CN111621547A

CN111621547A - 一种dna阻断序列组合物及其制备方法和检测系统及检测方法

Info

Publication number: CN111621547A
Application number: CN201910148955.4A
Authority: CN
Inventors: 肖荣荣
Original assignee: Beijing Da Xiang Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Da Xiang Technology Co ltd
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2020-09-04

Abstract

本发明公开一种DNA阻断序列组合物及其制备方法和检测系统及检测方法，属于生物技术领域。阻断序列组合物包括阻断序列A和阻断序列B，阻断序列A和阻断序列B可分别与目标DNA序列的正义链和反义链结合。两种阻断DNA序列均包括，单链toehold序列部分、双链主反应部分和发卡序列。本发明设计简单，仅根据目标位点所在序列的野生型序列信息进行设计，无需预先知道变异位点的具体位置和类型。且，独立性好，相互之间无相互作用发生，不会产生其他副产物。该阻断序列基于DNA链置换的反应原理，可特异性阻断目标序列的扩增。且对PCR退火温度要求不高，均有利于推广用于多重目标片段的Block PCR反应。本发明的封闭效果特异性好，可结合测序实现样本中0.1％SNP的富集检出。

Description

一种DNA阻断序列组合物及其制备方法和检测系统及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种DNA阻断序列组合物及其制备方法，和检测系统、检测方法。

背景技术

在目前的分子诊断中，DNA序列变异是一种非常有价值的分子标志物。可应用领域主要包括液体活检、产前诊断、感染性疾病、器官移植以及法医学。统计结果显示，截止到2018年，全球估计有1819万癌症新增病例以及960万癌症死亡病例。我国癌症患病率在国际上位于中等偏上水平，每天约有1万人确诊癌症，相当于平均每分钟就有7个人得癌症。现有研究表明，携带疾病信息的单碱基变异，尤其是低频突变位点的检测在癌症液体活检中是有重要意义的。例如，循环肿瘤DNA稀有突变位点的检测有助于癌症的早期检测、药物抗性的动态监测、发现微小残留病灶等。ddPCR和ARMS技术因其检测灵敏度高，已广泛用在已知变异位点检测中，然而这两种方法都需要针对特定已知类型的位点进行设计，应用通量低，不适用于未知位点的检测和复杂多样的临床应用。Sanger测序因其准确、稳定，价格低廉的特征，目前仍广泛应用，然而，这种方法只能用于检测SNP比例大于20％的样本。高通量二代测序技术(Next-generation sequence，NGS)已广泛应用于DNA序列分析中。在NGS相关应用研究中，为了减少测序成本，通常在测序文库构建过程中结合多重PCR和DNA杂交的方法进行靶向富集。在对目标片段进行富集过程中，携带突变位点的DNA序列和正常野生型DNA序列会统一被富集到测序文库中，携带变异位点的DNA序列仍然会淹没在正常野生型DNA序列的海洋中。在现在的标准操作流程下，二代测序技术尚不能精准识别低于2％的DNA单碱基变异，基于NGS的DNA低频突变位点的准确、灵敏地检测仍然存在很大的挑战性。尽管DNA序列精确度可以通过分子条形码和高深度测序实现，但是这些方法都需要对每个DNA分子进行大量读出，野生型序列消耗了大量的试剂和序列读出能力，造成数据量大，分析困难，超深度测序可以提供更多有意义的DNA稀有变异的序列信息，然而这种方法的高额费用，阻碍了广泛临床应用。

随着高通量测序技术的发展和广泛应用，迫切需要研究用于移除高丰度野生型DNA序列的方法，用于测序之前，对未知位点和类型的突变DNA序列(尤其是低频突变位点)进行负向富集。此类方法，通常通过对野生型序列进行选择性封闭，实现对未知突变位点序列的选择性扩增。现有已报道的DNA封闭探针包括普通DNA序列、PNA、LNA。这些特异性封闭方法的实现依赖于封闭探针与正常序列和野生型序列形成双链结构的差异性Tm值，因此对每个反应的温度控制要求非常严格。Tm值依赖的PCR反应，仅仅适用于同时富集单个或者限制数量的目标分子。对探针合成技术要求高，限制了在高通量测序技术应用过程中的广泛应用。

发明内容

本发明实施例提供了一种DNA阻断序列组合物及其制备方法，检测系统及检测方法，结合sanger测序，实现了对样本中低达0.1％的变异基因序列的检出。为了对披露的实施例的一些方面有一个基本的理解，下面给出了简单的概括。该概括部分不是泛泛评述，也不是要确定关键/重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围。其唯一目的是用简单的形式呈现一些概念，以此作为后面的详细说明的序言。

根据本发明实施例的第一方面，提供了一种DNA阻断序列组合物，包括，阻断序列A和阻断序列B；其中，所述阻断序列A可与目标DNA序列的正义链结合，所述阻断序列B可与目标DNA序列的反义链结合；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B均包括：

(1)单链toehold序列部分：阻断序列的缺口区域，可以识别目标DNA，能与目标DNA序列互补，引发链置换反应；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B的toehold位置不同；

