CN111655282A - 一种对抗动物增生性肠病的重组疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对抗胞内劳森氏菌的重组疫苗，其基于所述细菌的膜蛋白和侵袭素的重组合成嵌合变体。另外，本发明还公开了编码所述蛋白变体的合成核苷酸序列，重组蛋白，所述合成蛋白抗原的表达盒，转化细胞以及产生所述抗原的方法，证明了其对病原体胞内劳森氏菌的抗原性和保护潜力。

Description

一种对抗动物增生性肠病的重组疫苗
技术领域
本发明涉及兽药技术领域，具体地说，本发明提供了一种对抗由胞内劳森氏菌细菌引起的动物增生性肠病的重组疫苗。
背景技术
限制生猪生产的因素有很多，其中最重要的是疾病。增生性肠病(PE)是一种影响各种哺乳动物，主要是猪的肠道的病理学疾病，影响着世界范围内的工业。这种疾病的特征是小肠粘膜增厚，是由于胞内劳森氏细菌的增生所致。
感染这种细菌的猪有体重减轻、生长迟缓、出血性腹泻等症状，甚至导致死亡。这给智利乃至世界的养猪业带来了巨大的经济损失和相应的健康风险。最近的研究分析了这种疾病的流行率，指出在美国和欧洲，这种疾病的发病率可以达到猪的60％到100％(Machuca,M.A.等人(2017).30头阿根廷猪群内劳森氏菌感染的血清学和组织病理学调查.巴西兽医病理学杂志,2(1),8-11)。
关于细胞内劳森氏菌发病机理的研究，尚不清楚诱导感染动物肠细胞增生的机制，胞内劳森氏菌的致病因子尚未被表征，甚至有人提出该细菌可以调节宿主的免疫反应，降低体内T和B淋巴细胞的数量(Gebhart,C.J.和Guedes，R.M.C.(2010).胞内劳森氏菌.动物细菌感染的发病机理,3,363-372)。
关于现有技术中公开的用于治疗动物疾病的解决方案，Kroll，J.J.等人的出版物(2004年)(评价口服胞内劳森氏菌无毒活疫苗后猪的保护性免疫.美国兽医研究杂志，65(5)，559-565)中，描述了一种用于猪的细胞内劳森氏菌的无毒活疫苗。所述出版物表明尚未充分探究细菌的免疫原性位点，并且最初的研究通常提到外膜蛋白和糖蛋白。而且，它强调与使用活的无毒细菌相比，单独使用抗原肽不会在动物中产生保护性免疫反应。
同时，美国专利9,636,389公开了一种对抗胞内劳森氏菌和另一种传染源的预防方法，其涉及施用经修饰的胞内劳森氏菌活菌株。Riber,U等人的最新出版物(2015)(对减毒的细胞内劳森氏菌的猪进行的疫苗接种诱导了急性期蛋白反应并引发了细胞介导的免疫,而攻毒后细菌的脱落却没有减少.疫苗,33(1),156-162)表明，当使用减毒活疫苗时，细胞内劳森氏菌(
Figure BDA0002470954140000021
回肠炎，勃林格殷格翰公司)不可能从治疗的猪体内消除细菌，进一步表明应开发能够有效刺激T淋巴细胞的保护性疫苗。这些使用活细菌的解决方案具有很高的风险，因为它们可能会逆转其毒力并使被治疗的动物患病，从而产生不良的相反作用。
另一方面，美国专利9,463,231公开了一种药物组合物，其包含死亡的胞内劳森氏菌细菌与其他病原体抗原的混合物。在针对胞内劳森氏菌的重组疫苗中，已经公开了多种抗原，例如：核酸内切酶(申请US20070212373)，溶血素(美国专利7,029,683)，鞭毛蛋白(美国专利8,025,884)和位于所述细菌外膜中的蛋白质(US20110200631)。
尽管已经提供了几种控制动物增生性肠病的疫苗变体，但很少有疫苗变体进入市场并具有所需的保护功效。因此，仍然有必要以允许预防和控制该疾病的方式获得用于畜牧业的新的功能正常的疫苗。
附图说明
图1：合成抗原Invasq、OMP1q和OMP2q的表达盒的表示及其插入到载体pET-
Figure BDA0002470954140000022
中。其中(A)对应于间隔基/6xHis；(B)T7终止子；以及(C)T7启动子/Lac算子。
图2：用考马斯蓝(A和C)染色的蛋白质的凝胶电泳(SDS-PAGE)，对应于大肠杆菌中表达的合成抗原Invasq、OMP1q和OMP2q；和免疫印迹(B和D)。图A和B显示了三种抗原的表达；以及C和D显示纯化的抗原作为包涵体。
图3：在转化的大肠杆菌的破裂上清液和未加工细菌(阴性对照C-)的破裂上清液中表达的合成抗原(A)、(阳性对照C+)Invasq、OMP1q和OMP2q的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。图3B显示了当与感染胞内劳森氏菌的患病猪的血清一起温育时转移到硝酸纤维素膜上的现象(免疫印迹)。
图4：用合成蛋白抗原Invasq、OMP1q和OMP2q作为包涵体的小鼠的免疫方案(A)。使用经肌肉内途径免疫的小鼠样品在ELISA分析中的吸光度读数(B)。
