CN111662357A - 一种石杉型三萜类化合物及其提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的石杉型三萜类化合物及其提取方法，并提供其在制备治疗临床类风湿性关节炎的药物中的应用。具体方案为：一种石杉型三萜类化合物，结构式如下所示：

其中，R₁选自αOH、H；R₂选自O、αOH；R₃选自H、OH、CH₃；R₄选自CH₃、CH₂OH、CH₂OCOCH₃；R₅选自βOH、H；R₆选自CH₃、CH₂OH；R₇选自αH、βH。本发明提供的石杉型三萜类化合物，在抗炎方面具有明显积极的效果，为抗类风湿性关节炎先导化合物的发现提供了一种新的思路。

Description

一种石杉型三萜类化合物及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及一种新的石杉型三萜类化合物及其提取方法，并提供其在制备治疗临床类风湿性关节炎的药物中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(RA)是以滑膜增生和骨侵蚀为主要特征的自身免疫病的一种，早期表现为关节游走性疼痛和功能障碍，晚期则表现为关节僵硬、畸形，具有发病广泛、病程长、致残率高、不易治愈等特点，是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要病因之一；并且RA患者的死亡率明显高于健康人群，且呈现心血管和其他全身并发症，已成为21世纪影响人类健康的突出问题。

然而，RA的发病机制过于复杂，目前多认为该病为自身免疫性疾病，多种免疫细胞、免疫因子参与其中。TNF-α属肿瘤坏死因子，在RA的发病中居于核心位置，是一种促炎性细胞因子，主要由滑膜巨噬细胞产生，可加重中性粒细胞的炎性反应，是RA产生和持续的关键因子，在RA的局部滑膜炎症、血管翳的生成和组织损伤中都发挥着重要作用。NF-κB家族蛋白包括：NF-κB2 p52/p100、NF-κB1 p50/p105、c-Rel、RelA/p65和RelB。一般状态下NF-κB与其抑制蛋白IκB结合不发挥作用，当激活因子如TNF-α、IL-17等细胞因子存在时，在IκB激酶(IκB kinases，IKKs)的作用下，IκB被磷酸化、泛素化、最后被酶降解，IκB降解后，转录因子NF-κB的入核信号暴露，随即进入细胞核开始转录过程。NF-κB信号通路的激活可导致T细胞活化从而介导炎症反应，还可以诱导RA-FLS异常增殖，激发破骨细胞增殖与活化，其结果导致关节畸形、骨侵蚀，从而加重RA的病情。NF-κB信号通路产生的免疫产物(TNF-α、IL-17、IL-6等)同时可以再次激活NF-κB信号通路，这种正反馈作用的存在使得NF-κB信号通路处于一直被激活的状态。COX-2是一个重要的促炎症反应酶，是前列腺素E2(PGE2)合成过程中一个重要的限速酶，由其介导分解花生四烯酸(AA)生成代谢产物PGE2。PGE2是重要的炎症调节因子，参与炎症反应、骨形成与骨吸收过程，最终引起炎细胞浸润、滑膜组织异常增生、新生血管血管翳形成，导致关节肿胀、退变[6]。IL-6是趋化因子家族成员之一，其主要由单核巨噬细胞、血管内皮细胞等生成，其作用靶细胞较多，是B细胞分化因子是一种具有复杂生理功能的细胞因子。单核细胞在炎症的刺激下产生大量的IL-6，IL-6与其受体相结合，经过多次分化后形成的结合体会影响酪氨酸蛋白激酶1、2，最终导致患者体内释放大量TNF-α、IL-17等细胞因子，诱发关节炎。此外，VINAY等提到IL-6还能增强TNF-α的效应，被认为是TNF-α某些生物效应的放大因子。一氧化氮(NO)是一种简单而不稳定的自由基，NO在正常情况下含量很少，主要由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化产生。而一氧化氮合酶根据表达方式的不同可以分为结构型(constitutive nitrie oxides synthase，cNOS)和诱导型(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，正常细胞中几乎不含有iNOS，但在炎症、缺氧以及肿瘤等病理状态下会有所表达，随后短时间内大量催化诱导型NO的生成。NO参与许多生理和病理过程，巨噬细胞在IL-1、IL-2、TNF、IFN等细胞因子和内毒素(如LPS)的诱导下可以产生大量的NO，同时NO上调又可以使巨噬细胞释放炎症性细胞因子，如TNF-α、IL-1和γ-IFN等。这些因子对机体既起到介导炎症的作用，又起到细胞生长分化的调节作用。巨噬细胞在细胞内、外环境变化时可通过NO产生免疫保护、免疫损伤和免疫调节作用。因此，研究人员公认NO是判断炎症反应的非常合适的指标。

