CN111615562A

CN111615562A - 检测抗生素耐受性幽门螺旋杆菌的方法

Info

Publication number: CN111615562A
Application number: CN201880086812.9A
Authority: CN
Inventors: H·张; Y·周; R·卡库图鲁
Original assignee: American Molecular Laboratories Inc
Current assignee: American Molecular Laboratories Inc
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2020-09-01
Also published as: US11708616B2; US20200399685A1; WO2019099775A1

Abstract

本公开提供了用于确定样品中是否存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌的方法和材料。所述方法可以包括从样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA、扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝、对幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝进行测序、将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与参考序列进行比较、鉴定幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中存在的突变、和确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目，其中当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量时，则样品中存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌。

Description

检测抗生素耐受性幽门螺旋杆菌的方法

技术领域

本公开总体上提供了用于检测抗生素耐受性幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori；H.pylori)的方法和材料。

背景技术

幽门螺旋杆菌是全球最普遍的人类病原体之一，估计感染全球50％的人口。幽门螺旋杆菌主要存在于胃中，在慢性胃炎、消化性溃疡、与粘膜相关的淋巴样组织(MALT)淋巴瘤、胃癌(gastric carcinoma)和胃癌(gastric cancer)的发病机理中起重要作用。幽门螺旋杆菌在与肠道疾病无关的发病机理中也起着重要作用，包括：免疫性血小板减少性紫癜、难治性铁缺乏症贫血和B12缺乏症。

幽门螺旋杆菌感染或发病用抗生素治疗。实际上，用于治疗幽门螺旋杆菌感染或发病的前线治疗通常包括三种抗生素治疗，包括施用质子泵抑制剂(PPI)和另外两种抗生素，例如克拉霉素和甲硝唑或阿莫西林。但是，只有当被靶向的幽门螺旋杆菌对克拉霉素没有耐受性或对甲硝唑或青霉素类药物(如阿莫西林)没有耐受性时，此类治疗才有效。可以使用其他抗生素，但在每种情况下，至关重要的是要知道感染患者的幽门螺旋杆菌菌株是否对任何特定抗生素具有耐受性，以提供有效的治疗方法。

幽门螺旋杆菌的药物耐受性和多药物耐受性菌株变得越来越普遍，从而导致抗微生物药物根除幽门螺旋杆菌的速度下降。因此，基于治疗前的抗生素敏感性测试选择治疗方法至关重要。不幸的是，由于缺乏可用的快速而可靠的抗生素耐受性测试，该策略并不实用。

检测幽门螺旋杆菌抗生素耐受性的传统方法具有严重的缺点。例如，这样的方法仅能够测试单个幽门螺旋杆菌菌株，因此可能无法提供完整的抗生素耐受性数据。在高幽门螺旋杆菌感染率的地区尤其如此，在这些地区患者更容易感染多种幽门螺旋杆菌菌株。另外，这些方法需要培养幽门螺旋杆菌，这很繁琐并且由于采样偏差和运输过程中样品保存不良而导致失败的频率很高。因此，需要一种更快、更可靠、非侵入性的测试来确定幽门螺旋杆菌的抗生素耐受性。

发明内容

本公开涉及用于检测样品中的幽门螺旋杆菌的抗生素耐受性菌株的方法和材料，包括，例如，检测幽门螺旋杆菌的混合菌株中的幽门螺旋杆菌的抗生素耐受性菌株。另外，本公开涉及用于从样品获得幽门螺旋杆菌DNA的方法。

本公开提供了用于确定样品中是否存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌(例如，一种或多种抗生素耐受性幽门螺旋杆菌菌株)的方法和材料。所述方法可以包括：从样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA、扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝、对幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝进行测序、将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与参考序列进行比较、鉴定幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中存在的突变；和确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目，其中当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量时，则样品中存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌。在另一个实施方案中，具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量，其中具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域为测序的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％、大约55％、大约60％、大约65％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更多。

在每个或任何以上或以下提及的实施方案的一些实施方案中，阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA是来自至少10个幽门螺旋杆菌基因组的DNA(例如，在至少10个幽门螺旋杆菌基因组中存在的DNA数量)。在另一个实施方案中，阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA是来自至少50个幽门螺旋杆菌DNA片段的DNA。在另一个实施方案中，阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA是来自50至100个幽门螺旋杆菌DNA片段的DNA。