(2)双链主反应部分(自配对)：所述阻断序列A的主反应部分用于与所述正义链互补配对，所述阻断序列B的主反应部分用于与所述反义链互补配对；

(3)发卡序列：5′-T……T-3′，其中，“T……T”中碱基T的数量为6-10。

可选地，所述单链toehold序列部分中的toehold序列包括4-10个碱基。

可选地，所述双链主反应部分的DNA刚性段为15-30个碱基对。

可选地，所述阻断序列A和阻断序列B的摩尔比为1﹕1。

可选地，还包括，缓冲液，所述阻断序列A和阻断序列B混合，得到混合液形式的DNA阻断序列组合物。

可选地，所述混合液形式的DNA阻断序列组合物中，阻断序列A和阻断序列B的总浓度为4-10μmol/L。

根据本发明实施例的第二方面，提供一种DNA阻断序列组合物的制备方法，包括以下步骤：

分别合成阻断序列单链A和阻断序列单链B；并分别将所述阻断序列单链A和所述阻断序列单链B溶解，得，A溶液和B溶液；

将所述A溶液和所述B溶液分别与退火缓冲液混合，得A退火溶液和B退火溶液；

将所述A退火溶液和所述B退火溶液分别进行退火处理，获得阻断序列A和阻断序列B。

可选地，所述制备方法，还包括，

将所述阻断序列A和所述阻断序列B混合，然后稀释，得到DNA阻断序列组合物。

根据本发明实施例的第三方面，提供一种检测系统，包括前述的DNA阻断序列组合物和PCR扩增试剂(阻断PCR扩增试剂)；其中，所述PCR扩增试剂中采用无5’外切酶活性的DNA聚合酶。

可选地，检测系统，还包括第二PCR扩增试剂，第二PCR扩增试剂用于微量目标DNA序列或携带有目标DNA序列的gDNA的扩增反应。

根据本发明实施例的第四方面，提供一种检测方法，包括以下步骤：

将微量目标DNA序列或携带有目标DNA序列的gDNA进行PCR预扩增反应，得到目标DNA序列的预扩增产物；

向所述目标DNA序列的预扩增产物中加入DNA阻断序列组合物，得混合溶液；

对所述混合溶液进行目标序列阻断PCR扩增，得目标序列阻断的PCR扩增产物；

对所述目标序列阻断的PCR扩增产物进行磁珠纯化，得纯化DNA产物；

对所述纯化DNA产物进行凝胶电泳表征；

对所述纯化DNA产物进行序列检测。

可选地，所述混合溶液中，DNA阻断序列组合物中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为0.1-1μmol/L。

可选地，所述混合溶液中，DNA阻断序列组合物中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为1μmol/L。

可选地，所述阻断PCR扩增反应中，退火温度为55℃-65℃。

可选地，所述阻断PCR扩增反应中，退火温度为60℃。

可选地，所述阻断PCR扩增反应中，退火时间为30s-5min。

可选地，所述阻断PCR扩增反应中，退火时间为30s。

可选地，所述磁珠纯化中，以阻断PCR扩增产物和磁珠的体积比为1﹕1进行。

本发明实施例的检测方法中，序列检测可以采用Sanger测序法、qPCR定量、ddPCR定量等方法进行检测。

本发明实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

1.本发明设计简单，仅根据目标位点所在序列的野生型序列信息进行设计，无需预先知道变异位点的具体位置和类型。

2.本发明的DNAblockers独立性好，相互之间无相互作用发生，不会产生其他副产物，有利于推广用于多重目标片段的Block PCR反应。

3.该阻断序列基于DNA链置换的反应原理，可以特异性结合目标DNA片段，在PCR反应过程中，特异性阻断目标序列的扩增，即可以进行目标片段的block PCR反应。由于链置换反应不依赖于温度和buffer组分，对PCR的退火温度要求不高，均有利于推广用于多重目标片段的Block PCR反应。

4.该发明方法的封闭效果特异性好，可结合Sanger测序实现混合样本中0.1％SNP的富集检出。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

图1是本发明的DNA阻断序列组合物特异性识别结合Wild DNA片段的原理图；

图2是本发明的阻断PCR特异性阻断野生型DNA合成的技术路线图；

图3是不同退火温度下的阻断反应产物和对照样品的PAGE表征结果图；

图4是不同退火时间下的阻断反应产物和对照样品的PAGE表征结果图；

图5是阻断反应产物Ⅰ-11的Sanger测序结果图；

图6是阻断反应产物Ⅰ-13(纯化产物Ⅰ-21)的Sanger测序结果图；

图7是阻断反应产物Ⅰ-14的Sanger测序结果图；

图8是阻断反应产物Ⅰ-15的Sanger测序结果图；

图9是阻断反应产物Ⅰ-22的Sanger测序结果图；

图10是阻断反应产物Ⅰ-23的Sanger测序结果图；

图11是对照样品1-1(Control 1和30s Control)的Sanger测序结果图；

图12是对照样品1-2(1min Control)的Sanger测序结果图；

图13是对照样品1-3(5min Control)的Sanger测序结果图；

图14是对照样品1-4(Control 2)的Sanger测序结果图；

图15是阻断反应产物Ⅱ(Sample)，以及对照样品2-1(Control 1)和对照样品2-2(Control 2)的PAGE表征结果图；

图16是阻断反应产物Ⅱ的Sanger测序结果图；

图17是对照样品2-1的Sanger测序结果图；

图18是对照样品2-2的Sanger测序结果图；

图19是阻断反应产物Ⅲ(Sample)，以及对照样品3-1(Control 1)和对照样品3-2(Control 2)的PAGE表征结果图；

图20是阻断反应产物Ⅲ的Sanger测序结果图；

图21是对照样品3-1的Sanger测序结果图；

图22是对照样品3-2的Sanger测序结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例的第一方面，提供一种DNA阻断序列组合物(双链DNAblockers)，包括阻断序列A(blocker A)和阻断序列B(blocker B)；其中，阻断序列A可与目标DNA序列(gDNA)的正义链结合，阻断序列B可与目标DNA序列(gDNA)的反义链结合；且，阻断序列A和所述阻断序列B均包括：

(1)单链toehold序列部分：阻断序列的缺口区域，可以识别目标DNA，能与目标DNA序列互补，引发链置换反应；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B的toehold位置不同，以防彼此发生反应；

本发明实施例在DNA阻断序列组合物中，阻断序列A和阻断序列B的设计简单，只需依据目标位点所在序列的野生型序列信息进行设计，无需预先知道变异位点的具体位置和类型；而且，阻断序列A和阻断序列B的独立性好，相互之间无相互作用发生，不会产生其他副产物，有利于推广用于多重目标片段的Block PCR反应。

