CN111617112A

CN111617112A - 桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途

Info

Publication number: CN111617112A
Application number: CN202010485170.9A
Authority: CN
Inventors: 万凤; 杨汝春; 唐玥雯; 李有贵
Original assignee: Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-06-01
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2020-09-04

Abstract

本发明公开了一种桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途。所述桑黄通过调控血小板反应蛋白‑1缓解局灶节段性肾小球硬化进程。所述桑黄为桑黄水煎剂。本发明的桑黄水煎剂能够显著下调TSP‑1、TGF‑β1和ECM主要成分Collage IV和FN的表达量，进而桑黄可通过抑制TSP‑1/TGF‑β1通路延缓FSGS的进程，具有广阔的应用前景，具有实用性。

Description

桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途

技术领域

本发明属于中药药物领域，具体涉及一种桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途。

背景技术

局灶节段性肾小球硬化（Focal segmental glomerulomerulossclerosis, FSGS）特指一类常见的原发性肾小球疾病，以局灶、节段性硬化为主要病理学特征，临床主要表现为蛋白尿，其发病率有逐年增高的趋势，且极易进展为终末期肾脏病（end-stage renaldisease, ESRD）。FSGS发病机制复杂，与遗传因素、血流动力学改变、循环因子、病毒感染、足细胞损伤以及细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）的积聚等诸多因素相关。研究表明，ECM在肾小球中的过度沉积是引起肾小球硬化的重要病理基础。在正常情况下，肾小球内ECM的合成和降解保持动态平衡，以维持正常的生理功能。在病理条件下，该平衡会被打破，导致ECM合成增强或降解受阻，致使ECM大量沉积，从而引起肾小球硬化。

ECM合成的增加是引起肾小球ECM积聚的重要原因之一。研究显示，体内多种细胞因子、多肽因子和酶均可导致ECM成分的合成增加，继而引发ECM积聚。众所周知，转化生长因子（transforming growth factor β1, TGF-β1）是ECM沉积的一个关键促进剂。它主要是通过下游的信号调节蛋白Smads发挥生物学作用。然而，研究证明，经转录翻译初生成的TGF-β1大多是以无活性的形式存在，它与潜在状态相关蛋白（latency-associatedprotein, LAP）结合形成前体复合物，必须被活化后才能与其受体结合发挥生物学作用。因此，抑制TGF-β1的活化成为阻抑ECM沉积至关重要的一步。研究证实，血小板反应蛋白-1（thrombospondin, TSP-1/THBS）是TGF-β1的重要激活剂。它可与非活性型TGF-β1复合物的LAP区域结合，改变其空间构型，使TGF-β1与其受体结合的活性位点暴露，成为活性型的TGF-β1。目前，已有研究证实TSP-1活化TGF-β1在多种肾脏病发病过程中发挥重要作用，但是对该靶点的干预研究还知之甚少。

发明内容

本发明就是为了填补局灶节段性肾小球硬化病治疗领域的空白，所提供一种桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途。

进一步的，所述桑黄通过调控血小板反应蛋白-1缓解局灶节段性肾小球硬化进程。

进一步的，所述桑黄为桑黄水煎剂。

进一步的，所述桑黄水煎剂的制备方法包括以下步骤：

a.准确称取桑黄粉，加入蒸馏水浸泡30 min，煎制30 min;

b.双层纱布过滤，收集滤液；

c.加蒸馏水到药渣中，继续煎制7 h;

d.双层纱布过滤，合并滤液煎煮浓缩至所需浓度。

进一步的，桑黄的使用剂量是4 g•d^-1。

本发明的有益效果是：

本发明的桑黄能够显著下调TSP-1、TGF-β1和ECM主要成分Collage IV和FN的表达量，进而桑黄可通过抑制TSP-1/TGF-β1通路延缓FSGS的进程，具有广阔的应用前景，具有实用性。

附图说明

图1是本发明TMT定量蛋白组学结果图；

图2是本发明RT-PCR结果图；

图3是本发明Western blot结果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明技术方案，下面结合说明书附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

