CN111662962B

CN111662962B - 一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法

Info

Publication number: CN111662962B
Application number: CN202010515612.XA
Authority: CN
Inventors: 江洪; 曲越; 曲超琪
Original assignee: Zhuhai Kunyuan Technology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Kunyuan Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2020-06-09
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2040-06-09
Also published as: CN111662962A

Abstract

“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，属于核酸恒温扩增领域，其特征是一种环介导的链替换聚合酶扩增，采用一对模板引物5'前端预加对侧引物或稍短序列形成嵌合引物对，其新合成延伸链被模板外替换引物延伸替换出模板复制单链，新生单链预加首端与自身互补区成茎环结构，再用嵌合引物间的内替换引物结合环延伸后替换出茎环的嵌合引物区而露出两个及以上多引物结合位点，多个嵌合引物结合延伸链被5'外侧引物延伸后替换出成倍单链而形成子代茎环，内外双向链替换以及较短的茎环链替换高效率促使环循环指数扩增，反应产物经浊度、染料、荧光检测，核酸结合荧光于65℃及以上读值、染料白光及紫外显色。

Description

一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法

技术领域：

本发明属于分子生物学及核酸PCR恒温扩增的快速检测领域，具体地是利用DNA茎环可恒温结合引物复制、链替换循环的核酸恒温扩增方法。

背景技术：

多聚酶链反应PCR是在1953年Watson建立的DNA双螺旋模型及半保留复制法则基础以及1971年Khorana体外扩增思想上，于体外(试管内)模拟自然基因复制的核酸扩增技术；直至1985年，美国Cetus公司Mullis想到了PCR本质-指数扩增或几何级数式放大的巨大威力,发明了一对特异引物结合、复制靶分子基因，模拟天然DNA半保留复制的热循环PCR技术，再经过一系列发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司1987年申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。

随即PCR以几何级数放大的超级灵敏度和操作简便性成为生命科学最基础技术，其各种发展和应用一直是最热门中心，根据PCR指数扩增反应中DNA解链方式不同，可以将核酸扩增技术分为常规热循环PCR扩增和核酸恒温扩增技术两大类。热循环扩增包括普通终末PCR和实时荧光定量PCR，循环扩增经一步变性：靶DNA双链经高温94℃变性—解链为单链，二步退火：降温至54℃左右复性使过量引物粘合至单链互补区并以dNTP为聚合酶底物原料，互补序列为模板，引物末端开始渗入底物、复制，三步延伸：升温至72℃左右，在耐热DNA聚合酶的作用下，以结合引物自身延伸成为一条与模板互补新链，子代一半新链一半母链半保留复制。不断重复变性--退火--延伸步骤循环，这种新链、母链又可成为下次循环的模板，靶分子以2ⁿ级数扩增过亿倍的复制DNA供检测。多聚酶链反应PCR尤其实时荧光定量PCR已成为重大疾病核酸检测的首选并且难以替代的重要技术，但热循环所需复杂设备及较长反应时间和热循环带来的引物聚合非特异性都限制了其使用优越性。

目前核酸PCR扩增检测需要专们物理隔离的分子检验实验室和专业培养训练人员操作，大量疾病流行及基层地区亟需不依赖荧光热循环仪器的核酸现场检测或大规模检测，和家庭诊所及医院床边(POCT)适合快速便捷的核酸恒温检测技术方法。早期的核酸恒温扩增技术有链替换扩增(SDA)，依赖核酸序列的扩增(NASBA)，转录依赖的扩增系统(TAS)，Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA扩增,滚环扩增(RCA),和较近期的解链酶扩增技术等。但这些初期恒温扩增技术成熟度和使用率远不及热循环PCR扩增效果。使用较多和本专利相近的有环介导的恒温扩增LAMP(Nucleic Acids Res.2000,Vol.28,No.12,e63)，利用引物5'端带有的模板中倒置序列促使新合成的单链3'互补末端能返折自身结合而链内延伸扩增；交叉引物恒温扩增CPA(中国专利ZL200810134583.1)，利用引物5'端带有对侧引物序列促使扩增产物带有更多的引物结合位点而使一引物下游的引物产物链替换循环且新生片段聚合越来越长。但环介导的恒温扩增LAMP反应流程复杂而结果预期不明确，聚合酶的链替换功能对于连续超长菜花样产物片段链替换效率低下致使灵敏度仍不足和低浓度模板反应时间长于1小时；交叉引物恒温扩增CPA开始反应时只是产物逐个引物延长、增量线性上升(相对指数放大线性增量太少)，扩增反应循环中成倍产物链产生数量不够、效率不高而反应不恒定，CPA反应后期出现长产物，其每端有3个(3对)及以上的引物结合位点才开始指数链替换反应，结果CPA灵敏度仍显不足和低浓度样本反应时间长于1小时。

因此，为了克服目前链替换恒温扩增仅模板引物上游一个方向设置替换引物，其延伸后替换下方模板引物复制链成单链，且链替换过长单链效率低所致灵敏度和快捷性局限或不足。本专利“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”通过聚合酶的链替换较短的单链来提高链替换效率和抓住指数链替换的几何级数放大本质。选取一段长约100bp或短于200bp待扩增模板及两端序列设置引物，并将对侧引物序列置于引物5'端前面，形成嵌合引物对，其新合成延伸链被模板外替换引物延伸替换出模板复制单链，新生单链预加首端与自身互补区成茎环结构，再用嵌合引物间的内替换引物结合环延伸后替换出茎环的嵌合引物区而露出两个及以上多引物结合位点，多个嵌合引物结合延伸链被5'外侧引物延伸后替换出成倍单链而形成子代茎环，内外双向链替换以及较短的茎环链替换高效率促使环循环指数扩增，一侧嵌合引物5'端缩短1-7b碱基和甜菜碱环境下恒温扩增效率更佳。无需仪器设备于十几-三十分钟就可扩增至对数期-平台期，低浓度样本三十分钟内达峰值，灵敏度达4-6个拷贝基因。

恒温扩增检出样本初始浓度拷贝数与扩增循环数成反对数关系，越浓样本只需较少扩增循环就达到对数期，较稀样本需要较多扩增循环才达到对数期。但由于恒温扩增即不好控制扩增循环数也难以实时监测反应循环数，只有用反应时间长短来间接代表循环数。同时，我们又追求恒温扩增极致效率，传统实时扩增荧光曲线难以于数分钟内精确定量。恒温扩增定量检验还需要另一条稀释定量法/数字化定量思路，即通过样本倍比稀释靶分子直至无靶分子反应再算稀释倍数的倍比稀释定量方法；样本稀释、分散至大量的微型分隔单元使理论上每检测单元含0-1个靶分子，通过检测单元反应信号0-1计数和有限稀释倍数而对靶分子进行定量的方法,以便于计算机0或1模式的自动化操作。1992年,Sykes等人(Biotechniques13:p444)初步尝试了基于样本有限稀释和泊松分布计数的定量巢式PCR,并首次提出了数字化定量荧光PCR。Vogelstein&Kinzler于1999年报导微升级96孔板的致癌突变基因ras定量PCR而创新数字(digital)PCR概念(PNAS,USA 96:9236)。根据稀释比例和反应单元数、体积，推算出原始溶液的核酸浓度,通过计数及泊松分布统计,就可以实现起始DNA模板的绝对定量。超敏恒温扩增技术无需复杂热循环装置而或许会成为下代dPCR高效路径。

REFERENCES

(1)Mullis k；et al.,1987,US Patent 4,683,202.