在每个或任何上文或下文提及的实施方案的一些实施方案中，样品是活检样品，在另一个实施方案中，活检是牙菌斑、胃液或胃活检。在另一个实施方案中，活检样品是福尔马林固定的、或福尔马林固定且石蜡包埋的(FFPE)。

在每个或任何上文或下文提及的实施方案的一些实施方案中，该方法进一步包括提供与幽门螺旋杆菌DNA的扩增区域相对应的一个或多个野生型基因序列或参考序列的步骤。

在每个或任何上文或下文提及的实施方案的一些实施方案中，通过下一代测序(NGS)检测幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中的突变。

在每个或任何上文或下文提及的实施方案的一些实施方案中，扩增和测序幽门螺旋杆菌DNA的一个或多个区域的步骤包括：鉴定适于产生扩增子的PCR引物对，其中所述扩增子包含幽门螺旋杆菌DNA的一个或多个区域、将包含一个或多个引物的PCR引物对分隔(segregate)到单独的PCR引物对池中，所述引物对干扰另一PCR引物对产生扩增子，其中每个单独的PCR引物对池包含多个PCR引物对、从每个单独的PCR引物对池和幽门螺旋杆菌DNA中产生扩增子、和将从每个单独的PCR引物对池和幽门螺旋杆菌DNA中产生的所有扩增子组合到样品扩增子池中，向该样品扩增子池中的扩增子添加独特的索引序列，以产生索引样品扩增子池，任选地进一步将索引样品扩增子池与来自不同样品的一个或多个差异索引样品扩增子池组合，以及同时对所有索引样品扩增子进行测序。在一个实施方案中，方法进一步包括通过参照相应的野生型基因序列(例如，参考序列)从样品中鉴定索引序列扩增子中突变的步骤。

在一个实施方案中，PCR引物对针对以下基因中的一个或多个：16S rRNA(与四环素耐受性相关)、23S rRNA(与克拉霉素耐受性相关)、pbp1(与青霉素抗生素耐受性相关)、gyrA(与氟喹诺酮抗生素(fluoroquinone antibiotics)耐受性相关)、rpoB(与利福布汀耐受性相关)和rdxA(与甲硝唑耐受性相关)。

在每个或任何上文或下文提及的实施方案的一些实施方案中，幽门螺旋杆菌DNA的区域包含一个或多个选自以下的幽门螺旋杆菌基因：23S rRNA、gyrA、rdxA、frxA、pbp1、16S rRNA和rpoB。在另一个实施方案中，幽门螺旋杆菌DNA的一个或多个扩增区域的多个拷贝中的一个或多个鉴定的突变选自：23S rRNA中的A2143G和A2142G突变；gyrA中的A272GAsp91Gly和G271A Asp91Asn；rdxA中的pGlu194、G352A、pCys87、pR41Rfs；和16A rRNA中的T926C和C927A。

在每个或任何以上或以下提及的实施方案的一些实施方案中，鉴定的突变是幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的A2142G、A2143G和/或A2142C突变；幽门螺旋杆菌16S rRNA基因的A928C、AG926-927GT、A926G/A928C和/或AGA926-928TTC突变；编码DNA螺旋酶亚基A的幽门螺旋杆菌gyrA基因的C261A、C261G，G271A和/或G271T突变；在编码DNA指导的RNA聚合酶的β/β'亚基的幽门螺旋杆菌rpoB基因的密码子525和545之间；编码青霉素结合蛋白1的幽门螺旋杆菌pbp1基因中的Cl242A或C1242G突变；或在幽门螺旋杆菌rdxA基因内。在另一个实施方案中，鉴定的突变产生了由rdxA编码的幽门螺旋杆菌氧不敏感性(I型)NAPD(P)H硝基还原酶的功能丧失。

