实现对纳米粒粒径的精确调控，制得的纳米粒粒径高度均一，单分散性好，体内外稳定性好，血液循环时间长；
(5)乳化溶剂挥发方法制备条件温和，能够避免在制备中破坏多肽、蛋白质、抗体等靶向因子的生物活性；
(6)通过控制超声的条件，乳化溶剂挥发方法制备工艺重现性好，不同批次纳米粒的粒径、PDI值波动极小，且制备工艺可以按比例放大，易于实现大规模制备。
附图说明
图1是纳米粒的表观图；
图2是外消旋聚乳酸的红外结构图；
图3是盐酸石蒜碱纳米粒的最大吸收波长；
图4是盐酸石蒜碱纳米粒的回归曲线图；
图5是盐酸蒜石碱纳米粒的体外释放曲线。
具体实施方式
下面通过借助实施例更加详细地说明本发明，但以下实施例仅是说明性的，本发明的保护范围并不受这些实施例的限制。
本发明所制备的纳米粒以可生物降解的外消旋聚乳酸为载体材料，以可以治疗肿瘤的盐酸石蒜碱为粒心填充物质，采用乳化溶剂挥发方法制备。
制备方法如下：
(1)将外消旋聚乳酸作为载体材料溶于二氯甲烷中，成为油相，即O相；将盐酸石蒜碱溶解于水中成为内水相，即W1相；
(2)在O相中加入乳化剂A混匀后，超声下滴加到W1相中，制成初乳W1/O；
(3)将乳化剂B溶于水中制成外水相，即W2相；
(4)将初乳W1/O于超声下滴加到W2相中得到W1/O/W2相；
(5)将W1/O/W2相中的有机溶剂挥干，得到固化的纳米粒。
进一步，所述步骤(1)中载体材料外消旋聚乳酸的数均分子量为5000～30000，可用于装载药物，载体材料与药物质量之比2.5:1～5:1。优选的，载体材料与药物质量之比2.5:1。
外消旋聚乳酸可通过化学偶联肿瘤特异性靶向因子实现肿瘤靶向，肿瘤特异性靶向因子为叶酸、乳铁蛋白、乳铁蛋白受体单链抗体、转铁蛋白、转铁蛋白受体单链抗体、甲胎蛋白(AFP)受体单抗、RGD肽或各种癌细胞的单克隆抗体等。
载体材料可负载的抗肿瘤药物作为抗肿瘤靶向药物，抗肿瘤药物包括紫杉醇、多西他赛、羟基喜树碱、阿霉素、丝裂霉素、他莫昔芬、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、环磷酰胺、或铂类药物(顺铂、卡铂或奥沙利铂)等临床常用的抗肿瘤药物。
进一步，所述步骤(2)中，乳化剂A为W/O型乳化剂，包括司盘-80、司盘-20、司盘-40、司盘-60、司盘-65和司盘-85。
进一步，所述步骤(2)中，初乳W1/O中O相与W1相体积比为2:1～5:1。优选的，初乳W1/O中O相与W1相体积比为2:1。
进一步，所述步骤(2)中所述超声由超声细胞破碎仪提供，功率为100～250W，超声时间1～10分钟。
进一步，所述步骤(3)中，乳化剂B为O/W型乳化剂，包括SDS、波洛沙姆188、吐温类和卖泽类乳化剂，W2相中乳化剂B的浓度为1～10wt％。优选的，W2相中乳化剂B为SDS，浓度为2wt％。
进一步，所述步骤(4)中超声处理1～10分钟，超声功率设为30～100W。
所制备的纳米粒通过离心加速实验检验通过无沉淀破乳的情况；释放24h后，纳米粒累计释放率可达到98.99％，拟合Ritger-Pappas模型(R＝0.9327)与此释放机制最匹配。
纳米粒经注射进入体内后，需要穿过细胞内或细胞间内皮。毛细血管内皮间的主要联系方式之一的窦状隙的孔径为100～200纳米，仅存在于肝脏和脾脏中，纳米粒由此可进入肝实质细胞及脾。由于人体内的毛细血管直径约4微米，纳米粒很容易通过，注射给药后很容易被网状内皮系统捕捉，主要分布于肝，少量分布于骨髓。纳米粒口服给药时可被胃肠道存在一些与免疫有关的特定组织区域所摄取而进入血液循环，有以下途径：肠细胞的胞饮；细胞间摄取；细胞吞噬；派氏结中的M细胞摄取，后者可能是粒子摄取的主要途径。
实施例1
盐酸石蒜碱纳米粒的制备：
(1)DL丙交酯的提纯