(2)Notomi T.,et al.,Nucleic Acids Res.2000,Vol.28,No.12,e63

(3)中国专利ZL200810134583.1

(4)Fang R,et al.,Journal of Clinical Microbiology,2009,47(3):845-847.

(5)Sykes,P.J.；et al.,1992,BioTechniques 13:444-449.

(6)Vogelstein,B.；Kinzler,K.W.1999,PNAS,USA 96:9236-9241.

发明内容：

为了克服目前链替换恒温扩增仅模板引物上游一个方向设置替换引物，其延伸后替换下方模板引物复制链成单链，且链替换过长单链效率低所致灵敏度和快捷性局限或不足。本发明“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征是一种环介导的链替换聚合酶扩增而利用环可恒温结合引物延伸复制，采用一对模板引物5'前端预加对侧引物序列形成嵌合引物对和一侧预加序列5'短1-7b碱基，其新合成延伸链被模板外替换引物延伸替换出模板复制单链，新生单链预加首端与自身互补区杂交成茎环结构，新链首端预加序列与延伸的“互补区”形成茎和模板引物间的序列成为环(单链)部分；其环单链不用热变性先配对结合内替换引物，通过链替换聚合酶催化延伸至5'茎部而游离露出原茎环的3'茎部即多个嵌合引物位点，随后多个嵌合引物结合延伸链被5'外侧引物延伸后替换出成倍单链而形成子代茎环，且每次替换会先合成一双链，子代茎环又重复循环并以2ⁿ级数增加；内外双向链替换以及较短的茎环链替换高效率促使环循环而恒温金属浴、水浴扩增，反应产物经浊度、染料、或荧光检测，核酸结合荧光于65℃及以上读值、染料经白光及荧光显色。

根据所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于，选取一段长80bp至200bp样本特异基因序列作为待扩增核酸模板，模板两端各选不长于25个核苷酸碱基序列作为模板扩增引物配对区，模板引物间序列选择长度40-100个碱基片段利于形成茎环结构。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征是待扩模板两端各选18-24个核苷酸碱基长度作为模板扩增引物对，5'端选有意义链为正向上游引物序列，3'端取反意义链为反向下游引物序列；所述的下游引物反意义链5'→3'预加于上游引物序列5'端前面作为上游嵌合引物，上游引物序列预加于下游引物序列5'端前面作为下游嵌合引物，所述的一侧嵌合引物预加序列5'短1-7b碱基，且嵌合引物3'端优选A尾以便于产物配对U被UDG灭活污染，反应引物终浓度0.1μM—1.6μM。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于远离模板1-数个模板引物距离的上下游两侧各选17-23个核苷酸碱基特异序列作为外替换引物对，5'端选有意义链为上游外替换引物序列，3'端取反意义链为下游外替换引物序列，外替换引物延伸合成双链后替换出其3'下游的引物合成新链为单链，引物终浓度0.025μM—0.2μM。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于选取模板引物间序列40-60碱基长度以使形成茎环的成环效率最高，其分成左右各17-22个碱基两段序列或中间0-10个碱基重叠的两段序列作为内替换引物，左段即上游嵌合引物侧选反意义链为反向内替换引物，右段即下游嵌合引物侧取有意义链为正向内替换引物，内替换引物3'末端距离嵌合引物间隔2个碱基至20个碱基，引物终浓度0.012μM—0.1μM。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于恒温扩增反应扩增引物和内外替换引物遵从一般引物设计普通原则：

1)所有引物3'末端间不能有2base或2base碱基以上的连续反向互补,尤其是最末至倒数第2个碱基；

2)引物的3'末端碱基尽可能使每个引物的3'最末碱基为A/AC结尾特别嵌合引物A/AA尾,即不能选强“错配”多的NNGC或NNCG末端(所谓GC/CG夹),亦不能为特异性差的T结尾，或重复双GG/TT结尾；

3)上下游引物长度差别不能大于3base碱基,两者T_m值相差不能大于5℃；

4)G+C含量应在40％-60％,4种碱基分布/配要均匀,避免出现4个以上碱基同一重复、和序列简单重复的二级结构。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于防止扩增产物分子气雾胶交叉污染反应试剂，采取主动防污染措施包括使用部分至全部dUTP底物代替dTTP生成含dU产物，PCR试剂成分/各组份加0.2％-2％v/v大肠杆菌UDG酶预消化可能污染的dU产物后热灭活。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于核酸恒温扩增反应采用具有链替换功能的耐热聚合酶、逆转录和替换聚合酶包括Bst、Bca、phi29聚合酶。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于核酸恒温扩增反应产物检测使用染料、荧光染料包括钙黄绿素、SYBR Green、EvaGreen染料及浊度仪。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于核酸恒温扩增反应体积10μL-100μL可单管200μLPCR管、96孔板，和人工配制、机器自动化配制。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其所述的扩增操作步骤如下：

1)于EP管加纯化核酸20-40μL，反应缓冲液10X buffer0.5μL,10-20μM上下游嵌合引物和5μM两侧外替换引物各0.5-1μL置95℃金属浴5分钟后快速冰浴退火；

2)每个PCR反应管底先加入1.2-2.5μM正反内替换引物各0.5μL和10-40μM上下游嵌合引物各1.0μL混合含10％蔗糖3μL于管底缓慢释放-热启动反应；

3)于PCR管近管底加5X反应混合液mix包括10mM dNTP2.0μL、100mM MgSO₄2.0μL、10X Bst buffer 5μL、Bst polymerase 1-2μL混合液,和12.5M甜菜碱4μL；