目前认为，TNF-α启动了RA细胞因子的级联反应(Cytokinecascade)，引起关节组织病变。巨噬细胞分泌的IL-1和TNF-α刺激滑膜成纤维细胞增殖并分泌IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、IL-8和其它因子等，这些都会造成关节的损伤。这些细胞因子还能活化环境中的巨噬细胞，促进RA细胞因子生成，在成纤维细胞和巨噬细胞之间形成正反馈循环，使滑膜炎症进一步恶化。一些新发现的细胞因子如IL-18、IL-15也参与了这个正反馈循环。有研究认为，IL-1和TNF-α能激活iNOS，产生大量NO，在炎症反应的许多细胞活动中发挥作用。同时NO又能诱导产生TNF-α，从而形成正反馈循环，使前炎症(Pro-inflammatory)细胞因子的分泌以及其自身的表达得以持续。而在佐剂诱导的鼠关节炎中，亚硝酸盐和硝酸盐浓度上升先于其它症状的发生，说明在炎症反应中，NO的诱导生成有可能发生在其它细胞因子响应之前。原因可能在于巨噬细胞在关节炎发生时受到刺激，产生NO以杀死外源性异物，如果刺激持续，NO浓度继续升高，到一定程度则诱导巨噬细胞产生IL-1和TNF-α，引起细胞因子生成的恶性循环，产生骨和软骨破坏。NO还在多个环节参与环氧化酶-2(COX-2)的表达，促进滑膜增生等。

目前治疗RA的药物可分为4类，第一类为非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)如塞来昔布、罗非昔布等；第二类为改善病情抗风湿药(disease modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)如氨甲蝶呤(MTX)、来氟米特等；第三类为糖皮质激素类(GCS)如地塞米松、氢化可的松等；第四类为单抗类药物如依那昔普、阿达木单抗等。研究表明这些药物在抑制RA病情恶化的同时，各种胃肠道、肝肾、心脑血管等副作用尤为突出，且其治疗RA短期效果较为显著，但长期效果不尽人意。生物制剂的疗效虽然得到肯定，但依然有不少不良反应报道，尤其是感染和肿瘤方面，且生物制剂费用高昂，一般患者根本无法承受，如成本最低的英夫利昔单抗联合氨甲蝶呤治疗RA的费用就已达到了21.5万元/年。

传统中医理论认为RA属“痹症”范畴，最早记载《黄帝内经·素问·痹论》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹”，后《杂病源流犀烛·诸痹源流》曰：“痹者，闭也，三气杂至，壅闭经络，气血不行不能随时祛散，故久而为痹”。中医将“痹症”病因归结为内伤、外感及痰瘀互结，体内气血、肝脾肾等亏虚，加之风寒湿热等外邪入侵，注于经络，留于关节，痹阻气血而发病，病久可加重内虚而致痰淤闭阻，旧病新邪胶着使疾病缠绵难愈。中药在治疗RA方面具有悠久的历史，相比西药，其优势在于中医药治疗RA能有效减少患者痛苦，改善西药治疗的依赖性，减少对身体的伤害，显著提高患者预后生存质量。

大量文献报道表明中药在治疗RA方面具有显著的疗效，常见的用于治疗RA的中药多达两百余种，包括雷公藤、青风藤、柴胡、白芍、伸筋草、马钱子、独活、川乌等等，复方更是多达近四百种。它们可以下调炎性细胞因子(TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10、PGE2、NO等)的表达，缓解炎症；抑制成纤维样滑膜细胞(FLS)的增殖，进而减少滑膜组织增生；抑制人软骨细胞的降解和软骨的退化，阻止骨关节的破坏，可见中药治疗具有多途径、多层次、多靶点的特点。

