CN111647505A - 一种dna采集拭子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种DNA采集拭子及其制备方法和应用。所述DNA采集拭子的制备原料包括聚己内酯、亲水性介质和载体；所述亲水性介质包括糖类和/或非糖类有机高分子聚合物。所述DNA采集拭子以聚己内酯作为骨架，糖类和/或非糖类有机高分子聚合物作为亲水性介质对聚己内酯骨架进行改性，共同复合在载体上形成拭子，形成的拭子对细胞及痕量的DNA吸附和采集效果优异，并能在后续的DNA提取步骤中释放更多的DNA，而且不影响后续的PCR扩增，可应用于接触性痕量DNA的检测。

Description

一种DNA采集拭子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种DNA采集拭子及其制备方法和应用。
背景技术
法医DNA分析，是应用现代DNA技术分析DNA遗传标记在群体中的分布与传递规律，确定分析样品的一致性与遗传关系，为侦查破案件和司法审判提供证据的一门科学技术。常染色体STR(短串联重复序列)基因座是目前亲权鉴定实验室中运用最广泛的遗传标记，目前已经开发了很多用于法医DNA分析的商业化STR检测试剂盒，极大推动了侦查破案和司法审判的科学应用。但是在大量应用这些技术进行检验的过程中也存在现有检测条件无法很好解决的问题，如绳索、弹壳、面罩、混合精斑等微量、降解、混合检材的检测，而且随着犯罪分子作案手段的不断提高，此类检材在犯罪现场出现的情况也日益增多。通常情况下，使用常规检验技术难以得到理想实验结果的生物检材，而这里面难点之一是接触性微量检材。目前没有一个硬性的指标将微量DNA区别于传统的STR分型(Gill&Buckleton 2010)，但已有几种不同论述对其进行定义，如由PCR反应(聚合酶链式反应)所检测的DNA含量来界定，如＜100pg或＜200pg，其通过定量分析而确定。这也就是需要的细胞数目为25-50个，这还是提取效率100％的情况下，所以需要我们对接触性痕量的样本细胞数目为20-100的样本需要重点关注。
而现有的采集接触性样本的拭子材质一般是如下几种：1、聚酯纤维、涤纶或人造丝头，柄部为塑料或铝的拭子：宜用于病毒学检验标本的采集。2、棉拭子：宜用于支原体检验的阴道、宫颈及尿道标本的采集，不宜用于细菌(特别是苛养菌)、衣原体检验标本的采集。3、涤纶拭子和尼龙拭子：宜用于病毒和细菌标本的采样。4、植绒拭子：由尼龙纤维经专有的喷雾技术制成，宜用于呼吸道病毒采样和真菌培养标本的采样。5、藻酸钙拭子：宜用于衣原体和百日咳鲍特菌鼻咽拭子的采集，但不宜用于脂质包膜病毒及细胞培养的采样，不宜用于淋病奈瑟菌的采样。
上述这些不同类型的拭子有着不太一致的操作。如当使用棉签拭子时，这些接触性样本上的DNA痕迹可以转移至蘸过蒸馏水的消毒棉签上，用湿棉签擦拭痕迹部位，直至痕迹全转移至棉签上。湿、干棉签联用(Sweet at 1997)的所谓“双棉签技术”是一种最常见的采集细胞的方法。先用消毒的蒸馏水浸湿棉签，清刷痕迹表面使细胞水化，使其从附着表面松散。随后用干棉签从附着表面采集额外的细胞。普遍认为再水化的细胞更容易粘附于干棉签上。不幸的是，由于棉签中提取DNA的效率较差，这种方法会限制DNA的回收量。棉签拭子采集的第二个困难是细胞会粘附在棉花纤维上不易释放出来，Voorbees 2006中提到需要用纤维酶消化棉签，分解棉花中的纤维素，可以提高DNA的回收量。而用另一种尼龙植绒棉签的方法与普通棉签相对可以再采集提取过程中释放更多的细胞而产物更多的DNA(Benschop et al.2010)。尼龙植绒棉签的棉签虽然可以释放更多的DNA，但是其吸水性不佳，对细胞的粘附性不够，因此还是会限制其在接触性痕量DNA的采集使用。
综上所述，对于法医接触性痕量DNA采集来说急需一种高性能的拭子，需要满足如下几点：(1)对细胞及痕量的DNA吸附和采集效果较好；(2)能在后续的DNA提取步骤中释放更多的DNA；(3)不影响后续的PCR扩增。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种DNA采集拭子及其制备方法和应用。所述DNA采集拭子具有多孔性、亲水性、细胞粘附性以及易脱附的特性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种DNA采集拭子，所述DNA采集拭子的制备原料包括聚己内酯、亲水性介质和载体；
所述亲水性介质包括糖类和/或非糖类有机高分子聚合物。