4)沿管壁中部加钙黄绿素及氯化锰(1.2-2mM︰12-20mM)2μL染料，水dH₂O 20-10μL沿管壁冲下；

5)于PCR管管壁近上部加10-20μL变性样本，阴性对照品和阳性对照品于平行对照管，加样吸头采用过滤芯吸头，每一管换一吸头；

6)尽快、依次加10μL硅油和40μL矿物油双层封闭，瞬时离心，

置60℃—65℃金属浴反应30-60分钟及80℃停止反应5分钟，阳性可视显绿色，或不用钙黄绿素而补加SYBR Green/Eva Green染料于70℃—80℃荧光计读取荧光值，样本管荧光值较空白管值高2倍以上为阳性。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于，使用物理空间隔离的密闭独立配液、加样、扩增室，于独立配液室混合所述PCR试剂成分/组分,并在分隔的加样室进行样本DNA纯化及加样,加样使用过滤芯吸头及用后丢入5％次氯酸钠废液内，实验室定期用纯的1-2％次氯酸钠消化、70％酒精清洁后使用，实验前后用紫外灯和臭氧轮换消毒。

所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于：应用样本倍比稀释单元检测定量数字PCR，扩增检测分散单元有核酸扩增产生绿色荧光，没有核酸扩增而无荧光显黄色，根据稀释比例和反应单元体积，推算出原始溶液的核酸浓度，通过计数及泊松分布统计，实现起始核酸模板的绝对定量。

根据所述的“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征在于其方法应用于核酸检测试剂盒，盒成份包括：样本核酸提取试剂，dNTPs及dUTP，Bst酶及其缓冲液，嵌合引物和内外替换引物，甜菜碱，钙黄绿素染料、SYBR Green I，eUDG酶预加入各PCR成分/组分，化学法处理水无污染dH₂O，硅油和矿物油。

本发明“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，其特征利用引物前端添加序列与引物延伸链自身互补区成茎环结构，使用环结合内引物与外引物双向链替换出茎环以及通过聚合酶的链替换较短的茎环单链来提高链替换效率的环循环扩增几何放大策略。选取一段短于100bp至200bp待扩增模板，将对侧引物序列预置于扩增引物5'端前面，形成与对侧引物序列“倒置重复”(或交叉)的嵌合引物对，使用一5'稍短嵌合引物对和甜菜碱条件下有利于茎环多个“引物配对区”充分有序结合多引物；嵌合引物对扩增靶模板并被外替换引物替换出新生单链，嵌合引物序列自然延为新生单链5'端部分，嵌合引物首端“倒置重复”与新生单链自身的“对侧引物配对区”因链内碰撞优势而先于引物形成链内返折结合的茎环结构，新链首端“倒置重复”与延伸的“引物配对区”形成茎和模板引物间的序列成为环(单链)部分。环循环扩增：利用与环配对的内引物结合往环5'端延伸破坏茎而露出(替换)茎环“引物配对区”单链，与其配对的嵌合引物结合茎区单链合成新链并被外引物替换成新生的茎环短链；新的茎环短链带有两段或以上嵌合引物配对区，中间结合的嵌合引物合成新链被内引物引发启动和外侧嵌合引物延伸后替换；且每替换一茎环会先合成一双链。子代茎环又重复循环以2ⁿ级数扩增；反应后期长柄茎环结合更多引物而又＞2ⁿ额外增加放大。

原理示意图1是利用卡通图进一步阐述双向链替换环循环的扩增过程，以粗线条代表模板、引物有意义链(S代表)，细线代表互补的反意义链(a代表)；再以深黑色条线代表上游引物区，粗黑条示意上游引物有意义链；以齿状条线代表下游引物区，细齿线示意下游引物反意义链；细齿线连粗黑条代表上游嵌合引物Fas，粗黑条连细齿线代表下游嵌合引物Rsa，末端箭头代表3'末端及延伸方向。淡灰色线代表嵌合引物间成环部分的序列，双细灰线示意有意义链，单细灰线示意反意义链，依其序列以带箭头双细线IF，单细线IR代表内替换引物。嵌合引物Fas上游和Rsa下游外侧替换引物以dF和dR代表。利用一对引物5'端前预置的对侧引物序列与游离新生子链自身互补成茎环结构，与环部分结合的内替换引物启动茎环结构结合多对嵌合引物，内引物与外侧嵌合引物双向链替换出成倍茎环指数循环扩增。

恒温扩增反应具体步骤1a(见图1步骤1a)一对嵌合引物Fas和Rsa结合首次热变性模板DNA/RNA单链，同时外替换引物dF和dR亦于外侧结合单链，嵌合引物延伸新生长链并被外引物延伸后替换出一对长单链，其5'首段预先加上的“倒置重复”与新链自身(对侧引物结合区)互补链内成环；长链茎环再被内替换引物结合环单链部分延伸至“倒置重复”替换释放出引物结合区，下一轮嵌合引物结合延伸并被外替换引物延伸后替换出新的短链茎环结构。步骤1b(图1步骤1b)短链茎环结构有两段嵌合引物结合区，像第一步被内替换引物结合环单链部分启动替换而释放出嵌合引物两结合区，下一轮嵌合引物再结合延伸，中间嵌合引物延伸被外侧嵌合引物合成短双链后替换出新的短链茎环结构并会加延一个引物长度，茎环无需热变性解链而恒温循环扩增成新茎环，每扩增一新茎环同时产生一短双链。步骤二(图1步骤2ab)加延一个引物长度的茎环结构有了三段嵌合引物结合区，下一轮嵌合引物再结合延伸，中间两段嵌合引物延伸被外侧嵌合引物合成短双链2a后替换出1b和2b加倍数量茎环结构，环开始指数循环重复1-2步骤扩增。茎环结构由于链内碰撞机率远大于直接与引物分子间碰撞结合而为最主要反应，其中替换单链5'首段优先被替换其5'“倒置重复”折返结合成茎环的茎部优先于替换单链3'末端折返结合，单链3'末端折返结合的茎环结构反而会加延一个引物长度同样指数循环扩增。恒温扩增反应晚期随着茎环产物累积，步骤1b和3a突出的3'末段产物茎环间结合加延一个引物长度或与3b茎环产物间结合加延二个引物长度，循环扩增＞2ⁿ或3ⁿ—4ⁿ额外增加放大倍数。