在每个或任何上文或下文提及的实施方案的一些实施方案中，抗生素耐受性幽门螺旋杆菌对以下一种或多种具有耐受性：大环内酯、甲硝唑、喹诺酮、利福霉素、阿莫西林和四环素。

在每个或任何上文或下文提及的实施方案的一些实施方案中，样品是排泄物样品。在其他实施方案中，排泄物样品是通过以下方法获得的：将所述排泄物样品的第一部分暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体、从所述排泄物样品的第一部分中的排泄物材料中分离结合抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌、从分离自第一排泄物材料的幽门螺旋杆菌中提取幽门螺旋杆菌DNA、将排泄物样品的第二部分暴露于结合幽门螺旋杆菌DNA的DNA探针、从排泄物样品的第二部分中提取幽门螺旋杆菌DNA、和合并从排泄物样品的第一部分获得的幽门螺旋杆菌DNA和从排泄物样品的第二部分获得的幽门螺旋杆菌DNA。

本公开还提供了用于从排泄物样品中获得幽门螺旋杆菌DNA的方法和材料，该方法包括：将排泄物样品的第一部分暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体、从所述排泄物样品的第一部分中的排泄物材料中分离结合抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌、从分离自第一排泄物材料的幽门螺旋杆菌中提取幽门螺旋杆菌DNA、将排泄物样品的第二部分暴露于结合幽门螺旋杆菌DNA的DNA探针、从排泄物样品的第二部分中提取幽门螺旋杆菌DNA、和合并从排泄物样品的第一部分获得的幽门螺旋杆菌DNA和从排泄物样品的第二部分获得的幽门螺旋杆菌DNA。

在每个或任何上文或下文提及的实施方案的一些实施方案中，用于从排泄物样品获得幽门螺旋杆菌DNA的方法进一步包括使所述排泄物样品均一化的步骤。在另一个实施方案中，抗幽门螺旋杆菌抗体被标记。在另一个实施方案中，抗幽门螺旋杆菌抗体用生物素标记。

本公开还提供了用于治疗受试者中幽门螺旋杆菌感染的方法和材料，所述方法包括：从所述受试者获得样品、从所述样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA、扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝、对幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝进行测序、将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与一个或多个参考序列进行比较、检测幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中的突变、确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目，其中当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量时，则样品中存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌、以及当样品中存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌时，向受试者施用一种或多种幽门螺旋杆菌不具有耐受性的抗生素。

附图说明

图1是描述从排泄物样品中获得幽门螺旋杆菌DNA的方法的流程图。

图2是流程图，其描述了从已经被福尔马林固定的活检组织中获得幽门螺旋杆菌DNA的方法。

图3是说明书和实施例中公开的各个引物的表。

图4描述了幽门螺旋杆菌rdxA基因，并说明了所述扩增子的相对排列。

图5是电泳凝胶，表明合并所有rdxA特异性引物产生大小不正确的扩增子，而本文描述的分隔的引物池产生正确大小的扩增子。

图6是16个FFPE样品的汇总数据表，使用分隔池和合并的扩增子策略通过16个FFPE样品的下一代测序(NGS)数据进行了分析，其中鉴定出药物耐受性幽门螺旋杆菌特有的六个不同基因中每一个均具有突变。由NGS鉴定的所有突变均通过Sanger测序确认。

图7是24个FFPE样品的汇总数据表，使用分隔池和合并的扩增子策略通过来自24个FFPE样品的NGS数据进行分析，其中鉴定出药物耐受性幽门螺旋杆菌特有的六个不同基因中每一个均具有突变。数据表列出了由NGS鉴定的基因突变及其突变频率。

图8是含有不同抗生素耐受性菌株混合物的幽门螺旋杆菌DNA样品分析的汇总数据表。

图9是含有不同抗生素耐受性菌株混合物的幽门螺旋杆菌DNA的Sanger测序的图示。

图10A是检测23S rRNA幽门螺旋杆菌基因中的突变以及突变检测是否指示混合的幽门螺旋杆菌菌株的汇总数据表。数据表列出了来自下一代测序的样品的扩增数或“读取”数、具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数量以及具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数量是否指示存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌。

图10B是检测23S rRNA和gyrA幽门螺旋杆菌基因中的突变以及检测一个或多个突变是否指示混合的幽门螺旋杆菌菌株的汇总数据表。数据表列出了来自下一代测序的样品的扩增数或“读取”数、具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数量以及具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数量是否指示存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌。

图10C是检测23S rRNA、gyrA和rdxA幽门螺旋杆菌基因中的突变以及检测一个或多个突变是否指示混合的幽门螺旋杆菌菌株的汇总数据表。数据表列出了来自下一代测序的样品的扩增数或“读取”数、具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数量以及具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数量是否指示存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌。