在本发明中，所述聚己内酯作为DNA采集拭子的骨架，并用糖类和/或非糖类有机高分子聚合物作为亲水性介质对聚己内酯骨架进行改性，共同复合在载体上形成拭子。聚己内酯具有良好的生物相容性、良好的有机高聚物相容性，以及良好的生物降解性，而亲水性介质一是为聚己内酯提供亲水性基团；二是与聚己内酯之间提供交联网络结构，因而亲水性介质对聚己内酯骨架进行改性后，赋予了拭子较强的吸水性，形成拭子对细胞及痕量的DNA吸附和采集效果优异(DNA采集于皮革或玻璃上，采集效果均表现优异)，并能在后续的DNA提取步骤中释放更多的DNA，而且不影响后续的PCR扩增(体外DNA扩增技术，是在模板DNA、引物和脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应)，因此可应用于接触性痕量DNA的采集使用。
优选地，所述聚己内酯和亲水性介质的质量比为1:10-10:1，例如可以是1:10、2:10、3:10、4:10、5:10、6:10、7:10、8:10、9:10、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1等。其中，亲水介质与聚己内酯的质量比会最终影响其多孔性、亲水性和细胞粘附性；若不在此范围内，聚己内酯过多，由于区域疏水性最终拭子膜的亲水性不够，且形成的孔径较小；而亲水性介质过多，聚己内酯过少的话，则整个拭子膜的刚性下降，在随后的碱处理过程中拭子膜会出现坍塌的状态，且少量的聚己内酯不能形成穿网格的状态，不能形成多孔的复合结构。
优选地，所述聚己内酯的重均分子量为10000-60000，例如可以是10000、20000、30000、40000、50000、60000等。
优选地，所述糖类包括单糖、二糖或多糖中的任意一种或至少两种的组合，优选为多糖。其中，糖类选择多糖，是由于选择一种较高的分子量的糖类可以与高分子的聚己内酯形成多孔网格，而单糖则效果较差。
优选地，所述单糖包括葡萄糖和/或果糖。
优选地，所述二糖包括海藻糖和/或蔗糖。
优选地，所述多糖包括壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖、淀粉、纤维素或羧甲基纤维素中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述非糖类有机高分子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯马来酸乙磺酸、聚氨酯、聚乙烯醇、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚戊烯醇、聚醚多元醇、聚异戊烯醇、双环醇二聚物、聚碳酸酯二醇、聚己二醇、丙烯醇类聚醚或二聚酸聚酰胺中的任意一种或至少两种的组合，优选为聚乳酸和/或聚乙烯醇。
优选地，所述非糖类有机高分子聚合物的重均分子量为2000-18000，例如可以是2000、4000、6000、8000、10000、12000、14000、16000、18000等。
优选地，所述聚乳酸的重均分子量为14000-16000，例如可以是14000、14200、14400、14600、14800、15000、15200、15400、15600、15800、16000等，优选为15000。
优选地，所述聚乙烯醇的重均分子量为8000-15000，例如可以是8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000等，优选为12000。
优选地，所述载体的材质包括木质、聚乙烯、聚丙乙烯、聚四氟乙烯或金属中的任意一种。
优选地，所述金属包括铁、铝或合金中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述合金包括钼钨合金、铌钨合金、碳钨合金、碳钛合金或碳钽合金中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述载体在狭小的空间用铁丝、铝丝或者合金材料，在非狭窄空间用木质或聚乙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯材质的材料。
其中，所述狭小的空间指的是在直径小于5mm的圆柱形模具空间；非狭窄空间指的是直径大于等于5mm的圆柱形模具空间。
优选地，所述DNA采集拭子的制备原料还包括碱处理液。本发明的DNA采集拭子须经碱处理液进行处理，通过交联反应得到的DNA采集拭子还需要进行碱处理。通过碱处理可以把聚己内酯分子内部酯键水解进而形成亲水基团羧基和羟基，不易电离的羧基继续与碱反应变为易电离的盐，使DNA采集拭子的亲水性能得到进一步的提升。
优选地，所述碱处理液的pH在11以上，例如可以是11、11.5、12、12.5、13、13.5、14等。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述DNA采集拭子的制备方法，所述制备方法为：将聚己内酯和亲水性介质溶解后混合，与载体共同置于模具中成型，得到所述DNA采集拭子。