本发明“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”模板、引物设计原则：选取一段长约100-200bp样本特异序列作为待扩增模板，远离模板(其上下游1-数个引物距离)两端各选17-23个核苷酸碱基特异序列作为外替换引物对；模板两端各选18-24个核苷酸碱基长度作为模板扩增引物对；5'端选有意义链为上游引物序列，3'端取反意义链为下游引物序列；完整或稍短下游引物反意义链置于上游引物序列5'端前面作为上游嵌合引物，上游引物序列置于下游引物序列5'端前面作为下游嵌合引物。模板引物间序列40-60碱基长度形成茎环的成环效率最高，其分成左右两段序列17-22个碱基作为内替换引物，左段即上游嵌合引物侧选反意义链和右段即下游嵌合引物侧取有意义链且两者可分开至5'端重叠10个左右碱基，内替换引物3'末端距离嵌合引物间隔2-3个碱基以上。并且遵从一般引物设计普通原则，须特别注意：(1)所有引物3'末端间不能有2base或2base碱基以上的连续反向互补,尤其是最末至倒数第2个碱基；(2)引物的3'末端碱基尽可能使每个引物的3'最末碱基为A/AC结尾特别嵌合引物A/AA尾,即不能选强“错配”多的NNGC或NNCG末端(所谓GC/CG夹),亦不能为特异性差的T结尾，或重复双GG/TT结尾；(3)嵌合引物5'端选取或增加1-2个T便于嵌合引物链接处A-T配对具备有一定柔韧性；(4)G+C含量应在40％-60％,4种碱基分布/配要均匀,避免出现4个以上碱基同一重复、和序列简单重复的二级结构。

恒温扩增基本配方反应：纯化样本热变性处理，取纯化核酸20-40μL于EP管加反应缓冲液10X buffer0.5μL,10-20μM嵌合引物Fas、Rsa和5μM两侧外替换引物各0.5-1μL置95℃水浴5分钟后快速冰浴退火；配制及加反应试剂，每个200μL PCR反应管底先加入1.2-2.5μM正反内替换引物各0.5μL和10-40μM上下游嵌合引物各1.0μL混合含10％蔗糖共3μL于管底缓释，于PCR管近管底加5X反应混合液mix包括10mM dNTP2.0μL、100mM MgSO₄2.0μL、10XBst buffer 5μL、Bst polymerase 1-2μL混合液,和12.5M甜菜碱4μL；沿管壁中部加钙黄绿素及氯化锰(1.2-2mM︰12-20mM)2μL染料(或反应后补加SYBR Green/Eva Green)，水dH₂O20-10μL沿管壁冲下，于PCR管管壁近上部加10-20μL变性样本，阴性对照品和阳性对照品于平行对照管，加样吸头采用过滤芯吸头，每一管换一吸头；立即依次加10μL硅油和40μL矿物油双层封闭，瞬时离心；置60℃—65℃水/金属浴反应30-50分钟，停止反应80℃灭活5-10分钟。阳性可视显绿色，或不用钙黄绿素而补加SYBR Green/Eva Green染料于70℃—80℃荧光计读取荧光值，样本管荧光值较空白管值高2倍以上为阳性。由于SYBR Green/EvaGreen荧光染料结合DNA双链部分地干扰或阻碍链替换及聚合反应，使恒温扩增产物定量不确定和不准确，反应后加SYBR Green/Eva Green染料不干扰恒温扩增。

为防交叉污染，超敏的恒温扩增检测在闭管密封前，反应液一加完即刻开始扩增而造成气雾胶交叉污染，可将嵌合引物与替换引物加入重比重10％糖于管底缓释，反应待油封密闭后热混匀启动有助于消除交叉污染。同时加矿物油时溅起反应液于油面或管壁上的扩增泄露也是交叉污染源，先加少量硅油而不易溅起反应液再加多些矿物油双层封闭，即使“漏网”溅起液因引物对缓释而缺少反应完全成分，结果是无效扩增和无扩增气雾胶。同时加热盖可灭活气化的酶分子。

由于几何级数的恐怖放大倍数，所有PCR指数扩增产物都存在交叉再污染扩增问题，小分子产物还包括纯化靶分子尤其定量标准品质粒气雾胶容易交叉污染PCR试剂，放置的纯化水也易融溶气雾胶分子，并随冰箱长期冻存而污染难以杜绝。为防止这类产物气雾胶交叉污染，配制试剂和PCR操作必须于无菌、无核酸物理隔离空间，以及必要的主动防污染措施包括采用部分或全部dUTP底物代替dTTP生成含dU产物，PCR系统加入大肠杆菌UDG酶预消化可能污染的dU产物后热灭活。恒温扩增一般没有引物聚合体或引物二聚体产物污染，但恒温扩增还存在一加完试剂反应就立即启动，未封闭前就开始出现靶产物蒸发泄露风险。本专利内替换引物是启动恒温扩增反应关键成分，加引物含重比重10％蔗糖液预先加入PCR反应管底，分层缓释—65℃热混匀启动恒温扩增反应，启动前产生没有扩增或无效扩增气雾胶，加样后尽快加硅油和矿物油两层密闭，硅矿油层不影响光路传输或荧光强度。

本发明“一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法”，所使用PCR引物、常规寡核苷酸由生工生物工程(上海)有限公司合成，所使用甜菜碱、钙黄绿素试剂和底物dNTPs包括dUTP亦购自生工生物工程(上海)有限公司，Bst聚合酶、E.Coli UDG和限制内切酶购自NEB(北京)公司，荧光染料SYBR GreenⅠ购自Invitrogen公司；化学试剂购自中国化学试剂公司/网；荧光光度计产自西安天隆科技有限公司，荧光PCR仪器使用SLAN-96P(上海宏石医疗科技有限公司)。

现场批量样本检测操作：

每个样本分别热变性处理，取纯化核酸20—40μL置于1.5ml EP管加10X反应缓冲buffer0.5μL,10μM嵌合引物Fas、Rsa和5μM外替换引物dF、dR各0.5—1μL置95℃水浴5分钟后快速冰浴退火待测。

以下试剂配方为批量放大配制方法，以放大10次为计算倍数，以便于一组10倍、100倍试验反应液集中配制。缓释嵌合、内引物含重比重10％蔗糖，分别先反应液加入PCR管管底；其中配方上下游嵌合引物、dNTP、Mg²⁺、Bst、和10×buffer混一起等于5×倍浓缩的反应混合液。再每管加5X反应混合液mix10μL、甜菜碱4μL、钙黄绿素染料及氯化锰“1.5mM︰15mM”共2μL(或后加SYBR Green/Eva Green荧光染料)、dH₂O 10μL、加20μL变性样本/逆转录DNA，立即依次加10μL硅油和40μL矿物油双层封闭，瞬时离心。

批量反应液按下表比列放大配方：

置60℃—65℃恒温金属浴、水浴扩增30-60分钟，停止反应80℃灭活5-10分钟，反应产物经浊度、染料、或荧光检测，核酸结合SYBR Green荧光于65℃及以上读荧光值较空白管值高2倍以上为阳性、如加钙黄绿素染料经白光及荧光显色由黄色转变为绿色或绿色荧光为阳性。