具体实施方式

获得有关幽门螺旋杆菌抗生素耐受性的信息的能力对于有效、高效地治疗幽门螺旋杆菌感染至关重要。考虑到抗生素耐受性幽门螺旋杆菌的流行增多，这一点尤其重要。通过确定哪一种或多种抗生素不太可能对受试者的幽门螺旋杆菌感染起作用，受试者可以接受针对其感染的个性化治疗。然而，难以从患者样品(例如生物样品)中获得足够数量和质量的幽门螺旋杆菌DNA，以进行遗传分析来评估样品中是否存在对抗生素敏感、或对抗生素不敏感的幽门螺旋杆菌。发明人惊奇地发现，通过以下方法能够从样品(例如排泄物样品)中获得足够数量(例如，量)的幽门螺旋杆菌DNA：将所述排泄物样品的第一部分暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体、从所述排泄物样品的第一部分中的排泄物材料中分离结合抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌、从分离自第一排泄物材料的幽门螺旋杆菌中提取幽门螺旋杆菌DNA、将排泄物样品的第二部分暴露于结合幽门螺旋杆菌DNA的DNA探针、从排泄物样品的第二部分中提取幽门螺旋杆菌DNA、和合并从排泄物样品的第一部分获得的幽门螺旋杆菌DNA和从排泄物样品的第二部分获得的幽门螺旋杆菌DNA。随后，从样品(例如排泄物样品)中获得的幽门螺旋杆菌DNA可用于确定样品中是否存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌(例如，一种或多种抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌菌株)。

本公开提供了用于确定在样品(例如包括排泄物样品)中是否存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌的方法。该方法可以包括：从样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA(例如，来自至少10个幽门螺旋杆菌基因组的DNA，至少50个幽门螺旋杆菌DNA片段，包括例如50至100个幽门螺旋杆菌DNA片段)、扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝、对幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝进行测序、将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与野生型基因序列或参考序列进行比较、鉴定幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中存在的突变、和确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目，其中当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量(如，具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域是测序的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％、大约55％、大约60％、大约65％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更多)时，样品中存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌。

在每个或任何上文或下文提及的实施方案的一些实施方案中，所述方法可进一步包括：提供幽门螺旋杆菌DNA的扩增区域的一个或多个野生型基因序列或参考序列。在其他实施方案中，扩增和测序幽门螺旋杆菌DNA的一个或多个区域的步骤可进一步包括：鉴定适于产生扩增子的PCR引物对，其中所述扩增子包含幽门螺旋杆菌DNA的一个或多个区域；将包含一个或多个引物的PCR引物对分隔到单独的PCR引物对池中，所述引物对干扰另一PCR引物对产生扩增子，其中每个单独的PCR引物对池包含多个PCR引物对；从每个单独的PCR引物对池和幽门螺旋杆菌DNA中产生扩增子；和将从每个单独的PCR引物对池和幽门螺旋杆菌DNA中产生的所有扩增子组合到样品扩增子池中，向该样品扩增子池中的扩增子添加独特的索引序列，以产生索引样品扩增子池，任选地进一步将索引样品扩增子池与来自不同样品的一个或多个差异索引样品扩增子池组合，以及同时对所有索引样品扩增子进行测序。

在一些实施方案中，样品是排泄物样品。在进一步的实施方案中，可以通过以下方法获得排泄物样品，该方法包括：将所述排泄物样品的第一部分暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体、从所述排泄物样品的第一部分中的排泄物材料中分离结合抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌、从分离自第一排泄物材料的幽门螺旋杆菌中提取幽门螺旋杆菌DNA、将排泄物样品的第二部分暴露于结合幽门螺旋杆菌DNA的DNA探针、从排泄物样品的第二部分中提取幽门螺旋杆菌DNA、和合并从排泄物样品的第一部分获得的幽门螺旋杆菌DNA和从排泄物样品的第二部分获得的幽门螺旋杆菌DNA。在某些实施方案中，排泄物样品的第一部分与排泄物样品的第二部分相同。