本发明实施例在DNA阻断序列组合物中，阻断序列A和阻断序列B与目标DNA序列之间作用，是基于链置换的反应原理，该反应对PCR的退火温度要求不高，更加有利于推广为多重目标片段的Block PCR反应。因此，可以特异性地与野生型DNA序列发生链置换反应，形成稳定的DNA复合结构。因此，在PCR扩展采用无5’外切酶活性的DNA聚合酶时，由于PCR聚合酶无5’外切酶活性，故该DNA阻断序列组合物可以通过形成稳定结构的方式，成功封闭野生型DNA分子。同时，由于DNA阻断序列组合物与变异携带DNA序列不完全匹配，因此该置换反应发生较为困难。

本发明实施例在DNA阻断序列组合物，利用DNA阻断序列组合物与两种DNA序列反应的差异性，实现野生型序列的特异性封闭，而且封闭效果好，进而使得PCR产物中的变异位点携带DNA片段的比例会得到提高，尤其是携带稀有变异DNA序列的比例，可结合Sanger测序实现0.1％SNP的富集检出。

同时，本发明实施例的DNA阻断序列组合物利用toehold引发的DNA链置换反应，解决了对多种野生型模板封闭过程中的温度依赖问题，在不同退火温度下，可成功实现了样本中0.1％稀有变异DNA的富集与检测。

本发明实施例的DNA阻断序列组合物特异性识别结合Wild DNA片段的原理图参见图1所示。阻断PCR特异性封闭野生型DNA的技术路线参见图2所示。

在一种可选的实施例中，本发明实施例在DNA阻断序列组合物中，单链toehold序列部分中的toehold序列包括4-10个碱基。

可选地，toehold序列包括6-10个碱基。

可选地，toehold序列包括8个碱基。

在一种可选的实施例中，本发明实施例在DNA阻断序列组合物中，双链主反应部分的DNA刚性段为15-30个碱基对。

可选地，双链主反应部分的DNA刚性段为22个碱基对。

在一种可选的实施例中，发卡序列为柔性发卡结构。其中，“T……T”中碱基T的数量为8。

在一种可选的实施例中，本发明实施例在DNA阻断序列组合物中，阻断序列A和阻断序列B的摩尔比为1﹕1。

在一种可选的实施例中，本发明实施例在DNA阻断序列组合物中，以混合液形式存在，除了阻断序列A和阻断序列B以外，还包括缓冲液，阻断序列A和阻断序列B与缓冲液混合，得到混合液形式的DNA阻断序列组合物。

本实施例中，混合液形式的DNA阻断序列组合物是一种储备液的形式，其中阻断序列A和阻断序列B的总浓度不限定，在进行后续的阻断PCR扩增时，依据需要进行稀释，获得所需浓度的溶液即可。

可选地，混合液形式的DNA阻断序列组合物中，阻断序列A和阻断序列B的总浓度为4-10μmol/L。

可选地，混合液形式的DNA阻断序列组合物中，阻断序列A和阻断序列B的总浓度为5μmol/L。

本发明实施例的第二方面，提供一种DNA阻断序列组合物的制备方法，包括以下步骤：

S11、分别合成阻断序列单链A(DNAblocker oligo A)和阻断序列单链B(DNAblocker oligo B)；并分别将阻断序列单链A和阻断序列单链B溶解，得，A溶液和B溶液；

S12、将A溶液和B溶液分别与退火缓冲液混合，得A退火溶液和B退火溶液；

S13、将A退火溶液和B退火溶液分别进行退火处理，获得阻断序列A和阻断序列B。

本发明实施例的制备方法中，根据待检测序列DNA的正义链和反义链，设计合成阻断序列单链A和阻断序列单链B，其总长度为59bp，可自发形成toehold为8bp的toeholdDNAblocker，两条自配对互补链之间通过8bp的T相互连接。合成的DNA粉末首先溶于水中，再在退火缓冲液中，按PCR退火程序退火，即可完成阻断序列A和阻断序列B的制备。

步骤S11中，溶解阻断序列单链A和阻断序列单链B的水需要采用分子生物学级别的超纯水。

步骤S11中，阻断序列单链A和阻断序列单链B分别包含四个部分，toehold序列、主反应序列、发卡序列和自配对序列。

其中，toehold序列：阻断序列的单链缺口区域，能与目标DNA序列互补，引发链置换反应；且，所述阻断序列单链A和所述阻断序列单链B的toehold位置不同。可选地，toehold序列包括4-10个碱基对。

主反应序列：阻断序列单链A的主反应部分用于与正义链互补配对，阻断序列单链B的主反应部分用于与反义链互补配对。可选地，主反应序列的DNA刚性段为15-30个碱基对。

发卡序列：5′-T……T-3′，其中，“T……T”中碱基T的数量为6-10。可选地，“T……T”中碱基T的数量为8。

自配对序列：与发卡序列相连，与主反应部分完全互补配对。

步骤S12中，退火缓冲液采用商品化的退火缓冲液(10×Annealing Buffer forDNA Oligos，保证工作终浓度为1×)。

步骤S12中，A溶液与退火缓冲液的混合比例为9：1，B溶液与退火缓冲液的混合比例为9﹕1。

步骤S13中，退火处理中，采用PCR退火程序，程序性退火温度设置为由98℃逐渐降低至25℃。

在一种可选的实施例中，制备方法，还包括，S14，将阻断序列A和阻断序列B混合，然后稀释，得到DNA阻断序列组合物。本实施例的DNA阻断序列组合物以混合溶液的形式存在。