优选地，所述DNA采集拭子的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚己内酯溶解于预溶溶剂A中，得到聚己内酯溶液；将亲水性介质溶解于预溶溶剂B中，得到亲水性介质溶液；
(2)将步骤(1)得到的聚己内酯溶液和亲水性介质溶液混合后，与载体共同置于模具中成型，得到所述DNA采集拭子。
优选地，步骤(1)中所述预溶溶剂A包括二氯甲烷、氯仿、环己烷、甲苯、异辛烷或冰乙酸中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(1)中所述聚己内酯溶液的质量体积百分浓度为1-20％，例如可以是1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％等。(“质量体积百分浓度”指的是溶液中溶质的质量与溶液中溶剂的体积之比。)
优选地，步骤(1)中溶解于预溶溶剂A的温度为20-90℃，例如可以是20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃等。
优选地，所述预溶溶剂A为二氯甲烷、氯仿或冰乙酸中的任意一种或至少两种的组合。所述预溶溶剂A为二氯甲烷和/或氯仿，则聚己内酯加入后常温下机械搅拌即可；所述预溶溶剂A为冰乙酸，则需要对加热溶解，所述加热溶解的温度为60-90℃，所述加热时间为1-4h(例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h等)。
优选地，步骤(1)中所述预溶溶剂B包括二氯甲烷、氯仿、环己烷、甲苯、异辛烷、冰乙酸、水、甲醇、乙醇、正丙醇、1,2-丙二醇、丙三醇、甲醚或乙醚中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述聚己内酯溶液可以在25℃下储存3天以内，超过三天则聚己内酯的长链断裂，最终无法形成互穿网格的结构。
优选地，步骤(1)中所述亲水性介质溶液的质量体积百分浓度为2-40％，例如可以是2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％、40％等。(“质量体积百分浓度”指的是溶液中溶质的质量与溶液中溶剂的体积之比。)
优选地，步骤(1)中溶解于预溶溶剂B的温度为20-90℃，例如可以是20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃等。
优选地，步骤(2)中所述载体置于盛有混合液的模具中，所述载体与混合液液面底端的距离在0.1cm以上，例如载体与混合液液面底端的距离可以是0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm等。
优选地，步骤(2)中所述成型的温度为-80～-20℃，例如可以是-20℃、-30℃、40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃等，所述成型的时间为0.5-2h，例如可以是0.5h、0.6h、0.8h、1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2h等。
优选地，步骤(2)得到的DNA采集拭子还需依次进行冷冻干燥、清洗、碱处理液处理和杀菌处理。
优选地，所述冷冻干燥处理的温度为-80～-20℃，例如可以是-20℃、-30℃、40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃等，所述冷冻干燥处理的时间为1-10h，例如可以是1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h等。
优选地，所述清洗后的DNA采集拭子的pH为6.8-7.2，例如可以是6.8、6.9、7、7.1、7.2等。
优选地，所述碱处理液的pH在11以上，例如可以是11、12、13、14等。
优选地，所述杀菌处理采用紫外线杀菌。
优选地，所述DNA采集拭子的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚己内酯溶解于预溶溶剂A中溶解，得到质量体积百分浓度为1-20％聚己内酯溶液；将亲水性介质溶解于预溶溶剂B中溶解，得到质量体积百分浓度为2-40％亲水性介质溶液；
(2)将步骤(1)得到的聚己内酯溶液和亲水性介质溶液以体积比为(1-2):1混合后，与载体共同置于模具中，放置于-80～-20℃成型0.5-2h，得到所述DNA采集拭子；
