CN111656194A - Tnbc划分和治疗的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于诊断和/或治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的新亚型的方法，以及可用于此类方法的组合物和试剂盒。

Description

TNBC划分和治疗的方法和组合物
技术领域
本文提供可用于确定和/或治疗特定的乳腺癌亚型，尤其是三阴性乳腺癌的方法，以及可用于此类方法的组合物和试剂盒。
背景技术
在女性中，乳腺癌是最常见的肿瘤类型之一，其是导致癌症死亡的第5种最常见疾病。由于乳腺癌具有异质性，其10年无进展生存率随乳腺癌所处的发展阶段和乳腺癌的不同亚型而变化，从98％至10％。不同类型乳腺癌之间具有明显不同的生物学特性和临床表现。所以，对乳腺癌病人进行分型是决定其采取何种治疗方案的重要环节。例如，目前临床上主要通过乳腺癌标志物的免疫组织化学染色和乳腺癌进展程度进行分型，通常会考察乳腺癌样品中激素受体(雌激素ER和孕激素PR)以及人表皮生长因子受体HER2(ErbB2)的表达情况，因为现有的乳腺癌治疗药物绝大多数是靶向激素受体和HER2发挥作用的。ER和PR是核受体(主要分布在细胞核内，少量存在与细胞膜上)。针对ER、PR的小分子抑制剂现在已经被开发出来。人表皮生长因子受体HER2是一个定位于细胞膜上的受体，目前临床上也已经开发出了靶向HER2的抗体药物用于治疗。HER2是EGFR家族(还包括HER1(EGFR)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4))中唯一不能自己单独结合活性配体的成员。只能通过与其他EGFR家族成员如HER3形成异元二聚体来发挥功能。对于雌激素受体表达的乳腺癌(雌激素受体阳性，或ER+肿瘤)能够用雌激素激素受体的拮抗剂如他莫昔芬进行治疗。同理，诊断为HER2高表达的乳腺癌则能够用抗HER2的抗体(如trastuzumab)或HER2激活的受体酪氨酸激酶抑制剂(如lapatinib)进行治疗。
三阴性乳腺癌(TNBC)是用来统称一类具有明确的临床定义的乳腺癌亚型。通常占乳腺癌总病例的15％。三阴性乳腺癌是(通过传统的免疫组织化学染色和评判)ER、PR表达阴性、不表达扩增水平的HER2(即它们是ER-、PR-，HER2-)的乳腺癌。三阴性乳腺癌一般属于(但不绝对)一类分子和组织形态上不同的乳腺癌亚型-基底样(basal-like，BL)亚型。BL亚型乳腺癌的特点是表达一些特定的角蛋白(如CK，CK5/6，CK14，CK17)和一些其他乳腺基底/肌上皮细胞表达的蛋白。然而，除BL亚型外，特定其他亚型的乳腺癌，包括一些正常乳腺样癌、分化癌、腺癌和唾液腺样癌也会表现出三阴的表型。此外，TNBC在携带BRCA1突变的人群及绝经前的非裔、西班牙裔的美国人中更易出现。三阴性肿瘤通常表现出比其他乳腺癌亚型更高的恶性程度，具有更低的复发后生存率以及更低的整体生存率。
由于TNBC细胞中缺少激素受体的表达或显著量的HER2，用于治疗这类乳腺癌的方法非常有限。因为这类肿瘤不会响应靶向ER(如他莫昔芬，芳香化酶抑制剂)或HER2的药物(如trastuzumab)。一般临床上只能采用传统的辅助化疗或新辅助化疗方法，治疗效果不佳并且具有很强的毒副作用。此外，一些化疗方法会导致肿瘤对药物的抗性，使得三阴性乳腺癌在治疗后3年内的复发风险高于其他亚型的乳腺癌。
以下总结了四种乳腺癌亚型目前可使用的靶向治疗药物。很显然，现在迫切需要深入了解三阴性乳腺癌发生的分子基础，特别是寻找生物标记物和治疗靶点，以及开发治疗这一类恶性程度高的乳腺癌的药物。
Figure GDA0002610533020000021
发明内容
本文提供了确定、诊断和/或治疗三阴性乳腺癌(例如肿瘤)的特定亚型的方法，以及可用于此类方法的药物组合物。所述方法和组合物至少部分是基于如下令人惊讶的发现：PROCR水平在所有TNBC的约50％中上调并与之相关，此处被称为“PROCR+TNBC”或“高PROCR(PROCR-high)的TNBC”。相应地，PROCR阴性或低PROCR的TNBC被称为“四阴性乳腺癌”或“QNBC”。此处还披露了抑制或压制PROCR活性(例如PROC结合)以及抑制PROCR+TNBC细胞的生长的PROCR拮抗或中和抗体。因此，本文中公开的抗PROCR抗体或其抗原结合片段可用于PROCR+TNBC的诊断和/或治疗。
一方面，本文提供蛋白C受体(PROCR)，用于诊断和/或治疗高PROCR三阴性乳腺癌(TNBC)，其中检测PROCR表达水平的免疫组化分析中H分数(H-Score)至少为120表明存在高PROCR的TNBC。可以使用本领域已知的常规方法来生成用于免疫组化的多克隆和单克隆抗体。可以按照本领域已知的方法直接或间接标记抗体以促进检测。在某些实施方案中，免疫组化分析使用了抗PROCR抗体或其抗原结合片段。例如，抗PROCR抗体可选自以下组成的组：(i)SEQ ID NO:1-3和11-22中的任何一个，或其抗原结合片段；(ii)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与(i)交叉竞争结合PROCR；(iii)抗体，所述抗体具有选自含SEQ ID NO:1-3和11-22的CDR中的CDR1，CDR2和CDR3；和(iv)抗体或其抗原结合片段，其中抗体与(iii)交叉竞争结合PROCR。
本文还提供了一种抗PROCR抗体，或其抗原结合片段，用于对高PROCR的TNBC进行诊断和/或治疗，其中当抗PROCR抗体或其抗原结合片段用于免疫组化分析以检测PROCR的表达水平时，至少120的H分数表示存在高PROCR的TNBC。抗体可选自以下组成的组：(i)SEQID NO:1-3和11-22中的任何一个，或其抗原结合片段；(ii)抗体或其抗原结合片段，其中抗体与(i)交叉竞争结合PROCR；(iii)抗体，所述抗体含有选自SEQ ID NO:4和7的CDR1，选自SEQ ID NO:5、8和9的CDR2，选自SEQ ID NO:6和10的CDR3；和(iv)抗体或其抗原结合片段，其中抗体与(iii)交叉竞争结合PROCR。
在另一方面，本文提供分离的抗PROCR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与SEQ ID NO:1-3和11-22中的任一交叉竞争结合PROCR。
在进一步方面，本文涉及用于诊断高PROCR的TNBC的试剂盒，该试剂盒包含以下一项或多项：(i)SEQ ID NO:1-3和11-22中的任何一个，或其抗原结合片段；(ii)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与(i)交叉竞争结合PROCR；(iii)抗体，所述抗体具有选自含SEQID NO:1-3和11-22的CDR中的CDR1，CDR2和CDR3；和(iv)抗体或其抗原结合片段，其中抗体与(iii)交叉竞争结合PROCR。
另一方面涉及用于制备药物的PROCR抑制剂，所述药物用于：(1)治疗高PROCR的TNBC，(2)抑制高PROCR的TNBC细胞的生长，(3)减少高PROCR的TNBC细胞的转移，和/或(4)抑制高PROCR的TNBC细胞的上皮间充质转化(EMT)；其中PROCR抑制剂选自以下组成的组：(i)SEQ ID NO:1-3和11-22中的任何一个，或其抗原结合片段；(ii)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与(i)交叉竞争结合PROCR；(iii)抗体，所述抗体具有选自含SEQ ID NO:1-3和11-22的CDR中的CDR1，CDR2和CDR3；和(iv)抗体或其抗原结合片段，其中抗体与(iii)交叉竞争结合PROCR。
本文还提供一种用于治疗高PROCR的TNBC的药物组合物，包含本文公开的PROCR抑制剂和药学上可接受的载体。还包括本文公开的PROCR抑制剂在制备用于治疗高PROCR的TNBC的药物中的应用。另一个方面涉及抑制高PROCR的TNBC细胞的生长、转移和/或EMT的方法，该方法包括以有效量的本文公开的PROCR抑制剂接触所述细胞。
附图说明
图1.Procr对乳腺干细胞(MaSC)和基底细胞命运至关重要
(a)图示了Procr flox的构建，两个LoxP位点插入分别插在外显子2-4的两侧。
(b)在乳腺发育阶段条件性敲除Procr的策略。对两周龄处在青春期前的雌性小鼠每隔1天腹腔注射他莫昔芬，共三次注射。在小鼠八周龄时收取乳腺。全乳腺Carmine染色表明Procr条件敲除ProcrCreER/Flox(cKO)的小鼠乳腺发育出现了停滞。标尺＝1mm。
(c-d)在乳腺自稳态维持阶段条件性敲除Procr的策略。对八周龄处在成年期的母鼠每隔1天腹腔注射他莫昔芬，共三次注射。在小鼠十一周龄时收取乳腺。全乳腺共聚焦成像(c)和流式细胞统计(d)表明cKO乳腺基底细胞与对照组相比明显减少。在(d)中，基底细胞被K14标记；在(c)中基底细胞为Lin-，CD24+，CD29hi的细胞群。标尺＝50μm。
图2.Procr标记了基底样亚型中的肿瘤干细胞
(a)Procr+基底细胞(Lin-，CD24+，CD29hi，Procr+)和Procr-基底细胞(Lin-，CD24+，CD29hi，Procr-)分离自MMTV-Wnt1/FVB肿瘤。并分别进行不同梯度稀释后移植到FVB小鼠的乳腺脂肪垫中。Procr+基底细胞能很好的形成肿瘤，肿瘤干细胞频率为1/45；而Procr-基底细胞不能形成肿瘤。***<0.001
(b-c)Procr+细胞(Lin-，CD24+，CD29hi，Procr+)和Procr-细胞(Lin-，CD24+，CD29hi，Procr-)分离自MMTV-PyVT小鼠肿瘤(b)或MMTV-Cre；Brca1f/+；p53f/+肿瘤(c)。并分别进行不同梯度稀释后移植到裸鼠的乳腺脂肪垫中。两群细胞在成瘤效率上没有明显差别。ns p>0.1
(d)在MMTV-Wnt1成瘤前动物的乳腺中进行Procr+细胞谱系示踪的实验设计。8周龄时注射他莫昔芬，分别在短期(2天)和长期(6个月)追踪后收取成瘤前乳腺组织或肿瘤进行分析。
(e-f)切片成像表明在注射他莫昔芬两天后，单个的基底细胞被mGFP标记(箭头)。基底细胞被K14标记(e)。管腔细胞被K8标记(f)。
(g-i)切片成像表明，在谱系示踪6个月后，肿瘤中的GFP+细胞能扩增形成克隆。基底细胞被K14标记(g)。管腔细胞被K8标记(h)。统计切片中的GFP+细胞表明经过6个月的谱系示踪，切片中GFP+细胞的百分比明显上升(i)。
(j-o)在MMTV-Wnt1肿瘤中进行Procr+细胞谱系示踪的实验设计(j)。切片成像表明在TAM注射两天后，单个的Procr+细胞能被mGFP的表达标记(k-l)。经过3周谱系示踪后，切片免疫染色显示GFP+细胞的扩增(m-n)。统计切片中的GFP+细胞表明经过3周的谱系示踪，GFP+细胞的比例明显上升(i)。图中所有标尺均代表20μm。
图3.PROCR在一半三阴性乳腺癌中高表达并且能够标记这类亚群的肿瘤干细胞
(a)代表性的图片显示人非癌乳腺组织中PROCR和角蛋白14(K14)免疫染色。标尺在低倍图中代表20μm，在放大图中代表5μm。
(b)流式细胞分析人非癌乳腺组织(n＝4个病人)显示PROCR在约3％基底细胞中表达。
(c)在组织芯片中进行免疫组织化学染色测定PROCR表达情况。该组织芯片包括71个非瘤，99个管腔A肿瘤，105个管腔B肿瘤，90个Her2肿瘤和149个三阴性乳腺癌样品。图中显示了代表性的阴性(score 0)，弱阳性(score 1)，中等强度(score 2)和强阳性(score3)染色。PROCR低表达的样品包括score 0和score 1的病例；PROCR高表达的样品包括score2和score 3的病例。标尺在低倍图中代表200μm；在放大图中代表50μm。
(d)根据免疫组织化学染色得分统计分析PROCR表达。大部分非肿瘤乳腺组织、管腔A型，管腔B型和HER2阳性样品PROCR染色为弱阳性(score 1)或隐性(score 0)，而52.4％的三阴性乳腺癌样品表现为PROCR强阳性(score 2+score 3)。
(e-g)基于我们组织芯片样品进行的Kaplan-Meier无疾病生存分析。在三阴性乳腺癌病例中(e，141个病例)PROCR的表达与更差的预后相关。在激素受体阳性的乳腺癌(f，187个病例)和HER2富集的乳腺癌(g，87个病例)中，PROCR的表达与病人的预后无明显的相关性。
图4A.在PROCR+乳腺癌中，PROCR+细胞富集了肿瘤干细胞
(a)免疫组织化学染色显示PDX-1是ER-，PR-，HER2-，和PROCR-高表达。标尺代表100μm。
(b)流式细胞分析显示在PDX-1中，PROCR+上皮细胞(Lin-，Epcam+，PROCR+)占全部肿瘤上皮细胞(Lin-，Epcam+)的48.5±1.1％。
(c)流式细胞分析显示PDX-1中的PROCR+和PROCR-肿瘤细胞都是可分裂的，含有G2/M阶段细胞(4N)(左图)，而PROCR+细胞中处于4N阶段的细胞是PROCR-肿瘤细胞的1.9倍(右图)(c)。数据来自3次独立实验，并展示为平均值±标准差。**p<0.005。
(d)分离自PDX-1的PROCR+和PROCR-肿瘤细胞在体外培养时吸收了1小时EdU。左图为代表性的图。统计显示PROCR+细胞中被EdU标记的细胞是PROCR-中的2.6倍(右图)。标尺代表100μm。数据来自3次独立实验，并展示为平均值±标准差。***p<0.001。
(e)对分离自PDX-1的PROCR+和PROCR-肿瘤细胞进行Ki67染色。左图为代表性的图。统计显示PROCR+细胞中Ki67+细胞是PROCR-中的2.1倍(右图)。标尺代表100μm。数据来自3次独立实验，并展示为平均值±标准差。***p<0.001。
(f)对分离自PDX-1的PROCR+和PROCR-肿瘤细胞(Lin-，EpCam+)进行TUNEL凋亡信号染色，显示两种细胞中死亡细胞的比例无明显差别。标尺代表100μm.数据按平均值±标准差显示。p>0.05
(g)对分离自PDX-1的PROCR+和PROCR-肿瘤细胞进行梯度稀释后移植。PROCR+细胞容易形成肿瘤，而PROCR-细胞具有明显低的肿瘤形成能力。数据来自3次独立实验，并展示为平均值±标准差。***p<0.001。
(h)流式细胞分析移植PROCR+细胞长成的肿瘤，显示肿瘤中包含有PROCR+和PROCR-细胞，且细胞比例与前代PDX肿瘤一致。
(i)对PROCR+肿瘤细胞(Lin-，Epcam+，PROCR+)进行基因簇富集分析发现，相比于PROCR-肿瘤细胞(Lin-，Epcam+，PROCR-)，这群细胞富集了上皮间质转化1，Myc_靶基因2和乳腺干细胞标记基因3。
(j)对分离自PDX-1和PDX-2肿瘤的PROCR+和PROCR-肿瘤细胞进行热图分析。PROCR+肿瘤细胞E-cad水平(上皮特性基因)下降，间质特性基因表达上升。
(k)Western分析显示PROCR+肿瘤细胞的E-cad水平降低，且Slug和c-Myc水平升高。Tubulin作为上样对照。
图4B.在PROCR低表达的PDX肿瘤中(score1)，PROCR的表达不能用于区分肿瘤干细胞
(a)免疫组织化学染色显示PDX-4是PROCR-低表达。标尺代表100μm。
(b)流式细胞分析显示在PDX-4中，PROCR+上皮细胞(Lin-，Epcam+，PROCR+)占全部肿瘤上皮细胞(Lin-，Epcam+)的2.0±1.1％。
(c)对分离自PDX-4的PROCR+和PROCR-细胞进行梯度稀释后移植。PROCR+细胞和PROCR-细胞具有相同的肿瘤形成能力。数据来自3次独立实验，并展示为平均值±标准差。ns，不显著。
图5.抑制PROCR能阻止PROCR+乳腺癌PDX的肿瘤生长
(a-g)在PDX中通过sh RNA抑制PROCR的示意图。消化分离的PDX肿瘤细胞被scramble对照或sh-PROCR病毒感染，被病毒感染上的细胞能通过GFP标签进行分选，之后被移植到受体裸鼠中(a)。通过保留一部分被感染的细胞进行Western分析，确认在PDX-1(b)，PDX-2(d)和PDX-3(f)中，PROCR的敲低效率约为75％。感染后细胞形成的移植瘤显示PROCR的敲低阻止了PDX肿瘤的生长(b-g)。每组使用小鼠n＝4只或更多，数据展示为平均值±标准差。
(h-j)借助CRISPR系统抑制PROCR表达的示意图(h)。Western分析验证了PROCR的表达被KRAB抑制(i)。感染后细胞形成的移植瘤显示PROCR的敲低阻止了PDX-1肿瘤的形成(i，j)。每组使用小鼠n＝10只，数据展示为平均值±标准差。
图6.PROCR的抑制性纳米抗体能阻断PROCR+乳腺癌的生长。
(a)单结构域抗体的示意图，包含抗原结合的骆驼VHHs区(不包含轻链)和人的IgG。
(b-d)MDA-MB-231在用全细胞培养液培养时加入IgG或PROCR抑制性纳米抗体(200ug/ml)处理，并传代4次。每次传代时记录的细胞数目表明抗体能抑制细胞的分裂(b)。EdU插入实验(1小时)显示抗体能显著抑制细胞的分裂。TUNEL染色显示细胞的凋亡不受明显影响。数据来自3次独立实验，并展示为平均值±标准差。***p<0.001。
(e)在培养的MDA-MB-231细胞中，分别在纳米抗体处理8小时、12小时和16小时检测PROCR相关信号通路的活性。Western分析表明抗体在体外培养12小时和16小时时减弱了MDA-MB-231的Src和IGF-1R的磷酸化，同时也抑制了ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK通路的活性。该部分分析使用的细胞为同一批次的细胞并采用相同的上样量，所以只在该图最后展示了一次Tubulin作为上样量的对照。为了更好的展示，数据被分成了三列分别展示ERK，Akt和RhoA通路。
(f)在培养的MDA-MB-231细胞中，分别在纳米抗体处理8小时、12小时和16小时用Western检测EMT相关蛋白。纳米抗体在体外培养12小时和16小时时使E-cad水平升高，Vim，Slug和Zeb1的水平降低。
(g)在移植PDX肿瘤细胞后的5天、7天、10天、14天和19天分别对小鼠腹腔注射IgG或PROCR抑制性抗体(PROCR-单抗)(8mg/kg体重)(蓝色箭头)。肿瘤大小在注射PROCR抑制性抗体后被减小了约6倍。每组6只实验小鼠。数据展示为平均值±标准差。***p<0.001。用PDX-1和PDX-2也得到类似结果，见图14d-e。
(h)流式细胞分析显示在残留的肿瘤中，用PROCR纳米抗体处理组比对照IgG处理组PROCR+上皮细胞(Lin-，EpCam+，PROCR+)百分比显著降低(左图)。右图统计了PROCR+细胞比PROCR-的比值。数据来自3次独立实验，并展示为平均值±标准差。***p<0.001。
(i)对移植有PDX-1肿瘤(～200mm3)的小鼠腹腔注射paclitaxel和doxorubicin(PTX+DOX)或PROCR-单抗或二者同时注射。PTX+DOX的注射时间在移植后14天、20天和27天(PTX:20mg/kg，DOX:3mg/kg体重)(绿色箭头)；PROCR-单抗或IgG注射时间在移植后14天、17天、20天、24天、28天和32天(8mg/kg体重)(blue arrows)。肿瘤大小在注射PTX+DOX组降低了2倍，在注射PROCR-单抗组降低了3倍，在联用组降低了32倍。移植32天后，所有药物处理均撤去。继续测量记录肿瘤的大小(在撤去处理后)。肿瘤大小在撤去PTX/DOX处理后迅速增长(绿线)，这相反于撤去抗体处理(蓝线)或停止联合处理(黑线)增长缓慢。每个实验组有n＝10只或更多小鼠。数据展示为平均值±标准差。***p<0.001。
图7.基于PROCR表达的三阴性乳腺癌分型和靶向治疗的假想模型。
(a)基于PROCR的分型和靶向治疗的示意图。我们的数据提示三阴性乳腺癌能够依据PROCR的表达与否进一步分型。这些潜在的PROCR+乳腺癌亚群(PROCR-高表达的乳腺癌)占三阴性乳腺癌病例的一半。在PROCR+乳腺癌中，PROCR在肿瘤干细胞表面表达，并能被抑制性抗体靶向，进而抑制肿瘤干细胞的ERK，PI3K-Akt，RhoA通路并减低肿瘤干细胞的上皮间质转化特性，从而抑制肿瘤生长。
(b)人乳腺上皮系统的层级和PROCR+乳腺癌发生的示意模型。我们的假说认为，PROCR+乳腺癌可能起源于发生了遗传改变的乳腺干细胞。这些乳腺干细胞进而成为肿瘤干细胞支撑肿瘤的生长。
图8.Procr对乳腺干细胞和基底细胞的活性至关重要
(a)图示了利用同源重组策略进行Procr flox allele的构建。两个LoxP位点分别位于2-4外显子两侧。图中标注了基因型检测引物的位置。
(b)基因型检测PCR证明鼠仔1,2,7,8,9号为杂合子，而3,4,5,6号为野生型。
(c-d)在乳腺发育阶段条件性敲除Procr的策略。对4周龄处在青春期的雌性小鼠每隔1天腹腔注射他莫昔芬，共三次注射。在小鼠八周龄时收取乳腺(c)。全乳腺Carmine染色表明ProcrCreER/Flox(cKO)的小鼠乳腺发育在淋巴结(L.N.)处停滞。标尺＝1mm。
(e-f)在成年期乳腺中条件性敲除Procr的策略。对八周龄处在成年期的雌性小鼠每隔1天腹腔注射他莫昔芬，共三次注射。在小鼠十一周龄时收取乳腺(e)。全乳腺Carmine染色表明ProcrCreER/Flox(cKO)的乳腺侧分枝与对照组相比明显减少(f)。标尺＝2.5mm。
(g)定量PCR分析从对照组和cKO组乳腺中分离的基底细胞验证了Procr在cKO组成功敲除。
(h)移植实验的示意图。100个分离自对照组或Procr-cKO组乳腺的Lin-，CD24+，CD29hi，Procr+细胞被移植到3周裸鼠的乳腺脂肪垫中。在移植后2周或4周对小鼠注射他莫昔芬。在移植后9周分析移植后长出的乳腺。
(i)在移植后2周注射他莫昔芬的全乳腺carmine染色表明来自ProcrCreER/flox(cKO)组的乳腺生长更小(更少的乳腺脂肪垫被乳腺占满)。每组有6只小鼠，标尺＝1mm。
(j-k)在移植后4周注射他莫昔芬的全乳腺carmine染色表明来自ProcrCreER/flox(cKO)组的乳腺分枝异常。每组有6只小鼠，标尺＝1mm(j)。免疫染色表明，与对照组相比，cKO组长出的乳腺具有更少的基底细胞(K14+)。标尺＝50μm(k)。
图9.Procr能在MMTV-Wnt1乳腺肿瘤中标记肿瘤干细胞，但在MMTV-PyVT或MMTV-Cre；Brca1f/+；p53f/+乳腺肿瘤肿瘤中不能。
(a-c)流式分析显示了野生型乳腺、MMTV-Wnt1、MMTV-PyVT和MMTV-Cre；Brca1f/+；p53f/+肿瘤中Procr+细胞在基底细胞、管腔细胞和间质细胞中的分布(a)，只展示了三次相似试验中的一次。统计分析显示在普通组织对照(WT)中，Procr+基底细胞占全部基底细胞的2.5±0.9％。而在MMTV-Wnt1肿瘤中，Procr+基底细胞比例显著上升至8.1±1.1％。在MMTV-PyVT肿瘤和MMTV-Cre；Brca1f/+；p53f/+肿瘤中Procr+基底细胞比例下降至1.0±0.02％和1.3±0.1％(b)。Procr+细胞不存在于WT和两个肿瘤模型的管腔细胞中，且在WT和肿瘤的间质细胞中，Procr+细胞的百分比没有显著改变(c)。(b-c)中的数据来源于3次独立实验。***<0.001，*<0.05。
(d)FVB受体中MMTV-Wnt1/FVB肿瘤的生长的代表性图像。
(e-g)分离自MMTV-Wnt1/FVB肿瘤中的Procr+和Procr-基底细胞(2,000或10,000每只)移植到裸鼠的乳腺脂肪垫中。Procr+细胞能很容易的形成肿瘤而Procr-不能。(e)中显示为代表性图。肿瘤体积和无肿瘤小鼠比例分别显示在(f)和(g)中。每组有10只或更多的实验小鼠。
(h-j)在MMTV-Wnt1成瘤前动物乳腺中进行Procr+细胞谱系示踪的实验设计(h)。经过6个月的谱系示踪后，切片的免疫染色显示在成瘤前的乳腺组织中，GFP+细胞能形成克隆并扩增。GFP+细胞分布在基底细胞(箭)和管腔细胞(箭头)(i，j)。基底细胞被K14标记(i)，管腔细胞被K8标记(j)。
图10.Procr对MMTV-Wnt1乳腺肿瘤生长至关重要。
(a)定量PCR分析显示在MMTVWnt1肿瘤细胞中sh-Procr的敲低效率。