进一步可选的实施例中，步骤S14中，按阻断序列A和阻断序列B的摩尔比为1﹕1的比例将阻断序列A和阻断序列B混合。

进一步可选的实施例中，步骤S14中，得到的DNA阻断序列组合物为混合溶液形式的DNA阻断序列组合物，是作为一种储备液，其中阻断序列A和阻断序列B的总浓度不限定，在进行后续的阻断PCR扩增时，依据需要进行稀释，获得所需浓度的溶液即可。可选地，阻断序列A和阻断序列B的总浓度为4-10μmol/L。

进一步可选地，步骤S14中，在混合溶液形式的DNA阻断序列组合物中，阻断序列A和阻断序列B的总浓度为5μmol/L。

本发明实施例的第三方面，提供了一种检测系统，用于变异DNA位点检测的检测系统。检测系统，包括前述的DNA阻断序列组合物和PCR扩增试剂(即，阻断PCR扩增试剂)。其中，PCR扩增试剂中采用无5’外切酶活性的酶。PCR扩增试剂是用于目标DNA序列和DNA阻断序列组合物的混合液的扩增反应。

本实施例的检测系统可实现对样本中低达0.1％的变异基因序列的检出。由于PCR聚合酶无5’外切酶活性，故该DNA阻断序列组合物可以通过形成稳定结构的方式，成功封闭野生型DNA分子。

一种可选的实施例中，检测系统，还包括，第二PCR扩增试剂，第二PCR扩增试剂用于微量目标DNA序列或携带有目标DNA序列的gDNA的扩增反应。

本发明实施例的第四方面，提供了一种检测方法，包括以下步骤：

S21、将微量目标DNA序列或携带有目标DNA序列的gDNA进行PCR预扩增反应，得到目标DNA序列的扩增产物；

S22、向步骤S21得到的目标DNA序列的扩增产物中加入DNA阻断序列组合物，得到混合溶液；

S23、对步骤S22得到的混合溶液进行目标序列阻断PCR扩增反应，得目标序列阻断的PCR扩增产物；

S24、对所述目标序列阻断的PCR扩增产物进行磁珠纯化，得纯化DNA产物；

S25、对所述纯化DNA产物进行凝胶电泳表征；

S26、对所述纯化DNA产物进行序列检测。

一种可选的实施例中，步骤S21中，PCR预扩增反应采用常规PCR扩增手段即可。

一种可选的实施例中，步骤S21中，PCR预扩增反应的循环次数依据实际情况确定即可，如，10-15个循环。

一种可选的实施例中，步骤S21中，对携带0.1％变异位点目标DNA序列的gDNA，将10-50ng的目标DNA序列进行10-15个循环的PCR预扩增反应。

一种可选的实施例中，步骤S22中，混合溶液中，DNA阻断序列组合物中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为0.1-1μmol/L。

可选地，步骤S22中，混合溶液中，DNA阻断序列组合物中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为1μmol/L。

一种可选的实施例中，步骤S23中，阻断PCR扩增反应采用常规PCR扩增条件即可。

一种可选的实施例中，步骤S23中，阻断PCR扩增反应中，退火温度为55℃-65℃。

可选地，步骤S23中，阻断PCR扩增反应中，退火温度为60℃。

一种可选的实施例中，步骤S23中，阻断PCR扩增反应中，退火时间为30s-5min。

可选地，步骤S23中，阻断PCR扩增反应中，退火时间为30s。

一种可选的实施例中，步骤S23中，阻断PCR扩增反应的循环次数依据实际情况确定即可，如，30个循环。

一种可选的实施例中，步骤S24中，磁珠纯化中，以阻断PCR扩增产物和磁珠的体积比为1﹕1进行。

一种可选的实施例中，步骤S24中，还包括将纯化DNA产物重悬溶于水中的操作，以备后续进行表征或序列检测。

本发明实施例的检测方法中，步骤S25和步骤S26是两个并列的步骤，实施顺序没有先后之分。

下面结合具体实施例来说明本发明。实施例中采用的试剂、酶和实施序列等条件，可以根据需要做进一步的调整，未特别说明的实验条件通常按照常规实验中的条件。本发明给出的具体实施例主要是验证该发明的toehold双链DNAblocker用于特异性block PCR中对野生型DNA序列进行封闭的可行性，在未知DNA变异序列信息的情况下，结合sanger测序对产物进行序列检测。

实施例1toehold DNA阻断序列组合物

针对含有TP53上的一个编号为rs11540652的致病位点样本进行检测，为表述简单，只给出DNA的正义链序列。

野生DNA序列(SEQ ID NO：1)：

gttggctctgactgtaccaccatccactacaactacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaaccggaggcccatcctcaccatcatcacactggaagactccag

变异DNA序列(SEQ ID NO：2)：

gttggctctgactgtaccaccatccactacaactacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaacgggaggcccatcctcaccatcatcacactggaagactccag

为了电泳表征方便，依据上述的野生DNA序列(SEQ ID NO：1)和变异DNA序列(SEQID NO：2)，获得待检测的短链目标序列，即合成的59bp短链野生DNA序列(参见SEQ ID NO：3)和合成的59bp短链变异DNA序列(参见SEQ ID NO：4)，总长度为59bp。

合成的短链目标序列包括合成的59bp短链野生DNA序列(参见SEQ ID NO：3)和合成的59bp短链变异DNA序列(参见SEQ ID NO：4)，如下：

合成的59bp短链野生DNA序列：

actacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaaccggaggcccatcctcaccatc

合成的59bp短链变异DNA序列：

actacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaacgggaggcccatcctcaccatc

1、合成阻断序列单链A和阻断序列单链B

依据待检测的目标序列，设计合成可自发形成toehold为8bp的toehold DNAblocker，两条自配对互补链之间通过8bp的T(即柔性发卡部)相互连接。

2、制备阻断序列A和阻断序列B

将前述1合成的阻断序列单链A和阻断序列单链B溶于水中，得A溶液和B溶液。然后将A溶液和B溶液分别与10×退火缓冲液按比例混合，得A退火溶液和B退火溶液。其中，10×退火缓冲液用于DNA退火处理；且，A溶液和B溶液分别与10×退火缓冲液的混合比例均为9：1。