采用恒温扩增操作程序测试双向链替换环循环的扩增验证及效果：

一、嵌合引物与多对替换引物长时间恒温扩增无非特异性：

在没有加入反应模板前，测试恒温扩增系统荧光结合本底和无模板系统空白反应荧光值，采用以下实施例多对恒温扩增系统引物，乙型肝炎病毒HBV嵌合引物对HBFas/HBRsa与外替换引物对HBdF/HBdR和内替换引物HBIF/HBIR恒温扩增系统系统；结核分枝杆菌TB嵌合引物对TBFas/TBRsa与外替换引物对TBdF/TBdR和内替换引物TBIF/TBIR恒温扩增系统系统；和两者嵌合引物对与两者替换引物对相互交换的两组错乱配伍的引物系统。

没有任何双链DNA和没有扩增情况下，过量高浓度引物加染料或荧光染料于室温及40℃以下时单链引物乱配也结合大量荧光染料使荧光吸收值接近于高浓双链DNA情况，于50℃—60℃引物结合荧光染料使荧光读值减少一半，于70℃—87℃引物及长嵌合引物结合荧光染料很少使其荧光值最低，恒温扩增产物荧光结合检测适合65℃—85℃读取荧光值而避开了引物染色本底干扰。

四组恒温扩增系统在不加模板，加外替换引物和内替换引物、10μL反应5X混合液(嵌合引物、dNTP、Bst、10Xbuffer混一起)、2μL染料、30μLdH₂O、最后加硅油及矿物油，闭盖并瞬时离心后本底扩增，常规操作引物浓度和4倍过量引物系统，长时间置63℃金属浴反应30分钟、60分钟、2小时、5小时、12小时、24小时、两天后80℃变性10分钟，于70℃读取荧光值恒定不增加，荧光值变异明显小于一倍(50％以内)，没有引物非特异性扩增。

试验得出两大结论：

(1)恒温扩增产物荧光检测不能常温下进行，其产物荧光结合检测适合70℃—85℃读取荧光值而引物染色本底干扰最少。

(2)恒温扩增系统一大优点：一般没有热循环扩增的引物间二聚体、聚合体和引物-探针聚合体非特异性、假阳性反应以及小分子聚合体气雾胶交叉污染。

二、不同浓度模板需要不同浓度引物：

多聚酶链反应PCR依赖过量引物碰撞、结合量稀少的靶模板分子并指数扩增，引物序列自然延为新生复制链5'端部分，引物量往往比放大亿万倍的产物还要多数十至上百倍。过浓的待扩模板并不需要如此过量的引物，但极低浓度靶模板分子为保证每次有效碰撞、结合到一对引物分子而能够维持指数扩增，引物就必须具有一定过量的浓度。恒温扩增反应条件与引物需求还不同于热循环PCR反应，本专利灵敏度超过LAMP等恒温扩增技术或接近SYBR Green实时荧光定量PCR最高灵敏度，需要测试从单个靶分子至常规靶浓度测量窗口的最适引物浓度范围。

采用乙型肝炎病毒HBV核酸实时荧光定量检测盒作为定量标准，嵌合引物终浓度40μM(终浓度0.8μM)及成比例10μM替换引物作等比稀释梯度，不同梯度引物恒温扩增检测乙肝病毒HBV核心抗原C基因克隆质粒pHBc(0.1μg/ml)为模板作10×(倍)稀释系列梯度标I(0.1μg/ml×10^-1)、和×10^-7标VII。用pUC₁₉稀释的1μL标VII恒温30分钟扩增结果见下表：

绝对量3-5拷贝模板时嵌合引物0.2μM已够但离反应边界太近，0.4μM—0.8μM范围更佳。

三、倍比稀释法数字定量恒温扩增：

由于恒温扩增不好控制或监测反应循环数，只有用反应时间长短来间接指示循环数。同时，我们又追求恒温扩增极致效率，传统实时扩增荧光曲线难以于数分钟内精确定量。恒温扩增定量检验还需要另一条稀释定量法/数字化定量思路，即通过样本倍比稀释靶分子直至无靶分子反应再算稀释倍数的倍比稀释定量方法；样本稀释、分散至大量的微型分隔单元使理论上每检测单元含0-1个靶分子，通过扩增检测分散单元有核酸扩增产生荧光信号，没有核酸扩增而无荧光信号，根据稀释比例和反应单元体积，推算出原始溶液的核酸浓度，通过计数及泊松分布统计，实现起始DNA模板的绝对定量。

采用乙型肝炎病毒HBV核酸实时荧光定量检测盒作为辅助定量方法，恒温扩增或采用钙黄绿素与锰离子结合产物焦磷酸根经荧光显色，绿色为阳性、橙黄色为阴性。HBV质粒pHBc(0.05μg/ml)用pUC₁₉为稀释液作10X连续稀释梯度，实时荧光定量检测开始无模板的第8、第9梯度全部稀释液用来平行重复恒温扩增，结果梯度第1-7全部阳性，梯度第10以后仅1管出现弱阳性余阴性，梯度第8、第9全部平行重复检测少部分阳性、大部分阴性。结论是进一步采用大规模微囊数字定量恒温扩增方法将更加精确可行。

附图说明:

图1.原理卡通图，粗黑条线代表上游引物有意义链；齿状细线为下游引物反意义链，细齿线连粗黑条代表上游嵌合引物Fas，粗黑条连细齿线代表下游嵌合引物Rsa，箭头为3'末端及延伸方向；双细灰线示意嵌合引物间有意义链和单细灰线为反意义链及IF/IR代表内替换引物。一对引物5'前端添加对侧引物序列的嵌合引物对，其首端与引物对延伸链自身互补区成茎环结构，与环部分结合的内替换引物启动茎环结构结合多对嵌合引物，内替换引物与外侧嵌合引物双向链替换出成倍茎环指数循环扩增。

图2.质粒梯度灵敏度：5分钟时标I阳性，10分钟时标II—标III阳性，20分钟时标I—标VI全阳性，最迟30分钟标VII阳性，大部分扩增发生于20-30分钟左右，用于定性。