(3)将步骤(2)得到的DNA采集拭子在-80～-20℃下冷冻干燥1-10h后，清洗至DNA采集拭子的pH为6.8-7.2，再置于pH在11以上的碱处理液中浸泡12-48h，清洗烘干后置于紫外灯下进行杀菌处理。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述DNA采集拭子在痕量DNA检测中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以聚己内酯作为DNA采集拭子的骨架，并用糖类和/或非糖类有机高分子聚合物作为亲水性介质对聚己内酯骨架进行改性，共同复合在载体上形成拭子。亲水性介质对聚己内酯骨架进行改性后赋予拭子强的吸水性，形成拭子对细胞及痕量的DNA吸附和采集效果优异，并能在后续的DNA提取步骤中释放更多的DNA，而且不影响后续的PCR扩增；
(2)本发明所述DNA采集拭子吸水性可达到180μL以上；释放细胞测试中：对100个细胞释放率高达78％以上，1000个细胞释放率高达74％以上，10000个细胞释放率高达82％以上。
附图说明
图1是实施例1制备的DNA采集拭子的扫描电镜图。
图2是实施例2制备的DNA采集拭子的扫描电镜图。
图3是实施例2制备的DNA采集拭子的短片段重复序列分型图。
图4是实施例2制备的DNA采集拭子和棉签拭子对痕量稀释血液样本的提取、脱附DNA浓度对比图。
图5是实施例2制备的DNA采集拭子和棉签拭子对痕量稀释唾液样本的提取、脱附DNA浓度对比图。
图6是实施例2制备的DNA采集拭子和棉签拭子对痕量接触性样本的标准DNA释放浓度浓度对比图。
图7是实施例2制备的DNA采集拭子和棉签拭子对不同痕量物质采集DNA浓度对比图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种DNA采集拭子，所述DNA采集拭子的制备方法包括以下步骤：
(1)将重均分子量为6万的聚己内酯25℃下溶解于二氯甲烷溶液，配置成质量体积百分浓度为10％的聚己内酯溶液；将壳聚糖(分子量为20kD)溶解于冰乙酸溶液中，70℃下加热溶解2h，配置成质量体积百分浓度为2％的亲水性介质溶液；
(2)将步骤(1)得到的聚己内酯溶液和亲水性介质溶液按照体积比1:1，25℃下2h混合均匀得到混合液，在铝制圆柱形模具(该模具总共可以加入2mL液体)中加入0.75mL该混合液，将铁丝载体放置于盛有混合液的模具中，铁丝载体离液面底端尚有0.5cm空间，在25℃下放置30min后，将整体置于-60℃下成型1h，得到所述DNA采集拭子；
(3)将铁丝载体接连的模具放置于冷冻干燥机中，-20℃下进行冷冻干燥2h；将干燥好的聚己内酯复合拭子放置于体积比浓度50％乙醇水溶液中，多次清洗至pH为7，25℃风干；将风干后的DNA采集拭子置于2mL的离心管中，加入1mL的2M碳酸氢钠(pH 11.5)中，处理30h后，用蒸馏水反复清洗至pH为7，置于50℃烘干；将烘干后的DNA采集拭子置于紫外灯下进行杀菌处理2h后装入无DNA酶和RNA酶的包装袋中保存。
图1为实施例1拭子表面的扫描电镜图，从图中可以看到：所述DNA采集拭子的表面的孔径分布大小20-50μm之间，所述DNA采集拭子表面孔洞较多，证明其存在较强的吸水和吸附能力。
实施例2
本实施例提供一种DNA采集拭子，所述DNA采集拭子的制备方法包括以下步骤：
(1)将重均分子量为38000的聚己内酯溶解于冰乙酸中，80℃加热溶解2h，配置成质量体积百分浓度为15％的聚己内酯溶液；将重均分子量为2万的羧甲基纤维素溶解于冰乙酸溶液中，80℃加热溶解2h，配置成质量体积百分浓度为6％的亲水性介质溶液；
(2)将步骤(1)得到的聚己内酯溶液和亲水性介质溶液按照体积比2:1，25℃下2h混合均匀得到混合液，在铝制圆柱形模具(该模具总共可以加入2mL液体)中加入0.75mL该混合液，将聚四氟乙烯载体放置于盛有混合液的模具中，聚四氟乙烯载体离液面底端尚有0.5cm空间，在25℃下放置30min后，将整体置于-20℃下1h，然后置于-30℃下1h，-50℃下1h，最后再-80℃下成型2h成型，得到所述DNA采集拭子；
(3)将聚四氟乙烯载体接连的模具放置于冷冻干燥机中，-20℃下进行冷冻干燥2h，去除多余的溶液；将干燥好的聚己内酯复合拭子放置于体积比浓度50％乙醇水溶液中，多次清洗至pH为7，25℃风干；将风干后的DNA采集拭子置于2mL的离心管中，加入1mL的2M氢氧化钠中，处理30h后，用蒸馏水反复清洗至pH为7，置于50℃烘干；将烘干后的DNA采集拭子置于紫外灯下进行杀菌处理2h后装入无DNA酶和RNA酶的包装袋中保存。
图2为实施例2拭子表面的扫描电镜图，从图中可以看到：所述DNA采集拭子的表面的孔径分布大小在5-25μm之间，所述DNA采集拭子表面孔洞较多，证明其存在较强的吸水和吸附能力。
实施例3
本实施例提供一种DNA采集拭子，所述DNA采集拭子的制备方法包括以下步骤：
(1)将重均分子量为38000的聚己内酯溶解于冰乙酸中，80℃加热溶解2h，配置成质量体积百分浓度为15％的聚己内酯溶液；将重均分子量为2万的羧甲基纤维素溶解于冰乙酸溶液中，80℃加热溶解2h，配置成质量体积百分浓度为6％的亲水性介质溶液；