图5：在患病猪的血清(猪+)和用合成蛋白抗原Invasq、OMP1q和OMP2q(5A)免疫的小鼠(鼠+)之间进行竞争性ELISA分析的设计；以及健康猪(猪-)和免疫小鼠(鼠+)(5B)。
图6：用合成蛋白抗原Invasq，OMP1q和OMP2q免疫猪的方案(A)。间接ELISA法评估不同条件下猪的免疫应答(B)。
图7：定量OAS2/GAPDH基因的相对表达。所使用的统计分析是双向图基(Tukey)多重比较检验的双向方差分析(****p≤0,0001，***p≤0,001，**p≤0，01)。
图8：定量IL-12a/GAPDH基因的相对表达。为了对结果进行统计分析，使用双向方差分析和事后图基(Tukey)多重比较检验(***p≤0,001，*p≤0,05)。
发明内容
本发明提供了一种编码劳森氏菌属细菌抗原的核苷酸序列，其包括：a)一种编码从由侵袭素和外膜蛋白组成的群中选择的蛋白质或其片段的核苷酸序列；以及b)一种编码用于T或B淋巴细胞的识别的表位的核苷酸序列，其选自由FSYATDLSY、FSFPYWFTF和KQFNLNTLL肽序列组成的组或者其组合。所述劳森氏菌的外膜蛋白为OMP1或OMP2。
在本发明的一个优选的实施例中，合成侵袭素序列包括序列SEQ.ID.NO.1或由此衍生的任何变体；合成外膜蛋白序列OMP1包括序列SEQ.ID.NO.2或由此衍生的任何变体；以及合成外膜蛋白序列OMP2包括序列SEQ.ID.NO.3或由此衍生的任何变体。
本发明的第二个方面是劳森氏菌属细菌的抗原，该抗原是一种合成蛋白质，其包括：a)一种从由侵袭素和外膜蛋白组成的组中选出的蛋白或其片段；以及b)用以T或B淋巴细胞识别的表位，其肽序列选自由FSYATDLSY、FSFPYWFTF和KQFNLNTLL组成的组或其组合。在一个优选的实施例中，合成侵袭素序列包括序列SEQ.ID.NO.4或由此衍生的任何变体；合成外膜蛋白序列OMP1包括序列SEQ.ID.NO.5或由此衍生的任何变体；以及合成的外膜蛋白序列OMP2包括序列SEQ.ID.NO.6或由此衍生的任何变体。
第三个方面涉及一种编码劳森氏菌属细菌抗原的表达盒，包括：a)一种促进转录的核苷酸序列；b)一种编码对应于一种合成序列的劳森氏菌属细菌抗原的核苷酸序列，所述合成序列包括：i)一种编码从由侵袭素和外膜蛋白组成的组中选择的蛋白或其片段的核苷酸序列；以及i i)一种编码用以识别T或B淋巴细胞的表位的核苷酸序列，其选自由FSYATDLSY、FSFPYWFTF和KQFNLNTLL肽序列组成的组或其组合；其中所述编码劳森氏菌属细菌抗原的核苷酸序列与a)的核苷酸序列操作性地连接；以及c)与b)的核苷酸序列操作性连接的转录终止子。在一个优选的实施例中，表达盒串联重复地包括编码合成侵袭素蛋白和合成外膜蛋白OMP1和OMP2的表达盒。
本发明的第四个方面是用编码劳森氏菌属细菌抗原的核苷酸序列转化的细胞，所述核苷酸序列包括一个表达盒，所述表达盒包括一个合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列包括：i)一种编码从由侵袭素和外膜蛋白组成的组中选择的蛋白或其片段的核苷酸序列；和i i)一种编码为识别T或B淋巴细胞的表位的核苷酸序列，所述表位选自FSYATDLSY，FSFPYWFTF和KQFNLNTLL肽序列组成的组或其组合。在一个优选的实施例中，所述转化细胞是原核细胞，更优选的是大肠杆菌菌属的细菌。
本发明的第五个方面是针对劳森氏菌属细菌的疫苗，其包括至少一种抗原，选自包括以下的组：一种合成的侵袭蛋白，包括序列SEQ.ID NO.4号或由此衍生的任何变体的；一种合成的外膜蛋白OMP1，其包括序列SEQ.ID NO.5或由此衍生的任何变体；一种合成外膜蛋白OMP2，其包括序列SEQ.ID NO.6或由此衍生的任何变体；以及上述的组合。优选地，该疫苗包括三种合成蛋白质的组合。
本发明还提供了一种产生劳森氏菌属细菌抗原的方法，其包括以下步骤：a)提供一种可操作地插入到表达载体中的表达盒，所述表达盒包括合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列包括：i)一种编码从由侵袭素和外膜蛋白组成的组中选择的蛋白质或其片段的核苷酸序列；和i i)一种编码为识别T或B淋巴细胞的表位的核苷酸序列，该表位选自由FSYATDLSY、FSFPYWFTF和KQFNLNTLL肽序列组成的组或其组合，或其片段或其组合；b)用a的载体转化细胞；c)从b)的转化细胞的培养物中获得合成抗原。优选地，在所述方法中，所述表达盒串联重复地包括编码合成侵袭蛋白和合成外膜蛋白OMP1OMP2的表达盒。
序列
合成侵袭素(SEQ ID.NO.1)