三萜类化合物是自然界中一类十分重要的化合物，具有广泛的生理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗菌、镇痛等作用。雷公藤中的三萜类物质主要有雷公藤红素、雷公藤内酯甲和去甲泽拉木醛，雷公藤红素又称南蛇藤素，是治疗类风湿病雷公藤片、雷公藤多甙片等制剂的有效成分之一。袁凯发现雷公藤红素能够显著抑制中性粒细胞TNF-a、IL-6等炎症因子的分泌，增加促调亡蛋白表达，减少ERK蛋白的磷酸化，增加caspase-3的活化，从而促进中性粒细胞的调亡，改善炎症。去甲泽拉木醛能通过抑制T细胞的转化，主要是抑制淋巴细胞白介素2(IL-2)的生成和释放，降低IL-2的受体活性而起作用的，其可能是具有高免疫抑制性，低骨髓抑制的药物。七叶莲总三萜能降低促炎因子IL-1β，TNF-α，IL-6的分泌，提高抗炎因子IL-10的表达水平，抑制C-反应蛋白(CRP)，免疫循环复合物(CIC)，皮质醇(Cor)的产生，起到免疫抑制的作用。齐墩果酸及其相关联的三萜类化合物为公认的抗炎症药和免疫抑制药，由于它们能减少相关的细胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，而且能抑制C3转化酶作用补体激活经典途径。茯苓总三萜可能是茯苓抗炎的主要有效成分之一，其作用机制可能与抑制磷脂酶A2活性有关。柴胡皂苷不仅能显著抑制NF-κB的表达和激活，也抑制MAPK通路中的p38和ERK1/2的磷酸化激活，抑制炎症因子的表达，起到抗炎的作用。这些都表明，三萜类化合物很有可能是发挥抗炎活性的药效物质基础。

石松科植物是我国传统中药，具有祛风除湿和舒筋活络的功效，主要用于治疗关节酸痛，屈伸不利。全科全球分布共9属，我国有6属，分别为石松属(Lycopodium)、垂穗石松属(Palhinhaea)、扁枝石松属(Diphasiastrum)、藤石松属(Lycopodiastrun.Holub)、小石松属(Lyeopodlella.Holub)、拟小石松属(Pseudolycopodiella)[34]。石松入药伸筋草，扁枝石松入药过江龙，玉柏石松入药玉柏，藤石松入药舒筋草。其中伸筋草是药典收载的品种，得到广泛研究。现代药理学研究表明，石松科植物主要含有生物碱、三萜类、黄酮及苯丙素类等成分。目前，石松科植物的研究主要集中于石松生物碱以及它们的神经生物学活性；针对藤石松、伸筋草抗炎活性的研究甚少，针对扁枝石松和垂穗石松抗炎活性的研究几乎没有。有文献研究表明，藤石松总生物碱可降低佐剂关节炎大鼠滑膜细胞血清中TNF-α，IL-6和PGE2的水平；伸筋草乙醇提取物和水液对类风湿性关节炎和骨质疏松均有一定的治疗作用，石杉型三萜山芝烯二醇能促进成骨细胞的成骨活性，可治疗骨折、骨质疏松，Ara Jo等研究发现，从伸筋草中分离得到的石杉型三萜能够通过抑制ERK通路和NF-κB通路，降低iNOS和COX-2的表达，减少炎症因子NO、PEG2、IL-1β、IL-8的含量，从而起到缓解炎症的作用。但目前对于石松科植物的研究还多集中于简单粗提物和萃取物，对石杉型三萜抗炎机制的研究还远远滞后，这严重制约了其更为科学、广泛的临床应用和创新药物研发，亟需进一步研究和阐明。

发明内容

本发明目的在于提供石杉型三萜类化合物及其提取方法和在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种石杉型三萜类化合物，结构式如下所示：

其中，R₁选自αOH、H；R₂选自O、αOH；R₃选自H、OH、CH₃；R₄选自CH₃、CH₂OH、CH₂OCOCH₃；R₅选自βOH、H；R₆选自CH₃、CH₂OH；R₇选自αH、βH。