(b-g)MMTV-Wnt1/FVB乳腺肿瘤细胞分别被scramble对照或Sh-Procr病毒感染后，移植到裸鼠(b-d)或FVB(e-g)受体小鼠乳腺中。对照组的细胞能非常高效的形成肿瘤而敲低Procr抑制肿瘤的生长。代表性图显示在(b，e)。肿瘤的体积和无肿瘤小鼠百分比分别显示在(e，f)和(d，g)。每组实验有n＝8只或更多的小鼠。
图11.PROCR的表达与三阴性乳腺癌正相关，与PROCR-低表达的三阴性乳腺癌相比，PROCR-高表达的三阴性乳腺癌病人具有更差的预后。
(a)人的非瘤乳腺组织的免疫染色显示，在少部分区域，PROCR在许多基底细胞(基于位置判断)中可检测到表达。在这些例子中，基底细胞表达少量的(不可检测的)角蛋白14(K14)，这与其他区域，K14在基底细胞广泛表达而PROCR+细胞在基底细胞中零星分布很不一样(显示在图3a)。标尺表示20μm。
(b)非瘤乳腺组织的流式细胞分析(4个病例)显示PROCR在3％的基底细胞中表达，在3.5％的间质细胞中表达，在成熟管腔细胞和管腔祖细胞中不表达。无PROCR抗体的对照分析显示了基底细胞和间质细胞中的背景荧光水平，基底细胞和间质细胞具有比管腔细胞更高的背景荧光水平。
(c-d)4类亚型人乳腺癌组织样品代表性的PROCR免疫组织化学染色。图中显示了每种亚型的代表性图片。PROCR染色为褐色，苏木素染色为蓝色。标尺代表200μm(c)。H-score分析显示PROCR的表达与三阴性乳腺癌具有很强的相关性。t-检验***p<0.0001(d)。
(e-f)对一个大的公共临床数据库(kmplot.com)中的数据进行Kaplan-Meie分析。在激素受体阴性的乳腺癌病人中，PROCR的表达与更差的预后具有相关性(e，n＝671病例)。在激素受体阳性的乳腺癌病人中，PROCR的表达与预后没有相关性(f，n＝1802病例)。
图12.三阴性乳腺癌细胞系的分型和基因表达分析；PROCR-高表达的三阴性乳腺癌与BRCA1三阴性乳腺癌不同
(a)定量PCR分析人乳腺癌细胞系中PROCR的表达。PROCR在一部分三阴性乳腺癌细胞系中显著高表达(红色)在其他三阴性乳腺癌细胞系中低表达(蓝色)#代表有BRCA1/2突变的细胞系。只展示了三次相似试验中的一次。
(b)基于全基因组基因表达分析将三阴性乳腺癌细胞系划分成6个亚型和2个亚型1-3。PROCR状态与这些划分的亚型无相关性。表格列出了已知的细胞系中的基因突变。(www.sanger.ac.uk/denetics/CGP/cosmic)。
(c-d)免疫组织化学染色分析人三阴性乳腺癌样品中PROCR的表达情况。这些样品包括28例含有BRCA1突变病例和30例BRCA1野生型病例。图中展示了代表性的阴性(H-score<30)，弱阳性(H-score 30-75)，中等(H-score 80-120)和强阳性(H-score>120)染色结果。PROCR染色为棕色，苏木素染色为蓝色。标尺代表200μm(c)。统计显示89.3％的BRCA1突变样品低表达PROCR(n＝28)，而70％的BRCA1野生型三阴性乳腺癌样品是PROCR-高表达的(n＝30)，表现为H-score高于80(d)。(e)定量PCR分析Claudins(CLDN3，CLDN4，CLDN7)在三阴性乳腺癌细胞系中的表达。PROCR的表达与CLDNs的水平没有明显的相关性。
图13.PDX样品中的PROCR表达分析；抑制PROCR能够有潜力抑制MDA-MB-231细胞肿瘤生长，但对抑制BT549 or MCF-7细胞的肿瘤形成没有效果。
(a)三个PDX样品的来源病人信息。
(b-c)免疫组织化学染色显示PDX-2(b)和PDX-3(c)是ER-，PR-，HER2-和PROCR-high的。标尺表示100μm.
(d-e)流式细胞分析显示PROCR+(Lin-，Epcam+，PROCR+)和PROCR-(Lin-，Epcam+，PROCR-)细胞在PDX-2(d)和PDX-3(e)肿瘤中的比例。
(f)Western分析显示三个不同的PROCR shRNA具有不同的PROCR敲低效率。shRNA1表现出最有效的敲低(命名为Sh-PROCR)；shRNA3也表现出了显著的敲低效果。
(g)MDA-MB-231细胞(PROCR-high TNBC)感染scramble对照或分别感染两种独立的PROCR shRNAs(shRNA-1and shRNA-3)病毒，并在全细胞培养液中培养。统计4次传代中细胞数目。两个shRNAs都能抑制MDA-MB-231细胞的分裂。
(h)一部分细胞被用于Western分析并确认sh-PROCR(shRNA-1)的PROCR敲低效率为85％。移植瘤实验表明，敲低PROCR表达能够显著抑制MDA-MB-231肿瘤生长和延缓肿瘤的形成。每组4只实验小鼠，数据展示为平均值±标准差。
(i)BT549细胞是代表性的PROCR-低表达的三阴性乳腺癌细胞。BT549细胞感染scramble对照或感染sh-PROCR病毒，并在全细胞培养液中培养传代4代。统计4次传代中细胞数目。敲低PROCR表达对BT549细胞的分裂没有显著影响。
(j)MCF-7是代表性的激素受体阳性肿瘤。MCF-7细胞感染scramble对照或感染sh-PROCR病毒。尽管MCF-7相比MDA-MB-231细胞低表达PROCR，Sh-PROCR仍然可以进一步降低MCF-7细胞中PROCR的表达水平(3.4-倍降低)。移植瘤实验表明，敲低PROCR的表达不影响MCF-7这一代表性的激素受体阳性肿瘤的生长。每组4只实验小鼠，数据展示为平均值±标准差。
图14.PROCR的抑制性纳米抗体能抑制MDA-MB-231细胞分裂和PROCR+肿瘤的生长。
(a)报告的PROCR细胞外结构域的三维蛋白结构(绿色)，显示PROC(蓝色)结合PROCR的Gla结构域(蛋白的数据库编号为1LQV)4。糖基化修饰显示为米黄色。
(b)Elisa显示抑制性抗体能阻断PROCR和它的潜在配体PROC的结合，而对照抗体不能。
(c)Western分析显示在体外培养过程中添加PROCR抑制性抗体12小时或16小时处理后，MDA-MB-231细胞EGFR在T845位点的活性显著降低，但T1068和T1173位点的磷酸化不受影响。
(d-e)PDX-1(d)和PDX-2(e)肿瘤细胞移植到裸鼠体内，在移植后5天、7天、10天、14天和19天对移植小鼠腹腔注射IgG或PROCR抑制性纳米抗体。PROCR的抑制性纳米抗体(PROCR-单抗)能够抑制肿瘤生长。每组4只小鼠。数据展示为平均值±标准差。***p<0.001。
(f)流式分析显示，与以IgG处理的对照组相比，以PTX+DOX处理后的剩余肿瘤中PROCR+上皮细胞(Lin-，EpCam+，PROCR+)百分比显著升高(左图)。右图统计了PROCR+对比PROCR-比例。数据来自三次独立实验并展示为平均值±标准差。***p<0.001。
(g)经IgG或PTX/DOX或PROCR-单抗处理的剩余肿瘤被消化分散后按相同数量种植于培养基。并连续3天记录各组细胞的分裂情况。在第3天，经PTX/DOX处理的肿瘤细胞与对照组相比数目增加了1.5倍；而经PROCR-单抗处理的肿瘤细胞与对照组相比细胞数目降低了1.8倍。数据来自三次独立实验，并展示为平均值±标准差。***p<0.001。
图15.示意图展示了PROCR的功能和潜在应用。
图16.PROCR在乳腺癌细胞中激活ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-Rock信号通路。
(a)用感染scramble对照和sh-PROCR病毒的MDA-MB-231细胞的裂解液进行磷酸激酶芯片分析的示意图和代表性结果。PROCR敲低后最显著下调的7个蛋白被放大显示。
(b)Western分析显示在sh-PROCR敲低的MDA-MB-231中，ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK通路活性降低。Tubulin作为上样量对照。
(c)Western blot分析显示ERK，PI3K-Akt-mTOR and RhoA-ROCK通路活性在PROCR-高表达(MDA-MB-231，Hs578T)和PROCR-低表达的三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-468，BT549)中存在差异。
Western blot使用的细胞为同一批次的细胞并采用相同的上样量，所以只在该图最后展示了一次上样量对照。为了更好的展示，数据被分成了三列分别展示ERK，Akt和RhoA通路。
图17.在人的乳腺癌PDX中验证PROCR相关的信号活性
(a)免疫组化染色显示乳腺癌PDX样品是ER-，PR-，HER2-,和PROCR-高表达。标尺代表100um。
(b)用PROCR抗体(clone RCR-227)进行流式细胞分析显示PDX肿瘤细胞中86.9％的细胞是EpCam+的上皮细胞，在EpCam+细胞中，有48.7％的细胞是PROCR阳性的。
(c)Western分析展示了与PROCR-细胞相比，分选的PROCR+细胞中具有明显高的PROCR蛋白水平，确认了RCR-227抗体分选PROCR细胞的正确性。
(d)Western blot展示了从PROCR+乳腺癌PDX-1肿瘤中分离的PROCR+和PROCR-细胞具有明显不同的ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK通路活性。Tubulin作为上样量对照。Western blot使用的细胞为同一批次的细胞并采用相同的上样量，所以只在该图最后展示了一次上样量对照。为了更好的展示，数据被分成了三列分别展示ERK，Akt和RhoA通路。
图18.流式细胞分析验证PROCR抗体
(a)用两个不同的PROCR单克隆抗体对MDA-MB-231细胞进行流式细胞分析。RCR-252(BD Pharmingen，cat.557950)只能识别18.1％的细胞是PROCR阳性，而RCR-227(eBioscience，cat.17-2018-42)表明98.3％的细胞都是PROCR阳性的。
(b)定量PCR分析显示用RCR-252分选出的PROCR+/-细胞，其PROCR表达水平无明显差别。
(c)用两个不同的PROCR抗体对PDX细胞进行流式细胞分析。用RCR-252不能测得PROCR阳性细胞，而用RCR-227表明PDX样品中48.7％的细胞是PROCR阳性的。用RCR-227正确分选PROCR+/-细胞的验证展示在图17c。
图19.F2R通过PROCR激活了RhoA通路，但不激活ERK和PI3K-Akt-mTOR通路。
(a)用CRISPR干扰系统，借助dCas9-VP64和sg-PROCR病毒感染激活内源PROCR表达的示意图。
(b)Western blot表明ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK信号通路活性在PROCR过表达(a)后都上调，c-Myc和Cyclin D1水平也明显上升。
(c)Vimentin(Vim)染色显示在BT549细胞中过表达PROCR能够诱导细胞形态的改变。
(d)Western blot显示在BT549细胞中过表达PROCR，再用sh-RNA敲低F2R的表达，能够弱化RhoA-ROCK信号，但对ERK和PI3K-Akt-mTOR通路无显著影响。
Western blot使用的细胞为同一批次的细胞并采用相同的上样量，所以只在该图最后展示了一次上样量对照。为了更好的展示，数据被分成了三列分别展示ERK，Akt和RhoA信号通路。
图20.是IGF-1R，而不是EGFR介导了PROCR对ERK和PI3K-Akt-mTOR信号的激活
(a)用分离自PDX肿瘤中的PROCR+(Lin-，EpCam+，PROCR+)和PROCR-(Lin-，EpCam+，PROCR-)细胞进行磷酸激酶抗体芯片分析的示意图和代表性结果。
(b)Western blot展示了IGF-1R和EGFR的shRNA敲低效果。
(c)Western blot展示了在BT549细胞中过表达PROCR，再通过sh-RNA敲低IGF-1R的表达不影响Src的活化，但降低了ERK和PI3K-Akt-mTOR通路的活性，同时对RhoA-ROCK信号通路无影响。而用sh-RNA敲低EGFR的表达既不影响Src也不影响三条PROCR-相关的信号通路。
(d)Western blot展示了在BT549细胞中过表达PROCR，再通过添加Src抑制剂KX2-391，能够抑制Src活性和IGF-1R，EGFR的T845位点的活化，也抑制了ERK和PI3K-Akt-mTOR通路，但对RhoA-ROCK信号无影响。
(e)Western分析显示在MDA-MB-231细胞中，敲低PROCR弱化了EGFR在T845位点的活性，但不影响EGFR在T1068或T1173位点的磷酸化。
(f)PROCR相关的细胞内信号通路示意图。EGFR-T845的活化是PROCR激活Src时带来的边缘效应。
Western blot使用的细胞为同一批次的细胞并采用相同的上样量，所以只在该图最后展示了一次上样量对照。为了更好的展示，数据被分成了三列分别展示ERK，Akt和RhoA通路。
图21.在乳腺癌细胞中，蛋白C能够作为激活PROCR细胞内信号通路的配体
(a)MDA-MB-231细胞全细胞培养液中添加对照蛋白或sPROCR(6ug/ml)，并连续传代4代。记录每次传代中的细胞数目表明sPROCR能显著抑制细胞的分裂。MDA-MB-231细胞的纺锤形细胞形态(对照，上右图)在添加sPROCR后变成更像圆形(下右图)。图中展示了三次相似试验结果中的一次。
(b)MDA-MB-231细胞全细胞培养液中添加对照蛋白或PROC-DN(2ug/ml)，并连续传代4代。记录每次传代中的细胞数目表明PROC-DN能显著抑制细胞的分裂。MDA-MB-231细胞的纺锤形细胞形态(对照，上右图)在添加PROCR-DN后变成更像圆形(下右图)。图中展示了三次相似试验结果中的一次。
(c)Western blot显示MDA-MB-231培养过程中添加PROC-DN24小时后，Src活性和三条PROCR细胞内信号通路(ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK信号)均受到了抑制。
(d)Western blot显示MDA-MB-231培养过程中添加aPC 2小时后，Src活性和三条PROCR细胞内信号通路均被增强。
(e)乳腺癌细胞中的PROCR信号转导机制模型。Western blot使用的细胞为同一批次的细胞并采用相同的上样量，所以只在该图最后展示了一次上样量对照。
图22.阻滞PROCR细胞内信号能阻碍乳腺癌细胞的克隆形成
(a-b)PDX-1肿瘤单细胞形成的克隆被从Matrigel中溶出来并拍照。图中显示了代表性图片。敲低PROCR后克隆无法形成(a)。F2R的抑制剂(sch79797)或Src抑制剂(KX2-391)减弱了克隆的形成，同时使用2个抑制剂完全阻滞了克隆的形成(b)。标尺代表20μm。
(c-d)统计表明克隆形成效率(c)和克隆大小(d)在PROCR或PROCR下游信号通路被抑制后显著降低。同时使用F2R抑制剂和IGF-1R抑制剂能完全阻断克隆形成，效果与敲低PROCR的表达类似。**p<0.002，***p<0.0001。数据来自3次独立实验。
(e)乳腺癌细胞中的PROCR信号转导机制模型。
图23.h-ED抗原特异性滤膜提升实验(filter lift assay)
(每板～500pfu)用50nM biotin-h-ED检测了免疫管筛选形式的HDB169库(a)和HDB323库(b)。用50nM biotin-h-ED检测了溶液筛选形式的HDB169库(c)和HDB323库(d)。对HDB169库，总共筛选了10x500 pfu的O3噬菌体(筛选的滤片示例如图a)，共100个菌斑被挑选进行DNA测序。对HDB323库，总共筛选了13x500 pfu的O3噬菌体，如(b)和(d)所示，共18个阳性克隆被挑选进行测序。
图24.Anti-h-ED候选抗体的单点ELISA分析
96孔Greiner板分别包被50nM的h-ED、hIgG Fc、Fc对照和PBS。置于4℃过夜。所有118个候选抗体分别通过单点ELISA(SPE)的方法分析与h-ED抗原结合情况。图中显示了不同的抗体与h-ED蛋白的不同的亲和力。
图25.具有PROCR抑制功能的抗体的鉴定和验证
(a)竞争性Elisa鉴定能够抑制蛋白C与PROCR结合的抗体克隆。
(b)MDA-MB-231细胞的纺锤形细胞形态(对照，上图)在添加PROCR-抑制性抗体后变成更像圆形(下图)(PROCR-单抗，下图)。在(a)中鉴定出的所有抑制性克隆都表现出相似的表型。这里展示了代表性的结果。
(c)对携带PDX-1肿瘤的小鼠(～200mm3)腹腔注射不同的PROCR-单抗克隆。图中显示了PROCR-单抗注射的时间，共注射5次(8mg/kg体重)。如图所示，肿瘤大小能够被抗体抑制。
发明详述
应当理解，上述一般描述和以下详细描述都仅是示例性的和解释性的，并且不限制本公开的组合物和方法。
本公开一个方面涉及如下令人惊讶发现：PROCR可以用作约占所有TNBC的50％的一种TNBC亚型，即高PROCR的TNBC，的特异的治疗靶标和生物标志物。出乎意料的是，PROCR在某些但不是所有的TNBC细胞中高表达。在一些实施方案中，高PROCR的TNBC的特征是乳腺组织中PROCR的表达水平在免疫组化中具有至少120的免疫反应性H评分。相反，低PROCR的TNBC或QNBC的特征是，乳腺组织中PROCR的表达水平在免疫组化中具有小于约120或小于约100的免疫反应性H评分。可以在免疫组化中使用各种抗PROCR抗体，例如本文所公开的GS5，GS4，GS2，HD13，HD21，HD44，HD58或HD61单克隆抗体，以及RCR-252。
还发现PROCR的表达与以下高度相关：(a)高PROCR的TNBC患者的低生存率，(b)癌干细胞的干性增加和(c)肿瘤模型的转移。本文还确定，PROCR的抑制破坏了高PROCR的TNBC亚型的致瘤性和进展。因此，PROCR可以作为对高PROCR的TNBC的诊断和治疗干预的有效靶标。
应当指出，在2015年8月19日提交的PCT/CN2015/087555中，发明人先前曾报告将PROCR用于所有TNBC病例的诊断和治疗，其中有82.6％的TNBC患者是PROCR阳性的。然而，发明人惊讶地发现，如本文所述，仅52％的TNBC表现出PROCR的高水平表达，使PROCR成为TNBC亚型的生物标志物，而非所有TNBC。这是通过使用弱PROCR染色(H分数<120，例如80-120)分析PDX样品得到的。令人惊讶的是，通过FACS分析，仅2％的肿瘤细胞确实是PROCR+。使用限制性稀释的肿瘤细胞的异种移植实验表明，这2％的PROCR+未就癌干细胞富集(图4B)。相比之下，当使用强PROCR染色(H评分>120)分析PDX样品时，通过FACS分析显示48.5％的肿瘤细胞是PROCR+。异种移植实验表明这些PROCR+细胞是癌干细胞。通过异种移植，即使是从此类肿瘤中分离的一个单独的PROCR+细胞也很容易形成新的肿瘤(图4A)。因此，本公开没有将PROCR用作TNBC的替代标记，而是检测乳腺癌患者样本中所有四个标记，即ER-、PR-、HER2-和PROCR+，并以此确定PROCR+TNBC亚型。此后，可将PROCR抑制剂(如本文所公开的抗体)用于治疗PROCR+TNBC患者。
此外，在不希望受到理论限制，据信乳腺癌上皮细胞中的PROCR功能分子机制与内皮细胞中的PROCR不同。乳腺癌细胞中的PROCR需要Src和IGF-1R，但内皮细胞中不需要。这对于设计针对特定靶标乳腺癌细胞的靶向策略以及最小化对内皮细胞的潜在毒性具有重要意义。
具体而言，本文发现PROCR+乳腺癌细胞中PROCR同时通过F2R和Src/IGF-1R发生进展(参见图22e)。具体而言，PROCR诱导的RhoA-ROCK-p38信号传导依赖于F2R，而PROCR诱导的ERK和PI3k-Akt-mTOR信号传导依赖于Src和随后的IGF-1R激活。这是首次报道Src和IGF-1R介导PROCR信号传导功能。功能上，使用相应的抑制剂阻断F2R和Src抑制癌干细胞活性(图22)。
令人惊讶地发现，在乳腺癌细胞中，F2R并未参与所有PROCR活性，这与先前描述的PROCR在内皮细胞中的细胞内信号传导机制不同，其中F2R是所有PROCR活性的关键介导物(Cheng等,2003；Feistritzer等,2006；Riewald等,2002；Yang等,2009)。乳腺癌上皮细胞和内皮细胞之间这种信号传导机制的差异使得特异靶向乳腺癌细胞的新型治疗策略成为可能，并最小化对内皮细胞的潜在毒性。例如，将抗PROCR mAb与Src抑制剂或IGF-1R抑制剂联合使用可有效减少高PROCR的TNBC乳腺癌干细胞，并防止内皮细胞的潜在副作用。
定义
为方便起见，此处收集了本文中使用的某些术语，示例和附加的权利。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本文所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。
如本文所用，以下术语和短语旨在具有以下含义：
在本文中，术语“一”和“一种”指文章的一个或多个(即至少一个)语法对象。作为示例，“一种要素”是指一个要素或多于一个要素。
如本文所用，术语“约”是指可接受的变化在所示值的20％以内，更优选10％以内，最优选5％内。
本文所用，术语“三阴性”或“TN”或“TNBC”指肿瘤(例如癌)，通常是乳腺癌，其中，肿瘤细胞的雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)(均是核受体(即它们主要位于细胞核中))的得分为阴性(即使用常规的病理学方法)，并且所述癌细胞的位于细胞表面的受体，2型表皮生长因子受体(HER2或ErbB2)没有出现扩增。如果使用标准的免疫组化技术发现少于5％的肿瘤细胞核经染色显示ER和PR表达，则认为肿瘤细胞的ER和PR表达为阴性。如果使用HercepTestTM试剂盒(代码K5204，Dako North America公司，卡平特里亚，加利福尼亚州)，使用多克隆抗HER2一抗进行半定量免疫组化分析，产生3+的检测结果分数，则认为肿瘤细胞的HER2高度扩增(“HER23+”)，或通过荧光原位杂交(FISH)检测HER2阳性。如本文所用，如果产生的检测结果得分为0或1+，或2+，或者如果它们的HER2 FISH阴性，则认为肿瘤细胞对于HER2过表达是阴性的。
除非另有说明，否则“Procr”和“PROCR”可互换使用并指蛋白C受体，通常，“Procr”指基因或mRNA而“PROCR”指蛋白产品。应该理解的是，该术语包括完整的基因，cDNA序列，完整的氨基酸序列或其任何片段或变体。
如本文所用，术语“PROCR抑制剂”旨在包括抑制，降低，压制或下调PROCR活性的治疗药物。该术语旨在包括化学化合物，例如小分子抑制剂和生物制剂(例如抗体)，干扰RNA(shRNA，siRNA)，可溶性拮抗剂，基因编辑/沉默工具(CRISPR/Cas9，TALEN)等。
本文使用的“抗体”是包含与靶标表位结合的结合域的由一个或多个多肽组成的蛋白质。术语抗体包括包含免疫球蛋白重链和轻链分子的单克隆抗体，单重链可变域抗体，它们的变体和衍生物，包括单克隆抗体和单重链可变域抗体的嵌合变体。结合域基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码，其中蛋白质免疫特异性地与抗原结合。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，它们依次定义了免疫球蛋白类别，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。对于包括人和鼠科动物在内的大多数脊椎动物而言，典型的免疫球蛋白结构单元包括一四聚体，该四聚体包含两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。“VL”和“VH”分别指这些轻链和重链的可变域。“CL”和“CH”指轻链和重链的恒定域。位于VL和VH上的各三个β链环负责与抗原的结合，被称为“互补决定区”或“CDR”。“Fab”(片段、抗原结合)区域包括来自抗体的各重链和轻链的一个恒定域和一个可变域，即VL、CL、VH和CH1。