图3.结核灭活样本阳性实时荧光检测结果。

具体实施例：

一.乙型肝炎病毒(HBV)恒温扩增检测：

乙型病毒性肝炎(简称乙肝)由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染的一种世界性III类传染性疾病，据世界卫生组织WHO报道全球约20亿人携带乙肝病毒。我国人群中乙肝感染率非常高(近10％)，主要由肝炎病毒引发的肝癌已位列肿瘤首位，极大的危害了人民的身体健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法5项/7项、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增(PCR)荧光定量法等。传统酶免疫法应用较广，但灵敏度不足；实时荧光PCR定量和数字定量PCR法可以精确测定乙型肝炎病人的病毒载量,对感染者病毒复制水平的判断,病情传染性及抗病毒药物疗效监测具有无法替代的重要作用。核酸扩增目标区域大多选择乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)S区一段保守序列和HBV C区一段保守序列；我们将HBV C区一段序列(nt:1901-2497)克隆至pUC₁₉载体质粒pHBc(MW 2.1×10⁶)作为乙型肝炎病毒阳性对照序列。

HBV核心抗原C区作为模板引物：

选取HBV(NC-003977)C型core保守区nt2271—2480作为恒温扩增模板序列如下：

模板两端各选18-24个核苷酸碱基长度作为模板扩增引物对；5'端选序列有意义链

为上游引物序列，3'端序列/>

取反意义链gagat tgagatcttc tgcgac为下游引物序列；完整下游引物反意义链置于上游引物序列5'端前面作为上游嵌合引物Fas，5'稍短上游引物序列置于下游引物序列5'端前面作为下游嵌合引物Rsa；

HBFas:

HBRsa:

远离模板(其上下游1-数个引物距离)两端各选17-23个核苷酸碱基特异序列作为外替换引物,选上游有意义链为dF、下游tccctt ggactcataa ggtg反意义链为dR；

HBdF:5'-ttcg cactcctccc gctta-3'

HBdR:5'-caccttatgagtccaaggga-3'

模板引物间选取一段序列为内替换引物，其分成左右两段序列17-22个碱基作为内替换引物，左段即上游嵌合引物侧tag aagaagaact ccctcgc选反意义链gcgagggagttcttctt cta为反向内替换引物，右段即下游嵌合引物侧取有意义链gcctc gcagacgaag gtc为正向内替换引物，内替换引物3'末端距离嵌合引物间隔2-3个碱基以上。

HBIF:5'-gcctc gcagacgaag gtc-3'

HBIR:5'-gcgaggg agttcttctt cta-3'

检测操作：

(1)血清标本DNA提取：

微磁珠方法：采用盐酸胍/异硫氰酸胍裂解，核酸样本在高浓度4M胍盐及高碘化纳条件下结合至聚苯乙烯微磁球硅烷化表面羟基(Melzak et al,1996)，用小于pH6.0的异丙醇缓冲液洗涤，使用pH8.5或大于pH8.5洗脱溶液溶解洗脱。﹙微磁球结合-纯化法及自动化微磁球提取法已经越来越多地取代酚-氯仿抽提液体方法和硅吸附膜离心柱方法)。

取血清100μL于1.5mLEP管中，加等体积的胍盐裂解液5分钟，加0.8mL稀释中和盐液后再加25μL顺磁纳米硅化微球结合，将试管置于磁分离试管架吸附固定磁微球，弃液后，加0.8mL洗液洗涤固定磁微球两次，最后磁微球加50μL洗脱液收集纯化DNA。

(2)恒温检测对比标准实时荧光PCR反应：

纯化样本或质粒标准品热变性处理，核酸溶液20—40μL置于1.5ml EP管加10X反应缓冲液buffer 0.5μL,10μM嵌合引物Fas、Rsa和5μM外替换引物dF、dR各0.5—1μL置95℃水浴5分钟后快速冰浴退火待测；缓释引物Fas、Rsa和IF、IR含重比重10％蔗糖3μL，先反应液加入PCR管管底；批量反应液按以下简表快速配制N个/次单PCR反应混合液(×N代表单次乘上所有PCR反应管数目或总检测数目)。依次每管加缓释引物、10μL反应5X混合液(dNTP、MgSO₄、Bst、10Xbuffer混一起)、4μL甜菜碱、2μL染料、20μLdH₂O、分别加标I-标VI样品10μL变性质粒，最后加硅油及矿物油，闭盖并瞬时离心后扩增。

每个样本平行5个反应，60℃温浴反应50分钟，于5、10、20、30、50分钟取1支加SYBRGreen置于西安天隆科技公司带温控荧光光度计，于80℃灭活并测荧光读值。

乙肝病毒HBV数个阳性、阴性血清DNA，和HBV核心抗原C基因克隆质粒pHBc(0.1μg/ml)为模板作10×(倍)稀释系列梯度标I(0.1μg/ml×10^-1)、×10^-2、×10^-3、×10^-4、×10^-5、×10^-6、×10^-7标VII。采用乙肝病毒HBV核酸实时荧光定量检测盒注册试剂(CFDA注册证：国械注准20153402086)检测7个标准品10倍稀释曲线浓度梯度对应Ct值16.0、19.3、22.6、26.0、29.5、33.0、37.0作为对比，本专利恒温50分钟扩增结果与注册试剂阳性、阴性全部一致，梯度灵敏度检测：5分钟时标I阳性，荧光值600左右；10分钟时标II—标III阳性，荧光值1200-1500；20分钟时标I—标VI全阳性，荧光值1800左右；最迟30分钟标VII阳性。恒温扩增梯度扩增荧光值见附图2，大部分可见扩增发生于20-30分钟左右，目前定量线性关系不好，主要用于定性。

二.结核杆菌恒温扩增检测:

结核分枝杆菌(TB)简称结核杆菌，为结核病的病源菌。全球约有1/3(30％)人口感染了结核分枝杆菌，有2000万活动性肺结核病患者，每年新发病例900万人，每秒钟有1人感染结核，每年有300万人死于结核病。随着社会发展、营养改善，接种卡介苗和抗结核药物的进步，结核发病与死亡率一度大幅度减低；但20世纪80年代后，由于艾滋病和结核杆菌耐药株的出现，免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化，结核病再次成为威胁人类健康的主要传染病。常用的免疫血清法检测结核菌又因广泛接种卡介苗(减毒活菌)免疫使检测假阳性和大量漏检而不可靠，结核杆菌培养检测和核酸扩增检测成为主要诊断方法而具有不可替代的控制结核传染作用。结核杆菌插入序列如IS6110在结核基因组中重复序列1～20个拷贝数，选择插入序列检测有助于提高目标核酸扩增检测敏感性，而恒温扩增检测有利于结核快速诊断。