(2)将步骤(1)得到的聚己内酯溶液和亲水性介质溶液按照体积比2:1，25℃下2h混合均匀得到混合液，在铝制圆柱形模具(该模具总共可以加入2mL液体)中加入0.75mL该混合液，将铁丝载体放置于盛有混合液的模具中，铁丝载体离液面底端尚有0.5cm空间，在25℃下放置30min后，将整体置于-20℃下1h，然后置于-30℃下1h，-50℃下1h，最后再-80℃下成型2h成型，得到所述DNA采集拭子；
(3)将铁丝载体接连的模具放置于冷冻干燥机中，-20℃下进行冷冻干燥2h，去除多余的溶液；将干燥好的聚己内酯复合拭子放置于体积比浓度50％乙醇水溶液中，多次清洗至pH为7，25℃风干；将风干后的DNA采集拭子置于紫外灯下进行杀菌处理2h后装入无DNA酶和RNA酶的包装袋中保存。
实施例4
本实施例提供一种DNA采集拭子，与实施例1的区别在于，所述聚己内酯的重均分子量为9000，其他条件与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种DNA采集拭子，与实施例1的区别在于，所述聚己内酯的重均分子量为18万，其他条件与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供一种DNA采集拭子，与实施例1的区别在于，将壳聚糖替换为重均分子量为15000的聚乳酸，其他条件与实施例1相同。
实施例7
本实施例提供一种DNA采集拭子，与实施例1的区别在于，将壳聚糖替换为重均分子量为15000的聚乙烯亚胺，其他条件与实施例1相同。
实施例8
本实施例提供一种DNA采集拭子，与实施例1的区别在于，将壳聚糖替换为海藻糖，其他条件与实施例1相同。
实施例9
本实施例提供一种DNA采集拭子，与实施例1的区别在于，步骤(2)中聚己内酯溶液和亲水性介质溶液按照体积比10:1，其他条件与实施例1相同。
实施例10
本实施例提供一种DNA采集拭子，与实施例1的区别在于，步骤(2)中聚己内酯溶液和亲水性介质溶液按照体积比1:10，其他条件与实施例1相同。
实施例11
本实施例提供一种DNA采集拭子，与实施例1的区别在于，步骤(3)中将风干后的DNA采集拭子置于2mL的离心管中，加入1mL的0.5M碳酸氢钠(pH 9.0)中，处理30h后，其他条件与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供一种DNA采集拭子，所述DNA采集拭子的制备方法包括以下步骤：
(1)将重均分子量为6万的聚己内酯25℃下溶解于二氯甲烷溶液，配置成质量体积百分浓度为10％的聚己内酯溶液；
(2)在铝制圆柱形模具(该模具总共可以加入2mL液体)中加入0.75mL步骤(1)得到的聚己内酯溶液，将铁丝载体放置于盛有混合液的模具中，铁丝载体离液面底端尚有0.5cm空间，在25℃下放置30min后，将整体置于-60℃下成型1h，得到所述DNA采集拭子；
(3)将铁丝载体接连的模具放置于冷冻干燥机中，-20℃下进行冷冻干燥2h；将干燥好的聚己内酯复合拭子放置于体积比浓度50％乙醇水溶液中，多次清洗至pH为7，25℃风干；将风干后的DNA采集拭子置于2mL的离心管中，加入1mL的2M碳酸氢钠(pH为11.5)中，处理30h后，用蒸馏水反复清洗至pH为7，置于50℃烘干；将烘干后的DNA采集拭子置于紫外灯下进行杀菌处理2h后装入无DNA酶和RNA酶的包装袋中保存。
对比例2
本对比例提供一种DNA采集拭子，所述DNA采集拭子的制备方法包括以下步骤：
(1)将重均分子量为15000的聚乳酸溶解于冰乙酸溶液中，70℃下加热溶解2h，配置成质量体积百分浓度为2％的亲水性介质溶液；
(2)在铝制圆柱形模具(该模具总共可以加入2mL液体)中加入0.75mL步骤(1)得到的亲水性介质溶液，将铁丝载体放置于盛有混合液的模具中，铁丝载体离液面底端尚有0.5cm空间，在25℃下放置30min后，将整体置于-60℃下成型1h，得到所述DNA采集拭子；
(3)将铁丝载体接连的模具放置于冷冻干燥机中，-20℃下进行冷冻干燥2h；将干燥好的聚己内酯复合拭子放置于体积比浓度50％乙醇水溶液中，多次清洗至pH为7，25℃风干；将风干后的DNA采集拭子置于2mL的离心管中，加入1mL的2M碳酸氢钠(pH为11.5)中，处理30h后，用蒸馏水反复清洗至pH为7，置于50℃烘干；将烘干后的DNA采集拭子置于紫外灯下进行杀菌处理2h后装入无DNA酶和RNA酶的包装袋中保存。
试验例1
拭子采集吸水性测试
上述实施例1-11制备的DNA采集拭子、对比例1-2制备的DNA采集拭子以及商品化的棉签拭子、尼龙拭子、植绒拭子以及海绵拭子，取上述的各拭子样本，分别置于2mL EP管(微型离心管)中(已加入300μL的去离子水)，拭子静置3min后移出，称量EP管中去离子水的损失，即为拭子的吸水量，平行测试三次记录最终。具体测试结果如表1所示：