Figure BDA0002470954140000051
合成OMP1(SEQ ID.NO.2)
Figure BDA0002470954140000052
合成OMP2(SEQ ID.NO.3)
Figure BDA0002470954140000061
合成侵袭素“INVASq”(SEQ.ID.NO.4)
Figure BDA0002470954140000062
合成OMP1“OMP1q”(SEQ.ID.NO.5)
Figure BDA0002470954140000063
合成OMP2“OMP2q”(SEQ.ID.NO.6)
Figure BDA0002470954140000064
Figure BDA0002470954140000071
Figure BDA0002470954140000081
具体实施方式
本发明提供了一种对抗由胞内劳森氏菌细菌引起的动物增生性肠病的重组疫苗。所述疫苗基于重组抗原，其序列已经被人工修饰以暴露其表面的抗原结构域以被T或B淋巴细胞识别。本发明提供了疫苗制剂，其包含具有佐剂和/或合适载体的这些抗原。
本发明的疫苗在易受劳森氏菌属细菌感染的动物中施用，优选属于胞内劳森氏菌属。在一个优选的实施例中，疫苗用于兽医用途。优选地，在这类易感染动物的多样性中发现哺乳动物，例如非人类灵长类动物，狗，兔子，马，绵羊，大鼠和小鼠，仓鼠，狐狸，鹿和雪貂。在一个更优选的实施例中，动物是猪等。
本发明对全世界的猪的健康、管理和饲养产生潜在的直接利益。不论动物的年龄或其先前被细胞内劳森氏菌属细菌感染的程度如何，均可在猪场以一剂或两剂大规模施用该疫苗，也就是说，可在健康或患病动物中施用该疫苗。
用于描述本发明的所有技术和科学术语对于具有所述技术领域的基本知识的人具有相同的含义。然而，为了更清楚地定义本发明，以下术语将被理解为定义如下。
“合成的”，“嵌合的”(缩写为q)或“人工修饰的”序列应理解为在其原始天然序列中发生变化的核苷酸或氨基酸序列，因此其在自然界中不存在。在本发明的框架内，所述人工修饰是指为T或B淋巴细胞的识别，插入表位。
“表位”或“抗原决定序列”应理解为蛋白质分子被T或B淋巴细胞受体识别的部分。
“表达盒”应该理解为一种DNA片段，该DNA片段含有在一个或多个切割或识别位点之间通过酶限制编码目的蛋白质的基因的至少一个序列。
术语“可操作地连接”是指至少两个元素的组合，在这种情况下，基因或核苷酸序列相对于彼此处于一定位置，从而使它们以可预见的方式操作。
“载体”将被理解为能够容纳外源或内源DNA片段或其混合物的DNA分子。
术语“串联重复”是指在整个序列中并排重复的DNA片段。
本发明涉及疫苗或疫苗组合物以及用于制备所述疫苗抗原的方法，所述抗原针对感染以及与胞内劳森氏菌(动物内增生性肠病的病原体)有关的病理所述疫苗包括新的重组合成抗原，这些抗原对应于膜蛋白OMP1和OMP2以及侵袭素的变体，为了T或B淋巴细胞的识别，它们已被表位的至少一个编码序列人工修饰。疫苗可包括这些合成抗原之一或其组合。在本发明的一个优选的实施例中，疫苗包括三种修饰的抗原OMP1，OMP2和侵袭素的混合物。
本发明提供编码劳森氏菌属细菌，优选胞内劳森氏菌属的蛋白变体的合成DNA核苷酸序列，其已经用至少一种编码表位的序列人工修饰，所述表位用以识别T或B淋巴细胞，选自由FSYATDLSY，FSFPYWFTF和KQFNLNTLL肽序列组成的组或其组合
本发明还提供了由前述合成核苷酸DNA序列编码的蛋白质或合成蛋白质抗原，其中所述合成抗原可以包括一个或多个所示表位，其插入天然蛋白质序列内的任何位置。在一个优选的实施例中，将所述表位插入形成环的蛋白质的区域中。在另一个优选的实施例中，所述表位替代或替换了对主要组织相容性复合体(MHC)的等位基因覆盖率低的表位。
在本发明的一个实施例中，下表1表示合成DNA核苷酸序列及其相应的编码氨基酸序列。在编码DNA链的5'至3'方向提供核苷酸序列，其与转录的非编码模板链互补。DNA编码链与在转录过程中合成的信使RNA分子相同，后者具有尿嘧啶(U)而不是胸腺嘧啶(T)的含氮碱基。
表1抗原核苷酸和氨基酸序列。
名称 核苷酸序列 氨基酸序列
合成侵袭素(Invasq) SEQ.ID NO.1 SEQ.ID NO.4
合成OMP1(OMP1q) SEQ.ID NO.2 SEQ.ID NO.5
合成OMP2(OMP2q) SEQ.ID NO.3 SEQ.ID NO.6
合成或嵌合蛋白抗原侵袭素、OMP1和OMP2的核苷酸和氨基酸序列分别称为“Invasq”，“OMP1q”和“OMP2q”。其中与人工插入的表位的序列相对应的修饰用下划线标出，指示其被包括的位置。插入所述表位以替换具有主要组织相容性复合体(MHC)的覆盖率低的表位。