选取结核杆菌TB(Accession X52471)IS6110nt480—662作为恒温扩增模板序列如下：

为上游引物序列，3'端序列/>

取反意义链gatcgctgatccg gccaca为下游引物序列；完整下游引物反意义链置于上游引物序列5'端前面作为上游嵌合引物Fas，稍短上游引物序列置于下游引物序列5'端前面作为下游嵌合引物Rsa；

TBFas:

TBRsa:

在离模板1-数个引物距离的上下游两端各选17-23个核苷酸碱基特异序列作为外替换引物,选上游有意义链为dF、下游tggtcc tgcgggcttt gc反意义链为dR；

TBdF:5'-c caggatcctg cgagcgta-3'

TBdR:5'-gc aaagcccgca ggacca-3'

模板引物间选取一段序列为内替换引物，其分成左右两段序列17-22个碱基作为内替换引物，左段即上游嵌合引物侧t cgacacatag gtgaggtct选反意义链agacctcacctatgtgtcg a为反向内替换引物，右段即下游嵌合引物侧取有意义链gtgaggtctg ctacccaca为正向内替换引物，内替换引物3'末端距离嵌合引物间隔2-3个碱基以上。

TBIF:5'-gtgaggtctg ctacccaca-3'

TBIR:5'-agacctcac ctatgtgtcg a-3'

检测操作：

⑴痰液标本结核杆菌DNA提取：

痰阳性菌是结核病主要传染源，因此痰菌检测是发现结核病和评价疗效的首选。生理盐水漱口后弃第一口痰，痰液标本中加入2倍体积4％NaOH溶液，涡旋震荡，室温放置30min，液化后痰液0.5ml-1.0ml于1.5ml离心管中(避免吸出明显的固体杂质)，12000r/min，离心3min，弃上清取沉淀；向沉淀中加入1ml无菌生理盐水重悬沉淀，12000r/min，离心5min，弃上清取沉淀；重复盐水洗涤1次，沉淀采用以上的异硫氰酸胍裂解-微磁珠法核酸提取。最安全简便方法是痰液标本经120℃高压灭菌20分钟，12000r/min，离心5min，取上清的结核菌裂解完全，核酸释放充分而高压裂解液可直接扩增检测，回收率100％。

(2)灭活结核杆菌恒温检测反应：

纯化样本或克隆质粒标准品热变性处理，核酸溶液20—40μL置于1.5ml EP管加10X反应缓冲液buffer 0.5μL,10μM嵌合引物Fas、Rsa和5μM外替换引物dF、dR各0.5—1μL置95℃水浴5分钟后快速冰浴退火待测；缓释引物Fas、Rsa和IF、IR含重比重10％蔗糖3μL，先反应液加入PCR管管底；批量反应液按以下简表快速配制N个/次单PCR反应混合液(×N代表单次乘上所有PCR反应管数目或总检测数目)。依次每管加缓释引物、10μL反应5X混合液(dNTP、MgSO₄、Bst、10Xbuffer混一起)、2μL染料、20μLdH₂O、分别加标I-标VI样品10μL变性质粒，最后加硅油及矿物油，闭盖并瞬时离心后扩增。

由于SYBR Green/Eva Green荧光染料结合DNA双链部分地干扰或阻碍链替换及聚合反应，使恒温扩增产物定量不确定和不准确。甜菜碱可有效地使DNA双链65℃时部分处于解链状态但过量甜菜碱使DNA结合染料也减少，终浓度0.5M甜菜碱时预加SYBR Green，63℃温浴反应50分钟，每1分钟68℃ 15秒测一次荧光读值，可以部分地实时荧光检测但荧光值低大半；而预加钙黄绿素与锰离子使形成焦磷酸锰和钙黄绿素荧光显色而不影响DNA链替换反应及聚合扩增，反应液显绿色为阳性、橙黄色为阴性。

采用台湾贝索Baso公司提供的灭活样本部分实时荧光检测结果见附图3，和克隆质粒pIS6110(0.1μg/ml)模板梯度标I(0.1μg/ml×10^-1)、×10^-2、×10^-3、×10^-4、×10^-5、×10^-6、×10^-7标VII。本专利恒温30分钟扩增结果与实时荧光PCR阳性、阴性全部一致，梯度灵敏度检测：较本底2倍以上荧光值为阳性，5分钟时标I阳性，10分钟时标II—标III阳性，20分钟时标I—标VI全阳性，最迟30分钟标VII阳性。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海市坤元科技有限公司

<120> 一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 209

<212> DNA

<213> 乙型肝炎病毒HBV基因部分序列

<400> 1

tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc 60

cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc 120

gcagacgaag gtccaatcgc cgcgtcgcag aagatctcaa tctcgggaat ctcaatgtta 180

gtatcccttg gactcataag gtgggaaac 209

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagattgaga tcttctgcga ccaaatgccc ctatcttatc a 41

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcccctatc ttatcagaga ttgagatctt ctgcgac 37

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcgcactcc tcccgctta 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caccttatga gtccaaggga 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcctcgcaga cgaaggtc 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgagggagt tcttcttcta 20

<210> 8

<211> 183

<212> DNA

<213> >结核杆菌TB基因部分序列

<400> 8

ccaggatcct gcgagcgtag gcgtcggtga caaaggccac gtaggcgaac cctgcccagg 60

tcgacacata ggtgaggtct gctacccaca gccggttagg tgctggtggt ccgaagcggc 120

gctggacgag atcggcggga cgggctgtgg ccggatcagc gatcgtggtc ctgcgggctt 180

tgc 183

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gatcgctgat ccggccacac gtcggtgaca aaggccac 38

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agtgacaaag gccacgatcg ctgatccggc caca 34

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccaggatcct gcgagcgta 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcaaagcccg caggacca 18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtgaggtctg ctacccaca 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agacctcacc tatgtgtcga 20

Claims

1.一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：一种利用DNA茎环突出环部分恒温就能结合引物和产物茎环预设多个引物结合位点的环循环扩增策略；

选取一段长80bp至200bp样本特异基因序列作为待扩增核酸模板，所述待扩增核酸模板两端各选不长于25个核苷酸碱基序列作为模板扩增引物对，远离所述待扩增核酸模板的上下游两外侧为外替换引物，所述模板扩增引物间序列反向设置为内替换引物；

所述模板扩增引物对的5'端选有意义链为正向上游引物序列，3'端取反意义链为反向下游引物序列；所述的下游引物5'→3'预加于上游引物序列5'端前面作为上游嵌合引物，上游引物序列预加于下游引物序列5'端前面作为下游嵌合引物，而使一对嵌合引物复制链有多个引物结合位点，所述嵌合引物复制链被所述外替换引物延伸替换出模板复制单链，新生的所述复制单链首端预加序列与自身互补区成茎环结构；引物嵌合的长度至少为14bp；