表1
Figure BDA0002537429300000141
Figure BDA0002537429300000151
由表1的测试数据可知，本发明制备的到的DNA采集拭子吸水性可达到180μL以上，要比棉签拭子，尼龙拭子和植绒拭子的吸水性要强。而实施例3提供的是未经过碱处理的DNA采集拭子，其由聚己内酯和亲水性介质交联得到的聚合物表面，亲水基团较少亲水能力较差，因而吸水性能较差。而对比例1未复合亲水介质吸水性，聚己内酯表面无亲水基团，其本身的疏水结构，造成制备得到的材料吸水性能较差。
试验例2
拭子释放细胞测试
测试样品：上述实施例1-11制备的DNA采集拭子、对比例1-2制备的DNA采集拭子以及商品化的棉签拭子、尼龙拭子、植绒拭子以及海绵拭子。
测试方法：准备好细胞样本，A组每10μL中分别含有约100个细胞，B组每10μL含有约1000个细胞，C组每10μL含有约10000个细胞，每组滴加10μL，自然风干后，分别将上述各拭子置于含有200μL去离子水的离心管中，旋涡震荡混匀后，将拭子离心去除，将200μL去离子水回收，用染色液进行染色细胞，在荧光显微镜下计数，判断细胞的释放效率。具体测试结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002537429300000161
Figure BDA0002537429300000171
由表2测试数据可知，本发明制备的到的DNA采集拭子对100个细胞释放率高达78％以上，1000个细胞释放率高达74％以上，10000个细胞释放率高达82％以上。说明本发明以聚己内酯作为DNA采集拭子的骨架，并用糖类和/或非糖类有机高分子聚合物作为亲水性介质对聚己内酯骨架进行改性，共同复合在载体上形成拭子。亲水性介质对聚己内酯骨架进行改性后，细胞可紧贴于拭子的表面上，在裂解过程中细胞就能够更充分完全地被裂解液浸润裂解，可最大化地被释放出来，从而显著提高了细胞的释放效率，形成拭子对细胞吸附和采集效果。
而棉纤维是相互缠绕形成的纤维团，故细胞易被包裹于纤维团内部，在裂解过程中这些相互缠绕的棉纤维，就会阻碍其内部所吸附细胞的有效释放。检验结果提示随着保存时间的延长，拭子上附着的细胞释放模板DNA的细胞释放率显著下降。
试验例3
拭子采集后使用核酸提取定量结果
测试样品：上述实施例1-11制备的DNA采集拭子、对比例1-2制备的DNA采集拭子以及商品化的棉签拭子、尼龙拭子、植绒拭子以及海绵拭子。
测试方法：将细胞样本每10μL中含有80-120个细胞，滴加至光滑皮革上，静置风干，使用上述各拭子蘸取少量PBS溶液，然后擦拭皮革上的样品点，采用Qiagen公司
Figure BDA0002537429300000172
DNA Investigator Kit(Cat 952034)，配合Qiagen EZ1 XL自动化样品处理器，进行核酸提取，将取好样品的拭子加入2mL离心管中，并加入
Figure BDA0002537429300000182
DNA Investigator Kit中390μL裂解液以及10μL的蛋白酶K溶液，56℃500rpm下裂解1h，然后取上清液150μL，加入到QiagenEZ1 XL工作站，最终用40μL去离子水洗脱。洗脱液使用Applied Biosystems公司QuantifilerTM Human DNA Quantification Kit进行qPCR定量。
检测结果：反应结束后，仪器自动保存结果，用仪器的软件进行分析，记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；具体测试数据如下表3(其中，Ct(第一次)和Ct(第二次)指的是重复测试两个平行样本所得到的数值)。
使用1μL的洗脱液，使用Applied Biosystems公司GlobalFilerTMExpress PCRAmplification Kit进行STR扩增，使用Applied Biosystems公司3500XL电泳仪进行分析，GeneMapper软件分析，图3是实施例2制备的DNA采集拭子的短片段重复序列分型图，位STR峰型数据图，每个基因座下的数值代表其重复序列的次数，从图中可以看出STR的出峰完整性好，各峰高都超过1000，证明其DNA采集量高，且在DNA提取步骤中释放更多的DNA，而且不影响后续的PCR扩增。
表3
Figure BDA0002537429300000181
Figure BDA0002537429300000191