本公开还提供了用于从样品(例如排泄物样品)中获得幽门螺旋杆菌DNA的方法。该方法可以包括：将所述排泄物样品的第一部分暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体、从所述排泄物样品的第一部分中的排泄物材料中分离结合抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌、从分离自第一排泄物材料的幽门螺旋杆菌中提取幽门螺旋杆菌DNA、将排泄物样品的第二部分暴露于结合幽门螺旋杆菌DNA的DNA探针、从排泄物样品的第二部分中提取幽门螺旋杆菌DNA、和合并从排泄物样品的第一部分获得的幽门螺旋杆菌DNA和从排泄物样品的第二部分获得的幽门螺旋杆菌DNA。在某些实施方案中，排泄物样品的第一部分与排泄物样品的第二部分相同。

本公开进一步提供了用于治疗受试者中幽门螺旋杆菌感染的方法。该方法可以包括：从所述受试者获得样品、从所述样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA(例如，来自至少10个幽门螺旋杆菌基因组的DNA、至少50个幽门螺旋杆菌DNA片段，包括例如，50至100个幽门螺旋杆菌DNA片段)、扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生扩增的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝、对幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝进行测序、将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与一个或多个参考序列进行比较、检测幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中的突变、确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目，其中当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量时(例如，具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域为测序的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％、大约55％、大约60％、大约65％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更多)，样品中存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌、以及当样品中存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌时，向受试者施用一种或多种幽门螺旋杆菌不具有耐受性的抗生素。

从样品中获得幽门螺旋杆菌DNA

本公开提供了用于从样品(例如排泄物样品、牙菌斑、口腔唾液、胃液或胃活检)中获得幽门螺旋杆菌DNA的方法。在样品是排泄物样品的实施方案中，此类方法可包括：将排泄物样品暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体、从排泄物样品中的排泄物材料中分离结合抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌、并分离自排泄物材料的幽门螺旋杆菌中提取幽门螺旋杆菌DNA。所述方法可用于从包含完整和/或球状幽门螺旋杆菌(幽门螺旋杆菌体)的样品中获得DNA。

排泄物样品可以暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体，在优选的实施方案中，该抗体被标记，包括例如被生物素标记。在另一个优选的实施方案中，排泄物样品可以被均一化。然后可以使用标准条件将生物素标记的抗幽门螺旋杆菌抗体和排泄物样品孵育足够的时间段，以使得标记的抗幽门螺旋杆菌抗体与完整和/或球状幽门螺旋杆菌结合。可通过将排泄物样品(包含排泄物材料和结合标记的抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌)与能够结合标记的抗幽门螺旋杆菌抗体的珠(例如链霉亲和素珠)一起孵育，从排泄物样品中分离结合标记的抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌。然后可以通过从排泄物材料中分离珠并去除任何液体或碎片，从排泄物样品中的排泄物材料中分离结合标记的抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌。然后可以通过将从排泄物样品中获得的幽门螺旋杆菌与细胞裂解缓冲液一起孵育，从分离自排泄物材料的幽门螺旋杆菌中提取幽门螺旋杆菌DNA。随后可以将暴露的幽门螺旋杆菌DNA与珠一起孵育一段时间。幽门螺旋杆菌DNA与珠结合，例如通过其与抗幽门螺旋杆菌抗体的结合。将珠从裂解缓冲液或上清液分离，并去除上清液。然后可以使用洗脱缓冲液从珠中去除幽门螺旋杆菌DNA。

另外地或可替代地，用于从排泄物样品获得幽门螺旋杆菌DNA的方法可以包括：将排泄物样品暴露于与幽门螺旋杆菌DNA结合的DNA探针(例如，能够与幽门螺旋杆菌DNA杂交的核酸片段)、和从排泄物样品中提取幽门螺旋杆菌DNA。这样的探针可以用于结合来自排泄物样品的基因组和/或片段化的幽门螺旋杆菌DNA。在一个优选的实施方案中，DNA探针是生物素标记的探针。可以将珠添加到DNA探针和排泄物样品中，然后孵育一段时间。在一个优选的实施方案中，珠是链霉亲和素珠。在一个实施方案中，将珠与排泄物样品和DNA探针分离、洗涤，并洗脱幽门螺旋杆菌DNA。