优选的，所述石杉型三萜类化合物，结构式如下所示：

本发明还提供了从扁枝石松提取上述石杉型三萜类化合物的方法，包括以下步骤：

S1、将扁枝石松用乙醇加热回流提取，浓缩得浸膏；

S2、将浸膏用水分散，用乙酸乙酯萃取，并将萃取液浓缩，得乙酸乙酯萃取浓缩液；

S3、采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对乙酸乙酯萃取浓缩液进行分析及分离纯化；

具体为，S3中，乙酸乙酯部位部位经硅胶柱层析CH2Cl2∶CH3OH(100∶1-0∶100)梯度洗脱，10％EtOH-H2SO4对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，浓缩合并得到8个部位(A-H)；

A-H部位TLC薄层分析，10％H₂SO₄-EtOH加热显色，其中Fr.E薄层板显示紫红色条带，HPLC-DAD分析主要为α，β不饱和羰基，初步确定E部位为三萜类富集部位；

首先对Fr.E采用聚酰胺柱色谱，去除色素，鞣质等干扰性成分，接着采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备液相进一步对E部位进行分离纯化。经硅胶柱层CH₂Cl₂∶CH₃OH(100∶1-0∶100)得FrE1-4；FrE2经硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和半制备液相得化合物1、2，FrE3经硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和半制备液相得化合物3、4、5、10，FrE4经硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备液相得化合物11、12。

优选地，S1中，扁枝石松经过干燥粉碎处理。

优选地，S1中，乙醇的浓度为70％，扁枝石松质量与乙醇的比值为1∶6-15，加热的温度为120℃，加热的时间为2h，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为2-3天。

优选地，S1中，扁枝石松质量与乙醇的比值为1∶10。

本发明还提供了上述石杉型三萜类化合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种结构新颖的三萜类化合物，其在抗炎方面具有明显积极的效果，为抗RA先导化合物的发现提供了一种新的思路。

附图说明

图1表示化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞存活率的影响；

图2表示化合物对LPS诱导RAW264.7细胞NO含量的影响；

图3表示大鼠踝关节组织形态学观察结果。

具体实施方式

以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

化合物的提纯

1.1扁枝石松药材处理

扁枝石松干草(15Kg)，粉碎后用70％乙醇120℃加热回流提取(150L；2×2h)，60℃浓缩得浸膏，浓缩时间为2天。浸膏进一步用水分散，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每次15L，萃取3次，萃取液60℃浓缩，浓缩时间为24小时，分别得不同极性部位的萃取浓缩液。

1.2活性部位的分离与纯化

运用大孔树脂、聚酰胺、硅胶、HW-40C凝胶、Sephadex LH-20凝胶及PrepHPLC、PrepTLC等现代色谱分离技术对活性部位进行系统的化学成分研究。根据石杉型三萜类化合物的特征UV吸收和TLC显色反应，采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法进行追踪、分析及分离纯化。乙酸乙酯部位经硅胶柱层析CH2Cl2∶CH3OH(100∶1-0∶100)梯度洗脱，10％H2SO4-EtOH对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，浓缩合并得到8个部位(A-H)；A-H部位TLC薄层分析，10％H2SO4-EtOH加热显色，其中Fr.E薄层板显示紫红色条带，HPLC-DAD分析主要为α，β不饱和羰基，初步确定E部位为三萜类富集部位；首先对Fr.E采用聚酰胺柱色谱，去除色素，鞣质等干扰性成分，接着采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备液相进一步对E部位进行分离纯化。经硅胶柱层CH2Cl2∶CH3OH(100∶1-0∶100)得FrE1-4；FrE2经硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析和半制备液相得化合物1、2、6，FrE3经硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析和半制备液相得化合物3、4、5、8、10，FrE4经硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备液相得化合物7、9、11、12。正丁醇部位经大孔树脂(HPD-100)柱层析，乙醇-水体系梯度(0∶100-95∶100/v∶v)，浓缩合并得6个部位(A-F)；A-F部位TLC薄层分析，10％H2SO4-EtOH加热显色，其中Fr.D薄层板显示紫红色条带，HPLC-DAD分析主要为α，β不饱和羰基，初步确定D部位为三萜类富集部位；D部位经HW-40C凝胶柱层析(甲醇∶水0∶100-100∶0)得FrD1-5，FrD3部位经HW-40C凝胶柱层析和半制备液相得化合物15、16，FrD4部位经HW-40C凝胶柱层析和半制备液相得化合物13、14。