抗体包括完整的免疫球蛋白及其抗原结合片段。术语“抗原结合片段”是抗体的多肽片段，该多肽片段与抗原结合或与完整抗体(衍生出所述多肽片段的完整抗体)竞争结合(特异性结合)抗原。抗原结合片段可以通过本领域周知的重组或生化方法产生。示例性的抗原结合片段包括Fv、Fab、Fab’、(Fab’)2、CDR、互补位(paratope)和单链Fv抗体(scFv)，其中VH和VL链(直接或通过一个或多个肽接头)相连以形成连续的多肽。
在骆驼中(如单峰骆驼，双峰骆驼，野生双峰骆驼，美洲驼，羊驼，骆马和红褐色美洲驼)报告了称为重链抗体(HCA，也称为两链或两链重链抗体)的另一类抗体(Hamers-Casterman等,Nature,363,446-448(1993)；Wesolowski等,Med.Microbiol.Immunol(2009)198:157-174；参见例如美国专利5,759,808；美国专利5,800,988；美国专利5,840,526；和美国专利5,874,541)。与同样由骆驼科动物产生的IgG型常规四链免疫球蛋白相比，这些抗体缺乏常规免疫球蛋白的轻链和CH1结构域，它们的可变结构域有时被称为“VHH”。VHH可以包括四个框架区域或“FR”、FR1、FR2、FR3和FR4。框架区域被三个CDR，CDR1、CDR2和CDR3中断。这些天然存在的重链抗体的显著特征之一是，在它们的VHH的VL连接位置44、45和47处(Kabat编号)分别具有优势性的Glu、Arg和Gly。常规四链抗体VH中的相同位置几乎全部由Gly，Leu和Trp占据。与常规四链抗体的VH域的相对不溶性相比，这些差异被认为与骆驼科HCA可变域(VHH)的高可溶性和稳定性有关。骆驼科VHH域的另外两个显著特征是它们的CDR3相对更长，并且CDR中半胱氨酸对的出现率相对较高。似乎半胱氨酸对介导了二硫键的形成，从而参与了抗体结合位点的表面拓扑结构的调节。在骆驼sdAb-溶菌酶复合物的晶体结构中，从sdAb突出并被CDR二硫键部分稳定的刚性环从结合位点延伸，并深入穿入到溶菌酶活性位点(Desmyter等,Nature Struct.Biol.,3,803-811(1996))。
抗体还包括变体，嵌合抗体和人源化抗体。如本文所用，术语“抗体变体”是指在重链和/或轻链中具有单个或多个突变的抗体。在一些实施方案中，突变存在于可变区中。在一些实施方案中，突变存在于恒定区中。“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和轻链各自的氨基酸序列的一部分与衍生自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的其余区段为与其他抗体中的相应序列同源。通常，在这些嵌合抗体中，轻链和重链的可变区都模拟衍生自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与衍生自另一种哺乳动物的抗体的序列同源。这种嵌合形式的一个明显的优点是，例如，可变区可以方便地获自目前已知的来源，使用来自非人类宿主生物的容易获得的杂交瘤或B细胞而获得，与衍生自例如人细胞制剂的恒定区相结合。尽管可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受其来源的影响，但是恒定区是来自人，当注射抗体时，恒定区引发人类的免疫应答的可能性比来自非人类来源的恒定区要小。但是，定义不限于该特定示例。“人源化”抗体是指具有抗原结合位点的分子，该抗原结合位点基本上来源于非人类物种的免疫球蛋白，并且该分子的其余免疫球蛋白结构基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或仅包含嫁接到可变结构域中的适当框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，也可以由一个或多个氨基酸取代所修饰，例如，修饰得更接近于人免疫球蛋白。某些形式的人源化抗体保留所有CDR序列(例如，包含来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。其他形式的人源化抗体具有相对于原始抗体有所改变的一个或多个CDR(一个，两个，三个，四个，五个或六个)，也被称为“源自”一个或多个CDR的一个或多个CDR。
如本文所述，抗体(包括VHH)的氨基酸残基可以根据Kabat的通用编号进行编号(Kabat等，(1991)《感兴趣的免疫蛋白的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，Public Health Service，NIH，马里兰州贝塞斯达)。
如本文在抗体(例如VHH)和PROCR的表位作为靶标之间的结合的上下文中使用的术语“结合”是指分子之间的非共价相互作用的过程。优选地，所述结合是特异性的。抗体的特异性可以基于亲和力来确定。特异性抗体对其表位的结合亲和力或解离常数Kd可以小于10-7M，优选小于10-8M。
术语“亲和力”是指抗体的结合结构域和表位之间的结合反应的强度。它是在结合结构域和表位之间作用的吸引力和排斥力的总和。如本文所用，术语亲和力是指解离常数Kd。
术语“抗原”是指能够被选择性结合剂(例如抗体)结合的分子或分子的一部分，其还能够用于动物中以产生能够与该抗原的表位结合的抗体。抗原可以具有一个或多个表位。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何决定簇，优选多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸，糖侧链，磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是被抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，则称该抗体特异性结合抗原。用于表位作图的方法是本领域众所周知的，例如X射线共晶体学，基于阵列的寡肽扫描，定点诱变，高通量诱变作图和氢-氘交换。
抗体上结合表位的位点被称为“互补位”，其通常包括一旦结合后就非常靠近表位的氨基酸残基。参见Sela-Culang等,Front Immunol.2013；4:302。
“免疫组化”或“IHC”是指检测组织切片的细胞中的抗原的过程，该过程允许抗体的结合并随后检测在生物组织中免疫特异性识别感兴趣抗原的抗体。有关IHC技术的综述，请参见例如Ramos-Vara等，Veterinary Pathology，2014年1月，第51卷第1号，42-87，其通过引用全文并入本文。为了评估IHC结果，已经开发了不同的定性和半定量评分系统。参见，例如，Fedchenko等，Diagnostic Pathology，2014；9:221，其通过引用全文并入本文。一个示例是H分数，该分数是通过添加细胞百分比与染色强度顺序值(从“无信号”的0到“强信号”的3计分)相乘的结果而确定的，具有300个可能值。
“免疫特异的”或“免疫特异性”(有时与“特异性”互换使用)是指通过基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的结构域结合感兴趣蛋白质的一个或多个表位的抗体，该抗体基本上不识别包含抗原分子混合种群的样品中的其他分子并与其结合。通常，以表面等离振子共振测定法或细胞结合测定法进行测定，抗体以不大于50nM的Kd免疫特异性地结合同类(cognate)抗原。此类测定法的使用是本领域众所周知的。
“抗PROCR抗体”是免疫特异性结合PROCR(例如，其细胞外结构域)的抗体。该抗体可以是分离的抗体。与PROCR的这种结合表现出的Kd值为例如不大于1μM，不大于100nM或不大于50nM。Kd可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测量，例如表面等离振子共振测定法或细胞结合测定法。抗PROCR抗体可以是单克隆美洲驼抗体，例如本文公开的GS5，GS4，GS2，HD13，HD21，HD44，HD58或HD61或其抗原结合片段。示例性的抗PROCR抗体抑制PROCR与蛋白C的结合。抗PROCR抗体也可以是“RCR-252”抗体，是指具有克隆编号RCR-252的单克隆抗体，最早由Ye等在“内皮细胞蛋白C受体(EPCR)作为动脉、静脉和毛细血管的血管内皮细胞上用于蛋白C活化的初级受体(The endothelial cell protein C receptor(EPCR)functions as a primary receptor for protein C activation on endothelial cellsin arteries,veins,and capillaries)”Biochem Biophys Res Commun 1999,259:671中描述。RCR-252是大鼠抗人PROCR抗体，可从多种来源商购，例如Abcam目录号ab81712和Sigma产品号E6280。
术语“交叉竞争”、“交叉竞争性”，“交叉阻断”，“交叉阻断的”和“交叉阻断性”在本文中可互换使用，是指抗体或其片段通过本公开的抗PROCR抗体对靶PROCR的变构调节而直接或间接地干扰结合的能力。可以使用竞争结合测定法确定抗体或其片段能够干扰另一种抗体与靶标结合的程度，从而确定是否可以称为本公开所述的交叉阻断或交叉竞争。一种特别合适的定量交叉竞争测定法使用基于FACS或AlphaScreen的方法来测量标记的(例如His标签的、生物素化的或放射性标记的)抗体或其片段与另一种抗体或其片段在与靶标结合方面的竞争。通常，交叉竞争抗体或其片段是例如将在交叉竞争测定中结合靶标的抗体，使得在测定期间并且在存在第二抗体或其片段的情况下，本公开所述免疫球蛋白单可变结构域或多肽的记录位移是以给定量存在的待测潜在交叉阻断抗体或其片段的最大理论位移(例如，需要交叉杂交的冷(例如，未标记的)抗体或其片段的位移)的最多100％(例如，在基于FACS的竞争测定中)。优选地，交叉竞争抗体或其片段具有在10％至100％，更优选在50％至100％的记录位移。
本文术语“压制”，“压制性”，“抑制”，“抑制性”，“中和”和“中和性”可互换使用，指生物学活性(例如PROCR活性或肿瘤细胞生长)的任何统计学上显著的降低，包括完全阻断该活性。例如，“抑制”可以指生物活性降低约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。
术语“患者”包括接受预防性治疗或治疗性治疗的人或其他哺乳动物。
本文所用的术语“治疗”是指诸如本文所述的治疗性或预防性措施。“治疗”的方法采用向患者例如患有TNBC的患者施用本文提供的PROCR抑制剂，从而预防、治愈、延迟、减轻疾病的严重性或缓解疾病或紊乱或复发性疾病或紊乱的一种或多种症状，或从而延长患者的生存期，使其超出在没有此类治疗的情况下的预期。
如本文所用，术语“有效量”是指当给予患者时，对高PROCR的TNBC进行治疗、预后或诊断足够有效的试剂(例如PROCR抑制剂，例如抗PROCR抗体)的量。治疗有效量将根据患者和所治疗的疾病状况、患者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、给药方式等而变化，这可以通过本领域的普通技术人员容易地确定。给药剂量可以是例如如下范围的本文所提供的抗体或其抗原结合部分：约1ng至约10,000mg、约5ng至约9,500mg、约10ng至约9,000mg、约20ng至约8,500mg、约30ng至约7,500mg、约40ng至约7,000mg、约50ng至约6,500mg、约100ng至约6,000mg、约200ng至约5,500mg、约300ng至约5,000mg、约400ng至约4,500mg、约500ng至约4,000mg、约1μg至约3,500mg、约5μg至约3,000mg、约10μg至约2,600mg、约20μg至约2,575mg、约30μg至约2,550mg、约40μg至约2,500mg、约50μg至约2,475mg、约100μg至约2,450mg、约200μg至约2,425mg、约300μg至约2,000、约400μg至约1,175mg、约500μg至约1,150mg、约0.5mg至约1,125mg、约1mg至约1,100mg、约1.25mg至约1,075mg、约1.5mg至约1,050mg、约2.0mg至约1,025mg、约2.5mg至约1,000mg、约3.0mg至约975mg、约3.5mg至约950mg、约4.0mg至约925mg、约4.5mg至约900mg、约5mg至约875mg、约10mg至约850mg、约20mg至约825mg、约30mg至约800mg、约40mg至约775mg、约50mg至约750mg、约100mg至约725mg、约200mg至约700mg、约300mg至约675mg、约400mg至约650mg、约500mg、或约525mg至约625mg。给药可以是例如每周、每2周、每3周、每4周、每5周或每6周。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。有效量也是其中试剂的任何毒性或有害作用(副作用)被最小化和/或被有益作用所抵消的有效量。可以每周精确或约6mg/kg或12mg/kg静脉内给药，或者每两周一次精确或约12mg/kg或24mg/kg静脉内给药。其他给药方案如下所述。
如本文所用，在重组核酸技术、微生物学、免疫学、抗体工程学以及分子和细胞生物学领域中使用的其他术语将由适用领域的普通技术人员按通常理解。例如，常规技术可以用于制备重组DNA，进行寡核苷酸合成以及进行组织培养和转化(例如，电穿孔，转染或脂转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书进行或如本领域通常所进行或如本文所述进行。前述技术和过程通常可以根据本领域公知的常规方法来执行，并且如在本说明书全文中引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见，例如，Sambrook等，2001，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第三版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，其通过引用并入本文用于任何目的。除非提供具体定义，否则与本文描述的分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的命名法以及本文描述的分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学的实验室程序和技术是本领域众所周知的和常用的。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
如本文所用，术语“包含”或“包括”是指存在于给定实施方案中的组合物，方法和其各自的组分，但也可涵盖未指定要素。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。该术语允许存在另外的要素，该另外的要素不实质影响本公开的该实施方案的基本且新颖的或功能性的特征。
术语“由……组成”是指本文所述的组合物、方法及其相应的组分，其排除了在该实施方案的描述中未列举的任何要素。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一种”、“该”和“所述”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对“方法”的引用包括一种或多种本文所述类型的方法和/或步骤，和/或这在阅读本公开等之后对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
在以下小节中进一步详细描述了各个方面和实施方案。
高PROCR的TNBC
人PROCR是238个氨基酸的高度糖基化的I型跨膜蛋白(UniProtKB编号Q9UNN8)。这些氨基酸包括信号肽(氨基酸1017)，细胞外结构域(氨基酸18-210)，21-aa跨膜结构域(氨基酸211-231)和7-aa胞质内序列(氨基酸232-238)，这些一起编码约46kDa的蛋白质。去糖基化会将蛋白质质量降低至25kDa。PROCR在心脏和肺部的动脉和静脉的内皮细胞上强表达，在肺部和皮肤的毛细血管中表达不那么强，而在肝脏和肾脏的小血管的内皮细胞中则完全不表达。PROCR是蛋白C的受体，蛋白C是抗凝途径中的关键蛋白。蛋白C抗凝途径是响应炎症细胞因子和局部缺血而控制血栓形成、限制炎症反应、潜在地减少内皮细胞凋亡的主要系统。该途径的基本组成部分包括凝血酶，凝血酶调节蛋白，PROCR，蛋白C和蛋白S。当凝血酶与内皮表面的凝血调节蛋白结合时，该途径开始。PROCR通过与蛋白C结合并将其呈递给凝血酶-凝血调节蛋白激活复合物来增强蛋白C的激活。活化的蛋白C(aPC)保留了其结合PROCR的能力，并且这种复合物似乎参与了一些下调炎症细胞因子形成(TNF，IL-6)的细胞信号传导机制。PROCR通过炎症介质和凝血酶从脉管系统脱落。PROCR在涉及蛋白酶3和Mac-1的过程中与活化的嗜中性粒细胞结合。此外，PROCR可以从质膜移位到核。可以切割PROCR以在循环中释放可溶形式(sPROCR)。该sPROCR被检测为43kDa的单一物质，这是由于金属蛋白酶的作用导致膜PROCR脱落而引起的，该酶被凝血酶和某些炎症介质刺激。可溶性PROCR以相似的亲和力结合PC和aPC，但它与aPC的结合通过阻断aPC结合至磷脂和通过废除其灭活因子Va的能力而抑制aPC的抗凝血活性。可在血浆中检测到sPROCR。在正常人中，sPROCR的水平为83.6+/-17.2ng/ml。sPROCR水平升高与较高的血栓形成风险呈正相关。此外，单倍型(A3等位基因)与sPROCR的水平升高(264+/-174ng/ml)相关。
人Procr的完整基因序列是44819bp(GenBank登录号NC_000020.11)。人cDNA序列长度为717bp(GenBank登录号NM_006404.4)。小鼠Procr基因的完整基因序列是4354bp(GenBank登录号NC_000068.7)。
在一些实施方案中，PROCR的存在和/或其表达水平可以用作TNBC、PROCR+TNBC或高PROCR的TNBC的特定亚型的诊断和/或预后确定的生物标记物。这是基于如下令人惊奇的发现：约50-60％的TNBC细胞中PROCR表达水平升高。
PROCR蛋白水平可通过质谱或使用抗PROCR抗体的免疫测定进行测量，例如组织样品上的免疫组化或酶联免疫吸附测定(ELISA)或Western印迹。或者，可以通过定量逆转录PCR(qRT-PCR)或Northern印迹或微阵列来测量PROCR的mRNA水平。本领域已知的其他方法也可以用于检测PROCR的存在和/或测量其表达水平。
还提供了用于检测PROCR并因此诊断PROCR+TNBC的试剂盒。试剂盒可包含一种或多种本文公开的抗PROCR抗体或其抗原结合片段，用于与免疫测定例如免疫组化或ELISA或Western印迹联合使用。或者，试剂盒可以包括与qRT-PCR或Northern印迹相关的特异性引物和/或探针。该试剂盒还可以包括用于检测Procr mRNA或蛋白质水平的微阵列，其中Procr基因或其片段、或抗PROCR抗体或其抗原结合片段可以系连至微阵列。试剂盒中可以另外包含对照样品和用户说明手册，其中，与对照样品(标准化后)相比，试验样品的差异(例如，增加)表明存在PROCR+TNBC。增加可以大于约10％，大于约20％，大于约30％，大于约50％，大于约60％，大于约80％，大于约100％或更多，或者在其间的任何数字。
PROCR抑制剂及其用途
除了是PROCR+TNBC的强标志物外，对PROCR的抑制还破坏了该TNBC亚型的致瘤性和进展。这样，PROCR抑制剂可以用作有效的PROCR+TNBC治疗剂。
各种PROCR抑制剂包括在本公开中。实例包括化合物，例如可以结合PROCR并抑制或降低其活性(例如与蛋白C结合的活性)的生物试剂(例如抗体)和小分子抑制剂。还包括调节Procr基因表达水平的试剂，例如专门设计用于靶向Procr基因或其调控序列的干扰RNA(shRNA，siRNA)和基因编辑/沉默工具(CRISPR/Cas9，TALEN，锌指核酸酶)。
在某些实施方案中，PROCR抑制剂是抗PROCR抗体，例如单克隆抗体。示例性的抗PROCR抗体是GS5，GS4或GS2。或者，抗PROCR抗体可以是与GS5，GS4或GS2交叉竞争结合PROCR的抗体。在另一个实施方案中，抗PROCR抗体是包含GS5，GS4和/或GS2的一个或多个CDR序列的抗体，如下所示，其中各VHH的CDR以粗体和下划线表示。
GS2(SEQ ID NO:1):
Figure GDA0002610533020000251
GS4(SEQ ID NO:2):
Figure GDA0002610533020000252
GS5(SEQ ID NO:3):
Figure GDA0002610533020000253
在某些实施方案中，抗PROCR抗体可以是经修饰的，例如衍生自GS2，GS4和/或GS5的嵌合或人源化抗体。制备修饰的抗体的方法是本领域已知的。详情参见下文。修饰的抗体可包含GS2，GS4和/或GS5的一个或多个CDR。在一个实施方案中，该抗体包括以下的一个或多个：GS2的CDR1(GSTFSITT(SEQ ID NO:4))、GS2的CDR2(IIVVSDP(SEQ ID NO:5))，和(GS2的CDR3(VTSDHRGY(SEQ ID NO:6))。在另一个实施方案中，抗体包括以下的一个或多个：GS4或GS5的CDR1(GDITGDNC(SEQ ID NO:7))、GS4的CDR2(IYTATGS(SEQ ID NO:8))、GS5的CDR2(IHTATDS(SEQ ID NO:9))、和GS4或GS5的CDR3(PTNNRYPWGGCPLYEDAYNY(SEQ ID NO:10))。
在某些实施方案中，抗PROCR抗体可以选自如下所示的HD13、HD21、HD44、HD58或HD61或其抗原结合片段(例如，CDR)。或者，抗PROCR抗体可以是与HD13、HD21、HD44、HD58或HD61交叉竞争结合PROCR的抗体。在另一个实施方案中，抗PROCR抗体是包含HD13、HD21、HD44、HD58或HD61的一个或多个CDR序列的抗体(如下粗体和下划线所示)。
HD13-H(重链，SEQ ID NO:11；CDR1、CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000261
HD21-H(重链，SEQ ID NO:12；CDR1、CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000262
HD44-H(重链，SEQ ID NO:13；CDR1、CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000263
HD58-H(重链，SEQ ID NO:14；CDR1、CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000271
HD61-H(重链，SEQ ID NO:15；CDR1、CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000272
重链的共有序列(SEQ ID NO:16；CDR1、CDR2和CDR3如方框所示)
Figure GDA0002610533020000273
HD13-L(轻链，SEQ ID NO:17；CDR1、CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000274
HD21-L(轻链，SEQ ID NO:18；CDR1、CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000275
HD44-L(轻链，SEQ ID NO:19；CDR1、CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000281
HD58-L(轻链，SEQ ID NO:20；CDR1、CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000282