前述的两种方法可以如图1所示进行组合，并且可以包括：将排泄物样品的第一部分暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体、从所述排泄物样品的第一部分中的排泄物材料中分离结合抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌、从分离自第一排泄物材料的幽门螺旋杆菌中提取幽门螺旋杆菌DNA、将排泄物样品的第二部分暴露于结合幽门螺旋杆菌DNA的DNA探针、从排泄物样品的第二部分中提取幽门螺旋杆菌DNA、和合并从排泄物样品的第一部分获得的幽门螺旋杆菌DNA和从排泄物样品的第二部分获得的幽门螺旋杆菌DNA。在一个优选的实施方案中，合并从每种方法收集的幽门螺旋杆菌DNA，用于随后的PCR和测序分析。在某些实施方案中，排泄物样品的第一部分与排泄物样品的第二部分相同。

本文还提供了从福尔马林固定的样品中获得幽门螺旋杆菌DNA的方法。此类方法可包括：处理福尔马林固定的样品以去除福尔马林、和从处理的样品中提取幽门螺旋杆菌DNA。图2提供了流程图，其描述从人胃活检福尔马林固定的组织样品中获得幽门螺旋杆菌DNA的示例性方法。

确定样品中是否存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌

确定样品中是否存在抗生素幽门螺旋杆菌对于确保正确地、靶向性治疗幽门螺旋杆菌感染至关重要。本公开提供了确定样品中是否存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌的方法，包括，例如确定样品中是否存在多于一种的抗生素耐受性幽门螺旋杆菌的菌株。这样的方法可以包括：从样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA(例如，来自至少10个幽门螺旋杆菌基因组的DNA，至少50个幽门螺旋杆菌DNA片段，包括例如50至100个幽门螺旋杆菌DNA片段)、扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝、对幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝进行测序、将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与参考序列进行比较、确定幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中存在的突变、和确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目，其中当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量(如，具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域是测序的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％、大约55％、大约60％、大约65％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更多)时，样品中存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌。

在一些实施方案中，样品是牙菌斑、口腔唾液、胃液或胃活检。在其他实施方案中，样品是福尔马林固定的或福尔马林固定且石蜡包埋的(FFPE)。在一些实施方案中，FFPE样品是块样品。在其他实施方案中，FFPE样品由样品切片(section)或样品切片(slide)组成。在其他实施方案中，样品是排泄物样品。在一些实施方案中，样品是新鲜的。在其他实施方案中，样品是冷冻的、防腐保存的或在CLOtest Gel中的。

在排泄物样品用于确定样品中是否存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌的实施方案中，可以通过以下方法获得排泄物样品，该方法包括：将所述排泄物样品的第一部分暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体、从所述排泄物样品的第一部分中的排泄物材料中分离结合抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌、从分离自第一排泄物材料的幽门螺旋杆菌中提取幽门螺旋杆菌DNA、将排泄物样品的第二部分暴露于结合幽门螺旋杆菌DNA的DNA探针、从排泄物样品的第二部分中提取幽门螺旋杆菌DNA、和合并从排泄物样品的第一部分获得的幽门螺旋杆菌DNA和从排泄物样品的第二部分获得的幽门螺旋杆菌DNA。

本发明人出乎意料地确定了确定样品中是否存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌所需要的幽门螺旋杆菌DNA的阈值水平(例如，量)。

表1

拷贝数	C<sub>T</sub>值	用于NGS分析的阈值C<sub>T</sub>
			100	29-30	任何类型的样品
10	32-33	新鲜活检、牙菌斑、胃液
			2	35-36	无样品

例如，表1是列出了为确保使用本文公开的方法，某些样品中所需要的幽门螺旋杆菌DNA的拷贝数和循环阈值(C_T)的表。拷贝数是从样品中获得的幽门螺旋杆菌基因组的拷贝数。在实时PCR中，通过荧光信号的积累检测阳性反应。C_T是荧光信号跨越阈值并超过背景水平所需的循环数。用于NGS分析的阈值C_T列表示，针对给定拷贝数和C_T，可以用作幽门螺旋杆菌DNA来源的样品类型。如表1所示，如果拷贝数为100并且C_T值为29-30，则可以使用任何样品。但是，如果拷贝数为2并且C_T值为35-36，则无论其来源如何，都无法使用样品。如果样品提取的幽门螺旋杆菌DNA符合表1的要求，则可以将其用于公开的确定样品中是否存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌的方法中。