1.3结构确证

运用UV、IR、NMR、MS、CD、ORD、ECD及单晶X-rays等现代光谱技术确证各化合物的平面结构和立体构型，进行谱学表征和光谱数据的系统归属。鉴定后16个石杉型三萜的结构如下：

其中：

化合物1：白色无定形粉末，易溶于甲醇，不溶于水；-89.2

(c 0.2，MeOH)；UV(ACN-H₂O)λmax：248nm；and¹H and¹³C NMR(CDCl₃)见(表1和表2)；HRESIMS m/z 459.3468[M+H]⁺。

化合物2：白色无定形粉末，易溶于甲醇，不溶于水；-94.1

(c 0.2，MeOH)；UV(ACN-H₂O)λmax：248nm；and¹H and¹³C NMR(CDCl₃)见(表1和表2)；HRESIMS m/z 457.3313[M+H]⁺。

化合物3：白色无定形粉末，易溶于甲醇，不溶于水；-65.7

(c 0.1，MeOH)；UV(ACN-H2O)λmax：248nm；and 1H and 13C NMR(CD3OD)见(表1和表2)；HRESIMS m/z475.3423[M+H]⁺。

化合物4：白色无定形粉末，易溶于甲醇，不溶于水；-44.8

(c 0.2，MeOH)；UV(ACN-H₂O)λmax：248nm；and¹H and¹³C NMR(DMSO-d₆)见(表1和表2)；HRESIMS m/z 475.3424[M+H]⁺。

化合物5：白色无定形粉末，易溶于甲醇，不溶于水；+26.4

(c 0.2，MeOH)；UV(ACN-H₂O)λmax：248nm；and¹H and¹³C NMR(CD₃OD)见(表1和表2)；HRESIMS m/z 531.3684[M+H]⁺。

化合物10：白色无定形粉末，易溶于甲醇，不溶于水；+19.5

(c 0.1，MeOH)；UV(ACN-H₂O)λmax：260nm；and¹H and¹³C NMR(Pyridine-d₅)见(表1和表2)；HRESIMS m/z489.3580[M+H]⁺。

化合物11：白色无定形粉末，易溶于甲醇，不溶于水；+63.7

(c 0.1，MeOH)；UV(ACN-H₂O)λmax：260nm；and¹H and¹³C NMR(Pyridine-d₅)见(表1和表2)；HRESIMS m/z505.3512[M+H]⁺。

化合物12：白色无定形粉末，易溶于甲醇，不溶于水；+35.9

(c 0.1，MeOH)；UV(ACN-H₂O)λmax：260nm；and¹H and¹³C NMR(Pyridine-d₅)见(表1和表2)；HRESIMS m/z505.3522[M+H]⁺。

表1 化合物1-5和10-12的¹H NMR数据(500MHz)(δ_Hin ppm，J in Hz)

^a氘代氯仿

^b氘代甲醇

^c氘代二甲基亚砜

^d氘代吡啶

表2 化合物1-5和10-12的¹³C NMR数据(125MHz)(δ_Hin ppm)

^a氘代氯仿

^b氘代甲醇

^c氘代二甲基亚砜

^d氘代吡啶

实施例2

石杉型三萜对LPS诱导的RAW264.7细胞活性的影响

试验过程为：

(1)细胞铺板

收集处于对数生长期细胞，完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至合适浓度(20000/well)，接种至96孔板，每孔加90μl细胞悬液，于37℃、5％CO2条件下孵育12h。

(2)细胞给药

待细胞贴壁稳定后，每孔加入LPS溶液(终浓度1ug/ml)，然后每孔依次加入10μl对应3个梯度浓度的工作液(确保终浓度为100μM、50μM、25μM)，然后于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h；同时设立不加化合物加LPS的模型对照组(LPS组)和既不加LPS也不加化合物的空白对照组。

(3)吸光度测定

每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml)，继续孵育4h，吸出培养液，然后每孔加入100μlDMSO溶液，放置培养箱15min，再用酶标仪于490nm下进行检测，记录吸光度，计算细胞存活率。

(4)数据处理

细胞存活率＝(Vsample-Vblank)/(Vvehicle control-Vblank)×100％。其中Vsample为给药组(或模型对照组)的吸光度，Vvehicle control为空白对照组的吸光度，Vblank为背景孔的平均值，用Graph Pad Prism 7统计软件对数据进行分析、作图。