由表3测试数据可知，本发明制备的DNA采集拭子从Ct定量数值上来看，拭子上DNA的提取效率比对比例1-2制备的拭子以及各商品化拭子的的Ct值相对较小，裂解效果相对较好，其原因在于采用对比例1-2制备的拭子以及各商品化拭子采集样本时，DNA过程释放率低，导致最终得到的核酸模板数较少。而本发明制备的拭子以聚己内酯作为DNA采集拭子的骨架，并用糖类和/或非糖类有机高分子聚合物作为亲水性介质对聚己内酯骨架进行改性，共同复合在载体上形成拭子释放出来的核酸量更多，裂解效果相对较好，提取效率高。
试验例4
采集和脱附效率考察
测试样品：上述实施例2制备的DNA采集拭子和棉签拭子。
测试方法：
(1)对痕量稀释血液样本的采集和脱附效率考察：将常规取样血液样本稀释100倍后，取10μL滴加至光滑皮革上，静置风干，使用上述各拭子蘸取少量PBS溶液，然后擦拭皮革上的样品点，所用提取试剂、仪器以及定量试剂与试验例3一致；
(2)对痕量稀释唾液样本的采集和脱附效率考察：将常规取样唾液样本稀释50倍后，取10μL滴加至光滑皮革上，静置风干，使用上述各拭子蘸取少量PBS溶液，然后擦拭皮革上的样品点，所用提取试剂、仪器以及定量试剂与试验例3一致；
(3)对标准DNA释放效率考察：用标准DNA9947A进行DNA释放效率评价，加入20μL10ng/μL标准DNA于拭子头上，自然风干后加入200μL去离子水在56℃下1500rpm处理25min，对去离子水中的DNA进行分析。
具体测试结果如表4所示：
表4
Figure BDA0002537429300000201
由表4的测试结果可知，本发明制备得到的DNA采集拭子对痕量稀释血液样本提取效率在80％以上，脱附浓度浓度在0.048ng/μL以上；对痕量稀释唾液样本提取效率在89％以上，脱附浓度浓度在0.136ng/μL以上；对标准DNA样本释放效率在90％以上，DNA浓度在0.09ng/μL以上。说明采集样本时，本发明制备得到的DNA采集拭子可更大程度吸附细胞，在对样本进行裂解消化时，样本中微量成分也可高效释放，不滞留微量成分在拭子内部。其中，图4是实施例2制备的DNA采集拭子和棉签拭子对痕量稀释血液样本的提取、脱附DNA浓度对比图。图5是实施例2制备的DNA采集拭子和棉签拭子对痕量稀释唾液样本的提取、脱附DNA浓度对比图。图6是实施例2制备的DNA采集拭子和棉签拭子对痕量接触性样本的标准DNA释放浓度浓度对比图，更为清晰地看出，样本中微量成分容易滞留在缠绕的纤维团中，影响DNA提取效果。
试验例5
对痕量接触性样本采集效率考察
测试样品：上述实施例1-11制备的DNA采集拭子、对比例1-2制备的DNA采集拭子以及商品化的棉签拭子、尼龙拭子、植绒拭子以及海绵拭子。
测试方法：使用上述各拭子用痕量接触性物质进行采集评价，选择几部手机进行擦拭，具体测试结果如表5所示(其中，样本一指的是志愿者一手机；样本二指的是志愿者二手机；样本三指的是志愿者三手机)：
表5
Figure BDA0002537429300000211
Figure BDA0002537429300000221
由表5测试结果可知，本发明制备的DNA采集拭子对细胞及痕量的DNA的采集效果优异，对样本一采集浓度在0.008ng/μL以上，对样本二采集浓度在0.03ng/μL以上，对样本三采集浓度在0.023ng/μL以上。其中，为更为直观地看出本发明制备的DNA采集拭子对细胞及痕量的DNA的采集效果优异，图7是实施例2制备的DNA采集拭子和棉签拭子对不同痕量物质采集DNA浓度对比图，由图7更为明显发现对于样本一和样本二，本发明制备得到的DNA采集拭子采集DNA平均浓度要远远高于棉签拭子，而对于样本三，实施例2制备得到的DNA采集拭子比棉签拭子效率仍高20.3％。说明本发明以聚己内酯作为DNA采集拭子的骨架，并用糖类和/或非糖类有机高分子聚合物作为亲水性介质对聚己内酯骨架进行改性，共同复合在载体上形成拭子，形成拭子对细胞及痕量的DNA的采集效果优异。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明所述DNA采集拭子及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种DNA采集拭子，其特征在于，所述DNA采集拭子的制备原料包括聚己内酯、亲水性介质和载体；
所述亲水性介质包括糖类和/或非糖类有机高分子聚合物。
2.根据权利要求1所述的DNA采集拭子，其特征在于，所述聚己内酯和亲水性介质的质量比为1:10-10:1；
优选地，所述聚己内酯的重均分子量为10000-60000。
3.根据权利要求1或2所述的DNA采集拭子，其特征在于，所述糖类包括单糖、二糖或多糖中的任意一种或至少两种的组合，优选为多糖；
优选地，所述单糖包括葡萄糖和/或果糖；
优选地，所述二糖包括海藻糖和/或蔗糖；