HD61-L(轻链，SEQ ID NO:21；CDR1、CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000283
轻链的共有序列(底部序列，SEQ ID NO:22；CDR1，CDR2和CDR3如下划线所示)
Figure GDA0002610533020000284
在一些实施方案中，抗PROCR抗体是与人PROCR的表位(例如细胞外结构域)结合的抗体或其抗原结合部分。抗PROCR抗体可以与GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61交叉竞争结合表位。该表位可以被GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61结合。另外，GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61可以与PROCR上不同但邻近的表位结合。抗PROCR抗体的特征在于，在患者体内或源自患者的异种移植物中，至少部分抑制(例如，相对于对照至少10％)表达PROCR的癌细胞的增殖或至少部分抑制肿瘤的生长(例如，体积和/或转移))。
在又一个实施方案中，抗PROCR抗体可包含两种或更多种抗PROCR抗体的混合物或掺合物，其各自结合至PROCR上的不同表位。在一个实施方案中，混合物或掺合物包含三种抗PROCR抗体，其各自结合PROCR上的不同表位。
在另一个实施方案中，PROCR抑制剂包含抑制PROCR的表达或活性的核酸分子，例如RNA分子。可以根据本领域已知的方法设计对Procr具有特异性的干扰RNA，例如特异性抑制Procr的表达和/或活性的shRNA或siRNA。
在一些实施方案中，表达PROCR的细胞(例如PROCR+TNBC细胞)或源自患者的异种移植物可以用作筛选抑制PROCR表达和/或活性的试剂的模型。一种示例性方法包括：(a)向多个PROCR+TNBC细胞提供测试剂，以及(b)测定以下的一个或多个：(1)PROCR表达水平，(2)PROCR活性和(3)PROCR+TNBC细胞的存活率和/或增殖速率，其中，与未经测试剂处理的阴性对照相比发生降低表明该测试剂为PROCR抑制剂。另一示例性方法包括：(a)向源自患者的PROCR+TNBC异种移植物提供测试剂，和(b)确定(1)PROCR表达水平，(2)PROCR活性，和(3)异种移植物中肿瘤的生长和/或转移，其中与未用测试剂处理的阴性对照相比发生降低表明该测试剂是PROCR抑制剂。另一示例性方法包括：(a)提供测试剂，和(b)确定测试剂是否具有以下一个或多个特征：(i)与PROCR结合；(ii)干扰或抑制PROCR与蛋白C的结合；(iii)与GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61交叉竞争；(iv)干扰或抑制GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61与PROCR的结合；和/或(v)增强GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61与PROCR的结合；其中如果所述测试剂具有(i)-(v)中的一种或多种，则其为PROCR抑制剂。这些方法可在体内或体外进行。测试剂可以是抗体、小分子、肽和/或核酸。
一方面，提供了PROCR抑制剂在制备用于治疗PROCR+TNBC的药物中的用途。在另一方面，提供了抑制PROCR+TNBC细胞生长的方法，该方法包括使细胞与有效量的PROCR抑制剂接触。在另一方面，提供了抑制患者中PROCR+TNBC肿瘤生长的方法，该方法包括向患者施用有效量的PROCR抑制剂。在另一方面，提供了治疗患者的PROCR+TNBC肿瘤的方法，该方法包括向患者施用有效量的PROCR抑制剂。在另一方面，提供了一种治疗患者的乳腺癌肿瘤的方法，该方法包括：选择患有PROCR+TNBC肿瘤的患者；向患者施用有效量的PROCR抑制剂。在任何上述方法的一个实施方案中，PROCR抑制剂是抗PROCR抗体。示例性的抗PROCR抗体是GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61或其抗原结合片段，或与GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61交叉竞争结合PROCR的抗体。
抗PROCR抗体的制备
抗体通常包含两对相同的多肽链，每对具有一条全长“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条全长“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。每条链的氨基末端部分通常包含约100至110个或更多氨基酸的可变区，该可变区通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义负责效应子功能的恒定区。重链和轻链各自的可变区通常表现出相同的总体结构，该结构包括由三个超可变区(也称为互补决定区或CDR)连接的四个相对保守的框架区(FR)。来自每对两条链的CDR通常通过框架区进行对齐，该对齐可以使其结合至特定的表位。从N末端到C末端，轻链和重链可变区通常都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸对每个结构域的分配通常按照《免疫学感兴趣的蛋白质的Kabat序列》(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)的定义(1987和1991，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州)，Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196:901-917，或Chothia等，1989，Nature 342:878-883)。
随着单克隆抗体的发展，抗体成为有用和令人感兴趣的药物。单克隆抗体可以使用通过细胞系连续培养产生抗体分子的任何方法来产生。制备单克隆抗体的合适方法的实例包括Kohler等的杂交瘤方法(1975,Nature 256:495-497)和人B细胞杂交瘤方法(Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001；和Brodeur等，1987，《单克隆抗体生产技术和应用》(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)，Marcel Dekker公司，纽约，第51-63页)。
可以修饰单克隆抗体以用作治疗剂。一个例子是“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。其他实例是此类抗体的片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。参见美国专利4,816,567；和Morrison等(1985),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855。一种相关的发展是“CDR嫁接”抗体，其中抗体包含一个或多个来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的互补决定区(CDR)，而一条或多条抗体链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。
另一种发展是“人源化”抗体。使非人抗体人源化的方法是本领域众所周知的(参见美国专利号5,585,089和5,693,762；还参见Cécile Vincke等，J.Biol.Chem.2009；284:3273-3284的美洲驼抗体的人源化)。通常，人源化抗体由非人动物产生，然后通常来自抗体的非抗原识别部分的某些氨基酸残基被修饰为与相应同种型人抗体中的所述残基同源。可以例如使用本领域中描述的方法进行人源化(Jones等，1986，Nature 321:522-525；Riechmann等，1988，Nature 332:323-327；Verhoeyen等，1988，Science239：1534-1536)，将啮齿类动物可变区的至少一部分替换为人抗体的相应区域。
最近的发展是无需将抗原暴露于人的人抗体(“完全人抗体”)。使用在不产生内源性小鼠免疫球蛋白产物的情况下能够产生人类抗体库的转基因动物(例如小鼠)，所述抗体通过用抗原(通常具有至少6个连续氨基酸)免疫来产生，任选偶联至载体。参见例如Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551-2555；Jakobovits等，1993，Nature 362:255-258；和Bruggermann等，1993，Year in Immunol.7:33。在这些方法的一个例子中，通过使其中编码小鼠重链和轻链免疫球蛋白链的内源性小鼠免疫球蛋白基因座丧失能力，并将编码人重链和轻链蛋白的基因座插入其基因组中来生产转基因动物。然后将部分修饰的动物(具有少于全部修饰补充物)杂交，以获得具有所有所需免疫系统修饰的动物。当施用免疫原时，这些转基因动物产生对这些抗原具有免疫特异性的抗体，具有人(而非鼠)氨基酸序列(包括可变区)。参见PCT公开号WO96/33735和WO94/02602，其通过引用纳入本文。其他方法如美国专利5,545,807，PCT公开号WO91/10741，WO90/04036，EP546073B1和EP546073A1中所述，它们通过引用纳入本文。如本文所述，人抗体还可通过在宿主细胞中表达重组DNA或在杂交瘤细胞中表达而产生。
完全人抗体也可以从噬菌体展示文库中产生(如在Hoogenboom等1991，J.Mol.Biol.227:381；和Marks等，1991，J.Mol.Biol.222:581所述)。这些过程通过在丝状噬菌体表面上展示抗体库以及随后通过结合所选抗原以选择噬菌体来模拟免疫选择。PCT公开号WO99/10494中描述了一种这样的技术，该专利以引用方式纳入本文，其描述了使用这种方法分离针对MPL-和msk-受体的高亲和力和功能性激动抗体。
一旦确定了编码上述抗体的核苷酸序列，也可以通过重组方法产生嵌合的、CDR移植的、人源化的和完全人源的抗体。将编码抗体的核酸引入宿主细胞中，并使用本领域通常已知的材料和程序进行表达。
本公开提供了一种或多种针对PROCR的单克隆抗体。优选地，抗体结合PROCR。在优选的实施方案中，本公开提供了编码重链和轻链免疫球蛋白分子的核苷酸序列和包含该重链和轻链免疫球蛋白分子的氨基酸序列，特别是对应于其可变区的序列。在优选的实施方案中，提供了对应于CDR的序列，特别是CDR1至CDR3。在另外的实施方案中，本公开提供了表达此类免疫球蛋白分子的杂交瘤细胞系和由其产生的单克隆抗体，优选纯化的针对人PROCR的人单克隆抗体。
本公开的抗PROCR抗体的轻链和重链可变区的CDR可以嫁接至来自相同或另一物种的框架区(FR)。在某些实施方案中，抗PROCR抗体的轻链和重链可变区的CDR可以被嫁接至共有人FR。为了产生共有人FR，将来自多种人重链或轻链氨基酸序列的FR进行比对以鉴定共有氨基酸序列。抗PROCR抗体重链或轻链的FR可以被来自不同重链或轻链的FR替换。抗PROCR抗体的重链和轻链的FR中的稀有氨基酸通常不被替换，而其余的FR氨基酸可以被替换。稀有氨基酸是特定氨基酸，它们位于FR中通常它们所不存在的位置。来自本公开的抗PROCR抗体的嫁接的可变区可以与不同于抗PROCR抗体恒定区的恒定区一起使用。或者，嫁接的可变区是单链Fv抗体的一部分。CDR嫁接描述于例如美国专利6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101，它们通过引用纳入本文用于任何目的。
在某些实施方案中，本公开提供了抗PROCR抗体GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61。在其他实施方案中，本公开提供了抗PROCR抗体，其包含GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61的一个或多个CDR。
在一些实施方案中，本公开的抗体可以由杂交瘤细胞系产生。在这些实施方案中，本公开的抗体以约4pM至1μM的解离常数(Kd)结合至PROCR。在本公开的某些实施方案中，抗体以小于约100nM、小于约50nM或小于约10nM的Kd结合至PROCR。
在优选的实施方案中，本公开的抗体具有IgG1、IgG2或IgG4同种型，最优选IgG1同种型。在本公开的优选实施方案中，抗体包含人κ轻链和人IgG1、IgG2或IgG4重链。在具体实施方案中，抗体的可变区与IgG1、IgG2或IgG4同种型的恒定区以外的恒定区连接。在某些实施方案中，本公开的抗体已经被克隆以在哺乳动物细胞中表达。
在替代实施方案中，本公开的抗体可以在杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。在这些实施方案中，编码特定抗体的序列可以用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。根据这些实施方案，可以使用将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法来实现转化，包括例如将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体)中并用病毒(或载体)或通过本领域已知的转染方法转导宿主细胞。此类方法示例于美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(均通过引用全部纳入本文用于任何目的)。通常，使用的转化方法可能取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域众所周知的，包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包囊在脂质体中、和将DNA直接显微注射到细胞核中。
根据本公开的方法的某些实施方案，编码本公开的PROCR抗体的重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区或轻链可变区的氨基酸序列的核酸分子使用标准连接技术插入合适的表达载体中。在一个优选的实施方案中，PROCR重链或轻链恒定区被附加到合适的可变区的C-末端，并被连接到表达载体中。通常选择能在所用的特定宿主细胞中起作用的载体(即，载体与宿主细胞机制相容，从而可以发生基因的扩增和/或基因的表达)。有关表达载体的综述，参见Goeddel(编),1990,Meth.Enzymol.第185卷,学术出版社，纽约。
通常，在任何宿主细胞中使用的表达载体将包含用于质粒维持以及用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。此类序列通常包括以下核苷酸序列中的一个或多个：启动子，一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、包含供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码由于肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达多肽的核酸的多接头区域，和选择性标记元件。这些序列是本领域众所周知的。
本公开的表达载体可以从起始载体例如可商购的载体构建。这样的载体可以包含或可以不包含所有期望的侧翼序列。当载体中尚不存在本文所述的一个或多个侧翼序列时，这些侧翼序列可以单独获得并连接到载体中。用于获得各侧翼序列的方法是本领域技术人员众所周知的。
构建载体并将包含抗PROCR抗体的编码轻链或重链或轻链和重链的核酸分子插入载体的适当位点后，可将完整的载体插入合适的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。抗PROCR抗体的表达载体向所选宿主细胞的转化可以通过众所周知的方法完成，包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其他已知技术。选择的方法将部分取决于所用宿主细胞的类型。这些方法和其他合适的方法是技术人员众所周知的，并且例如在上文的Sambrook等中有阐述。
在适当条件下培养时，宿主细胞会合成抗PROCR抗体，随后可从培养基(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生它的宿主细胞(如果未分泌)中收集抗PROCR抗体。合适的宿主细胞的选择将取决于多种因素，例如所需的表达水平，对于活性而言期望或必需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)以及折叠成生物活性分子的难易程度。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和许多其他细胞系。在某些实施方案中，可以通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有组成型PROCR结合特性的抗体来选择细胞系。在另一实施方案中，可以从B细胞谱系中选择不产生其自身抗体但是具有产生和分泌异源抗体的能力的细胞系(例如，小鼠骨髓瘤细胞系NS0和SP2/0)。
药物组合物及其用途
在另一方面，提供了可用于本公开的方法的药物组合物，即，用于治疗PROCR+TNBC的药物组合物。
在一个实施方案中，用于治疗TNBC的药物组合物包含PROCR抑制剂和药物载体。可以将PROCR抑制剂与药物载体一起配制为药物组合物。另外，药物组合物可以包括例如使用该组合物治疗PROCR+TNBC患者的说明书。
在一个实施方案中，组合物中的PROCR抑制剂是抗PROCR抗体，例如GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61或包含GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61的CDR的抗体，所述CDR以与它们在GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61中相同的相对顺序排列，从而提供对PROCR的免疫特异性结合。在一些实施方案中，本公开提供了可以与GS5、GS4、GS2、HD13、HD21、HD44、HD58或HD61交叉竞争结合PROCR的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂和生理上相容的其他赋形剂。优选地，载体适合于肠胃外、口服或局部用。取决于给药途径，可以将活性化合物例如小分子或生物剂包被在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。
药学上可接受的载体包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌水溶液或分散液和无菌粉剂，以及用于制备片剂、丸剂、胶囊等的常规赋形剂。此类介质和试剂用于配制药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则可考虑将其用于本文提供的药物组合物中。补充性活性化合物也可以掺入组合物中。
药学上可接受的载体可以包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本文提供的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。当需要时，适当的流动性可以被维持，例如可以通过使用包覆材料如卵磷脂，通过在分散的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇，山梨醇或氯化钠是有用的。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
这些组合物还可包含功能性赋形剂，例如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。
在制造和储存条件下，治疗组合物通常必须是无菌的、非系统发生的并且稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。
可以通过将所需量的活性化合物与以上列举的成分之一或组合按需并入适当的溶剂中，然后进行灭菌，例如通过微滤，来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物并入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含基本分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥(冻干)，该步骤从活性成分和任何其他所需成分的在先无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。可以在无菌条件下将一种或多种活性剂与另外的药学上可接受载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
可以通过上述灭菌方法以及通过包含各种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等，来确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
包含PROCR抑制剂的药物组合物可以单独或联合治疗给药。例如，联合疗法可包括本文提供的组合物，其包含PROCR抑制剂和至少一种或多种附加的治疗剂，例如本领域已知的一种或多种化学治疗剂，这将在下面进一步详细讨论。药物组合物也可以与放射疗法和/或手术联合施用。
调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如，治疗响应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
用于施用抗体的示例性剂量范围包括：10-1000mg(抗体)/kg(患者体重)、10-800mg/kg、10-600mg/kg、10-400mg/kg、10-200mg/kg、30-1000mg/kg、30-800mg/kg、30-600mg/kg、30-400mg/kg、30-200mg/kg、50-1000mg/kg、50-800mg/kg、50-600mg/kg、50-400mg/kg、50-200mg/kg、100-1000mg/kg、100-900mg/kg、100-800mg/kg、100-700mg/kg、100-600mg/kg、100-500mg/kg、100-400mg/kg、100-300mg/kg和100-200mg/kg。示例性的剂量时间表包括每3天一次，每5天一次，每7天一次(即一周一次)，每10天一次，每14天一次(即每两周一次)，每21天一次(即每三周一次)，每28天一次(即每四周一次)和每月一次。
为了易于施用和剂量均匀，以单位剂型配制肠胃外组合物可能是有利的。如本文所用，单位剂型是指适合作为待治疗患者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含预定量的活性剂和任何所需的药物载体，该活性剂经计算可产生所需的治疗效果。单位剂型的规范直接取决于以下内容并由其决定：(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，以及(b)本领域中将这种活性化合物配制成用于个体敏感性治疗的内在限制。
可以改变本文公开的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以便获得对于特定患者、组合物和给药方式有效实现期望的治疗响应并且对患者无毒的活性成分的量。如本文中所用，“肠胃外”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
如本文所用，短语“肠胃外施用”和“在肠胃外施用”是指非肠内(即，通过消化道)和局部施用的施用方式，通常通过注射或输注，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。静脉内注射和输注通常(但不完全地)用于抗体给药。