本发明用于延缓FSGS进程的药物主要是：桑黄水煎剂，桑黄剂量是参考成人用量4g•d^-1，再根据单位体表面积生药量计算SD大鼠干预剂量。

具体制备方法为：采用常规中药熬制方法，准确称取桑黄粉，加入蒸馏水浸泡30min，煎制30 min，双层纱布过滤，收集滤液；再加蒸馏水到药渣中，继续煎制7 h，双层纱布过滤，合并滤液煎煮浓缩至所需浓度。

用法用量：每日一次， 2 mL灌胃，直至实验结束。

实验流程：采用单侧肾切除联合阿霉素注射法构建FSGS大鼠模型，实验设为对照组（Control），模型组 (Model)，桑黄组（Phellinus baumii，PLB），术后次日开始进行桑黄水煎剂干预治疗，每天一次2mL灌胃，正常组和模型组用等量的水灌胃。

实施例1 采用TMT定量蛋白组学初步分析桑黄干预的可能机理

提取大鼠肾脏蛋白，胰酶酶解成肽段，进行TMT标记，肽段采用液相色谱-质谱联用分析，二级质谱数据使用Maxquant (v1.5.2.8)进行检索，数据库为Rattus_Uniprot_10116，然后进行生物信息学分析。

通过质谱定量分析检测出肽段对应在每个样本中的定量值，每个蛋白会对应多个肽段，在计算蛋白在每个样本中的定量值时，采用蛋白所对应特异性肽段的定量值中值作为该蛋白的定量值。对于每一次重复实验，两个不同样本之间蛋白定量值取比值作为比较组差异表达量（Ratio）。计算该蛋白在两个样本中的差异表达显著性P-value，首先将两个样本中蛋白对应特异性肽段的定量值取log2（以使得数据符合正态分布），然后用双样本双尾T检验方法计算p-value。当p-value<0.05时，以差异表达量变化超过1.3作为显著上调的变化阈值，小于1/1.3作为显著下调的变化阈值。取两次重复实验中，共同上调和共同下调蛋白作为该比较组最终的差异表达蛋白。

实验结果如图1所示，采用TMT定量蛋白组学分析正常组、模型组和桑黄水煎剂组中肾脏的差异表达蛋白。通过质谱分析并对其图谱解析，一共鉴定到6381.0个蛋白，其中5525.0个可定量。对差异蛋白进行了蛋白注释和功能分类之后，发现与对照组相比，模型组中TSP-1的表达显著增高，TGF-β1和ECM主要成分Collage IV和FN也显著上调；与模型组相比，桑黄干预之后TSP-1、 TGF-β1、Collage IV和FN这些蛋白的表达均明显下调。

当前，中药的多成分、多靶点、多层次的作用特点是其作用机理的研究的一大障碍，故需借助新的技术和手段对其作用机理进行深入的研究。蛋白组学技术可从整体的角度可比较中药作用前后靶组织中蛋白质的变化，有助于识别出中药的作用靶点，为阐明中药作用机制带来了曙光。

实施例2 RT-PCR和Western blot验证分析

采用TRIzol法提取大鼠肾组织总RNA，采用Primescript^TMRT试剂盒将RNA逆转录为cDNA。利用TB Green^® Premix Ex Taq^TM (Tli RNaseH Plus)试剂盒在Applied Biosystems^® 7500 PCR 荧光定量PCR仪上进行。以GAPDH的表达作为内参，每个样品设置3个平行重复，采用2^-ΔΔCT法进行数据分析。

定量引物序列：

TSP-1-Forward:5’-GGCTTCATCTTCCTGGCTTCCTTG-3’,

TSP-1-Reverse: 5’-GCTTCCTCCACTGACACCACTTG-3’;

TGF-β1-Forward: 5’-GGCACCATCCATGACATGAACCG-3’,

TGF-β1-Reverse: 5’-GCCGTACACAGCAGTTCTTCTCTG-3’;