本发明还提供了一种编码胞内劳森氏菌抗原的表达盒，其包含转录启动子DNA的核苷酸序列，编码所述细菌的合成抗原的核苷酸序列和转录终止DNA的核苷酸序列。表达盒的所有元件彼此可操作地连接，从而可以从中实现生物系统中编码序列的转录。在编码序列的上游发现启动子序列，而在编码序列的下游发现转录终止子序列。表达盒可包含至少一个编码根据本发明的合成蛋白Invasq，OMP1q或OMP2q的序列。启动子序列可以是结构性或可诱导性的。举例来说，可用于这些目的的本领域已知的一些启动子是基因lacI，lac/lacUV5，lac/lacUV5，tac/trc，T7/T7/lac或其变体的启动子，或其他本领域技术人员已知的其他启动子。
在一个优选的实施例中，表达盒以串联重复的方式包括编码合成侵袭素蛋白和合成外膜蛋白OMP1和OMP2的表达盒，即并排。其中可能任选地存在其他元素，例如报告基因，选择标记编码基因，限制性酶切位点，多个克隆位点，用于产生蛋白质目的地的信号序列，促进纯化产生的蛋白质的标记以及在现有技术中众所周知的其他元素。所述编码合成蛋白Invasq，OMP1q和OMP2q的表达盒可以以任何顺序定位。
为了转化合适的宿主并产生本发明的合成抗原，可以将本发明的表达盒可操作地插入表达载体中。或者可以将其插入克隆载体中以在合适的宿主中获得其拷贝。优选地，所述合适的宿主是原核细胞。在一个优选的实施例中，所述细胞是大肠杆菌。进行这种操作的分子生物学技术在本领域中以及本领域技术人员中是众所周知的。作为参考，以下文献Rosano，G.L.和Ceccarelli，E.A.(2014)，《大肠杆菌中的重组蛋白表达：进展与挑战》，《前沿微生物学》(Front Microbiol。2014；5：172指出在大肠杆菌中获得重组蛋白的标准方案。目的抗原的表达可以直接针对细胞的任何一个隔间。尽管有前述规定，但是本领域的任何技术人员都将理解，可以使用各种各样的原核，真核宿主细胞，或者甚至将所述表达盒并入病毒载体中以便随后感染合适的宿主。或者，本发明的表达盒可用作DNA疫苗的一部分，以在易受胞内劳森氏菌感染的目的动物中产生重组抗原。任选地，本发明的合成蛋白抗原可以在能够组装形成病毒样颗粒(VLP)的无害蛋白中表达。
本发明的另一个目的是针对劳森氏菌属细菌，优选胞内劳森氏菌细菌的疫苗或疫苗组合物。所述疫苗包含至少一种从以下的组中选出的合成抗原，所述组由合成侵袭素蛋白，OMP1或OMP2，其已经根据本发明进行了人工修饰，以包括至少一个用于识别从所述FSYATDLSY、FSFPYWFTF，以及KQFNLNTLL肽序列组中选择的T或B淋巴细胞的表位或其组合。在一个优选实施例中，合成侵袭素序列包括SEQ.ID.NO.4或从其衍生的任何变体；合成外膜蛋白OMP1包括序列SEQ.ID.NO.5或其衍生的任何变体；合成外膜蛋白OMP2包括序列SEQ.ID.NO.6或从其衍生的任何变体。在一个更优选的实施例中，疫苗包含上述三种合成蛋白抗原的混合物。所述混合物可以以任何比例包含所述三种抗原，优选等比例为1∶1∶1。任选地，疫苗可以包括用于增强免疫应答的干扰素。
本发明的疫苗包含数量在100至200μg之间的合成抗原。该疫苗可与任何对猪可能具有潜在免疫原性的油性或其他佐剂结合使用，这在现有技术中是已知的。作为参考，出版物(Heegaard,P.M.等人(2011).兽医疫苗学中的佐剂和给药系统：当前状态和未来发展.病毒学档案,156(2),183-202)公开了用于这些目的的佐剂。举例来说，可以使用佐剂蒙塔尼德(Montanide)ISA 15A VG，Adyuvac 70，蒙塔尼德(Montanide)888，弗氏佐剂。在另一个优选的实施例中，合成抗原可以与免疫增强细胞因子猪干扰素α(pIFN-α)以100-300μg之间的比例范围共同施用，以进一步增强动物的免疫应答，最终获得合成抗原，干扰素α和佐剂的混合物比例为80:20v/v，其中80％的体积对应于合成抗原成分和干扰素α。疫苗可任选地包括药用载体，该药用载体允许获得适合在猪中施用的药物形式，例如胶囊，微胶囊，纳米颗粒，脂质体等。
施用途径可以是肌内注射，皮下或皮内注射，经皮和其他途径，例如腹腔内、静脉内、口服甚至是吸入。可以至少施用一剂，并且可选地向动物提供加强疫苗接种。疫苗可以在动物的任何年龄施用。在一个优选的实施例中，待接种疫苗的猪的年龄范围可以在生命的15至30天之间变化，优选在断奶前。
本发明的另一个目的是一种生产胞内劳森氏菌抗原的方法，该方法包括以下步骤：提供编码本发明的合成抗原的表达盒，该表达盒可操作地插入表达载体中；用所述载体转化宿主细胞并从所述转化细胞的培养物中获得合成抗原。在一个优选的实施例中，所述宿主细胞是大肠杆菌。如前所述，大肠杆菌的转化和培养技术在现有技术中是众所周知的。作为参考，出版物(Sivashanmugam,A.等(2009).使用大肠杆菌生产非常高产量的重组蛋白的实用规程.蛋白质科学,18(5),936-948)提供了用于在该宿主中获得重组蛋白的方案和培养基。