当本文提供的药剂作为药物施用给人或动物时，它们可以单独给予或作为含有例如0.001至90％(例如0.005至70％，例如0.01至30％)活性成分并组合有药学上可接受载体的药物组合物给予。
在某些实施方案中，本文提供的用于抑制PROCR+TNBC细胞生长或用于治疗具有PROCR+TNBC的患者的方法和用途可包括给予PROCR抑制剂和至少一种不是PROCR抑制剂的附加的抗癌剂。
在一个实施方案中，至少一种另外的抗癌剂包括至少一种化疗药物。此类化疗药物的非限制性示例包括铂基化疗药物(例如顺铂、卡铂)、紫杉烷类(例如紫杉醇
Figure GDA0002610533020000371
多西紫杉醇
Figure GDA0002610533020000372
EndoTAG-1TM(紫杉醇包封在正电荷脂基复合物中的制剂；MediGene公司)、
Figure GDA0002610533020000373
(与白蛋白结合的紫杉醇制剂)、酪氨酸激酶抑制剂(例如imatinib/
Figure GDA0002610533020000374
sunitinib/
Figure GDA0002610533020000375
dasatinib/
Figure GDA0002610533020000376
)及其组合。
在另一个实施方案中，至少一种另外的抗癌剂包含EGFR抑制剂，例如抗EGFR抗体或EGFR信号传导的小分子抑制剂。一种示例性的抗EGFR抗体是西妥昔单抗
Figure GDA0002610533020000377
西妥昔单抗可购自ImClone Systems股份有限公司。抗EGFR抗体的其他实例包括马妥珠单抗(EMD72000)、帕尼单抗(
Figure GDA0002610533020000378
Amgen公司)；尼妥珠单抗(TheraCIMTM)和mAb 806。EGFR信号传导途径的示例性小分子抑制剂是吉非替尼
Figure GDA0002610533020000379
其可从AstraZeneca公司和Teva公司商购。EGFR信号传导途径的小分子抑制剂的其他实例包括厄洛替尼盐酸盐(OSI-774；
Figure GDA00026105330200003710
OSI Pharma公司)；拉帕替尼(
Figure GDA00026105330200003711
GlaxoSmithKline公司)；卡尼替尼(卡纽替尼二盐酸盐，Pfizer公司)；培利替尼(Pfizer公司)；PKI-166(诺华公司)；PD158780和AG1478(4-(3-氯苯胺)-6,7-二甲氧基喹唑啉)。
在另一个实施方案中，至少一种另外的抗癌剂包含VEGF抑制剂。示例性的VEGF抑制剂包含抗VEGF抗体，例如贝伐单抗(
Figure GDA00026105330200003712
Genentech公司)。
在另一个实施方案中，至少一种另外的抗癌剂包含抗ErbB2抗体。合适的抗ErbB2抗体包括曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。
一方面，可以通过实现治疗协同作用来证明根据本公开的组合的有效性得到改善。
当在给定剂量下两种产品的组合比在相同剂量下单独使用两种产品的各自最佳效果更好时，使用术语“治疗协同作用”。在一个实例中，可以通过使用从使用参数肿瘤体积的重复测量值(例如时间因子)的双向方差分析获得的估计值，将组合与最佳单一药物进行比较，来评估治疗协同作用。
术语“加和性”是指两种或多种产品在给定剂量下的组合等效于所述两种或更多种产品各自获得的功效总和，而术语“超加性”是指组合比使用所述两种或更多种产品各自获得的功效总和更有效。
可量化有效性(包括组合的有效性)的其他度量是通过计算log10细胞杀伤，这根据以下公式确定：log10细胞杀伤＝T-C(天数)/3.32×Td
其中T-C代表细胞生长的延迟，这是治疗组(T)的肿瘤和对照组(C)的肿瘤达到预定值(例如1g或10毫升)的平均时间(以天为单位)，Td表示对照组动物的肿瘤体积倍增所需的时间(以天为单位)。当应用此度量时，如果log10细胞杀伤大于或等于0.7，则该产品被视为具有活性；如果log10细胞杀伤大于2.8，则该产品被认为具有非常高的活性。
使用该度量，以其自身最大耐受剂量使用的组合(其中每种成分的剂量通常小于或等于其最大耐受剂量)，在其log10细胞杀伤大于单独施用最佳成分时的log10细胞杀伤值时，表现出治疗协同作用。在示例性情况下，组合的log10细胞杀伤超过组合的最佳成分的log10细胞杀伤值至少一个log细胞杀伤。
实施例
下列实施例，包括进行的实验和获得的结果仅用于说明目的，而不应解释为限制本公开。
实施例1：靶向蛋白C受体以在一部分三阴性乳腺癌亚型中抑制癌干细胞
乳腺癌具有异质性，特别是其中的三阴性乳腺癌，是由多种不同分子亚群构成，特性不明确，目前几乎没有靶向治疗的方法。我们最近鉴定了蛋白C受体(Procr)能够作为一个乳腺干细胞(MaSCs)表面的分子标记。这些乳腺干细胞位于正常乳腺的基底上皮层。我们假设TNBC很可能来自基底上皮层的乳腺干细胞，对小鼠和人的乳腺癌中的Procr进行了分析比较。在小鼠的乳腺组织中，Procr对乳腺的发育和稳态维持是必要的。通过移植实验和细胞谱系示踪实验，我们发现在Wnt-1基底样肿瘤中，Procr+cells是富集的肿瘤干细胞(CSCs)，但在Brca1基底样肿瘤或PyVT管腔肿瘤中不是。在人的乳腺癌中，PROCR高表达在约一半的三阴性乳腺癌病例中。通过病人来源的移植瘤模型(PDX)进行的实验表明，PROCR能够在这一类PROCR高表达的乳腺癌亚群中标记肿瘤干细胞(命名为PROCR+乳腺癌)。通过抑制性抗体干扰PROCR的功能能抑制肿瘤的生长和快速复发转移。我们的数据揭示了Procr在乳腺干细胞维持中的重要功能，同时提示了乳腺干细胞在乳腺癌发生过程中扮演重要角色。更进一步的，我们的工作提示PROCR能够作为一个生物标记进一步将三阴性乳腺癌划分成与临床更相关的不同亚群，并可能作为一个新的治疗靶点来用于治疗这类临床上重要的肿瘤亚型。
如图15所总结的：(1)Procr对于小鼠乳腺干细胞的功能至关重要，并能标记Wnt1基底细胞样乳腺肿瘤中的肿瘤干细胞；(2)PROCR能够作为一个生物标记进一步将三阴性乳腺癌划分成与临床更相关的不同亚群，即PROCR+三阴性乳腺癌(PROCR+肿瘤)和PROCR-三阴性乳腺癌；(3)PROCR的表达能富集PROCR+乳腺癌中的肿瘤干细胞；和(4)PROCR的抑制性抗体如纳米体(nanobody)能有效抑制PDX肿瘤的形成。
结果
介绍
乳腺癌(BC)包含多种生物学上不同的亚群并具有不同的临床表现。对于BC分类，传统上进行预后和管理通常借助一些免疫组化(IHC)标志物分子如雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)和HER2，结合临床病例特性来共同完成。这些IHC标记将患者划分成四个亚群：管腔A(ER+，PR+)，管腔B(ER+，PR+，HER2/Ki67+)，HER2(HER2+)和三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC，即缺少ER和PR的表达，同时没有出现HER2的基因扩增或过表达)(Foulkes et al.，2010)。三阴性乳腺癌占了新诊断乳腺癌病例的15-20％，通常具有更高的复发转移风险和更低的存活率(Foulkes et al.，2010；Lehmann et al.，2011)。三阴性乳腺癌是一个治疗困难且十分复杂的疾病，即使在很早期被诊断，其临床治疗也很难让人满意(Carey et al.，2010；Foulkes et al.，2010；Metzger-Filho et al.，2012)。三阴性乳腺癌在生物学中具有很强的异质性，不同病人的预后和对治疗的响应存在明显的差异(Adamo and Anders，2011；Perou et al.，2000；Prat et al.，2010)。缺少好的分子靶标是三阴性乳腺癌治疗中最主要的挑战。所以如何将三阴性乳腺癌进一步划分成具有明确定义的不同的分子亚型，并且鉴定驱动肿瘤发展的关键分子来作为新的靶向治疗的基础至关重要。
基因测序分析表明三阴性乳腺癌的基因表达与正常乳腺干细胞十分相似(Lim etal.，2009；Prat et al.，2010)。尽管有这些研究进展，正常乳腺干细胞与乳腺癌干细胞之间潜在的联系一直知之甚少。另一方面，有证据表明，BRCA1突变的三阴性乳腺癌起源于乳腺管腔祖细胞(Lim et al.，2009；Molyneux et al.，2010；Nolan et al.，2016；Proia etal.，2011；Sau et al.，2016)，提示正常乳腺干细胞在这些乳腺癌中与肿瘤干细胞可能不相关。现在越来越多的多研究意识到不同亚型的乳腺癌可能具有不同的细胞起源B(Li etal.，2003；Visvader，2011)，所以此前研究发现的乳腺干细胞可能与肿瘤干细胞不相关的这种与主流观点相矛盾的结果很可能是由于三阴性乳腺癌的异质性造成的。所以在我们的工作中，我们进一步研究了乳腺干细胞与一类特定的三阴性乳腺癌亚型之间的关系。我们此前的研究鉴定了在正常小鼠乳腺中，Procr能够作为乳腺干细胞的标记分子(Lin-，CD24+，CD29hi，Procr+)(Wang et al.，2015)。在这部分工作中，我们进一步研究了Procr在小鼠乳腺干细胞、小鼠乳腺肿瘤和人的乳腺癌中发挥的功能，并揭示了Procr表达的重要生理意义。之后我们研究了Procr在三阴性乳腺癌诊断和治疗中的潜在应用。
在乳腺的发育和稳态维持中，Procr是乳腺干细胞必须的
为研究Procr在乳腺干细胞的作用，我们制作了Procr的条件敲除小鼠模型(Procrflox/+)，在第二和第四外显子的两端插入LoxP位点(图1a，图8a-b，并描述于详细方法中)。Procrflox/+和纯合子突变(Procrflox/flox)表现正常(数据未显示)。为了在乳腺干细胞中特异的敲除Procr，我们将ProcrCreER-IRES-tdTomat/+小鼠(Wang et al.，2015)，之后称为ProcrCreER/+，与Procrflox/+小鼠交配。得到的ProcrCreER/flox(cKO)小鼠的发育正常并且乳腺没有异常的表型(数据未显示)。对对照组(Procrflox/+)和cKO组小鼠在青春期以前(2周大)注射他莫昔芬(TAM)。并在小鼠8周成年时观察Procr敲除的表型。对照组的乳腺上皮细胞能够充满整个乳腺脂肪垫(图1b)。令人惊讶的是，在cKO小鼠中，乳腺上皮的生长出现了停止，仅有一点点乳腺上皮分支分布在乳头处。(图1b)。当在小鼠4周大青春期诱导Procr的敲除时，乳腺的发育也遇到停滞，8周cKO小鼠的乳腺上皮细胞的生长仍然停留在淋巴结附近，与青春期乳腺上皮的位置类似(图8c-d)。
为了研究Procr在乳腺的稳态维持中的作用，我们在8周龄小鼠诱导Procr的敲除，这时候对照和cKO小鼠的乳腺都完成了发育并充满了脂肪垫。在敲除Procr 3周后，cKO乳腺变得稀疏且分支明显变少(图8e-f)。值得注意的是，通过全乳腺的免疫染色和流式细胞分析，我们发现cKO小鼠乳腺的基底细胞明显变少(图1c-d)。在不同时期Procr的敲除效率都得到了验证(图8g)。
由于Procr也在其他组织如血管内皮和间质细胞中表达，为了避免这些潜在的系统性效应，我们将100个分离自对照或cKO小鼠(未进行敲除Procr)乳腺的乳腺干细胞(Lin-，CD24+，CD29hi，Procr+)移植到受体裸鼠身上。分别在移植后不同的时间点(2周或4周)注射TAM在移植乳腺中敲除Procr。并在移植后9周分析移植的乳腺(图8h)。当2周注射TAM时，敲除Procr后移植后长出的乳腺与对照组相比明显变小(图8i)。而在移植后4周注射TAM，这时小鼠乳腺已经完成重建，与对照相比，Procr的敲除导致乳腺的分支明显变少，并且基底细胞的数目也明显减少(图8j-k)，与之前的Procr敲除的表型一致。综合这些结果表明Procr对乳腺干细胞在乳腺发育和乳腺稳态维持及再生过程中至关重要。
Procr能够标记MMTV-Wnt1基底样乳腺肿瘤中的肿瘤干细胞
接下来，我们在肿瘤形成中研究Procr。选用了三个不同的乳腺肿瘤模型：MMTV-Wnt1倾向于在干细胞和祖细胞中诱导肿瘤(Li et al.，2003)，并且与人的基底样乳腺癌和三阴性乳腺癌具有相似的转录组(Herschkowitz et al.，2007；Tsukamoto et al.，1988)，MMTV-PyVT与人的管腔B亚型乳腺癌最为接近(Guy et al.，1992；Herschkowitz et al.，2007)，MMTV-Cre；Brca1f/+；p53f/+肿瘤与人的BRCA1基底样肿瘤相似(Herschkowitz etal.，2007；Xu et al.，1999)。在3个肿瘤模型中，Procr+细胞都分布在少量的基底细胞和一些间质细胞中(图9a-c)。为研究Procr+细胞是否在这些肿瘤中标记肿瘤干细胞，从这些肿瘤中分选Procr+细胞(Lin-，CD24+，CD29hi，Procr+)和Procr-细胞(Lin-，CD24+，CD29hi，Procr-)并进行梯度稀释后移植到受体小鼠的乳腺脂肪垫中。对于移植到FVB受体的MMTV-Wnt1/FVB肿瘤细胞，Procr+能很容易的重建形成肿瘤，而与之鲜明对比的是，Procr-细胞不能形成肿瘤(图2a，图9d)。用裸鼠作为受体也得到相同的结果(图9e-g)。这些结果表明Procr+细胞在MMTV-Wnt1肿瘤中标记肿瘤干细胞。值得注意的是，此前有研究发现移植混在一起的MMTV-Wnt1基底和管腔细胞才能形成肿瘤，而移植基底细胞自己不能形成肿瘤(在遗传背景复杂的小鼠中)(Cleary et al.，2014)。而我们的结果提示，FVB背景的MMTV-Wnt1基底细胞自己，特别是Procr+基底细胞就能很高效的在移植后成瘤。这些观察到的现象等不一致可能是由小鼠的遗传背景决定的，此前也有报道证明遗传背景会影响MMTV-Wnt1肿瘤的形成(Li et al.，2000)。我们也用MMTV-PyVT和MMTV-Cre；Brca1f/+；p53f/+肿瘤做了相似的实验。分选的Procr+和Procr-细胞移植到裸鼠受体中。有意思的是，它们形成肿瘤肿瘤的能力并没有明显的差别(图2b-c)，这也提示Procr在这些肿瘤亚型中不标记肿瘤干细胞。这些结果表明Procr标记了一类特定的干细胞起源的乳腺肿瘤中的肿瘤干细胞(Wnt1基底样肿瘤)。
为了进一步研究Procr+细胞对于MMTV-Wnt1基底样肿瘤形成和发展的贡献，我们用MMTV-Wnt1；Procr-CreERT2；R26-mTmG小鼠进行了谱系示踪实验。首先我们在8周龄的恶性病变前的小鼠乳腺中进行细胞谱系示踪，通过注射TAM来随机标记Procr+细胞；之后分析后代被mGFP(mG)标记的细胞随时间变化的命运(图2d)。在TAM注射2天后，mG+细胞散在分布在未发生恶性转变的乳腺上皮细胞的基底层(mG+，K14+，K8-)，表明这些细胞是最初被标记的Procr+细胞(图2e-f)。经过6个月以后，一些MMTV-Wnt1乳腺还未成瘤，而有些乳腺发育成了肿瘤(Li et al.，2000)。在这两种情况下都观察到大的mG+克隆(图2g-h，图9h-j)。统计分析显示随着时间推移，mG+细胞的比例增高，表明Procr+乳腺干细胞在肿瘤形成过程中能够形成更多的后代(图2i)。值得注意的是，在未成瘤的乳腺中，乳腺的双层上皮结构得以维持，显然mG+能够贡献于基底和管腔细胞中(图9i-j)。接下来我们在6个月大已经形成了肿瘤(在早期阶段)的MMTV-Wnt1；Procr-CreERT2；R26-mTmG小鼠中注射TAM。(图2j)，我们观察到在注射TAM两天后有单个的mG+细胞被标记(图2k-i)，并且这些细胞在未来3周大肿瘤快速增长期能够形成更多的肿瘤细胞(图2m-n)。这些遗传谱系示踪实验支持了Procr+细胞是MMTV-Wnt1乳腺肿瘤中的富集的肿瘤干细胞。
Procr对MMTV-Wnt1乳腺肿瘤的生长至关重要
为了研究Procr对MMTV-Wnt1肿瘤形成的重要性，我们在肿瘤移植实验中敲低Procr的表达，并检测其对于肿瘤异种移植的影响。从MMTV-Wnt1原代肿瘤中分离的单细胞被sh-Procr(带有GFP tag)病毒感染。感染后的细胞通过GFP进行分选后移植到免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪垫。我们发现抑制了Procr表达会显著移植移植细胞的肿瘤形成，而对照组能够正常形成肿瘤(图10a-d)。将MMTV-Wnt1移植到同背景的FVB乳腺脂肪垫也会得到相似的结果(图10e-g)。所以，抑制Procr能够使MMTV-Wnt1肿瘤中的肿瘤干细胞丧失成瘤能力。这提示Procr对于特定的基底样乳腺肿瘤的形成至关重要。
PROCR在一半的三阴性乳腺癌病例中高表达，并且与PROCR低表达的三阴性乳腺癌相比具有更差的临床预后
在人的乳腺癌组织中，我们首先检测了PROCR在非癌乳腺组织中的表达。免疫组织化学染色显示，在多数组织中，PROCR散在表达在导管上皮的基底细胞中(图3a，n＝4病例)。在少数的区域，PROCR的染色信号能在很多的基底细胞中检测到(图11a)。这与之前的一个报道的发现一致(Shipitsin et al.，2007)。流式细胞分析统计表明PROCR在3％的基底上皮细胞和3.5％的间质细胞中表达。而在管腔细胞中不表达(图3b，图11b)。所以PROCR在人的非癌乳腺组织中的表达与其在小鼠乳腺中的表达分布是一致的(Wang et al.，2015)。
随后，我们对含有八十例乳腺癌肿瘤的大块组织切片进行了PROCR的染色分析(每个亚型20例，包括管腔A、管腔B、HER2+和三阴性乳腺癌)。我们发现与管腔亚型和HER2+亚型相比，PROCR的表达在三阴性乳腺癌中显著增高(图11c)。在三阴性乳腺癌中，20例中的13例(65％)H-score高于80(图11d)。为扩大样本量，我们使用了含有449例乳腺癌和71例对照非癌乳腺组织的组织芯片来考察PROCR的表达情况。与之前的结果一致，三阴性乳腺癌中具有更多的PROCR高表达的病例(52.35％PROCR高表达(score＝2，3)；47.64％PROCR低表达(score＝0，1)，n＝149)。PROCR高表达的病例在非瘤乳腺组织和其他亚型乳腺癌中显著低，比例从2％到7％不等(图2c-d)。我们进一步考察了PROCR的表达与各种临床指标的关系。与之前的结果一致，在乳腺癌中，PROCR的表达与ER水平(P<0.001)，PR水平(P<0.001)和HER2水平负相关(P<0.001)，但与其他的临床病理指标没有明显的相关性(表1)。
表1.在我们采用的样本中，各临床病理指标与PROCR表达的相关性
Figure GDA0002610533020000441
缩写：PROCR，蛋白C受体；ER，雌激素；PR，孕激素受体；HER-2，人表皮生长因子2；TNBC，三阴性乳腺癌
a基于Pearson X2试验(当需要时应用Fisher精确检验)。
b亚型定义：管腔(ER和/或PR阳性)，HER-2富集(ER和PR阴性，HER-2阳性)，以及TNBC(ER阴性，PR阴性和HER-2阴性)
我们考察了乳腺癌中PROCR表达的临床重要性。在三阴性乳腺癌病人中，与PROCR低表达的乳腺癌病例相比，通过Kaplan-Meier分析发现，PROCR的高表达提示了更差的无病生存率(DFS)(图3e)。而在激素受体阳性亚型和HER2+亚型中，PROCR的表达与病人的预后不相关(图3f-g)。在用我们的样本分析的同时，我们也采用了更大的乳腺癌公共数据库(Kaplan-Meier Plotter)中的数据进行了分析，结果也支持在激素受体阴性乳腺癌中PROCR的表达与更差的临床预后相关(图11e)，而在激素受体阳性乳腺癌中，PROCR的表达与预后无关(图11f)。此外，单因素和双因素分析发现PROCR的表达与更高的疾病风险相关(双因素分析仅表现出趋势，表2)。综合这些结果表明，PROCR-高表达的乳腺癌占三阴性乳腺癌病例的一半，通过免疫组织化学染色检测PROCR的表达能够将三阴性乳腺癌进一步划分成两个具有不同临床预后的亚群。
表2.单因素和双因素分析各因子与三阴性乳腺癌病人无疾病生存的关系
Figure GDA0002610533020000451
缩写：PROCR，蛋白C受体；TNBC，三阴性乳腺癌
我们也在人的乳腺癌细胞系中检测了PROCR的表达。定量PCR分析显示所有检测的ER+/PR+细胞系(T-47D，ZR75-1，MB415和MCF-7)和HER2+细胞系(SK-BR-3，MDA-MB-453和BT474)都表现出PROCR的相对低表达。一部分三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231，Hs578T，HCC38，CAL51和HCC1806)高表达PROCR，而另一些三阴性乳腺癌细胞系(DA-MB-468，BT549，MDA-MB-436，HCC1937，HCC1599和HCC2157)低表达PROCR(图12a)。这些结果与我们在病人组织切片中的发现相一致(52％的三阴性乳腺癌病例高表达PROCR)，都支持我们的设想，即PROCR的表达能用于三阴性乳腺癌的分型。
PROCR高表达的三阴性乳腺癌与BRCA1突变的三阴性乳腺癌是不同的亚群
有意思的是，我们发现携带BRCA1突变的细胞系(MDA-MB-436，HCC1937,和HCC2157)或BRCA2突变的细胞系(HCC1599)都是PROCR低表达的三阴性乳腺癌亚群(图12a-b)。所以我们进一步研究了PROCR表达水平与BRCA1的突变状态是不是存在负相关。我们使用了58个三阴性乳腺癌样本(28个携带BRCA1突变，30个为BRCA1野生型病例)。我们发现大部分的BRCA1突变病例低表达PROCR(89.3％，n＝28)，而大部分BRCA1野生型的三阴性乳腺癌高表达PROCR(70％，n＝30)，表现为H-score高于80(图12c-d；表3)。综合这些细胞系和病人组织染色的结果，表明PROCR高表达的三阴性乳腺癌与BRCA1突变的三阴性乳腺癌存在负相关，提示可能存在一个有趣的假说，即这两类亚群的三阴性乳腺癌为分离的亚群，具有不同的生物学基础。
表3.三阴性乳腺癌的各临床病理指标与BRCA1突变状态的关系
Figure GDA0002610533020000461
缩写：PROCR，蛋白C受体；TNBC，三阴性乳腺癌
a基于Pearson X2试验(当需要时应用Fisher精确检验)。
基于全基因组测序研究，此前报道了这些三阴性乳腺癌细胞系能够被进一步分成基底样和Claudin低表达的亚型(Prat et al.，2010)，或可分成分裂相关亚型、间质相关亚型和免疫相关亚型(Lehmann et al.，2011)。然而PROCR的表达与这些分离标准并不相关(图12b)。定量PCR进一步验证了PROCR高表达的三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231，Hs578T)或PROCR低表达的三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-436，HCC1599和HCC2157)表现出了Claudins(Claudin3/4/7)的低表达(图12e)，这表明PROCR的水平与基底样和Claudin低表达的分型无关。
在人PROCR+乳腺癌中PROCR标记肿瘤干细胞