可以使用本文所述的方法从样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA，包括从排泄物样品中获得幽门螺旋杆菌DNA的方法和从福尔马林固定的样品中获得幽门螺旋杆菌DNA的方法。可以使用从样品获得DNA的其他已知方法，只要这样的方法获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA即可。在一个实施方案中，阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA是来自至少10个幽门螺旋杆菌基因组的DNA。在另一个实施方案中，阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA是来自至少50个幽门螺旋杆菌DNA片段的DNA。在另一个实施方案中，阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA是来自50至100个幽门螺旋杆菌DNA片段的DNA。

可以多种方式扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝。在一个实施方案中，PCR引物和扩增子的分隔池用于扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域(参见，例如，PCT/US17/31901，通过引用整体并入本文)。在另一个实施方案中，使用巢式或半巢式PCR。

在一个方面，本公开提供了一组PCR扩增引物，以确定样品中是否存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌。图3列出了由两对引物组成的引物(每对引物中有一个正向和一个反向引物)，用于分离已知的药物耐受性幽门螺旋杆菌菌株特有的基因。这里展示的示例性基因包括16S rRNA(与四环素耐受性相关)、23S rRNA(与克拉霉素耐受性相关)、pbp1(与青霉素抗生素的耐受性相关)、gyrA(与氟喹诺酮抗生素的耐受性相关)、rpoB(与利福布汀耐受性相关)和rdxA(涉及对甲硝唑的耐受性)。

本领域技术人员理解，涉及对其他抗生素耐受性的其他遗传基因座是已知的，并且可以被包括在本文中或替代在此描述的那些。实际上，对每个靶基因(例如幽门螺旋杆菌DNA的区域)使用两个引物对可最大程度地减少在靶DNA序列中发现的任何特定损伤(例如交联或加合)抑制两个扩增子的PCR扩增的机会，这是因为这种损伤不太可能发生在两个不同的引物结合位点，并参与靶(模板)DNA内靶基因的所有拷贝。但是，使用靶向细菌染色体相同区域、产生不同的但重叠的片段的两个引物对，需要分别进行PCR扩增反应，以避免产生与设计的每个引物对旨在所产生的全长扩增子不匹配的杂合扩增子。因此，必须对每组引物对进行至少两个PCR扩增反应。相反，可以合并靶向不同基因并产生没有同源序列的扩增子的PCR引物对，从而可以尽可能有效地利用可以从FFPE保存的组织中扩增的有限量的靶细菌DNA。本公开教导了将靶向重叠的扩增子组的引物对分隔到单独的池中，并且在分隔的池上进行单个PCR扩增反应以产生期望的扩增子。在本文提供的一个实施例中，使用从FFPE胃活检样品中提取的DNA进行仅两个PCR反应，就可以产生多达10个扩增子，用于诊断以上列表中的五种不同类型的药物耐受性幽门螺旋杆菌基因。

本公开的一个实施方案是一种用于在样品内检测多个基因(例如，幽门螺旋杆菌DNA的区域)中的突变的方法，该方法包括：a)鉴定适于产生包含每个基因区域的扩增子的PCR引物对，所述每个基因包含一个或多个突变；b)将包含一个或多个引物的PCR引物对分隔到单独的PCR引物对池中，所述引物对干扰另一PCR引物对产生扩增子，其中每个单独的PCR引物对池包含多个PCR引物对；c)从每个单独的PCR引物对池和分离自样品的靶DNA中产生扩增子；d)将每个单独的PCR引物对池和靶DNA产生的所有扩增子组合到样品扩增子池中，向该样品扩增子池中的扩增子添加独特的索引序列，以产生索引样品扩增子池，任选地进一步将索引样品扩增子池与来自不同样品的一个或多个差异索引样品扩增子池组合，以及同时对所有索引样品扩增子进行测序；和e)参照野生型序列鉴定来自样品的索引测序的扩增子中的突变。