所述上游嵌合引物和所述下游嵌合引物均为嵌合引物，其中一个所述嵌合引物的预加序列5'短1-7b碱基，且嵌合引物3'端选A尾以便于产物配对U被UDG灭活污染，反应引物终浓度0.1µM—1.6µM；

再用嵌合引物间的所述内替换引物结合环延伸后替换出茎环的嵌合引物区而露出两个及以上多引物结合位点，随后多个嵌合引物结合延伸链被5'外侧引物延伸后替换出成倍单链而形成子代茎环，内外双向链替换所述茎环使茎环指数循环，经恒温金属浴、水浴扩增，反应产物经浊度、染料、或荧光检测，核酸结合荧光于65℃及以上读值、染料经白光及紫外显色，

所述双向链替换环循环扩增反应过程如下：

1）嵌合引物序列自然延为新生单链5'端部分，嵌合引物5'首端预加序列与新生单链自身的模板引物的配对区因链内碰撞优势而先于引物形成链内返折结合的茎环结构，新链首端预加序列与延伸的模板引物配对区形成茎和模板引物间的序列成为环单链环部分；

2）具有一系列多引物结合位点的茎环，其环单链不用热变性先配对结合内替换引物，通过链替换聚合酶催化延伸至5'茎部而游离露出原茎环的3'茎部即多个嵌合引物位点，恒温结合成倍嵌合引物；

3）所述茎环的3'茎部配对结合多个嵌合引物，中间两个及以上多个嵌合引物复制新链被5'最外侧嵌合引物延伸替换出成倍子代茎环，且每次替换会先合成一双链，子代茎环又重复第1）步第2）步进入指数循环并以2ⁿ级数增加；反应后期更长柄的茎环结合更多嵌合引物而又＞2ⁿ额外增加放大。

2.根据权利要求1所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：远离模板1至数个模板引物距离的上下游两侧各选17-23个核苷酸碱基特异序列作为外替换引物对，5'端选有意义链为上游外替换引物序列，3'端取反意义链为下游外替换引物序列，外替换引物延伸合成双链后替换出其3'下游的引物合成新链为单链，引物终浓度0.025µM—0.2µM。

3.根据权利要求1所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：选取模板引物间序列40-60碱基长度以使形成茎环的成环效率最高，其分成左右各17-22个碱基两段序列或中间0-10个碱基重叠的两段序列作为内替换引物，左段即上游嵌合引物侧选反意义链为反向内替换引物，右段即下游嵌合引物侧取有意义链为正向内替换引物，内替换引物3'末端距离嵌合引物间隔2个碱基至20个碱基，引物终浓度0.012µM—0.1µM。

4.根据权利要求1所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：恒温扩增反应扩增引物和内外替换引物遵从一般引物设计普通原则：

1) 所有引物3'末端间不能有2base或2base碱基以上的连续反向互补,尤其是最末至倒数第2个碱基；

2）引物的3'末端碱基尽可能使每个引物的3'最末碱基为A/AC结尾特别嵌合引物A/AA尾,即不能选强“错配”多的NNGC或NNCG末端,亦不能为特异性差的T结尾，或重复双GG/TT结尾；

4)G+C含量应在40%-60%,4种碱基分布/配要均匀,避免出现4个以上碱基同一重复、和序列简单重复的二级结构。

5.根据权利要求1所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：防止扩增产物分子气雾胶交叉污染反应试剂，采取主动防污染措施包括使用部分至全部dUTP底物代替dTTP生成含dU产物，PCR试剂成分/各组份加0.2%-2%v/v大肠杆菌UDG酶预消化可能污染的dU产物后热灭活。

6.根据权利要求1所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：核酸恒温扩增反应采用具有链替换功能的耐热聚合酶、逆转录和替换聚合酶包括Bst、Bca、phi29聚合酶。

7. 根据权利要求1所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：核酸恒温扩增反应产物检测使用浊度仪,染料钙黄绿素、羟基萘酚蓝，荧光染料SYBR Green、Eva-Green染料。

8.根据权利要求1所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：核酸恒温扩增反应体积10µL-100µL可单管200µLPCR管、96孔板，和人工配制、机器自动化配制。

9.根据权利要求1所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：

扩增操作步骤如下：

1）于EP管加纯化核酸20-40µL，反应缓冲液10X buffer0.5µL,10-20µM上下游嵌合引物和5µM两侧外替换引物各0.5-1µL置95℃金属浴5分钟后快速冰浴退火；

2）每个PCR反应管底先加入1.2-2.5µM正反内替换引物各0.5µL和10-40µM上下游嵌合引物各1.0µL混合含10%蔗糖3µL于管底缓慢释放-热启动反应；

3）于PCR管近管底加5X反应混合液mix包括10mM dNTP2.0µL、100mM MgSO₄2.0µL、10XBst buffer 5µL、Bst polymerase 1-2µL 混合液,和12.5M甜菜碱2-4µL；

4）沿管壁中部加钙黄绿素及氯化锰2µL染料，水dH₂O 20-10µL沿管壁冲下，其中所述钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1.2-2mM︰12-20 mM；

5）于PCR管管壁近上部加10-20µL变性样本，阴性对照品和阳性对照品于平行对照管，加样吸头采用过滤芯吸头，每一管换一吸头；

6）尽快、依次加10µL硅油和40µL矿物油双层封闭，瞬时离心，

10.根据权利要求1所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：使用物理空间隔离的密闭独立配液、加样、扩增室，于独立配液室混合PCR试剂成分/组分,并在分隔的加样室进行样本DNA纯化及加样,加样使用过滤芯吸头及用后丢入5%次氯酸钠废液内，实验室定期用纯的1-2%次氯酸钠消化、70%酒精清洁后使用，实验前后用紫外灯和臭氧轮换消毒。

11.根据权利要求1所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：应用样本倍比稀释单元检测定量数字PCR，扩增检测分散单元有核酸扩增产生荧光信号，没有核酸扩增而无荧光信号，根据稀释比例和反应单元体积，推算出原始溶液的核酸浓度，通过计数及泊松分布统计，实现起始核酸模板的绝对定量。

12.根据权利要求1-11任一项所述的一种双向链替换环循环的核酸恒温扩增法，其特征在于：其方法应用于核酸检测试剂盒，盒成份包括：样本核酸提取试剂，dNTPs及dUTP，Bst酶及其缓冲液，嵌合引物和内外替换引物，甜菜碱，钙黄绿素染料、SYBR Green I， eUDG酶预加入各PCR成分/组分，化学法处理水无污染dH₂O，硅油和矿物油。