接下来我们研究了在PROCR高表达的三阴性乳腺癌(后续称为PROCR+BC)中，PROCR是否富集了肿瘤干细胞。由于所有的MDA-MB-231细胞都表达PROCR，使得这个细胞系不适合研究肿瘤干细胞(见讨论)。所以我们使用了病人来源的移植瘤模型作为更好的原代肿瘤的代表模型。免疫组织化学染色确认这3例PDX肿瘤细胞不表达ER，PR和HER2，但高表达PROCR(图4A，图13a-c)。流式分析显示在这些PDX肿瘤中，PROCR+占肿瘤细胞的约50％(图4A，b，图13，d-e)，与非肿瘤乳腺组织中的PROCR+比例(3％)相比，有显著的上升。PROCR+和PROCR-肿瘤细胞都能分裂，但PROCR+肿瘤细胞表现出多约2倍的G2/M期细胞(4N)(图4A，c)，EdU+和Ki67+细胞(图4A，d-e)。TUNEL染色显示两组细胞的凋亡没有差别(图4A，f)。为了考察这些细胞的肿瘤形成能力，我们从PDX肿瘤细胞中分选PROCR+和PROCR-细胞，进行梯度稀释后移植到免疫缺陷的受体小鼠中。PROCR+细胞能很容易的形成肿瘤(1/64的肿瘤干细胞效率)。甚至移植单个细胞都有30％肿瘤形成率(30个中9个成瘤)(图4A，g)。尽管PROCR-细胞能够分裂，但它们起始肿瘤的能力很差(1/29475肿瘤干细胞效率)，提示这些细胞不能驱动肿瘤形成(图4A，g)。流式分析显示移植PROCR+细胞形成的肿瘤中包含PROCR+和PROCR-细胞，并与亲代的肿瘤具有相似的比例(图4A，h)，提示PROCR+细胞能够分化形成PROCR-细胞。对两个肿瘤PDX细胞测序结果进行基因簇富集分析(GSEA)发现EMT相关基因，Myc靶基因和乳腺干细胞基因在PROCR+细胞中富集(4A，i)。热图分析和Western分析进一步验证了PROCR+细胞与PROCR-细胞相比具有低的E-cad水平，高达Slug和c-Myc表达(图4A，j-k)。综合这些结果，证明PROCR+细胞是PROCR+乳腺癌(PROCR高表达的三阴性乳腺癌)中的肿瘤干细胞。
抑制PROCR能抑制PROCR+乳腺癌的形成
我们接下来考察了通过靶向PROCR抑制PROCR+乳腺癌生长的可能性。三例PROCR+乳腺癌PDXs细胞消化后感染sh-PROCR病毒，感染细胞经GFP标签进行流式分选后移植到受体小鼠的乳腺脂肪垫中(图5a)。我们发现与对照组(scramble control)相比，敲低PROCR的表达显著抑制三例PDX肿瘤的生长(图5b-g)。此外，敲低PROCR带来的效果也用CRISPR干扰的方法进行了验证(Gilbert et al.，2013)。对PDX肿瘤细胞感染dCas9-KRAB和sgRNA(sg-PROCR)(图5h)。用sgRNA敲低PROCR也能显著抑制移植后肿瘤的形成(图5i-j)。敲低PROCR带来的效果也通过细胞系进行了验证。在MDA-MB-231细胞中，用两种独立的PROCR shRNAs分别感染细胞，显著抑制细胞的分裂(图13f-g)。在移植实验中，与对照相(scramblecontrol)比，sh-PROCR能够显著延缓MDA-MB-231细胞的肿瘤形成和生长(图13h)。而与之相对比，PROCR的敲低对PROCR低表达的三阴性乳腺癌(BT549)或ER+/PR+管腔乳腺癌(MCF-7)的生长和肿瘤形成没有抑制效(图13i-j)。综合这些结果证明了PROCR能被用作靶向抑制PROCR+乳腺癌的靶点。
PROCR的抑制性纳米抗体能抑制PROCR+乳腺癌的生长
接下来我们采用了临床上更可接受的方法考察靶向PROCR的治疗效果。我们制备了一个靶向PROCR细胞外区段的包含羊驼的VHH区的单结构域抗体GS5(Hamers-Castermanet al.，1993)。它能够阻断PROCR与其配体蛋白C的结合(图6a，图14a-b，详细信息见方法)。在MDA-MB-231细胞培养中，添加抑制性抗体能够抑制细胞的分裂，降低传代过程中细胞的数量并减少EdU的插入(图6b-c)。TUNEL染色显示没有明显增多的细胞凋亡(图6d)。我们最近的工作解析了三阴性乳腺癌细胞中的PROCR信号通路，PROCR能够激活pSrc，之后活化IGF-1R进而激活MEK-ERK和PI3K-Akt-mTOR信号通路，同时，PROCR通过一个细胞表面效应分子F2R激活RhoA-ROCK-p38信号通路(JBC修订版，见补充操作手册)。这里我们也研究了PROCR抑制性纳米抗体对PROCR信号通路的影响。在细胞培养过程中，添加抗体12小时开始看到明显的pSrc，pIGF-1R和所有的已知PROCR相关细胞内信号通路活性的降低，并且在16小时更为显著(图6e)。EGFR的T845位点是一个已知的被Src磷酸化的位点(Tice et al.，1999)，该位点在抗体处理后磷酸化出现下降，而其他EGFR位点(T1068和T1173)不受影响(图14c)。这也显示了抗体靶向PROCR相关信号通路的特异性。同时，PROCR+细胞具有明显的EMT特性，我们也考察了纳米抗体是否会影响EMT。如我们所预期的，纳米抗体能够抑制细胞的间质属性。被抗体处理后的细胞，E-cad表达增强，而Vimentin，Slug和Zeb1水平降低(图6f)。
我们进一步在体内验证抗体对肿瘤的抑制。对携带PROCR+乳腺癌PDX肿瘤的小鼠腹腔注射抑制性抗体。注射时间在移植后5天开始，总共注射5次抗体。我们发现肿瘤的生长被显著抑制(6倍抑制效果，图6g)。相似的抑制效果在三个PDX中都有发现(图14d-e)。进一步观察剩余的肿瘤。我们发现在IgG对照处理后的肿瘤保持与亲代肿瘤相似的PROCR+细胞比例(48.2％)，而抗体处理后的PROCR+细胞比例降低到22.1％，这也支持抗体能够直接靶向PROCR+细胞从而抑制肿瘤生长(图6h)。接下来我们想要研究抗体能否影响已经形成的PDX肿瘤。在PDX肿瘤长到约200mm3时开始用抗体处理。将纳米抗体或其他化疗药物(paclitaxel和doxorubicin；PTX/DOX)单独使用或联合使用。我们发现纳米抗体单独使用(3倍肿瘤抑制，蓝色线)比PTX/DOX单独使用(2倍肿瘤抑制(图6i，绿线)效果更好。令人惊讶对是，药物联合使用(32倍抑制)能够完全抑制已经形成的肿瘤的生长(图6i，黑线)。我们对处理后的肿瘤进行了分析。有意思的是，PTX/DOX处理后，PROCR+细胞的比例上升到了77.7％，表明PTX/DOX很可能倾向于杀伤PROCR-细胞，而PROCR+细胞可能天然的更抗化疗药物(图14f)。PROCR+细胞的EMT特性可能对其化疗药物耐受有帮助。这些处理后的肿瘤也被消化成单细胞进行体外培养考察细胞的分裂能力。与对照相比，经过PTX/DOX处理的肿瘤上皮细胞细胞数目在第三天有1.5倍升高，而抗体处理的肿瘤细胞在第三天分裂降低了1.8倍(图14g)。抗体处理后PROCR+肿瘤干细胞的比例降低和分裂能力降低可能代表了更加缓慢的肿瘤复发。所以我们进一步考察了各组处理后肿瘤的发展。停止PTX/DOX处理导致很快的复发转移，显示为肿瘤大小急剧增长(图6i，绿线)，这可能与PTX/DOX处理后肿瘤起始细胞(PROCR+细胞)比例的增长有关。而相对的，快速的复发并没有在撤销抗体处理后表现会出来(图6i，蓝色和黑色线)。这些数据进一步夯实了我们的结论，即抑制PROCR能够通过直接靶向PROCR+肿瘤中的肿瘤起始细胞(TICs)来抑制肿瘤生长，也进一步证明了PROCR的抑制性单克隆抗体能够作为一个潜在的PROCR靶向药物来抑制这一类亚型的乳腺癌。
讨论
我们的研究揭示了PROCR在乳腺干细胞和一类特殊的三阴性乳腺癌亚群中的肿瘤干细胞中的功能和生物学重要性。三阴性乳腺癌被认为是一类异质性的肿瘤，虽然有相似的表型，但具有不同的基因型和对化疗预测和响应性。我们的研究如图7a所述，提供了一种新的基于PROCR表达的三阴性乳腺癌分类依据。在我们的样本中，我们发现了一类PROCR+乳腺癌亚群约占三阴性乳腺癌病例的一半，与PROCR低表达的乳腺癌相比，具有更差的预后。进一步研究发现，在PROCR+乳腺癌中，PROCR+是其中的肿瘤干细胞，这些细胞能被PROCR的抑制性纳米抗体靶向。这种新的基于PROCR表达的乳腺癌分型具有广泛的临床应用前景。首先，PROCR的表达可以通过免疫组织化学染色进行衡量。这是一种非常常规的乳腺癌诊断方法。其次，我们也发现了在PROCR+乳腺癌中肿瘤存活和生长的分子通路，这种新的分型将会对这类乳腺癌病人的治疗提供新的策略，例如潜在的联合抑制这些PROCR+细胞中的信号通路。
在此前的有些研究中，借助一些潜在的标记基因，证明了乳腺癌中肿瘤干细胞的存在(Al-Hajj et al.，2003；Ginestier et al.，2007)。有意思的是，此前，他人报道过在一群富集的CD44+肿瘤干细胞中测到PROCR的表达(Shipitsin et al.，2007)。这些研究的一个潜在的问题是不同亚型的乳腺癌之间的抑制性可能非常广，所以用单一的干细胞类群来应用于所有的乳腺癌很可能是不准确的。PROCR标记三阴性乳腺癌中的肿瘤干细胞的设想在之前借助MDA-MB-231细胞进行的体外研究中曾有提及(Hwang-Verslues et al.，2009；Schaffner et al.，2013)。但是MDA-MB-231是一个均一的乳腺癌细胞系，并具有广泛的PROCR表达水平，完全不适合用来研究乳腺干细胞(Wang et al.，2017)。在本研究中，我们提出PROCR+细胞是PROCR+乳腺癌亚型中的肿瘤干细胞。依据以下几个肿瘤干细胞的功能性实验(Clarke et al.，2006；Kreso and Dick，2014)：这群细胞能够1)被有效的分离(Lin-，Epcam+，PROCR+)；2)能够在单细胞水平移植成瘤并传代3)形成的异种移植肿瘤与前代肿瘤相似，和4)能够形成PROCR-细胞。这些PROCR-细胞能够分裂但不具备单独形成肿瘤的能力。我们的研究还进一步验证了PROCR是一个存在于乳腺干细胞表面的潜在药物靶点。通过抑制性纳米抗体抑制PROCR的功能会导致MEK-ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK信号通路的同时阻断和细胞EMT特性的抑制。并最终在很大程度上抑制肿瘤的形成。值得注意的是，PROCR的抑制对于低表达PROCR的三阴性乳腺癌(QNBC)或ER+/PR+乳腺癌没有效果，这也进一步证实了肿瘤干细胞的特性和乳腺癌的治疗方法是需要依赖于乳腺癌的分型来决定。
尽管最近的一些研究取得了一定的进展，但正常组织中的乳腺干细胞与肿瘤干细胞的潜在联系一直没有明确的结论(Chakrabarti et al.，2014；Su et al.，2016；Zhanget al.，2008)。有证据表明BRCA1 TNBC起源于管腔祖细胞(Lim et al.，2009；Molyneux etal.，2010；Nolan et al.，2016；Proia et al.，2011；Sau et al.，2016)。有意思的是，我们的数据提示PROCR+乳腺癌与BRCA1 TNBC是不同的亚群。它们很可能具有不同的细胞来源。Procr能在正常小鼠乳腺中标记表现出EMT的特性的干细胞(Wang et al.，2015)。在我们的研究中，我们的数据证明PROCR的表达也能够标记人PROCR+乳腺癌中的具有EMT特性的肿瘤干细胞。所以有可能的假说是：PROCR+乳腺癌是由正常的PROCR+乳腺干细胞的恶性病变引起的。乳腺干细胞通过积累遗传突变，转变为肿瘤干细胞，但PROCR的基因表达和相关分子特性仍然伴随着这些细胞存留了下来(图7b)。
综上所述，我们的研究发现PROCR能够作为一个生物标志物来进一步将三阴性乳腺癌划分成不同的临床亚型。同时，我们的研究也揭示了PROCR在PROCR+乳腺癌中发挥的促进肿瘤形成的核心作用。PROCR的抑制纳米0.性抗体能够十分有效的抑制PROCR+乳腺癌的生长。我们的研究提示了在PROCR+乳腺癌中，PROCR是一个具有广阔应用前景的乳腺癌靶向治疗的细胞表面靶点。
方法
病人与组织切片样品
人乳腺癌组织来自复旦大学肿瘤中心，并得到了复旦大学上海肿瘤中心伦理委员会的批准。所使用的新鲜样本是组织形态正常的癌旁乳腺组织。对于PROCR在大块组织切片样品上的免疫组织化学染色分析，共计采用了80例从2013年8月到2014年3月间从复旦大学肿瘤中心手术平台随机收集的处于1期到3期的女性浸润性导管癌乳腺癌样品。乳腺癌的临床病理诊断由肿瘤中心病理科的病理专家完成。在我们的研究中，ER，PR和人表皮生长因子受体2(HER2)的表达情况通过免疫组织化学染色确定。大部分(但并非全部)在免疫组化上表现为HER2表达(score≥2)的病例进一步通过荧光原位杂交(FISH)确认HER2基因是否存在扩增。HER2过表达的亚群最终被定义为荧光原位杂交信号阳性或免疫组化染色score≥3。因此，乳腺癌病例基于ER、PR、HER2表达最终被划分为4种不同的分子亚型包括管腔A亚型(ER+和/或PR+，低Ki67)，管腔B亚型(ER+和/或PR+，高Ki67或HER2+)，HER2+亚型(HER2+，ER-和PR-)，和三阴性亚型(ER-，PR-,和HER2-)。PROCR的蛋白水平在共计80例乳腺癌样品的大块组织切片(每个亚型20例)中通过免疫组织化学染色进行了分析。
为了在更大的乳腺癌样本库中检测PROCR的预后值，我们使用了含有450例乳腺癌样本和72个非癌乳腺对照的组织芯片来考察PROCR的表达水平。组织芯片中肿瘤样品的选择标准在之前的研究中进行了描述(Ye et al.，2015)。概括来说，乳腺癌病例的选择满足以下标准(i)诊断为1-3期原发性乳腺癌的女性病例；(ii)全部为浸润性导管癌病例(IDC)；排除了原位型导管癌病例(iii)没有任何被诊断为转移的迹象；(iv)病人完成了乳房切除并且腋下淋巴节的去除或进行了保乳手术和辅助化疗；乳腺癌的诊断和治疗策略基于中国抗癌协议颁布的指导手册完成。
对于组织芯片的样品采集，我们采用了完全随机的方法，从2001年8月到2008年1月间在复旦大学上海肿瘤中心乳腺外科诊断的1709例符合条件的样本中选出了207个管腔亚型的乳腺癌，93个HER2阳性乳腺癌亚型和150个三阴性乳腺癌亚型。此外，如之前的描述(Ye et al.，2015)总共72例经过病例分析确认为良性乳腺组织的的对照收集自2013年1月到2013年2月间来到复旦大学上海肿瘤中心进行肿瘤筛查的女性。该研究得到了复旦大学上海肿瘤中心相关委员会的审核通过，研究中所有样品的获取均通知了病人并获得了同意。
组织芯片(TMA)
组织芯片包含了上述的450乳腺癌和72个非瘤乳腺对照的石蜡包埋样品并使用tissue micro arrayer(UNITMA Instruments，Seoul，Korea)进行制作。对每个使用的样品经过伊红苏木精(HE)染色确认其最具代表性的肿瘤核心区域。组织芯片中的每个样本采用了一个肿瘤中2个不同部位的肿瘤核心区域，每个区域直径为1mm。组织芯片的切片经过脱蜡和复水后进行免疫组化染色。PROCR染色的统计由两个实验人员在对所有临床数据完全不了解的条件下独立平行完成。
乳腺癌大块切片和组织芯片免疫组化结果的评判
在80例乳腺癌大块样品切片中，PROCR的表达水平按照免疫反应的H-score(HS；range 0–300)进行半定量分类，H-score是由染色深度score(1，无/弱；2，中等；3，强)乘以染色阳性的细胞比例score得来(在1％到100％之间)。
在组织芯片中，共分析了450例浸润性导管癌样品和72个非癌乳腺组织的样品。在这些样品中，有7例乳腺癌和1例正常乳腺样品出现了2个组织中心在免疫组织化学染色后同时丢失的情况。所以，共有443个乳腺癌和71个非瘤乳腺样品用于后续的统计分析。每个病人样品的两个组织中心也都用半定量的方法并且采用上述相同的H-score标准进行分类。接着，score分类基于以下的H-score值进行划分：HS<80，scored记为0；80<HS<120，scored计为1；120<HS<150，scored记为2，HS>200，scored记为3。如果score值大于或等于2，则肿瘤样品被认为是PROCR高表达，否则被划分为PROCR低表达。
按照这样的原则，染色结果由DS Wang和F Qiao分别独立完成，两个实验人员在进行染色结果分析前对临床数据完全不知情。
用组织芯片数据和Kaplan-Meier Plotter进行Kaplan-Meier生存分析
在上述的组织芯片的病人进行了相关的随访，共计得到了415个病人的随访结果。最后一次随访结果的更新在2014年10月。随访时间段被定义为从手术后到随访丢失或复发转移或死亡的时间，以进行完整调查。无疾病生存(DFS)被定义为从初次手术到复发转移或因乳腺癌死亡的事件或随访截止时间2014年10月。DFS代表第一次原位复发或近端远端转移或因乳腺癌造成的死亡。达到随访时限或中途丢失随访的被认为是通过了审查的。所以共计415例病例参与了Kaplan-Meier生存分析。
此外一个大的乳腺癌临床数据库的数据(Kaplan-Meier Plotter)也被用来分析PROCR表达和临床预后的关系，样本选择的限制条件如下：1)140个月随访时间2)选择了中等的临界值3)选择了有ER表达信息的病例。这个数据库最初的目的是进行基于生物标记物评价的荟萃分析。我们在671个激素受体阴性和1802个激素受体阳性的乳腺癌病人中考察了PROCR表达对病人无疾病生存时间的影响。采用了数据库的最新版本(2014年版本，http://www.kmplot.com/analysis/index.php？p＝service)。
实验动物
我们构建了靶向Procr的Procrflox小鼠，在Procr的第二个外显子前插入loxP位点，在第四外显子后插入frt-flanked PGK-neo元件和第二个loxP位点。基因型鉴定后，Procrflox小鼠与可进行生殖系传递的带Flpase酶的小鼠品系交配以去除frt-flanked NEO选择元件。ProcrCreERT2-IRES-tdTomato小鼠在之前研究中也进行了描述(Wang et al.，2015)。为了条件诱导Procr的敲除，每隔两天对小鼠腹腔注射4mg/25g体重的，稀释在葵花籽油中的他莫昔芬(TAM，Sigma-Aldrich)，共注射3次。本研究使用了MMTV-Wnt1，MMTV-PyVT，MMTV-Cre，Brca1f/+，p53f/+,裸鼠和SCID/Beige小鼠品系。实验动物方法得到了中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所实验动物管理委员会的批准。
细胞系和细胞培养
MCF7，SK-BR-3，MDA-MB-231，Hs578T，T-47D，ZR-75-1，MDA-MB-415，MDA-MB-453，BT474，MDA-MB-436，BT549，HCC38，CAL51，HCC1806，MDA-MB-468，HCC1937，HCC1599和HCC2157人乳腺癌细胞系和HEK293T细胞系来自上海细胞库型培养收集委员会或AmericanType Culture Collection(ATCC)，并按照供应商意见在全细胞培养液中培养。
抗体
免疫组织化学染色抗体：小鼠抗人PROCR(1:300，Abcam)，兔抗人K14(1:100，Thermo)，小鼠抗ER(1:50，DAKO)，小鼠抗PR(1:50DAKO)，兔抗HER2(1:50，Proteintech)。
Western blotting使用的抗体：兔抗人PROCR(1:200，Novus)，兔抗人phospho-Src(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人总Src(1:1000，Cell SignalingTechnology)，兔抗人phospho-MEK(1:1000，Cell Signaling Technology)，小鼠抗人总MEK(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人phospho-ERK(1:1000，Cell SignalingTechnology)，兔抗人总ERK(1:100，Santa Cruz)，兔抗人phospho-Raf(1:100，SantaCruz)，兔抗人总Raf(1:100，Santa Cruz)，兔抗人phospho-Akt(1:1000，Cell SignalingTechnology)，兔抗人总Akt(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人phospho-GSK3β(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人总GSK3β(1:1000，Cell SignalingTechnology)，兔抗人phospho-CREB(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人总CREB(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人phospho-S6K(1:1000，Cell SignalingTechnology)，兔抗人总S6K(1:1000，Cell Signaling Technology)，小鼠抗人c-Myc(1:100，Santa Cruz)，小鼠抗人Cyclin D1(1:100，Santa Cruz)，小鼠抗人RhoA(1:100，SantaCruz)，兔抗人ROCK2(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人phospho-p38(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人p38(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人phospho-IGF1R(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人IGF-1R(1:1000，CellSignaling Technology)，兔抗人phospho-EGFR(Tyr1068，Tyr1173，Tyr845)(1:1000，CellSignaling Technology)，兔抗人EGFR(1:1000，Cell Signaling Technology)，小鼠抗tubulin(1:5000，Sigma)和兔抗GAPDH(1:5000，Proteintech)。
人磷酸化蛋白激酶芯片(R&D system，ARY003B)按照试剂盒的说明书进行使用。每组样品需要106个MDA-MB-231细胞用于分析。人磷酸化RTK芯片((R&D system，ARY001B)按照试剂盒的说明书进行使用。每组样品需要106个从PDX肿瘤中新鲜分选的PROCR+或PROCR-细胞。蛋白样品在进行芯片分析前通过Western印迹分析Tubulin水平进行定量。
原代细胞的制备
将剪碎的原代肿瘤放在培养液中，培养液配方为：RPMI 1640培液加入25mMHEPES，5％胎牛血清，1％青链霉素，300U ml-1胶原酶III[Worthington]。将肿瘤在消化液中37℃消化3小时。然后用NH4Cl去除红细胞，用0.25％胰酶-EDTA在37℃处理5min，再用0.1mg/ml DNase I(Sigma)处理5分钟并缓慢吹打，之后经70um滤膜过滤后获得单细胞悬液。
细胞标记与流式细胞分析
下列抗体按照1:200稀释使用：PE/cy7-抗人EpCam，APC-抗人CD49f，Biotin-抗人CD49f，FITC-抗人CD31，FITC-抗人CD45，FITC-抗人CD235a(Biolegend)，APC-抗人PROCR(eBioscience)，Streptavidin-V450(BD PharMingen)。抗体在含10％胎牛血清的HBSS中并在冰上孵育20分钟。对于DNA含量的分析，采用了Hoechst(1ug/ml)。所有分选实验使用的流式细胞仪为FCASJazz(Becton Dickinson).定期检测分选的细胞的纯度并确保超过95％。
免疫组织化学染色
将石蜡或冰冻切片先用一抗在4℃孵育过夜，之后进行清洗，然后二抗25℃孵育2小时。之后染色DAPI(Sigma)。每个免疫荧光染色至少进行三次独立实验，图中显示为代表性结果。
PROCR的免疫组化使用抗-PROCR的抗体(1:300稀释，Abcam)，之后用羊抗小鼠HRP(1:1000稀释，Santa Cruz)作为二抗进行孵育，然后进行显色和(DAKO)苏木素染色。
过表达，shRNA和sgRNA构建
sPROCR(1-214aa，细胞外结构域)和Protein C(1-252氨基酸，蛋白酶结构域缺失)的表达载体构建在pCMV-Fc载体中(Addgene)。构建在慢病毒表达载体上的hPROCR使用pHIV-zsgreen载体，在N端携带FLAG标签(Addgene)。
靶向hPROCR序列的shRNA构建在基于慢病毒载体的pLKO.1-EGFP质粒上(Addgene)。每个shRNA的效率通过Western blotting或定量PCR验证。hPROCR的shRNA-1和shRNA-3的序列如下：
5’GCAGCAGCTCAATGCCTACAA 3’(SEQ ID NO:23)和
5’TGGCCTCCAAAGACTTCATAT 3’(SEQ ID NO:24).