在一个优选的实施例中，可以从先前转化的大肠杆菌培养物中纯化来源于劳森氏菌的合成抗原作为包涵体。包涵体可以用于疫苗，因为它们呈现免疫显性序列。使用本发明的合成蛋白抗原作为包涵体具有很大的优势，因为在提取蛋白后不必重新自然化。从大肠杆菌获得包涵体的方法在现有技术中是已知的，作为参考，出版物(Promdonkoy,B.等(2004).在大肠杆菌中从大鲶鱼(巨鲶鱼)生产具有生物活性的生长激素.生物技术快报,26(8),649-653)公开了一种用于此目的的有效方案。
在描述了本发明的优选实施例之后，参照说明书中包括的附图，应当理解本发明不限于所述优选实施例，并且本领域技术人员可以在保持本发明的实质的前提下进行修改。
下面给出了本发明的实施方式的示例，这些示例是为了说明本发明、其优选实施方式和比较示例而包括的，但在任何情况下都不应被视为限制本专利申请的范围，专利申请的范围仅由本文所附权利要求书的内容限定。
应用实施例
实施例1：胞内劳森氏菌的保护性抗原的预测。
使用NCBI Finder开放阅读框工具分析了胞内劳森氏菌PHE/MN1菌株的完整基因组序列，以找到开放阅读框(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。通过鉴定可能编码蛋白质的1,340个序列，通过生物信息学工具(http://www.cbs.dtu.dk)鉴定了与膜和分泌蛋白相对应的序列。通过该分析，鉴定了对应于分泌蛋白的33个序列和306个膜蛋白。从后者来看，123对应于类型I。
从先前鉴定的蛋白质，进行表位预测以识别B和T淋巴细胞。使用ABCpred和BCEpred工具(http://www.imtech.res.in/raghava)鉴定B表位，应用大于0.9的临界值。选择有这些特征的具有至少五个B表位的28种蛋白质。从这些蛋白质中，使用CBS服务器的NetMHC工具，在MHCI类环境中识别出具有潜在识别能力的T表位，以增强Th1反应，并作为标准，所有评估的MHC等位基因的覆盖率均大于50％。
根据胞内劳森氏菌的生命周期和发病机理，考虑到分子量小于70kDa的蛋白质，进行在大肠杆菌中表达的蛋白质的筛选。另外，为每个MHC等位基因插入三个覆盖率为100％的T表位。这些表位被包括在与这些蛋白质形成键的区域中，并且总是以低覆盖率取代T表位。通过这种方式，获得了本发明的合成核苷酸和氨基酸序列，其对应于Invasq蛋白抗原和外膜蛋白OMP1q和OMP2q；那些包括用于识别T或B淋巴细胞的FSYATDLSY，FSFPYWFTF和KQFNLNTLL表位序列。
实施例2：合成抗原Invasq、OMP1q、OMP2q的表达盒的设计。
一旦由编码核苷酸序列(或基因)设计合成或嵌合蛋白抗原Invasq、OMP1和OMP2，则设计了一个表达盒，用于随后将其克隆到载体中。序列SEQ ID.NO 7显示所述表达盒，其中转录的调节元件被指示。作为一个优选的实施例，所述盒以串联重复的方式包括编码所提及的合成抗原的合成核苷酸序列，每个合成序列的启动子和终止子序列均可操作地连接。将表达盒克隆到限制位点NdeI和XhoI之间的表达载体pET22b(+)
Figure BDA0002470954140000141
中。图1显示了插入到所提及的载体中的表达盒的表现，其被命名为pLawVac。每个蛋白质具有氨基酸组氨酸的重复序列，以促进在金属离子结合基质中的纯化。
实施例3：由胞内劳森氏菌产生合成抗原
合成抗原在大肠杆菌中的表达。
上述获得的包括三种合成抗原Invasq、OMP1和OMP2的表达盒的表达载体(pLawVac)用于转化大肠杆菌K12菌株的培养液(
Figure BDA0002470954140000151
T7，新英格兰生物实验室)。用载体(100μL培养液/100ng载体)进行转化，方法是在42℃下热震荡2分钟，然后将细菌接种到37℃下的琼脂LB-氨苄青霉素平板上(0.1μg/mL))上16小时。用0.5mM异丙基β-D1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行蛋白质表达的诱导。将培养物保持12小时，然后在4330g下离心15分钟以获得沉淀或颗粒中的细菌。将细菌重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水溶液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、8M尿素)中，然后在8M尿素存在下，使用法国乳化C-5压力机Avestin公司(900psi)进行细胞破碎。最后，回收上清液，在15000g在4℃下离心20分钟。