将A退火溶液和B退火溶液分别在PCR退火程序中进行程序性退火处理(如，程序性退火温度设置为由98℃逐渐降低至25℃)，获得阻断序列A和阻断序列B，完成制备。

针对两个目标位点C和G，设计得到的阻断序列A和阻断序列B的DNA序列如下：Toe8C-30gaggatgggcctccggttcatgccgcccattttttttatgggcggcatgaaccggaggc Toe8G-30gaggatgggcctcccgttcatgccgcccattttttttatgggcggcatgaacgggaggc反义Toe8C-30atgggcggcatgaaccggaggcccatcctctttttttgaggatgggcctccggttcatg反义Toe8G-30atgggcggcatgaacgggaggcccatcctctttttttgaggatgggcctcccgttcatg

其中，Toe8C-30参见SEQ ID NO：5；Toe8G-30参见SEQ ID NO：6；反义Toe8C-30参见SEQ ID NO：7；反义Toe8G-30参见SEQ ID NO：8。

对制备得到的阻断序列A和阻断序列B进行表征，各取3μL浓度为50μmol/L的阻断序列A和阻断序列B，然后与凝胶加样缓冲液(6×gel loading buffer)按比例进行混合(阻断序列A和阻断序列B与凝胶加样缓冲液的混合比例均为5：1)，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，确定合成的DNA oligo可以形成双链，并无单链条带出现，且DNA blocker A与DNAblockerB不会发生副反应，即无其他DNA片段形成。

实施例2

本实施例2为混合液形式的toeholdDNA阻断序列组合物Ⅰ，将实施例1中的阻断序列A和阻断序列B以摩尔比为1﹕1的比例混合，再加入缓冲液，得到混合溶液形式的DNA阻断序列组合物。

本实施例2的混合溶液形式的DNA阻断序列组合物是作为一种储备液，其中阻断序列A和阻断序列B的总浓度不限定，在进行后续的阻断PCR扩增时，依据需要进行稀释，获得所需浓度的溶液即可。

本实施例2中，保证其中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为4-10μmol/L即可。可选地，阻断序列A和阻断序列B的总浓度为5μmol/L。

可选地，将实施例1中的Toe8C-30和反义Toe8C-30以摩尔比为1﹕1的比例混合，两者的总浓度为5μmol/L，记为toeholdDNA阻断序列组合物Ⅰ-1。

可选地，将实施例1的Toe8G-30和反义Toe8G-30以摩尔比为1﹕1的比例混合，两者的总浓度为5μmol/L，记为toeholdDNA阻断序列组合物Ⅰ-2。

实施例3

基于实施例2的toehold DNA阻断序列组合物Ⅰ(即，混合溶液形式的DNA阻断序列组合物)的阻断PCR结合Sanger测序技术对含有1％TP53上的一个，编号为rs11540652的致病位点样本进行检测的技术方案。

检测方法，包括以下步骤：

S31、将rs11540652的致病位点的SNP样本(即变异DNA序列，参见SEQ ID NO：4)和野生DNA序列样本(参见SEQ ID NO：3)分别进行产物为150bp的序列PCR扩增反应，纯化后，分别得到SNP样本扩增产物和野生DNA序列扩增产物，并利用Sanger测序确保序列准确无误。然后将SNP样本扩增产物和野生DNA序列扩增产物以摩尔比为1﹕100的比例混合得到目标DNA序列扩增混合产物Ⅰ。

S32、向目标DNA序列的扩增产物Ⅰ中加入Q5酶的mix(即PCR扩增试剂)和DNA阻断序列组合物(具体采用前述实施例2的混合液形式的toeholdDNA阻断序列组合物Ⅰ-1)，得到混合溶液Ⅰ。并使混合溶液中DNA阻断序列组合物中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为0.5-1μmol/L。可选地，总浓度为1μmol/L。

S33、对步骤S32得到的混合溶液Ⅰ进行阻断PCR扩增反应，扩增30个循环，对应得到阻断PCR扩增产物Ⅰ。其中，阻断PCR扩增反应中，退火温度为55℃-65℃，退火时间为30s-5min。在阻断PCR扩增反应中，采用引物1(参见SEQ ID NO：9)：gttggctctgactgtaccaccatcc；引物2(参见SEQ ID NO：10)：ctggagtcttccagtgtgatgatggt。

其中，针对在退火时间为30s下，分别在退火温度为55℃、58℃、60℃、62℃和65℃的条件下，PCR扩增反应，对应得到阻断PCR扩增产物Ⅰ-11、Ⅰ-12、Ⅰ-13、Ⅰ-14和Ⅰ-15。

针对在退火温度为60℃，退火时间为30s、1min和5min的条件下，PCR扩增反应，对应得到阻断PCR扩增产物Ⅰ-21、Ⅰ-22和Ⅰ-23。

S34、对步骤S33得到的各个阻断PCR扩增产物进行磁珠纯化，得阻断反应纯化产物。其中，磁珠纯化中阻断PCR扩增产物和磁珠的体积比为1﹕1。对应地，得到阻断反应纯化产物Ⅰ-11、Ⅰ-12、Ⅰ-13、Ⅰ-14和Ⅰ-15，以及，阻断反应纯化产物Ⅰ-21、Ⅰ-22和Ⅰ-23。其中，阻断反应纯化产物Ⅰ-13与Ⅰ-21反应条件相同。

S35、分别取S34中8个阻断反应纯化产物5μL，用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合DNA染色进行表征，分别对S34中8个阻断反应纯化产物样本，以及对照样品1-1、对照样品1-2、对照样品1-3和对照样品1-4(参见对比实施例1)进行荧光定量。