取大约4g丙交酯粉末，烧杯中加入30mL乙酸乙酯溶液后倒入取好的丙交酯，在水浴锅中温度为95℃的条件下搅拌至溶解，然后将其置于室温下冷却，等到温度降到室温后放入4℃的冰箱冷藏保存，2h后过滤，置于真空干燥箱内干燥36h，得到丙交酯的晶体粉末，重复上述实验两次。
(2)制备外消旋聚乳酸
称取适量的重结晶丙交酯作为原料，辛酸亚锡作为催化剂，适量水为引发剂，在50mL容量的单口圆底烧瓶中，抽真空(两次)、充氮气(一次)的条件下，油浴锅加热至120℃，搅拌下反应3h，反应得到的产物中添加二氯甲烷边搅拌加快溶解，再加入无水乙醇使溶解于二氯甲烷中的产物以沉淀形式析出，将其置于真空干燥箱内在常温条件下干燥24h。
(3)采用乳化溶剂挥发制备纳米粒
(i)运用乳化-溶剂挥发法制备W/O/W型复乳，0.5mL水溶解4mg盐酸石蒜碱作为内水相，称取10mg的外消旋聚乳酸(分子量12000)用1.5mL二氯甲烷溶解作为油相，在油相中加入W/O型乳化剂span-80一滴，均匀混合后将内水相置于烧杯中，超声细胞破碎仪的作用下边超声边滴加油相，超声功率为195w，时间2min制成初乳(W1/O)；
(ii)再向5ml 1％SDS中滴加制备好的初乳同时用30％功率超声5min得到(W1/O/W2)；
(iii)最后将得到的产物在室温的条件下搅拌直至有机溶剂挥干，得到固化的纳米粒。
所制备的纳米粒表观如图1所示，所制备的纳米粒的外观呈现出澄明的蓝色，纳米粒溶液所特有的外观特征就是具有蓝色乳光。
实施例2
制备方法同实施例1，区别在于：
步骤(3)的(i)中外消旋聚乳酸用量为15mg，盐酸石蒜碱用量为6mg；超声功率为200w；
步骤(3)的(ii)中SDS的浓度变为2％；超声功率为40W；
实施例3
制备方法同实施例1，区别在于：
步骤(3)的(i)中外消旋聚乳酸用量为30mg，盐酸石蒜碱用量为12mg，超声功率为220w；
步骤(3)的(ii)中SDS的浓度变为3％；超声功率为50W。
实施例4
制备方法同实施例1，区别在于：
步骤(3)的(i)中外消旋聚乳酸用量为45mg，盐酸石蒜碱用量为18mg，超声功率为250w；
步骤(3)的(ii)中SDS的浓度变为4％；超声功率为70W。
实施例5
一、外消旋聚乳酸的结构表征
将实施例1制备的外消旋聚乳酸用傅里叶红外变换光谱仪进行表征，如图2所示。羰基的特征吸收峰：1759㎝-1，阐明产物中的分子结构中含有羰基；CH-和-CH3的伸缩振动峰：3000cm-1左右，CH-和-CH3的弯曲振动吸收峰：1384cm-1与1480cm-1；证明高分子的化合物结构中包含有CH-和-CH3。
二、纳米粒的含量测定方法
将实施例1制备的纳米粒进行紫外吸收测定，见图3，盐酸石蒜碱最大吸收波长为290nm，并且在290nm处空白溶剂无吸收峰，所以选择290nm处为盐酸石蒜碱的紫外吸收测定波长。
如图4所示，得到的回归方程为：A＝2.2155C-0.0061(r＝0.9996)，说明盐酸石蒜碱在50～350μg/mL范围之间具有良好的线性关系。
三、纳米粒的粒径
将实施例1制备的纳米粒采用激光粒度仪(Zetasizer/Nano ZS90，Malvern公司)4℃时测定纳米泡粒径，测得平均粒径为96.3±5.1nm，PDI为0.141±0.020。
四、纳米粒体外释放特性的研究
将实施例1制备的纳米粒用低温超速离心法通过在超滤管中高速离心将溶液中游离的药物与纳米粒分离开来；将新鲜制备的纳米粒2mL至微孔滤膜中，使用低温高速离心机10000r/min，离心25分钟，取其上清液用紫外分光光度法进行含量测定，即得到游离盐酸石蒜碱的含量，根据以下方法测定载药量及包封率：
载药量(％)＝W总-W游/W o×100％；纳米粒的总质量用Wo表示。