如图1所示，化合物2、5、12在100uM时对RAW264.7细胞表现出细胞毒性，但所有化合物在25M、50uM均未表现出细胞毒性，因此选取50uM浓度进行NO含量检测。

实施例3

石杉型三萜对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO含量的影响

具体试验过程为：

(1)细胞铺板

收集处于对数生长期细胞，完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至合适浓度(20000/well)，接种至96孔板，每孔加90μl细胞悬液，于37℃、5％CO2条件下孵育12h。

(2)细胞给药

待细胞贴壁稳定后，每孔加入LPS溶液(终浓度1ug/ml)，然后每孔依次加入10μl工作液(确保终浓度为50μM)，然后于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h；同时设立不加化合物加LPS的模型对照组(LPS组)和既不加LPS也不加化合物的空白对照组。

(3)吸光度测定

给药后24小时后，每孔吸取50uL上清液，转移至新的96孔板中，加入等量的Griess试剂1和Griess试剂2，再用酶标仪于540nm下进行检测，记录吸光度，计算NO含量。

(4)数据处理

NO含量计算：首先根据NO试剂盒说明书，制作出NO含量标准曲线，然后根据该曲线，将测得的吸光度值代入，求出不同吸光度所对应的NO含量，用Graph Pad Prism 7统计软件对数据进行分析、作图。

如图2所示，正常对照组NO含量0.7±0.1μM，LPS模型组NO含量18.3±0.9μM。在50uM时，所有化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞均有减少NO产生的作用，尤其是化合物2、4、5、11、12，NO含量均降低至50％及以下，其次是化合物13-16，NO抑制率在50％-60％之间，其中化合物2作用效果与阳性药吲哚美辛(Indo)相当。并且，新化合物除1、3、10外，其他新化合物抑制NO产生的作用明显高于已知化合物6-9，这表明石杉型三萜这类化合物具有很好的抗炎作用。

新化合物2、4、5、11、12均表现出较强的对LPS诱导的RAW.264.7细胞分泌NO的抑制作用，NO含量均在50％以下，其中化合物2的抑制作用与阳性药物吲哚美辛效果相当；而来源于正丁醇部位新化合物13-16对NO的抑制作用次之，NO含量降至50％-60％之间。由此推测乙酸乙酯部位抗炎活性最好，很有可能与所含石杉型三萜数量较多有关，而石杉型三萜可能是通过抑制NO产生，发挥改善抗类风湿性关节炎的作用，这丰富了潜在的一氧化氮合酶抑制剂种类，同时也为后面深入的分子作用机制研究提供思路与方向。

实施例4

佐剂性关节炎(AA)大鼠模型是一种经典的免疫性炎症模型，其病理改变为滑膜下组织炎症、滑膜增生、血管翳形成、软骨破坏，与RA患者的关节组织病理学变化相似。

以塞来昔布为对照药，采用AA模型进一步评价新的单体化合物Comp.2、4、5、11、12与已知化合物6、7的抗炎消肿作用，评价其抗RA活性。

试验过程如下：

(1)对足趾容积的影响：分别于动物造模前、分组前以及给药第7、14、21天后用足趾容积仪测定左后及右后肢两侧的体积。每次平行测定两次取平均值，当两次测量差值超出均值的±10％范围，进行第三次测量，弃去超范围值，再取平均值(大鼠足趾肿胀度＝致炎后体积-致炎前体积)。结果见表3。

(2)对关节液中炎症因子的影响：末次给药后次日，腹腔注射10％水合氯醛300mg/kg麻醉，自大鼠踝关节后方横切，暴露左侧踝关节，打开关节腔，用注射器抽取5mL生理盐水分多次冲洗踝关节腔，收集冲洗液，并将踝关节放置于冲洗液中再次浸泡1h，将浸泡液3000rpm离心10min，取上清液，用ELISA试剂盒检测类风湿因子RF、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)、环氧酶2(COX-2)和细胞因子κB(NF-κB)。结果见表3-4和图3。

表3 单体化合物对AA大鼠左后侧足趾肿胀度的影响(单位：Δml，

)