如图3所示，为阻断反应纯化产物Ⅰ-11、Ⅰ-12、Ⅰ-13、Ⅰ-14和Ⅰ-15，以及对照样品1-1(Control 1)和对照样品1-4(Control 2)的PAGE表征结果图，即不同退火温度下的PAGE表征结果图。由图3可以看出，未加DNA阻断序列的对照样品1-1和加不相关DNA阻断序列的对照样品1-4，在PCR反应完成之后，都有大量反应产物生成。而加入可以阻断野生型序列扩增的DNA阻断序列的样品(退火温度从55℃到65℃)在PCR反应完成之后，DNA产物相对对照组来说都大大减少。表明该阻断PCR反应的有效性以及具有温度稳定性。

如图4所示，为阻断反应纯化产物Ⅰ-21、Ⅰ-22和Ⅰ-23，以及对照样品1-1(30s-Control)、对照样品1-2(1min-Control)和对照样品1-3(5min-Control)的PAGE表征结果图，即不同退火时间下的PAGE表征结果图。由图4可以看出，未加DNA阻断序列，退火时间分别为30s、1min、5min的对照样品，在PCR反应完成之后，都有大量反应产物生成。而加入可以阻断野生型序列扩增的DNA阻断序列的样品(退火时间分别为30s、1min、5min)在PCR反应完成之后，DNA产物相对对照组来说大大减少。表明该阻断PCR反应具有退火时间稳定性，可以兼容各种PCR引物。

S36、对S34中8个纯化产物，以及对照样品1-1、对照样品1-2、对照样品1-3和对照样品1-4(参见对比实施例1)，进行正义链的sanger测序。

如图5所示，阻断反应纯化产物Ⅰ-11的Sanger测序结果图；如图6所示，阻断反应纯化产物Ⅰ-13(阻断反应纯化产物Ⅰ-21)的Sanger测序结果图；如图7所示，阻断反应纯化产物Ⅰ-14的Sanger测序结果图；如图8所示，阻断反应纯化产物Ⅰ-15的Sanger测序结果图；如图9所示，阻断反应纯化产物Ⅰ-22的Sanger测序结果图；如图10所示，阻断反应纯化产物Ⅰ-23的Sanger测序结果图。如图11所示，对照样品1-1(Control1和30s Control)的Sanger测序结果图；如图12所示，对照样品1-2(1min Control)的Sanger测序结果图；如图13所示，对照样品1-3(5min Control)的Sanger测序结果图；如图14所示，对照样品1-4(Control 2)的Sanger测序结果图。

通过对图5至图8，以及图10和图14的比对分析，可得，未加DNA阻断序列的对照样品1-1和加不相关DNA阻断序列的对照样品1-4，只能测到占比优势的野生型序列的序列信息。而加入可以阻断野生型序列扩增的DNA阻断序列的样品组(退火温度从55℃到65℃)，可以测到输入量为1％的突变型(C＞G)序列信息。表明该阻断PCR反应可行，且具有温度稳定性。

通过对图6和图11、图9和图12、图10和图13的比对分析，可得，未加DNA阻断序列，退火时间分别为30s、1min、5min的对照样品在PCR反应完成之后，只能测到占比优势的野生型序列的序列信息。而加入可以阻断野生型序列扩增的DNA阻断序列的样品组(退火时间分别为30s、1min、5min)在PCR反应完成之后，可以测到输入量为1％的突变型(C＞G)序列信息。表明该阻断PCR反应具有退火时间稳定性，可以兼容各种PCR引物。

实施例4

基于双链toehold DNA blocker的Block PCR结合Sanger测序技术对含有0.1％TP53上的一个SNP，编号为rs11540652的致病位点样本进行检测的技术方案。

检测方法，包括以下步骤：

S41、将rs11540652的致病位点的SNP样本(即变DNA序列，参见SEQ ID NO：4)和野生DNA序列样本(参见SEQ ID NO：3)分别进行产物为150bp的序列PCR扩增反应，纯化后，分别得到SNP样本扩增产物和野生DNA序列扩增产物，并利用Sanger测序确保序列准确无误。然后将SNP样本扩增产物和野生DNA序列扩增产物以摩尔比为1﹕1000的比例混合得到目标DNA序列扩增产物Ⅱ。

S42、向目标DNA序列的扩增产物Ⅱ中加入Q5酶的mix(即PCR扩增试剂)和DNA阻断序列组合物(具体采用前述实施例2的混合液形式的toeholdDNA阻断序列组合物Ⅰ-1)，得到混合溶液Ⅱ。并使混合溶液中DNA阻断序列组合物中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为0.5-1μmol/L。可选地，总浓度为1μmol/L。

S43、对步骤S42得到的混合溶液Ⅱ进行阻断PCR扩增反应，扩增30个循环，对应得到阻断PCR扩增产物Ⅱ。其中，阻断PCR扩增反应中，退火温度为60℃，退火时间为30s。

S44、对步骤S43得到的阻断PCR扩增产物Ⅱ进行磁珠纯化，得阻断反应纯化产物Ⅱ。其中，磁珠纯化中阻断PCR扩增产物和磁珠的体积比为1﹕1。

S45、分别取S44中阻断反应纯化产物Ⅱ5μL，用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合DNA染色进行表征，分别对S44中阻断反应纯化产物Ⅱ样本，以及对照样品2-1和对照样品2-2(参见对比实施例2)进行荧光定量。

如图15所示，为阻断反应纯化产物Ⅱ(Sample)，以及对照样品2-1(Control 1)和对照样品2-2(Control 2)的PAGE表征结果图。由图15可以看出，未加DNA阻断序列的对照样品2-1和加不相关DNA阻断序列的对照样品2-2，在PCR反应完成之后，都有大量反应产物生成。而加入可以阻断野生型序列扩增的DNA阻断序列的样品组(Sample)在PCR反应完成之后，DNA产物相对对照组来说大大减少。