在变性条件下通过12％电泳凝胶(SDS-PAGE)分析上清液，随后转移至硝酸纤维素膜上(免疫印迹)以评价合成抗原的细胞内表达。诱导后6小时和12小时取样。如图2a(考马斯蓝染色)和B(免疫印迹)所示，分别表达了3种蛋白Invasq、OMP1q和OMP2q，分别对应于约25、35和65kDa的分子量(分别为诱导后2和4、6和12小时的通道)。通道1和3显示未转化细菌的细胞破裂上清液作为对照。以小鼠抗组氨酸(美国Clontech实验室)为主要抗体，以标记的抗小鼠(美国Jackson，Alexa Fluor 680)为次要抗体。使用图像采集系统(Odysseysystem，LI-COR，Bioscience)在680nm波长处观察到了这些谱带。
同时，从先前转化的大肠杆菌培养物中获得合成抗原作为包涵体。为此，使用了Promdonkoy,B.等人的协议(2004)(在大肠杆菌中从大鲶鱼(巨鲶鱼)生产具有生物活性的生长激素.生物技术快报,26(8),649-653)。图2C显示了用考马斯蓝染色的所述抗原(通道1)的SDS-PAGE凝胶，并且在D中，按照相同的实验步骤显示了免疫印迹转移。C和D中标有a1的通道显示分子量模式。
感染猪血清中特异性抗体的识别。
在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，图3A)中分析了大肠杆菌
Figure BDA0002470954140000152
T7的破裂上清液，其中含有劳森氏菌的蛋白抗原(C+)和未加工细菌的破裂上清液(C-)，并转移到硝酸纤维素膜上(免疫印迹，图3B)。作为首要抗体，使用感染了胞内劳森氏菌的患病猪的血清，并作为次要抗体使用标记为抗猪的(Alexa fluor 680，杰克逊，美国)。结果显示，根据三种劳森氏菌蛋白(分别为Invasq、OMP1q、OMP2q：25、35和65kDa)的分子量，可以在预期的电泳高度处出现谱带。作为阴性对照在未转化的大肠杆菌样品中未观察到信号。这一结果具有很大的相关性，因为它证实了在表达载体中包含潜在免疫原性序列的生物信息设计所依据的预测。
实施例4：用合成蛋白抗原Invasq、OMP1q和OMP2q进行免疫分析。
评价被劳森氏菌包涵体免疫的小鼠的免疫反应。
用溶解在PBS盐水中的50μg合成蛋白抗原作为包涵体给雌性C57BL/6小鼠免疫。作为阴性对照，使用未转化的大肠杆菌细菌的包涵体。肌内免疫。使用
Figure BDA0002470954140000161
ISA 15AVG(Seppic)作为佐剂，抗原：佐剂比例(80∶20)，并施用100μL。在试验的第1天进行第一次免疫，然后在第21天进行第二次免疫。从试验开始到试验的第35天，每7天采集一次血样(图4A)。制作每组5只小鼠的实验组，评价相对于阴性对照组的抗原的体液反应。
采用间接ELISA，通过肌肉内途径给予两次50μg剂量的劳森氏菌合成抗原Invasq、OMP1q和OMP2q包涵体后，对小鼠的IgG反应(血清中)进行评价。为此，用100μL包涵体包被板，并在4℃下用8M尿素(10μg/mL)溶解过夜。用1/100稀释的小鼠血清作为主要抗体，用山羊抗鼠IgG结合过氧化物酶(1/10000)作为次要抗体。在492nm的波长下进行读取。在实验中，使用未转化细菌的蛋白质作为对照。
结果表明，从进行第二次免疫后的第三周开始，与使用未处理细菌的包涵体进行免疫的小鼠相比，经肌内途径用合成蛋白抗原进行免疫的小鼠具有显着差异(图4B)。
合成蛋白抗原功能的评价。
重组抗原的功能通过竞争性ELISA分析进行评估(图5)。实验是通过用获得的合成蛋白抗原(Invas、OMP1q、OMP2q)作为溶解的包涵体包被酶标板和用不同血清浓度孵育被劳森氏菌感染而患病的猪进行的。随后将其与来自如上所述用合成蛋白抗原免疫的小鼠的血清一起孵育。采用与过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(英国，Abcam)作为二级抗体。这样，测定吸光度的降低反映了识别抗原的主要抗体之间的竞争。
图5显示了吸光度值的结果，从中减去用未转化细菌包涵体免疫的小鼠血清作为对照获得的值。使用的统计分析是Kruskal-Wallis检验，然后是Dunn post-hoc检验(**p<0.01)。图5A和5B所示的结果表明，用合成蛋白抗原(小鼠+)免疫的小鼠中产生的抗体与患病猪的血清中存在的抗体竞争(猪+，图5A)。