注：与模型对照组比较，+P＜0.05，++P＜0.01。

结果显示，石杉型三萜类化合物均能改善AA大鼠足趾肿胀度，但新化合物2、4、5、11、12活性好于已知化合物6、7。

表4 单体化合物对AA大鼠关节液中炎症因子的影响(

n＝6)

注：与正常对照组比较++P＜0.01；与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

结果显示，相对于已知化合物，新化合物降低炎症因子的水平要好于已知化合物。

以塞来昔布为对照药，采用AA模型进一步评价体外活性明显的3个单体化合物Comp.2、4、5抗炎消肿作用，评价石杉型三萜类成分抗RA作用。

大鼠踝关节组织形态学观察结果表明：正常对照组大鼠滑膜组织由1～2层FLSs细胞构成，细胞排列整齐，无增生现象，无充血水肿。关节结构完整，表面有完整的软骨构成，表面光滑，软骨与骨组织连接紧密，关节腔无渗出。模型对照组大鼠滑膜组织重度增生，FLSs细胞水肿、排列紊乱，呈短绒毛状或指突状深入关节腔内，有大量炎细胞及纤维母细胞浸润，其内见较多毛细血管。阳性对照药组大鼠滑膜组织轻度增生，细胞排列整齐，滑膜组织中可见少量扩张毛细血管及散在炎性细胞。化合物2组大鼠滑膜组织见小灶性增生，大部分滑膜排列较均匀，可见滑膜下层血管数量增多，扩张充血，并有炎性细胞浸润。化合物4组大鼠滑膜组织轻度增生，细胞排列整齐，滑膜组织中可见少量扩张毛细血管及散在炎性细胞。Comp.5组大鼠滑膜组织轻度增生，细胞排列整齐，滑膜组织中仅少量分散的炎性细胞，炎症明显改善。综合各实验组踝关节组织形态变化学结果，与模型对照组相比，阳性药组的炎症情况明显减轻。总体而言，化合物2、4、5组与阳性药组效果相差不大。

上述实验结果进一步表明，化合物2、4、5具有较显著的抗炎消肿活性，显示出很好的抗RA作用。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims (6)

1.一种石杉型三萜类化合物，其特征在于，结构式如下所示：

其中， R₁选自αOH、H； R₂选自O、αOH；R₃选自H、OH、CH₃；R₄选自CH₃、CH₂OH、CH₂OCOCH₃；R₅选自βOH、H；R₆选自CH₃、CH₂OH；R₇选自αH、βH。

2.根据权利要求1所述的石杉型三萜类化合物，其特征在于，结构式如下所示：

。

3.一种从扁枝石松提取如权利要求2所述的石杉型三萜类化合物的方法，包括以下步骤：

S1、将扁枝石松用乙醇加热回流提取，浓缩得浸膏；

S2、将浸膏用水分散，用乙酸乙酯萃取，并将萃取液浓缩，得乙酸乙酯萃取浓缩液；

S3、采用HPLC-DAD、TLC和UPLC-MS/MS方法对乙酸乙酯萃取浓缩液进行分析及分离纯化；

所述步骤S3中，乙酸乙酯部位经硅胶柱层析CH₂Cl₂ : CH₃OH (100:1-0:100) 梯度洗脱，10% EtOH-H₂SO₄对TLC斑点进行显色，不同波段的紫外灯下观察及HPLC-DAD对样品进行分析，浓缩合并得到8个部位 (A-H)；

A-H部位TLC薄层分析，10% H₂SO₄-EtOH加热显色，其中Fr.E薄层板显示紫红色条带，HPLC-DAD分析主要为α,β不饱和羰基，初步确定E部位为三萜类富集部位；

对Fr.E采用聚酰胺柱色谱，去除色素，鞣质等干扰性成分，接着采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备液相进一步对E部位进行分离纯化；

经硅胶柱层CH₂Cl₂:CH₃OH(100:1-0:100)得FrE1-4; FrE2经硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和半制备液相得化合物1、2，FrE3经硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和半制备液相得化合物3、4、5、10，FrE4经硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备液相得化合物11、12。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1中，青钱柳叶经过干燥粉碎处理。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1中，乙醇的浓度为70%，扁枝石松质量与乙醇的比值为1:6-15，加热的温度为100℃，加热的时间为2h，浓缩的温度为60℃，浓缩的时间为2-3天。

6.权利要求1或2所述的石杉型三萜类化合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

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