S46、对S44中阻断反应纯化产物Ⅱ，以及对照样品2-1和对照样品2-2(参见对比实施例1)，进行正义链的sanger测序。

如图16所示，阻断反应纯化产物Ⅱ的Sanger测序结果图；如图17所示，对照样品2-1的Sanger测序结果图；如图18所示，对照样品2-2的Sanger测序结果图。

通过将图16与图17和图18进行分析比对，可得，未加DNA阻断序列的对照样品2-1和加不相关DNA阻断序列的对照样品2-2，只能测到占比优势的野生型序列的序列信息。而加入可以阻断野生型序列扩增的DNA阻断序列的样品组，可以测到输入量为0.1％的突变型(C＞G)序列信息。表明该阻断PCR反应可行，且可以实现0.1％突变位点的有效富集。

实施例5

针对实施例1至实施例2中的序列信息，选择反向混合，检测。具体如下：

S51、将rs11540652的致病位点的SNP样本(即目标DNA序列，参见SEQ ID NO：4)和野生DNA序列样本(参见SEQ ID NO：3)分别进行产物为150bp的序列PCR扩增反应，纯化后，分别得到SNP样本扩增产物和野生DNA序列扩增产物，并利用Sanger测序确保序列准确无误。然后将SNP样本扩增产物和野生DNA序列扩增产物以摩尔比为1000﹕1的比例混合得到目标DNA序列扩增产物Ⅲ。

S52、向目标DNA序列的阻断反应扩增产物Ⅲ中加入Q5酶的mix(即PCR扩增试剂)和DNA阻断序列组合物(具体采用前述实施例2的混合液形式的toehold双链DNA阻断序列组合物Ⅰ-2)，得到混合溶液Ⅲ。并使混合溶液中DNA阻断序列组合物中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为0.5-1μmol/L。可选地，总浓度为1μmol/L。

S53、对步骤S52得到的混合溶液Ⅲ进行阻断PCR扩增反应，扩增30个循环，对应得到阻断PCR扩增产物Ⅲ。其中，阻断PCR扩增反应中，退火温度为60℃，退火时间为30s。

S54、对步骤S53得到的阻断PCR扩增产物Ⅲ进行磁珠纯化，得纯化产物Ⅲ。其中，磁珠纯化中阻断PCR扩增产物和磁珠的体积比为1﹕1。

S55、分别取S54中阻断反应纯化产物Ⅲ5μL，用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合DNA染色进行表征，分别对S54中纯化产物Ⅲ样本，以及对照样品3-1和对照样品3-2(参见对比实施例3)进行荧光定量。

如图19所示，为阻断反应纯化产物Ⅲ(Sample)，以及对照样品3-1(Control 1)和对照样品3-2(Control 2)的PAGE表征结果图。由图19可以看出，未加DNA阻断序列的对照样品3-1和加不相关DNA阻断序列的对照样品3-2，在PCR反应完成之后，都有大量反应产物生成。而加入可以阻断野生型序列扩增的DNA阻断序列的样品组(Sample)在PCR反应完成之后，DNA产物相对对照组来说大大减少。

S56、对S54中纯化产物Ⅲ，以及对照样品3-1和对照样品3-2(参见对比实施例3)，进行正义链的sanger测序。

如图20所示，纯化产物Ⅲ的Sanger测序结果图；如图21所示，对照样品3-1的Sanger测序结果图；如图22所示，对照样品3-2的Sanger测序结果图。

通过将图20与图21和图22进行分析比对，可得，未加DNA阻断序列的对照样品3-1和加不相关DNA阻断序列的对照样品3-2，只能测到占比优势的序列信息。而加入可以阻断目标序列扩增的DNA阻断序列的样品组，可以测到输入量为0.1％的野生型型序列信息。表明该阻断PCR反应可行，且可以实现0.1％稀有位点的有效富集。

实施例6

检测系统，包括前述实施例1制备得到的阻断序列A和阻断序列B，以及PCR扩增试剂。或者，包括前述实施例2的合液形式的DNA阻断序列组合物和PCR扩增试剂。其中，PCR扩增试剂中采用无5′外切酶活性的DNA聚合酶。PCR扩增试剂是用于目标DNA序列和DNA阻断序列组合物的混合液的扩增反应。

本实施例6的检测系统中，还包括，第二PCR扩增试剂，第二PCR扩增试剂用于微量目标DNA序列或携带有目标DNA序列的gDNA的扩增反应。

对比实施例1

对照样品1-1的制备未加DNA阻断序列

向实施例3中的步骤S31得到的目标DNA序列的扩增产物Ⅰ中加入Q5酶的mix(即PCR扩增试剂)，得到混合溶液。对混合溶液进行PCR扩增反应，扩增30个循环，得到PCR扩增产物。其中，PCR扩增反应中，退火温度为60℃，退火时间为30s。对步骤得到的PCR扩增产物进行磁珠纯化，得纯化产物。其中，磁珠纯化中阻断PCR扩增产物和磁珠的体积比为1﹕1。记为对照样品1-1。

对照样品1-2的制备未加DNA阻断序列

同前述对照样品1-2的制备不同的是，在PCR扩增反应中，退火温度为60℃，退火时间为1min。其余步骤和参数同对照样品1-1相同。记为对照样品1-2。

对照样品1-3的制备未加DNA阻断序列

同前述对照样品1-3的制备不同的是，在PCR扩增反应中，退火温度为60℃，退火时间为5min。其余步骤和参数同对照样品1-1相同。记为对照样品1-3。

对照样品1-4的制备加入不相关的对照阻断序列组合物

同前述对照样品1-3的制备不同的是，向实施例3中的步骤S31得到的目标DNA序列的扩增产物Ⅰ中加入Q5酶的mix(即PCR扩增试剂)和对照阻断序列组合物(参见SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)，得到对照混合溶液。其余步骤和参数同对照样品1-1相同。记为对照样品1-4。