包封率(％)＝W总-W游/W总×100％；药物的总含量用W总表示，游离的药物含量用W游表示。
然后计算每个时间点取出的样品的累计释放量，再总合得到累计释放率。如以下的计算公式：
Figure BDA0002612887570000071
其中Ai表示第i小时透析袋内液的吸光度；Ar表示对照溶液的吸光度；Cr对照溶液的浓度；纳米粒的浓度为S；m为取样量(2mL)；释放介质的总体积(50mL)用V0来表示；
(2)累计释放度(％)＝(Cn×50+2×∑Ci)/M×100％
其中用Cn表示各取样点的盐酸石蒜碱的浓度；Ci表示0到t时间点之前各时间点样品浓度之和；M表示样品中盐酸石蒜碱的含量。如图5，绘制得到纳米粒体外释放的曲线，其中横坐标为释放的时间t，纵坐标为盐酸石蒜碱的累积释放率；结果显示纳米粒在12小时的累计释放率为94.43％，表明工艺优化得到纳米粒有优良的缓释效果。拟合Ritger-Pappas模型(R＝0.9327)与此释放机制最匹配。表1是纳米粒体外释放模型的拟合。
表1纳米粒体外释放的模型拟合
Figure BDA0002612887570000081
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种盐酸石蒜碱纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将外消旋聚乳酸作为载体材料溶于二氯甲烷中，成为油相，即O相；将盐酸石蒜碱溶解于水中成为内水相，即W1相；
(2)在O相中加入乳化剂A混匀后，超声下滴加到W1相中，制成初乳W1/O；
(3)将乳化剂B溶于水中制成外水相，即W2相；
(4)将初乳W1/O于超声下滴加到W2相中得到W1/O/W2相；
(5)将W1/O/W2相中的有机溶剂挥干，得到固化的纳米粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中载体材料外消旋聚乳酸的数均分子量为5000～30000，可用于装载药物，载体材料与药物质量之比2.5:1～5:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，乳化剂A为W/O型乳化剂，包括司盘-80、司盘-20、司盘-40、司盘-60、司盘-65和司盘-85。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，初乳W1/O中O相与W1相体积比为2:1～5:1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述超声由超声细胞破碎仪提供，功率为100～250W，超声时间1～10分钟。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，乳化剂B为O/W型乳化剂，包括SDS、波洛沙姆188、吐温类和卖泽类乳化剂，W2相中乳化剂B的浓度为1～10wt％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中超声处理1～10分钟，超声功率设为30～100W。
8.一种盐酸石蒜碱纳米粒，其特征在于：采用权利要求1～7任一项所述的方法制备。
9.根据权利要求8所述的盐酸石蒜碱纳米粒，其特征在于：所述纳米粒粒径范围为96.3±5.1nm，多分散指数PDI＝0.141±0.020。
10.权利要求8或9所述的盐酸石蒜碱纳米粒在诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，抑制和阻断细胞的周期和介导细胞自我吞噬方面的应用。
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