Smad3-Forward: 5’-CTTCACAGCCGTCCATGACAGTAG-3’,

Smad3-Reverse: 5’-CCAATGTAGTAGAGCCGCACACC-3’;

Collage IV-Forward: 5’-GATTGTGGTGGCTCTGGCTGTG-3’,

Collage IV-Reverse: 5’-TCGTTCCAGGAAGTCCAGGTTCTC-3’;

FN-Forward: 5’-TGACGAGGACACGGCAGAGC-3’,

FN-Reverse: 5’-AGGAATGGCTGTGGACTGGACTC-3’;

GAPDH-Forward: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’;

GAPDH-Reverse: 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’

PCR反应体系如下：

反应体系	剂量
		cDNA模板	0.5 μL
Primer F	0.5 μL
		Primer R	0.5 μL
TB Green® Premix Ex TaqTM （2×）	5 μL
		ddH<sub>2</sub>O	up to 10 μL

荧光定量PCR反应程序为：95℃ 预变性30s，接着进行40次循环的两步法PCR反应：95℃5s，60℃ 34s，最后添加溶解曲线分析程序：95℃15s，60℃ 1min，95℃ 15s。

WB实验流程：

（1）采用含蛋白酶抑制剂Cocktail的RIPA裂解液（20 mM Tris (pH 7.5), 150 mMNaCl, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS和1 mM EDTA等）提取肾脏组织蛋白，冰上裂解30 min后10,000 g离心10 min，收集上清液。采用BCA法进行蛋白定量，然后将一定量的上清液与等体积2×上样缓冲液混匀，置沸水浴10 min，冷却后12,000 g离心5 min，取20 μL样本（约80 μg蛋白量）进行SDS-PAGE电泳；

（2）剪裁一张与胶块一样大小的PVDF膜，先在甲醇中浸泡30 s，然后转移至电转缓冲液中平衡10 min，按照从负极到正极的顺序，依次放置海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵，排尽气泡，将转印夹插入电转槽中，加入适量的预冷的电转缓冲液，冰浴下100V转印1.5 h；

（3）取出PVDF膜，确定正反面并作好标记，用双蒸水洗涤后，可加入少量丽春红染色，以确定转印是否成功，之后用双蒸水洗去丽春红染液；

（4）采用PBST配置的5% 脱脂奶粉进行封闭，室温2 h；

（5）弃封闭液，按照适当的稀释度加入待测一抗（用一抗稀释液稀释）；

（6）用PBST洗涤3次，每次10 min，按照1/15,000的稀释比例加入红外线标记的羊抗兔/鼠二抗，室温孵育1.5 h；

（7）PBST洗涤3次，每次10 min，取出PVDF膜，用吸水纸稍微吸一下其表面的洗涤液，正面朝下，采用双色红外激光成像系统Odyssey CLx image system (LI-COR)进行拍照。

为了验证上述TMT定量蛋白组学结果，采用RT-PCR结合Western blot技术进行了验证，结果显示（参见图2、3）模型组中TSP-1、TGF-β1和ECM主要成分Collage IV和FN显著上调，桑黄干预可显著下调它们的表达，表明桑黄可通过抑制TSP-1/TGF-β1通路延缓FSGS的进程。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途。

2.根据权利要求1所述的一种桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途，其特征在于：所述桑黄通过调控血小板反应蛋白-1缓解局灶节段性肾小球硬化进程。

3.根据权利要求1所述的一种桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途，其特征在于：所述桑黄为桑黄水煎剂。

4.根据权利要求3所述的一种桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途，其特征在于：所述桑黄水煎剂的制备方法包括以下步骤：

a.准确称取桑黄粉，加入蒸馏水浸泡30 min，煎制30 min;

b.双层纱布过滤，收集滤液；

c.加蒸馏水到药渣中，继续煎制7 h;

d.双层纱布过滤，合并滤液煎煮浓缩至所需浓度。

5.根据权利要求1所述的一种桑黄在延缓局灶节段性肾小球硬化进程中的用途，其特征在于：桑黄的使用剂量是4 g•d^-1。