对比实施例2

对照样品2-1的制备未加DNA阻断序列

向实施例4中的步骤S41得到的目标DNA序列的扩增产物Ⅱ中加入Q5酶的mix(即PCR扩增试剂)，得到混合溶液。对混合溶液进行PCR扩增反应，扩增30个循环，得到PCR扩增产物。其中，PCR扩增反应中，退火温度为60℃，退火时间为30s。对步骤得到的PCR扩增产物进行磁珠纯化，得纯化产物。其中，磁珠纯化中阻断PCR扩增产物和磁珠的体积比为1﹕1。记为对照样品2-1。

对照样品2-2的制备加入不相关的对照阻断序列组合物

同前述对照样品2-1的制备不同的是，向实施例4中的步骤S41得到的目标DNA序列的扩增产物Ⅱ中加入Q5酶的mix(即PCR扩增试剂)和对照阻断序列组合物(参见SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)，得到对照混合溶液。其余步骤和参数同对照样品2-1相同。记为对照样品2-2。

对比实施例3

对照样品3-1的制备未加DNA阻断序列

向实施例5中的步骤S51得到的目标DNA序列的扩增产物Ⅲ中加入Q5酶的mix(即PCR扩增试剂)，得到混合溶液。对混合溶液进行PCR扩增反应，扩增30个循环，得到PCR扩增产物。其中，PCR扩增反应中，退火温度为60℃，退火时间为30s。对步骤得到的PCR扩增产物进行磁珠纯化，得纯化产物。其中，磁珠纯化中PCR扩增产物和磁珠的体积比为1﹕1。记为对照样品3-1。

对照样品3-2的制备加入不相关的对照阻断序列组合物

同前述对照样品3-1的制备不同的是，向实施例5中的步骤S51得到的目标DNA序列的扩增产物Ⅲ中加入Q5酶的mix(即PCR扩增试剂)和对照阻断序列组合物(参见SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)，得到对照混合溶液。其余步骤和参数同对照样品3-1相同。记为对照样品3-2。

其中，对比实施例1至3中，对照阻断序列组合物的DNA序列如下：

反522blocker(SEQ ID NO：11)

ttttcccccctttctttaatgaagataaccttttttttaggttatcttcattaaagaaag

522blocker(SEQ ID NO：12)

taggttatcttcattaaagaaaggggggaaattttttttttcccccctttctttaatgaa

应当理解的是，以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>北京大橡科技有限公司

<120>一种DNA阻断序列组合物及其制备方法和检测系统及检测方法

<160> 12

<210> 1

<211> 110

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 1

gttggctctg actgtaccac catccactac aactacatgt gtaacagttc ctgcatgggc 60

ggcatgaacc ggaggcccat cctcaccatc atcacactgg aagactccag 110

<210> 2

<211> 110

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 2

gttggctctg actgtaccac catccactac aactacatgt gtaacagttc ctgcatgggc 60

ggcatgaacg ggaggcccat cctcaccatc atcacactgg aagactccag 110

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 3

actacatgtg taacagttcc tgcatgggcg gcatgaaccg gaggcccatc ctcaccatc 59

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 4

actacatgtg taacagttcc tgcatgggcg gcatgaacgg gaggcccatc ctcaccatc 59

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 5

gaggatgggc ctccggttca tgccgcccat tttttttatg ggcggcatga accggaggc 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 6

gaggatgggc ctcccgttca tgccgcccat tttttttatg ggcggcatga acgggaggc 59

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 7

atgggcggca tgaaccggag gcccatcctc tttttttgag gatgggcctc cggttcatg 59

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 8

atgggcggca tgaacgggag gcccatcctc tttttttgag gatgggcctc ccgttcatg 59

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 9

gttggctctg actgtaccac catcc 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 10

ctggagtctt ccagtgtgat gatggt 26

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 11

ttttcccccc tttctttaat gaagataacc ttttttttag gttatcttca ttaaagaaag 60

<210> 12

<211>60

<212> DNA

<213> 智人种（Homo Sapiens）

<400> 12

taggttatct tcattaaaga aaggggggaa attttttttt tccccccttt ctttaatgaa 60

Claims

1.一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，包括，阻断序列A和阻断序列B；其中，所述阻断序列A可与目标DNA序列的正义链结合，所述阻断序列B可与目标DNA序列的反义链结合；且，所述阻断序列A和所述阻断序列B均包括，

(2)双链主反应部分：所述阻断序列A的主反应部分用于与所述正义链互补配对，所述阻断序列B的主反应部分用于与所述反义链互补配对；

2.根据权利要求1所述的一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，所述单链toehold序列部分中的toehold序列包括4-10个碱基。

3.根据权利要求1所述的一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，所述双链主反应部分的DNA刚性段为15-30个碱基对。

4.根据权利要求1所述的一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，所述阻断序列A和阻断序列B的摩尔比为1﹕1。

5.根据权利要求1所述的一种DNA阻断序列组合物，其特征在于，还包括，缓冲液，所述阻断序列A和阻断序列B与所述缓冲液混合，得到混合液形式的DNA阻断序列组合物。

6.如权利要求1至5中任一项所述的DNA阻断序列组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法，包括以下步骤：

分别合成阻断序列单链A和阻断序列单链B；并分别将所述阻断序列单链A和所述阻断序列单链B溶解，得A溶液和B溶液；

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括，

8.一种检测系统，其特征在于，包括权利要求1至5中任一项所述的DNA阻断序列组合物和PCR扩增试剂；其中，所述PCR扩增试剂中采用无5’外切酶活性的DNA聚合酶。

9.如权利要求8所述检测系统的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

对所述纯化DNA产物进行凝胶电泳表征；

对所述纯化DNA产物进行序列检测。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述混合溶液中，DNA阻断序列组合物中的阻断序列A和阻断序列B的总浓度为0.1-1μmol/L。