如无特殊说明，sh-PROCR表示hPROCR-shRNA-1。
用于激活和移植基因表达的dCas9-VP64和dCas9-KRAB质粒来自Addgene公司。靶向hPROCR基因组序列的sgRNAs构建到基于慢病毒载体的质粒中(MP177质粒来自Addgene)。每个sgRNA的效率通过Western blotting进行验证。
用于hPROCR激活的sgRNA序列：TCCTGCCGGCGCTGACTCAG(SEQ ID NO:25)
用于hPROCR抑制的sgRNA序列：CAGACTCCGCCCCTCCCAGA(SEQ ID NO:26)
竞争性ELISA实验
用纯化的蛋白C(100ul，0.2ug/ml)包被96孔板，在4℃孵育过夜。之后将孔板用含0.5％Tween-20的PBS进行清洗，并用1％BSA进行封闭。之后加入纯化的sPROCR(100ul，3ug/ml)和竞争性抗体或对照抗体混合液(梯度稀释)，并在37℃孵育2小时。结合的sPROCR量通过之后与biotin偶联的PROCR一抗孵育(R&D Systems)1.5小时，与Streptavidin-HRP二抗(R&D Systems)孵育30分钟，并进行HRP显色和450nm吸光度测定来确定。所有实验都进行了3次重复。
体外细胞分裂实验
感染了对照scramble或PROCR shRNA病毒的MDA-MB-231或BT549按照相同细胞量铺在孔板中并每两天传代一次。每次传代记录细胞的数量。为了研究抑制性抗体对细胞分裂的作用，每24小时向培养体系中加入对照的非中和抗体或中和抗体(200ug/ml)。为了研究PDX细胞在注射IgG、化疗药物或中和抗体处理后的分裂能力，在孔板中每组铺4X104个EpCAM+上皮细胞，并用全细胞培养液培养。每天记录细胞数目。
EdU标记实验
在PDX样品中，PROCR+和PROCR-细胞经流式分选后铺在孔板中，用全细胞培养液进行2维培养过夜。之后细胞添加EdU孵育1小时。之后用PFA固定15分钟，EdU显色按照试剂盒中的说明书进行(Life Technology，C10339)。
将MDA-MB-231细胞按照较低的密度(5×104)铺在盖玻片上并在12孔板中培养，在培养使用的全细胞培养液中添加抗体。16小时后，在细胞中添加EdU孵育1小时，之后用PBS清洗细胞，并用4％PFA固定细胞10分钟。EdU或TUNEL显色按照试剂盒中的抗体说明书进行(EdU:Life Technology，C10339，TUNEL:Roche，12156792910)。
在乳腺脂肪垫中进行肿瘤移植和分析
将分选的细胞重悬在含有50％Matrigel，含20％FBS的PBS，和0.04％台盼蓝(Sigma)的溶液中，注射10-20ul体积的细胞到8周裸鼠的乳腺脂肪垫中。对于体内shRNA敲低实验，MDA-MB-231，MCF-7和PDX细胞分别感染对照scramble病毒或sh-PROCR病毒。根据shRNA载体上的GFP标签的表达分选感染的细胞，并重悬在上述溶液中进行移植。用卡尺定期测量肿瘤的直径，每周3次测量小鼠的体重。肿瘤的体积(mm3)按照如下公式进行计算：体积＝长X宽2X 0.52。按时检测小鼠的体重。对于肿瘤抑制试验，分别对小鼠腹腔注射PROCR的非中和对照抗体(control)或中和抗体(8mg/kg体重)，Doxorubicin(3mg/kg体重)和Paclitaxel(20mg/kg体重)，注射的时间按照图6和图14中所述。在小鼠实验中，每组的实验小鼠至少为4只。在乳腺上皮细胞或肿瘤细胞注射时，所有小鼠处在相同的年龄，并保持相同的性别。未采取统计方法预先确定实验样本的大小。本实验不是随机实验。实验的分组和结果分析未使用双盲法。
从乳腺癌样品中制备病人来源的移植瘤
病人来源的移植瘤(PDX)最初是将新鲜病人肿瘤组织块包被在SCID/Beige小鼠的乳腺脂肪垫中长成的。移植瘤在小鼠以内传代并不定期检查每个移植瘤品系的特性是否发生改变。所有实验都按照动物福利委员会的要求进行。
制作PROCR的单克隆抗体
天然的羊驼(camelid)sdAb噬菌体库(金斯瑞公司)被用来筛选PROCR特异的单结构域抗体。来源于HEK293T表达的Fc–PROCR细胞外结构域(ECD)(1-214aa)蛋白被用做靶抗原进行多轮的筛选来富集特异结合的的sdAb。从输出的噬菌体中提取质粒序列并构建到含有人IgG1的载体中进行可溶性sdAb的筛选。可溶性的sdAb克隆与PROCR的结合通过与Fc–sPROCR进行ELISA验证。并进一步通过流式分析sdAb克隆与HEK293细胞中稳定表达的全长PROCR的结合。抗体的抑制活性进一步通过如上所述的竞争性Elisa验证。在所有的体外细胞培养和体内研究中，使用的抗体克隆为GS-5。
统计分析
在显示为柱状图的数据中采用了Student’s t-检验，并用Prism软件计算P值。如无特殊说明，试验结果来自3次独立实验。每个需要显示误差的实验结果，采用标准差(s.e.m.)进行显示。
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实施例2:蛋白C受体在乳腺癌细胞中能激活多条信号通路
蛋白C受体PROCR在多种组织中被发现作为干细胞的标记。PROCR也参与肿瘤的发展。但是，对PROCR的功能和PROCR的下游信号转导机制仍然了解得很少。这里我们详细解析了乳腺癌细胞中的PROCR信号通路。通过结合蛋白芯片、基因的敲低和过表达方法，我们发现PROCR能够同时激活多条信号通路。PROCR依赖的ERK和PI3k-Akt-mTOR信号通路是通过Src和IGF-1R的转激活介导的，最终导致肿瘤中c-Myc和Cyclin D1的积累；而PROCR依赖的RhoA-ROCK-p38信号通路激活依赖F2R。这些发现也在高表达PROCR的三阴性乳腺癌病人来源肿瘤模型(PDX)中分选原代细胞进行了验证。这也是第一次系统地在乳腺癌细胞中研究PROCR的信号通路。这些发现也为在正常组织的干细胞中PROCR分子机制研究提供了思路。
介绍
蛋白C受体PROCR在多种组织中被发现作为干细胞的标记，包括乳腺(1)，造血系统(2-5)，和血管内皮细胞(6)。除了作为细胞表面标记，其在干细胞中的信号转导机制是未知的。PROCR也参与了肿瘤发生过程。但是，现有的证明PROCR功能的证据间存在矛盾。有报道证明PROCR能促进肿瘤生长(7-9)，但也有证据显示PROCR能抑制肿瘤(10)。因此，PROCR的功能和其在肿瘤细胞中的功能和信号转导通路知之甚少。
PROCR是一个单跨膜的受体，已知表达在血管内皮上，具有抗凝血的作用(11)。PROCR能激活它的配体，一个蛋白酶前体蛋白C(PC)使其成为活化的PC(aPC)，之后aPC从PROCR上解离，通过失活FVa和FVIIIa，直接产生抗凝血的效果(综述(12,13))。
有证据表明，在血管内皮细胞、单核细胞，角质细胞和小肠上皮细胞中，PROCR能激活细胞内的信号通路，产生细胞保护的效果(14-18)。一个被广泛接受的PROCR细胞内信号的核心事件是PROCR能够激活一个G蛋白偶联受体(GPCR)，F2R(也叫蛋白酶激活受体-1，PAR-1)(19)。aPC借助PROCR作为共受体来切割F2R，使得F2R激活下游信号通路(综述(12,13))。有结果显示PROCR-F2R轴能通过增强MAPK、PI3K、或内皮细胞的eNOS信号通路或抑制p53增强血管内皮细胞的屏障功能、细胞的存活、分裂和迁移(20-23)。有限的数据发现PROCR能激活非血管细胞的细胞内信号通路。在淋巴细胞、表皮角蛋白细胞和乳腺癌上皮细胞中，有报道发现aPC-PROCR-F2R能通过激活表皮生长因子受体EGFR激活MAPK通路(17,24,25)。
在该研究中，我们利用乳腺癌细胞系和病人来源的移植瘤(PDX)细胞研究PROCR在乳腺癌细胞中的信号通路。这里描述的结果为PROCR诱导激活ERK，PI3K-Akt和RohA信号提供了证据。与之前的报道不同，乳腺癌细胞中PROCR依赖的ERK和PI3K-Akt活性不通过F2R和EGFR介导，而是通过Src和IGF-1R的活化。
PROCR在三阴性乳腺癌细胞中激活ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK通路
我们发现PROCR在不同的乳腺癌细胞系中表达不同。基本上，PROCR在ER+/PR+(雌激素受体、孕激素受体)和HER2+细胞中表达相对低，在三阴性乳腺癌(TNBC)中表达更高(图12a)。在三阴性乳腺癌细胞中，MDA-MB-231，Hs578T，HCC38，CAL51，HCC1806表现出更高的PROCR表达水平，相比较，其他细胞系MDA-MB-468，BT549，MDA-MB-436，HCC1937，HCC1599，HCC2157，ER+/PR+细胞系和HER+细胞系PROCR表达较低(图12a)。为了研究PROCR激活的细胞内通路，我们进行了磷酸激酶抗体芯片实验。使用的样品为病毒感染48小时的MDA-MB-231(一个PROCR-高表达的三阴性乳腺癌细胞系)细胞裂解液。PROCR的shRNA(sh-PROCR)使得几个蛋白激酶的磷酸化受到了显著的抑制，包括p38α(T180Y182)，ERK(T202Y204，T221Y223)，Src(Y419)，Ampka1(T183)，CREB(S133)，S6K(T389)和Wnk1(T60)(图16a)。基于看到pSrc和pERK的下调，我们研究了抑制PROCR是否影响MAPK信号，同时研究了PI3K-Akt-mTOR信号(基于看到pCREB和pS6K的下调)和RhoA-ROCK信号(基于看到p38α的下调)。它们都是乳腺癌中关键的信号通路(26)。Western分析验证了pSrc(Y416)和pERK(T202Y204)以及进一步相关的pRaf(S338T341)和pMEK(S217S221)的下调，提示抑制PROCR会降低ERK信号的活性(图16b)。此外，Western分析验证了pAkt(S473)和Akt的活性指标如pGSK3β(S21S9)和pCREB(S133)在PROCR沉默后显著下降(图16b)。其他下游如mTOR1活性也受到抑制，表现为pS6K(T389)的降低和c-Myc和Cyclin D1水平的下降(Figure 16b)。这些结果提示抑制PROCR会影响PI3K-Akt-mTOR信号的活性。此外，当PROCR抑制后，RhoA、ROCK2和p-p38α(T180Y182)水平也显著降低(Figure16b)。这些结果提示，在MDA-MB-231细胞中，PROCR能诱导激活ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK信号级联。
接下来，我们选择了另一个PROCR高表达的三阴性乳腺癌细胞系Hs578T和2个PROCR低表达的细胞系MDA-MB-468和BT549，进一步验证PROCR表达与三条信号通路激活的相关性。Western分析验证了这些细胞的PROCR水平(图16c)。事实上，在两个PROCR高表达的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和Hs578T中，三条信号通路都是激活的(图16c)。与之对比，在两个PROCR低表达的三阴性乳腺癌细胞系中，没有看到3条信号通路的共同激活(图16c)。值得注意的是，PI3K-Akt-mTOR通路在MDA-MB-468细胞的激活很可能是因为已知的该细胞系中EGFR的拷贝数扩增(27)。在BT549细胞中，所有3条通路的活性都很低(图16c)。综合看来，这些结果支持我们的模型，在PROCR高表达的三阴性乳腺癌中，PROCR能够激活ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK信号通路。
在移植瘤细胞中验证ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK信号活性
接下来我们研究了肿瘤中的PROCR+细胞的信号活性。我们采用高表达PROCR的三阴性乳腺癌病人来源的移植瘤(PDX)细胞(图17a)。为了正确分选PROCR+和PROCR-细胞，我们寻找了能够有效用于分选的流式抗体。我们发现克隆RCR-227能够准确的在流式分析中区分PROCR+和PROCR-细胞，而克隆RCR-252则不能。我们同时采用了MDA-MB-231细胞和三阴性乳腺癌PDX肿瘤细胞进行了对比。首先，在MDA-MB-231细胞中，流式分析发现RCR-252抗体能够识别一小部分(18.1％)PROCR+细胞(图18a)。但定量PCR验证分选细胞的PROCR表达却没有差别(图18b)，提示用这个抗体分选出的PROCR+和PROCR-细胞不正确。而相对的，用RCR-227抗体进行流式分析显示几乎所有的MDA-MB-231细胞(98.3％)是PROCR+(图18a)，提示与RCR-252对比，RCR-227在这种分析方法下是更好的抗体。用PROCR高表达的三阴性乳腺癌PDX细胞进一步对比了这两个抗体。发现RCR-252不能在流式分析中有效识别PDX中的PROCR+细胞(图18c)，而用RCR-227发现约48.7％的PDX细胞是PROCR+(图17b和18c)。Western分析PROCR的蛋白水平验证了应用RCR-227分选的正确性。(图17c)。
在正确分选的PROCR+和PROCR-细胞中，我们检测了三条信号通路(ERK，PI3K-Akt和RhoA)的活性。Western分析显示PROCR+肿瘤细胞与PROCR-肿瘤细胞相比，表现出了显著更强的三条通路的信号激活(图17d)。PROCR+肿瘤细胞也具有明显高于PROCR-肿瘤细胞的c-Myc和Cyclin D1表达(图17d)。这些数据进一步验证了在乳腺癌细胞中，ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA-ROCK-p38信号级联是PROCR的细胞内效应体系。
PROCR通过F2R激活RhoA-ROCK-p38信号
随后，我们研究了PROCR激活下游信号通过了哪些细胞表面组分的介导。我们建立了一个PROCR过表达的系统，其能够激活PROCR的下游信号。在一个PROCR低表达的三阴性乳腺癌细胞系BT549中，上述的三条信号通路的基础活性很低。我们引入了一个CRISPR干扰系统能够激活PROCR的内源表达(28)。通过病毒将dCas9-VP64和sg-RNA(sg-PROCR)导入BT549细胞中(图19a)。利用该体系我们首先验证了PROCR表达的增强(图19b)。在PROCR过表达后，ERK，PI3K-Akt-mTOR信号和RhoA-ROCK信号级联都上调，c-Myc和CyclinD1的蛋白水平也得到了积累(图19b)。随着PROCR的过表达，细胞的形态也发生了变化：过表达PROCR的BT549细胞形态比对照组更长(图19c)。在这个过表达系统中，我们探究哪些表面效应分子对PROCR依赖的信号是必须的。之前有研究报道，GPCR、F2R是PROCR在多种细胞类型中发挥细胞保护功能的关键。所以我们考察了在乳腺癌细胞中，F2R是否对乳腺癌细胞中PROCR相关信号是必须的。有意思的是，我们发现过表达PROCR激活的信号中，只有RhoA-ROCK/p38信号通路在敲低F2R的条件下受到了抑制，另外两条信号通路(ERK和PI3K-Akt-mTOR)不受影响(图19d)。这些结果说明PROCR激活RhoA-ROCK-p38信号通路依赖F2R，而ERK和PI3K-Akt-mTOR的激活依靠其他膜上的效应分子，而不是F2R。
PROCR通过IGF-1R激活ERK和PI3K-Akt-mTOR通路
我们想知道是不是其他受体酪氨酸激酶(RTKs)参与到了PROCR依赖的ERK和PI3K-Akt-mTOR信号的激活。为了鉴定潜在的RTK，我们进行了RTK抗体芯片实验。使用的样品是从PROCR高表达的三阴性乳腺癌病人移植瘤中分选出的PROCR+和PROCR-细胞的裂解物。在PROCR+细胞中，IGF-1R，Axl，RYK和EGFR具有明显更高的活性(图20a)。所以我们验证了PROCR过表达诱导的ERK和PI3K-Akt-mTOR信号的激活是否依靠这些蛋白。我们通过Western分析验证了IGF-1R或EGFR的表达能被shRNA敲低(图20b)。令我们惊讶的是，敲低IGF-1R显著抑制了ERK和PI3K-Akt-mTOR信号，而RhoA-ROCK信号不受影响(图20c)。相反，用shRNA敲低EGFR不影响PROCR诱导激活的三条信号级联(图20c)。相似的是，敲低Axl和RYK对PROCR诱导激活的三条信号级联也没有影响(数据未显示)。我们猜测EGFR，Axl和RYK在PROCR+细胞中的激活可能是其他细胞内事件的伴随结果，而不介导PROCR激活三条细胞内信号通路。
有意思的是，在PROCR过表达系统中，敲低IGF-1R不影响pSrc的水平，提示Src的激活在IGF-1R的上游(图20c)。为了进一步验证这一点，我们用KX2-391抑制Src。我们发现抑制Src会减弱IGF-1R(图20d)，这支持我们之前的观点，即Src在IGF-1R的上游来激活IGF-1R。作为结果，Src的抑制也导致了ERK和PI3k-Akt-mTOR通路活性的降低，但对RhoA-ROCK通路无影响(图20d)，这也与Src是IGF-1R的上游相一致。此外，抑制Src也会弱化EGFR-T845活性(图20d)，这也与我们之前的设想相一致，即EGFR在PROCR+细胞中的高活性是Src激活的结果。因为已知报道Src能磷酸化EGFR的T845位点(29)。的确，我们发现抑制PROCR仅能减弱EGFR在T845位点的活性，但对其他位点(T1068，T1173)无影响(图20e)。这些结果进一步支持了EGFR在PROCR+细胞中的高活性是Src激活的结果，但EGFR本身不是PROCR信号级联反应中的核心RTK(在图20f说明)。综合这些结果，证明PROCR通过Src转激活IGF-1R和其他的RTKs，但IGF-1R是这些细胞中进一步激活ERK和PI3K-Akt-mTO信号通路的核心RTK。
蛋白C是乳腺癌细胞中PROCR激活细胞内信号需要的配体
为研究乳腺癌细胞中PROCR细胞内信号的激活是否需要配体，我们借助了sPROCR(可溶性的PROCR，PROCR的细胞外结构域)，它可以与细胞膜上的PROCR进行竞争(30)。在培养的MDA-MB-231细胞中加入sPROCR，会导致分裂下降并伴随细胞形态的改变，使纺锤形的MDA-MB-231细胞变成圆形(图21a)。类似的对细胞分裂的影响和细胞形态改变的表型在用shRNA敲低PROCR时也会出现(结果未显示)。这些结果提示在乳腺癌细胞中，PROCR胞外段与配体的结合是至关重要的。蛋白C(PROC)是一个凝血蛋白酶，是在血管内皮细胞中已知的PROCR配体，参与细胞的抗凝血、抗炎症和屏障保护(14,15,19,31-33)。为研究在乳腺癌细胞中，蛋白C是否也作为PROCR的配体发挥功能，我们制备了蛋白酶功能缺失的PROC(PROC-DN，一种PROC的竞争性抑制形式)。添加PROC-DN导致MDA-MB-231细胞的分裂能力降低，并改变细胞形态(图21b)。更重要的是，PROCR的3条胞内信号的活性在PROC-DN的作用下被阻断(图21c)。相反，添加激活型的PROC(aPC)能增强PROCR相关的三条胞内信号(图21d)。这些结果提示，在乳腺癌中，PROC是PROCR的配体。
抑制PROCR的细胞内信号能抑制乳腺癌细胞的克隆形成能力
我们考察了PROCR通过这些细胞内信号发挥的功能是否调控了细胞的干性。我们进行了体外的克隆形成实验。将PDX-1样品中分离的细胞铺在Matrigel中进行3维培养，并记录它们的克隆形成能力在抑制PROCR或它的下游信号后的变化。我们发现每两个铺下去的PDX上皮细胞中有一个能形成克隆，与PDX中约50％的PROCR+细胞一致(图22a)。敲低PROCR能够阻断克隆的形成(图22a，22c-d)。用sch79797抑制F2R或用KX2-391抑制Src，都能一定程度上阻止克隆的形成。克隆的大小和克隆的形成率都降低。而同时抑制F2R和Src具有最强的效果，能够完全阻止细胞形成克隆(图22b-d)。这些结果提示，在乳腺癌细胞中，PROCR下游的三条信号对干细胞的活性和功能的发挥至关重要。
讨论
PROCR参与到了肿瘤的发生，在一些组织中是正常干细胞的重要表面标志物。但对PROCR的信号转导机制研究很少。在这个研究中，我们分析了PROCR在乳腺癌细胞中的信号转导机制。发现了PROCR通过Src转激活IGF-1R来激活ERK和PI3K-Akt-mTOR信号；同时通过F2R来激活RhoA-ROCK-p38信号(在Figure 22e中说明)。这些结果进一步在PDX肿瘤中分离的PROCR+和PROCR-细胞中得到了验证。我们也进一步确认了在乳腺癌中，PROC是PROCR的配体。
在该研究中，我们发现F2R不能解释乳腺癌细胞中全部的PROCR活性，这与之前研究发现的PROCR细胞内信号转导机制是通过F2R介导来发挥促进存活、抗炎症和促进细胞迁移不同(15,17-19,24,25)。在乳腺癌细胞中，只有RhoA-ROCK-p38信号依赖F2R，而ERK和PI3k-Akt-mTOR信号不依赖F2R，是依赖Src和随后的IGF-1R的激活。这也是第一次报道了IGF-1R介导了PROCR的信号通路。我们的结果同样看到了PROCR能激活EGFR(17,24,25)。但我们的研究发现PROCR相关的ERK和PI3k-Akt-mTOR信号激活不依赖EGFR，EGFR的激活只是PROCR-相关的Src激活的副产物。此前已有研究发现了F2R被PROCR-aPC轴激活。F2R能被aPC在N端切割，从而被活化。被切下来的N端能作为一个配体插入到F2R蛋白自身中从而起始跨膜信号(34)。目前我们还不了解Src是如何被PROCR-aPC激活的。我们目前的结果不能排除对信号通路的影响中的一些是间接的。
基于PROCR能够激活ERK，PI3K-Akt-mTOR和RhoA通路，并导致c-Myc和Cyclin D1的积累，而这些都是乳腺癌中的核心信号通路(26)，我们的结果支持PROCR是促进肿瘤的分子。之前在正常乳腺和乳腺癌细胞中的研究，发现PROCR+细胞具有更强的上皮-间质转化(EMT)特性(1，35)。在本研究中，观察到的在改变PROCR表达的条件下细胞形态的改变可能是改变了细胞EMT的程式。EMT也可能是PROCR促进肿瘤的另一种方式。在本研究中，效应RTK-IGF-1R是通过磷酸化抗体芯片筛选得到的。我们意识到我们的抗体芯片方法也有可能会遗漏其他重要的RTKs。考虑到PROCR能够在不同细胞系中转激活不同的RTKs(17,24,25)，PROCR在细胞内激活了一个更加复杂的信号及联网络也不无可能。然而，选择性地抑制ERK或PI3K信号通路中的单个的激酶在临床上只有有限的或分散的反应(36)。所以同时减弱多条通路，如只用一个试剂抑制PROCR，很可能是一个对抗乳腺癌细胞中复杂的信号网络更有效的方法。
综上所述，我们的研究解析了PROCR在乳腺癌中的信号转导机制，证明了PROCR在三阴性乳腺癌中的潜在作用。这些发现对未来通过开发拮抗PROCR的治疗试剂来治疗乳腺癌具有指导意义。
方法
细胞系和细胞培养
MCF7，SK-BR-3，MDA-MB-231，Hs578T，T-47D，ZR-75-1，MDA-MB-415，MDA-MB-453，BT474，MDA-MB-436，BT549，HCC38，CAL51，HCC1806，MDA-MB-468，HCC1937，HCC1599和HCC2157人乳腺癌细胞系来自上海细胞库型培养收集委员会或American Type CultureCollection(ATCC)，并按照供应商意见在全细胞培养液中培养。
从乳腺癌样品中制备病人来源的移植瘤
病人来源的移植瘤最初是将新鲜病人肿瘤组织块包被在SCID/Beige小鼠的乳腺脂肪垫中长成的。移植瘤在小鼠以内传代并不定期检查每个移植瘤品系的特性是否发生改变。所有实验都按照动物福利委员会的要求进行，并得到了复旦大学肿瘤研究中心委员会(FDSCC)的审批和同意。
抗体
免疫组织化学染色抗体：小鼠抗人PROCR(1:300，Abcam)，小鼠抗ER(1:50，DAKO)，小鼠抗PR(1:50DAKO)，兔抗人HER2(1:50，Proteintech)。
Western blotting使用的抗体：兔抗人PROCR(1:200，Novus)，兔抗人phospho-Src(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人总Src(1:1000，Cell SignalingTechnology)，兔抗人phospho-MEK(1:1000，Cell Signaling Technology)，小鼠兔抗总MEK(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人phospho-ERK(1:1000，Cell SignalingTechnology)，兔抗人总ERK(1:100，Santa Cruz)，兔抗人phospho-Raf(1:100，SantaCruz)，兔抗人总Raf(1:100，Santa Cruz)，兔抗人phospho-Akt(1:1000，Cell SignalingTechnology)，兔抗人总Akt(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人phospho-GSK3β(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人总GSK3β(1:1000，Cell SignalingTechnology)，兔抗人phospho-CREB(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人总CREB(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人phospho-S6K(1:1000，Cell SignalingTechnology)，兔抗人总S6K(1:1000，Cell Signaling Technology)，小鼠抗人c-Myc(1:100，Santa Cruz)，小鼠抗人Cyclin D1(1:100，Santa Cruz)，小鼠抗人RhoA(1:100，SantaCruz)，兔抗人ROCK2(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人phospho-p38(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人p38(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人phospho-IGF1R(1:1000，Cell Signaling Technology)，兔抗人IGF-1R(1:1000，CellSignaling Technology)，兔抗人phospho-EGFR(Tyr1068，Tyr1173，Tyr845)(1:1000，CellSignaling Technology)，兔抗人EGFR(1:1000，Cell Signaling Technology)，小鼠抗tubulin(1:5000，Sigma)和鼠抗人beta-Actin(1:2000，Sigma).