先前小鼠血清孵育(未稀释)时获得的吸光度的显着降低(492nm)表明受感染猪血清和合成蛋白抗原免疫小鼠的血清中存在的抗体与重组合成蛋白抗原中存在的表位共享。当使用来自受感染猪的血清的连续稀释液时，这种行为会发生变化，从而导致猪血清稀释液的稀释度越高，竞争性降低，因此吸光度差异也将降低。使用健康猪的血清(猪-)作为对照进行竞争性测试时，未观察到吸光度下降，如预期的那样(如图5B所示)。该结果非常重要，因为它表明本发明的合成蛋白抗原作为制备疫苗的候选物是特异和有效的。
评价用劳森氏菌包涵体免疫的猪的免疫应答。
断奶后三周，对八只健康猪进行了免疫，每只动物通过肌肉内注射200μg抗原，包含在大肠杆菌中获得的浓度为200μg/mL的合成蛋白抗原Invasq、OMP1q和OMP2q的包涵体。并在21天时进行加强免疫(T21)，如图6A所示。将抗原与佐剂Montanide ISA 15A VG以80:20的比例混合。使用向其注射细菌的阴性蛋白质的八头猪作为阴性对照组。另外，对实验组(n＝8)进行了测试，其中给猪施用由合成抗原，猪干扰素α和佐剂的混合物组成的乳剂，保持水溶液：(Montanide)佐剂的比例为(80∶20)。
从第1周(T7)到第6周(T42)，每7天从T7至T42采集血清样品，并通过间接ELISA分析定量免疫应答(IgG抗体)。为此，用可溶性劳森氏菌合成蛋白抗原(Invasq、OMP1q和OMP2q)对平板进行敏化。图6B中的数据显示了猪IgG间接ELISA检测中获得的吸光度，方法是分析用劳森氏菌合成抗原、合成抗原与猪α干扰素的混合物免疫的动物和对照组的血清。结果显示，与加强剂量后的第四周相比，试验结果有显著差异，观察到在猪体内注射合成抗原Invasq、OMP1q和OMP2q作为疫苗产生的IgG应答明显大于阴性对照组。另外，观察到通过在免疫混合物中加入猪干扰素α，获得了比以前的组明显更大的IgG免疫应答。上述结果表明，根据本发明，接种疫苗的猪能够产生对抗胞内劳森氏菌的重组合成蛋白抗原(Invasq、OMP1q和OMP2q)的抗体。此外，在制剂中添加干扰素α，显著提高了仅注射合成抗原混合物的组的IgG应答。
免疫混合物中干扰素α的活性是通过实时聚合酶链反应(PCR)在第一次免疫后0、4和8天测量每个实验组的8只猪中寡聚腺苷酸合成酶(OAS2)基因的差异表达来确定的。为此，将GAPDH基因的表达用作参考基因(图7)。干扰素α/β与受体的相互作用导致基因(例如OAS)的转录，该基因通过被感染细胞中病原体遗传物质的降解来诱导免疫系统的反应。从外周血中提取的淋巴细胞中，RNA通过标准方案(TRIzol，Invitrogen)纯化，并通过逆转录使用RevertAidTM逆转录酶试剂(M-MuLV RT，Thermo)获得第一条互补DNA链分析OAS2基因相对于参考基因GAPDH的相对表达，所述基因显示抗病毒活性。
结果表明，与不含细胞因子的抗原混合物的免疫组和对照组相比，第一次接种含有合成蛋白抗原Invasq、OMP1q和OMP2q加α-干扰素的免疫组第8天的OAS2基因表达有显著差异。结果表明，通过在免疫混合物中加入猪干扰素α，可以激活免疫系统，特别是由增加的IgG表达的体液免疫反应，如图6所示。
对劳森氏菌包涵体免疫的猪的细胞免疫反应的评价。
通过测定促炎细胞因子IL-12，评价三组猪实验组的细胞反应。使用GAPDH基因的表达为参考基因，在第一次免疫后0、2、4、6和8天，通过实时PCR测定每个实验组8头猪中IL-12基因编码的差异表达(图8)。为此，提取外周血淋巴细胞(PBL)，并从所述淋巴细胞中通过标准化方案(TRIzol，Invitrogen)纯化RNA。纯化RNA后，使用RevertAidTM逆转录酶试剂(M-MuLV RT，Thermo)进行逆转录以获得第一条互补DNA链。
结果显示，与阴性对照组相比，用含有合成抗原的配方(***p≤00001)和也含有干扰素α(*p≤0.05)的配方免疫的组在首次免疫后8天，IL12/GAPDH的相对表达显著增加。促炎性IL-12的增加表明Th1型细胞反应的发生。
实施例5：被合成蛋白抗原Invasq、OMP1q和OMP2q免疫的猪对抗暴露于胞内劳森氏菌属细菌的保护性检测。
在实施例4中所述的两个实验组，每组8头猪中，对抗胞内劳森氏菌感染的保护性进行评估。用与猪干扰素α联合配制的由合成蛋白抗原Invasq、OMP1q和OMP2q免疫的组和阴性对照组。在第一次免疫后55天，两组所有动物都从一只自然感染胞内劳森氏菌的动物身上口服40ml浸渍回肠。通过组织病理学和免疫组织化学检测作为接种物的浸渍组织中是否存在胞内劳森氏菌。每隔一天对两组动物进行一次监测，观察在激发试验期间的临床症状和行为。
接种30天后，采集血液和血清样品，随后处死所有动物以进行尸检。尸检时，相对于用蛋白抗原加干扰素α免疫的组，在阴性组动物中观察到胃肠道的改变。使用传统和免疫组织化学技术进行组织病理学研究，仅在接种组的动物中观察对细胞内劳森氏菌感染的保护作用。