优选地，所述多糖包括壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖、淀粉、纤维素或羧甲基纤维素中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的DNA采集拭子，其特征在于，所述非糖类有机高分子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙烯马来酸乙磺酸、聚氨酯、聚乙烯醇、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚戊烯醇、聚醚多元醇、聚异戊烯醇、双环醇二聚物、聚碳酸酯二醇、聚己二醇、丙烯醇类聚醚或二聚酸聚酰胺中的任意一种或至少两种的组合，优选为聚乳酸和/或聚乙烯醇；
优选地，所述非糖类有机高分子聚合物的重均分子量为2000-18000；
优选地，所述聚乳酸的重均分子量为14000-16000，优选为15000；
优选地，所述聚乙烯醇的重均分子量为8000-15000，优选为12000。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的DNA采集拭子，其特征在于，所述载体的材质包括木质、聚乙烯、聚丙乙烯、聚四氟乙烯或金属中的任意一种；
优选地，所述金属包括铁、铝或合金中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述合金包括钼钨合金、铌钨合金、碳钨合金、碳钛合金或碳钽合金中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述DNA采集拭子的制备原料还包括碱处理液；
优选地，所述碱处理液的pH在11以上。
6.根据权利要求1-5中任一项所述DNA采集拭子的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将聚己内酯和亲水性介质溶解后混合，与载体共同置于模具中成型，得到所述DNA采集拭子。
7.根据权利要求6所述DNA采集拭子的制备方法，其特征在于，所述DNA采集拭子的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚己内酯溶解于预溶溶剂A中，得到聚己内酯溶液；将亲水性介质溶解于预溶溶剂B中，得到亲水性介质溶液；
(2)将步骤(1)得到的聚己内酯溶液和亲水性介质溶液混合后，与载体共同置于模具中成型，得到所述DNA采集拭子。
8.根据权利要求7所述DNA采集拭子的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述预溶溶剂A包括二氯甲烷、氯仿、环己烷、甲苯、异辛烷或冰乙酸中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)中所述聚己内酯溶液的质量体积百分浓度为1-20％；
优选地，步骤(1)中溶解于预溶溶剂A的温度为20-90℃；
优选地，步骤(1)中所述预溶溶剂B包括二氯甲烷、氯仿、环己烷、甲苯、异辛烷、冰乙酸、水、甲醇、乙醇、正丙醇、1,2-丙二醇、丙三醇、甲醚或乙醚中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(1)中所述亲水性介质溶液的质量体积百分浓度为2-40％；
优选地，步骤(1)中溶解于预溶溶剂B的温度为20-90℃；
优选地，步骤(2)中所述成型的温度为-80～-20℃，所述成型的时间为0.5-2h；
优选地，步骤(2)得到的DNA采集拭子还需依次进行冷冻干燥、清洗、碱处理液处理和杀菌处理；
优选地，所述冷冻干燥处理的温度为-80～-20℃，所述冷冻干燥处理的时间为1-10h；
优选地，所述清洗后的DNA采集拭子的pH为6.8-7.2；
优选地，所述碱处理液的pH在11以上；
优选地，所述杀菌处理采用紫外线杀菌。
9.根据权利要求6-8中任一项所述DNA采集拭子的制备方法，其特征在于，所述DNA采集拭子的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚己内酯溶解于预溶溶剂A中溶解，得到质量体积百分浓度为1-20％聚己内酯溶液；将亲水性介质溶解于预溶溶剂B中溶解，得到质量体积百分浓度为2-40％亲水性介质溶液；
(2)将步骤(1)得到的聚己内酯溶液和亲水性介质溶液以体积比为(1-2):1混合后，与载体共同置于模具中，放置于-80～-20℃成型0.5-2h，得到所述DNA采集拭子；
(3)将步骤(2)得到的DNA采集拭子在-80～-20℃下冷冻干燥1-10h后，清洗至DNA采集拭子的pH为6.8-7.2，再置于pH在11以上的碱处理液中浸泡12-48h，清洗烘干后置于紫外灯下进行杀菌处理。
10.根据权利要求1-5中任一项所述DNA采集拭子在痕量DNA检测中的应用。
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