流式细胞分析使用的抗体按照1:200稀释：PE/cy7-抗人EpCam，FITC-抗人CD31，FITC-抗人CD45，FITC-抗人CD235a(Biolegend)，APC-抗人PROCR(eBioscience)，PE-抗人PROCR(BD Pharmingen).
磷酸化蛋白芯片
人磷酸化蛋白激酶芯片(R&D system，ARY003B)按照试剂盒的说明书进行使用。每组样品需要106个MDA-MB-231细胞用于分析。人磷酸化RTK芯片((R&D system，ARY001B)按照试剂盒的说明书进行使用。每组样品使用106个从PDX肿瘤中新鲜分选的PROCR+和PROCR-细胞。蛋白样品在进行芯片分析前用Western分析tubulin进行了定量。
原代细胞的制备
将剪碎的原代肿瘤放在培养液中，培养液配方为：RPMI 1640培液加入25mMHEPES，5％胎牛血清，1％青链霉素，300U ml-1胶原酶III[Worthington]。将肿瘤在消化液中37℃消化3小时。然后用NH4Cl去除红细胞，用0.25％胰酶-EDTA在37℃处理5min，再用0.1mg/ml DNase I(Sigma)处理5分钟并缓慢吹打，之后经70um滤膜过滤后获得单细胞悬液。
细胞标记和流式细胞分析验证PROCR的抗体
抗体在含10％胎牛血清的HBSS中于冰上孵育20分钟。所有的分选实验都采用FCASJazz(Becton Dickinson)。定期检查了细胞纯度并确认超过了95％。比较了两个抗体在MDA-MB-231细胞和三阴性乳腺癌PDX肿瘤细胞中的标记效率：克隆RCR-252(PE-偶联，BDPharmingen，货号557950)和克隆RCR-227(APC-偶联，eBioscience，货号17-2018-42)。首先，在MDA-MB-231细胞中，RCR-252抗体只能在流式分析中检测到一部分(18.1％)PROCR+细胞(图18a)。然而分选的细胞在定量PCR检测时却没有PROCR的表达差别(图18b)，这表明用该抗体分选的PROCR+和PROCR-细胞是不正确的。相反，用RCR-227进行流式分析发现绝大部分MDA-MB-231细胞(98.3％)是PROCR+(图18a)，这提示在流式分析中，RCR-227比RCR-252更有潜力。我们更进一步在新分离的PROCR高表达的三阴性乳腺癌PDX细胞中比较了两种抗体。RCR-252不能有效的在流式分析中识别PROCR+细胞，而RCR-227能识别PDX肿瘤细胞中48.7％的PROCR+细胞(图18c)。Western分析PROCR的蛋白水平证明RCR-227抗体分选的细胞的正确性(图17c)。在MDA-MB-231细胞PDX肿瘤细胞中的实验RCR-227抗体在流式分析中的有效性和RCR-252抗体的低效性。
免疫组织化学染色
将石蜡切片用PROCR一抗4℃孵育过夜，(1:300稀释，Abcam)，之后用山羊抗小鼠HRP(1:1000稀释，Santa Cruz)作为二抗25℃孵育2小时。然后进行显色和(DAKO)苏木素染色。
过表达，shRNA和sgRNA构建
sPROCR(1-214aa，细胞外结构域)和Protein C(1-252aa，蛋白酶结构域缺失)的表达载体构建在pCMV-Fc载体中(Addgene)。
靶向PROCR序列的shRNA构建在基于慢病毒载体的pLKO.1-EGFP质粒上(Addgene)。每个shRNA的效率通过Western blotting或定量PCR验证。shRNA的序列如下：
PROCR:GCAGCAGCTCAATGCCTACAA(SEQ ID NO:27)
F2R:CCCGGTCATTTCTTCTCAGGA(SEQ ID NO:28)
IGF-1R:GCGGTGTCCAATAACTACATT(SEQ ID NO:29)
EGFR:CGCAAAGTGTGTAACGGAATA(SEQ ID NO:30)
dCas9-VP64质粒来自Addgene公司。靶向PROCR基因组序列的sgRNA构建到基于慢病毒载体的质粒中(MP177质粒，来自Addgene)。每个sgRNA的效率通过Western blotting进行验证。
用于PROCR激活的sgRNA序列：TCCTGCCGGCGCTGACTCAG(SEQ ID NO:31)
体外MDA-MB-231和BT549细胞形态分析
感染了对照scramble或PROCR shRNA病毒的MDA-MB-231细胞或感染了对照或PROCR sgRNA病毒的BT549细胞按较低的密度(5×104)铺在盖玻片上，并用全细胞培养液在120孔板中进行培养。12小时后，细胞能贴在盖玻片长，用PBS清洗孔板中的细胞，并用4％PFA固定10分钟。将爬在玻片上的细胞进行Vimentin抗体染色并用DAPI染核。为了研究不同蛋白对MDA-MB-231细胞形态的影响，纯化的sPROCR蛋白(6ug/ml)或蛋白酶结构域缺失的Protein C蛋白(2ug/ml)在铺好细胞后加入培养体系中。
统计分析
在显示为柱状图的数据中采用了Student’s t-检验，并用Prism软件计算P值。如无特殊说明，试验结果来自3次独立实验。每个需要显示误差的实验结果，采用标准差(s.e.m.)进行显示。
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实施例3制备PROCR抑制性抗体
PROCR细胞外结构域抗原(h-ED)是一个大小25KD的可溶性蛋白，这里将它与人的Fc蛋白融合表达。这个项目主要聚焦在利用噬菌体展示平台发现和发展能结合h-ED的抗体。该报告分为两个部分：抗体的筛选部分和未来抗体的克隆表达工作规划。该报告记录了贯穿整个项目的工作流程、现阶段及下一步详细的工作计划和相关的实验与结果。对于筛选部分，总共118个携带候选抗体的噬菌体从噬菌体库(HDB323，HDB169)中被发现。采用了两种不同的筛选形式：溶液形式和免疫管形式。噬菌体的抗原结合特异性通过测序分析和单点ELISA实验进行了验证。对抗原结合阳性的噬菌体上的Fab基因进行PCR扩增和DNA测序。分析VL和VH序列发现41个决定抗体多样性的特征序列。单点ELISA(SPE)显示所有的携带抗体的候选噬菌体都与h-ED抗原有不同程度的结合。这些候选抗体被转到抗体的表达载体上进行表达，它们与PROCR的结合通过进一步的单点ELISA和在稳定表达全长PROCR的HEK293细胞中进行的流式细胞分析进行验证。抗体的抑制活性进一步通过竞争性ELISA，体外细胞实验和体内肿瘤形成实验进行了筛选验证。
结果
抗体的筛选
使用两个Fab噬菌体展示库(HDB323和HDB169)分别用来筛选能够结合h-ED抗原的抗体片段。采用了两种筛选形式：Streptavidin-磁珠溶液和免疫管筛选形式。共进行了3轮筛选。三轮筛选后，通过筛选滤膜实验发现了大约20,000output-3(O3)噬菌体能结合biotin-标记的抗原(图23)。阳性的噬菌体被DNA测序并通过进一步的单点ELISA(SPE)进行了验证(图24)。在下一步传递之前，对所有候选噬菌体中的VL和VH基因测序以确保质量。
表1.溶液筛选法检测噬菌体库对h-ED的结合
Figure GDA0002610533020000731
表1：使用2个库(HDB323 and HDB169)分别筛选与100nM(1st轮)，100nM(2nd轮)，50nM(3rd轮)h-ED结合的噬菌体。详细描述见方法部分。每轮筛选后记录输出噬菌体的滴度和Fab阳性的比值。
表2.免疫管筛选法检测噬菌体库对h-ED的结合
Figure GDA0002610533020000732
Figure GDA0002610533020000741
表2：使用2个库(HDB323 and HDB169)分别筛选与100nM(1st轮)，100nM(2nd轮)，50nM(3rd轮)h-ED结合的噬菌体。详细描述见方法部分。每轮筛选后记录输出噬菌体的滴度和Fab阳性的比值。(参考书HDBA01007，P1-25，Expt.1-6)
克隆到抗体表达载体中
筛选得到的噬菌体通过PCR扩增VL和VH基因并进行测序。之后克隆到抗体表达载体pFUSE2ss-CLIg-hk(轻链)和pFUSEss-CHIg-hG1(重链)并进行测序。抗体与PROCR的结合进一步通过单点ELISA和在稳定表达全长PROCR的HEK293细胞中进行的流式细胞分析进行验证。(数据未展示)
筛选抑制PROCR功能的抗体
抗体的抑制活性通过竞争性ELISA进行了验证。纯化的蛋白C(100ul，0.2ug/ml)包被96孔板并在4℃过夜。用含0.5％Tween-20的PBS洗板并用1％BSA封闭。之后加入纯化的sPROCR(100ul，3ug/ml)和竞争性抗体或对照抗体混合液(梯度稀释)并在37℃孵育2小时。结合的sPROCR量通过之后与biotin偶联的PROCR一抗孵育(R&D Systems)1.5小时，与Streptavidin-HRP二抗(R&D Systems)孵育30分钟，并进行HRP显色和450nm吸光度测定来确定。所有实验都进行了3次重复。我们发现克隆13，21，44，58和61能够影响蛋白C与sPROCR的结合(图25a)。之后进一步通过体内体外实验验证了这些抗体对PROCR的抑制能力。将MDA-MB-231以较低的密度(5×104)铺在盖玻片上，并在含有全细胞培养液的12孔板中进行培养。加入上述抑制性抗体会导致细胞形态的改变，MDA-MB-231细胞从纺锤形变成圆形(图25b)，表明PROCR相关的EMT特性被抑制。进一步在体内试验研究抗体的抗肿瘤能力。用抗体处理携带PROCR+乳腺癌PDX肿瘤的裸鼠。当裸鼠携带的肿瘤达到约200mm3时开始开始抗体处理，每周两次，共注射5次抗体。我们发现上述抗体都能表现出显著的肿瘤抑制效果(图25c)。综合上述结果，这些数据提示克隆13，21，44，58和61号PROCR抗体能影响PROCR的功能，抑制(PRROCR-高表达三阴性乳腺癌)的肿瘤形成。
实验方法
材料
ELISA板，Greiner Bio-one，货号.650061；
PBS，Life technologies，货号.70013；
Tween 20，Sigma-Aldrich，货号.P1379；
PEG，Sigma-Aldrich，货号.P2139；
Casein，Thermo scientific，货号.37532；
BSA，Dingguo，货号.DH016-3；
TEA，Sigma-Aldrich，货号.90335；
LB broth，Invitrogen，货号.12780-052；
Typton，Oxoid，货号.LP0042；
NH4OAC，Sigma-Aldrich，货号.A1542；
Tris，Dingguo，货号.DH350-3.1；
IPTG，Sigma，货号.I5502.
pFUSE2ss-CLIg-hk(light chain)，Invivogen，货号.pfuse2ss-hclk；
pFUSEss-CHIg-hG1(heavy chain)，Invivogen，货号.pfusess-hchg1；
Pfu DNA Polymerase，TIANGEN，货号.EP101；
dNTP Mixtrue，2.5mM each，TaKaRa，货号.4030；
Cycle Pure试剂盒，Omega Bio-Tek，货号.D6492；
DNA Markers，TIANGEN，Marker II货号.MD102-01；
DNA Markers，TIANGEN，Marker III货号.MD103-02；
Gel Extraction试剂盒，Omega Bio-Tek，货号.D2500；
DNA Ligation试剂盒Ver.2.1，TaKaRa，货号.6022；
Taq DNA Polymerase:TaKaRa，货号.R001；
Endo-Free Plasmid Mini试剂盒II:Omega Bio-Tek，货号.D6950；
Blasticidin S，Invitrogen，货号.ant-bl-1；
Zeocin，Invitrogen，货号.ant-zn-1
噬菌体库和库的扩增
Figure GDA0002610533020000751
Figure GDA0002610533020000761
筛选前，噬菌体库先进行了扩增，并诱导获得能够展示Fab的噬菌体。每个库的第一次输入的噬菌体通过扩增5x1010储存噬菌体得来。每一轮所有的输出噬菌体也被扩增作为下一轮的输入。为了扩增噬菌体库或输入噬菌体，50ml的XL1-blue细胞培养在含有10μg/ml TET的2YT培液中生长至OD600达到0.8-1.2，之后感染噬菌体并继续在含1μM IPTG的培液中37℃培养3小时。收集上清中的噬菌体进行离心，并按照PEG沉降法标准流程进行纯化。纯化的噬菌体重悬在1ml PBS中并储存在4℃。扩增后的噬菌体不能保存超过4周否则需要弃掉。
溶液筛选法检测噬菌体库对h-ED的结合
第一次输入的噬菌体库(5x1012 pfu在1ml的0.5％casein中)先在casein-封闭的100μL streptavdin-磁珠中孵育15分钟来耗尽与噬菌体与streptavidin-磁珠的非特异结合。耗尽后的噬菌体库与bio-Fc-对照孵育，进行2小时的上下翻转，之后与casein-封闭的100μL streptavdin-磁珠孵育15分钟。耗尽后的噬菌体库与bio-hIgG1-Fc孵育，进行2小时的上下翻转，之后与casein-封闭的100μL streptavdin-磁珠孵育15分钟。耗尽后的噬菌体库与bio-h-ED孵育，进行2小时的上下翻转，之后与casein-封闭的100μL streptavdin-磁珠孵育15分钟。未结合的噬菌体通过PBSt洗10-15次洗掉。结合的噬菌体用400μL新鲜制备的100mM Triethylamine洗脱，并用200μL 1M Tris-HCl，pH 6.4进行中和。第一轮输出的噬菌体始终保存在冰上放置。每一次输入、输入的噬菌体库中的Fab阳性克隆百分比通过滤膜实验检测。
免疫管筛选法检测噬菌体库对h-ED的结合
将免疫管用1ml抗原4℃包被过夜。第一轮输入的噬菌体(5x1012 pfu在1ml的1％BSA中)在casein-包被的免疫管中孵育2小时。耗尽后的噬菌体库在Fc-对照包被的免疫管中孵育上下翻转2小时。耗尽后的噬菌体库在hIgG1-Fc包被的免疫管中孵育上下翻转2小时。耗尽后的噬菌体库在h-ED包被的免疫管中孵育上下翻转2小时。未结合的噬菌体通过PBSt洗5-20次洗掉。结合的噬菌体用1mL新鲜制备的100mM Triethylamine洗脱，并用0.5mL1M Tris-HCl，pH 6.4进行中和。第一轮输出的噬菌体始终保存在冰上放置。每一次输入、输入的噬菌体库中的Fab阳性克隆百分比通过滤膜实验检测。
通过抗原特异性的滤膜实验筛选O3噬菌体
用EZ-link sulfo-NHS-LC-biotin(Thermo)生物素偶联试剂盒将h-ED连上Biotin。O3噬菌体进行稀释并铺在培养平板中(500-5000pfu每板)，37℃生长8小时，之后用抗kappa抗体-包被的滤膜22℃捕获过夜。用Biotin-偶联的h-ED(50nM)和NeutrAvidin偶联的AP(1:1000dilution)检测能与抗原结合的抗-h-ED噬菌体。阳性噬菌体菌斑被挑选出来，并用100μl噬菌体洗脱缓冲液洗脱。用约10-15μl洗脱的噬菌体感染1ml XL1 blue细胞来制备更高滴度的噬菌体(HT)进行后续分析。
PCR和DNA测序分析
从抗原结合阳性的噬菌体中，用引物19939和530PCR扩增Fab基因。用引物355和530在Genewiz Biotech Co.(Shanghai)公司进行测序。VL和VH序列分别用来分析筛选出特异的序列和决定抗体多样性的序列。
噬菌体的单点ELISA
将96孔Greiner板用抗原4℃包被过夜并用1％casein封闭。将抗原结合阳性的高滴度噬菌体克隆用0.1％BSA封闭1小时，之后在包被抗原的板中孵育2小时。孵育后的板用PBSt洗去未结合的噬菌体。与抗原结合的噬菌体用抗-M13-HRP(1:5000稀释在1％casein中)检测。
克隆
将抗原结合阳性的噬菌体中的Fab基因用克隆引物PCR扩增出来(来自第一部分)。引物序列见下表。候选克隆的VL和VH基因序列分别克隆到表达载体pFUSE2ss-CLIg-hk和pFUSEss-CHIg-hG1中，扩增条件见下表。
克隆引物 酶切位点
轻链正向引物 引物VLF-EcoRI
轻链反向引物 引物VLR-BsiWI
克隆引物 序列(5’至3’)
重链正向引物 引物VHF-EcoRI
重链反向引物 引物VHR-NheI
扩增条件
Figure GDA0002610533020000771
Figure GDA0002610533020000781
DNA测序分析
从抗原结合阳性的噬菌体中PCR扩增Fab基因，并用测序引物PZH-2-SEP-ZH-BL-FW在Genewiz Biotech Co.(Shanghai)公司测序。分析VL和VH序列中原始独有的序列。
本公开的各个方面可以单独使用、组合使用或以在上文描述的实施方案中未具体讨论的各种安排来使用，因此，本公开的各个方面的应用不限于上文所述或附图所述的组成部分的细节和安排。例如，一个实施方式中描述的方面可以以任何方式与其他实施方式中描述的方面组合。
尽管已经讨论了本公开的特定实施方式，但是以上说明书是说明性的而非限制性的。在阅读本说明书之后，本公开的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本公开的全部范围应该通过参考权利要求书以及其等同形式的全部范围，和说明书以及所述变化来确定。
通过引用纳入
出于所有目的，在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容以引用的方式整体纳入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体指明通过引用纳入一样。

Claims (13)

1.蛋白C受体(PROCR)，所述受体用于诊断和/或治疗高PROCR三阴性乳腺癌(TNBC)，其中检测PROCR表达水平的免疫组化分析中H分数至少为120表明存在高PROCR的TNBC。
2.如权利要求1所述的PROCR，其中所述免疫组化分析使用抗PROCR抗体或其抗原结合片段。
3.如权利要求2所述的PROCR，其中所述抗PROCR抗体选自以下组成的组：(i)SEQ IDNO:1-3和11-22中的任何一种，或其抗原结合片段；(ii)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与(i)交叉竞争结合PROCR；(iii)抗体，所述抗体具有选自如SEQ ID NO:1-3和11-22所示的CDR中的CDR1、CDR2和CDR3；和(iv)抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与(iii)交叉竞争结合PROCR。
4.一种抗PROCR抗体，或其抗原结合片段，用于对高PROCR的TNBC的诊断和/或治疗，其中当抗PROCR抗体或其抗原结合片段用于免疫组化分析以检测PROCR的表达水平时，H分数至少为120表明存在高PROCR的TNBC。
5.如权利要求4所述的抗体，其中所述抗PROCR抗体选自以下组成的组：(i)SEQ ID NO:1-3和11-22中的任何一种，或其抗原结合片段；(ii)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与(i)交叉竞争结合PROCR；(iii)抗体，所述抗体具有选自如SEQ ID NO:1-3和11-22所示的CDR中的CDR1、CDR2和CDR3；和(iv)抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与(iii)交叉竞争结合PROCR。
6.分离的抗PROCR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与SEQ ID NO:1-3和11-22中的任一交叉竞争结合PROCR。
7.一种用于诊断高PROCR的TNBC的试剂盒，所述试剂盒包含以下的一种或多种：(i)SEQID NO:1-3和11-22中的任何一种，或其抗原结合片段；(ii)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与(i)交叉竞争结合PROCR；(iii)抗体，所述抗体具有选自如SEQ ID NO:1-3和11-22所示的CDR中的CDR1、CDR2和CDR3；和(iv)抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与(iii)交叉竞争结合PROCR。
8.一种用于制备药物的PROCR抑制剂，所述药物用于：(1)治疗高PROCR的TNBC，(2)抑制高PROCR的TNBC细胞的生长，(3)减少高PROCR的TNBC细胞的转移，和/或(4)抑制高PROCR的TNBC细胞的上皮间充质转化(EMT)；其中PROCR抑制剂选自以下组成的组：(i)SEQ ID NO:1-3和11-22中的任何一个，或其抗原结合片段；(ii)抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与(i)交叉竞争结合PROCR；(iii)抗体，所述抗体具有选自如SEQ ID NO:1-3和11-22所示的CDR中的CDR1，CDR2和CDR3；和(iv)抗体或其抗原结合片段，其中抗体与(iii)交叉竞争结合PROCR。
9.用于治疗高PROCR的TNBC的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求8所述的PROCR抑制剂和药学上可接受的载体。
10.权利要求8所述的PROCR抑制剂在制备用于治疗高PROCR的TNBC的药物中的用途。
11.一种抑制高PROCR的TNBC细胞的生长、转移和/或EMT的方法，所述方法包括以有效量的权利要求8所述的PROCR抑制剂接触所述细胞。
12.一种治疗高PROCR的TNBC的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的权利要求8所述的PROCR抑制剂。
13.如权利要求12所述的方法，还包括向所述患者施用治疗有效量的Src抑制剂或IGF-1R抑制剂。
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