Claims (15)

1.一种编码劳森氏菌属细菌抗原的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是一个合成序列，包括：
a)一种编码从由侵袭素和外膜蛋白组成的组中选出的蛋白或其片段的核苷酸序列；以及
b)一种编码表位的核苷酸序列，所述表位用于识别T或B淋巴细胞，其选自由FSYATDLSY、FSFPYWFTF和KQFNLNTLL肽序列组成的组或者其组合。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的劳森氏菌外膜蛋白为OMP1和OMP2。
3.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述合成侵袭素序列包括序列SEQ.ID.NO.1或由此衍生的任何变体。
4.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述合成外膜蛋白OMP1的序列包括序列SEQ.ID.NO.2或由此衍生的任何变体。
5.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述合成外膜蛋白OMP2的序列包括序列SEQ.ID.NO.3或由此衍生的任何变体。
6.一种劳森氏菌属细菌的抗原，其特征在于，所述劳森氏菌属细菌的抗原是一种合成蛋白质，包括：
a)一种从由侵袭素和外膜蛋白组成的组中选择的蛋白质或其片段；以及
b)一种用以识别T或B淋巴细胞的表位，其肽序列选自由FSYATDLSY、FSFPYWFTF和KQFNLNTLL组成的组或其组合。
7.根据权利要求6所述的抗原，其特征在于，所述合成侵袭素序列包括序列SEQ.ID.NO.4或由此衍生的任何变体。
8.根据权利要求6所述的抗原，其特征在于，所述合成外膜蛋白OMP1的序列包括序列SEQ.ID.NO.5或由此衍生的任何变体。
9.根据权利要求6所述的抗原，其特征在于，所述合成外膜蛋白OMP2的序列包括序列SEQ.ID.NO.6或由此衍生的任何变体。
10.一种编码劳森氏菌属细菌抗原的表达盒，其特征在于，所述表达盒包括：
a)一种促进转录的核苷酸序列；
b)一种编码对应于一种合成序列的劳森氏菌属细菌抗原的核苷酸序列，包括：
i.一种编码从由侵袭素和外膜蛋白组成的组中选出的蛋白或其片段的核苷酸序列；以及
ii.一种编码表位的核苷酸序列，所述表位用以识别T或B淋巴细胞，其选自由FSYATDLSY、FSFPYWFTF和KQFNLNTLL肽序列组成的组或其组合；
其中所述编码劳森氏菌属细菌的抗原的核苷酸序列与核苷酸序列a)操作性地连接；以及
c)一种与核苷酸序列b)操作性地连接的转录终止子。
11.根据权利要求10所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒串联重复地包括编码合成侵袭蛋白和合成外膜蛋白OMP1和OMP2的表达盒。
12.一种对抗劳森氏菌属细菌的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括至少一种抗原，所述抗原选自包括以下的组：
·一种合成侵袭素蛋白，包括序列SEQ.ID NO.4或由此衍生的任何变体；
·一种合成外膜蛋白OMP1，包括序列SEQ.ID.NO.5或由此衍生的任何变体；
·一种合成外膜蛋白OMP2，包括序列SEQ.ID.NO.6或由此衍生的任何变体；
·以及以上的组合。
13.根据权利要求12所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括三种合成蛋白和猪干扰素α的组合。
14.一种产生劳森氏菌属细菌的抗原的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)提供一种可操作地插入到一个表达载体中的表达盒，所述表达盒包括合成核苷酸序列，所述合成核苷酸序列包括：
i.一种编码从由侵袭素和外膜蛋白组成的组中选出的蛋白或其片段的核苷酸序列；以及
ii.一种编码表位的核苷酸序列，所述表位用于识别T或B淋巴细胞，其选自由FSYATDLSY、FSFPYWFTF和KQFNLNTLL肽序列组成的组或其组合或其片段或其组合；
b)用a)的载体转化细胞；
c)从b)的转化细胞的培养物中获得合成抗原。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述表达盒串联重复地包括编码所述合成侵袭蛋白和所述合成外膜蛋白OMP1和OMP2的表达盒。
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