在另一个实施方案中，多个基因包含选自幽门螺旋杆菌16S rRNA、23S rRNA、gyrA、rpoB、pbp1和rdxA的基因(例如幽门螺旋杆菌DNA的区域)。在进一步的实施方案中，所鉴定的突变是幽门螺旋杆菌23S rRNA基因的A2142G、A2143G和/或A2142C突变；幽门螺旋杆菌16S rRNA基因的A928C、AG926-927GT、A926G/A928C和/或AGA926-928TTC突变；编码DNA螺旋酶亚基A的幽门螺旋杆菌gyrA基因的C261A、C261G、G271A和/或G271T突变；在编码DNA指导的RNA聚合酶的β/β'亚基的幽门螺旋杆菌rpoB基因的密码子525和545之间；编码青霉素结合蛋白1的幽门螺旋杆菌pbp1基因的C1242A或C1242G突变；或幽门螺旋杆菌rdxA基因内。在另一个实施方案中，所鉴定的突变产生了由rdxA编码的幽门螺旋杆菌氧不敏感性(I型)NAPD(P)H硝基还原酶的功能丧失。

在本发明的一个实施方案中，扩增子的长度不超过230个碱基对。在另一个实施方案中，扩增子的长度大于130个碱基对。在另一个实施方案中，包含一个或多个引物的PCR引物对通过形成交叉对引物二聚体或通过形成交叉对截短的扩增子来干扰，所述引物干扰另一PCR引物对产生扩增子。

本公开的另一个实施方案涉及一种用于检测患者来源的样品中是否存在药物耐受性幽门螺旋杆菌的方法，该方法包括：a)从分离自患者来源的样品中的DNA(例如幽门螺旋杆菌DNA的区域)和i)包含引物SEQ ID NO.1-10的PCR引物对池1；ii)包含引物SEQ IDNO.11-22的PCR引物对池2；iii)包含引物SEQ ID NO.23-28的PCR引物对池3；iv)包含引物SEQ ID NO.29-32的PCR引物对池4；v)包含引物SEQ ID NO.33-38的PCR引物对池5；vi)包含引物SEQ ID NO.39-44的PCR引物对池6中产生扩增子；b)将从步骤a)中的PCR引物对池1-6产生的所有扩增子组合到样品扩增子池中，向该样品扩增子池中的扩增子添加独特的索引序列，以产生索引样品扩增子池，可选地进一步组合索引样品扩增子池与来自不同患者来源的样品的一个或多个差异索引样品扩增子池，并同时对所有索引样品扩增子进行测序；c)参照SEQ ID Nos.47-52鉴定测序的索引样品扩增子中的突变，和d)通过步骤c)中鉴定的突变的存在或不存在，确定患者来源谱中存在的幽门螺旋杆菌的药物耐受性谱。

本公开的又一个实施方案涉及一种用于检测患者来源的样品中是否存在药物耐受性幽门螺旋杆菌的方法，该方法包括：a)从分离自患者来源的样品中的DNA(例如幽门螺旋杆菌DNA的区域)和i)包含引物SEQ ID NO.23-28的PCR引物对池1；ii)包含引物SEQ IDNO.29-32的PCR引物对池2；iii)包含引物SEQ ID NO.33-38的PCR引物对池3；iv)包含引物SEQ ID NO.39-44的PCR引物对池4中产生扩增子；b)将从步骤a)中的PCR引物对池1-4产生的所有扩增子组合到样品扩增子池中，向该样品扩增子池中的扩增子添加独特的索引序列，以产生索引样品扩增子池，可选地进一步组合索引样品扩增子池与来自不同患者来源的样品的一个或多个差异索引样品扩增子池，并同时对所有索引样品扩增子进行测序；c)参照SEQ ID No.47-52鉴定测序的索引样品扩增子中的突变，和d)通过步骤c)中鉴定的突变的存在或不存在，确定患者来源谱中存在的幽门螺旋杆菌的药物耐受性谱。

在另一个实施方案中，可以通过经典的Sanger测序方法对本文所述的任何扩增子池进行测序，使用池中单个扩增子的末端引物之一作为正向测序引物，使用该扩增子的另一个末端引物作为反向测序引物。备选地，对于扩增子池内的每个单独的扩增子，对每个期望反应具有特异性的独特测序引物可以用于相同目的。这样，每个扩增子都可以直接从扩增子池中测序。扩增子池可以与也可以不与来自相同FFPE提取的活检样品的其他扩增子池进行组合，并且可以通过在用于下一代测序(NGS)的制备物中添加接头(adaptor)和索引标签，来制备用于测序的组合扩增子。可以将来自单个FFPE活检样品的标记的扩增子池与来自不同FFPE活检样品的差异标记的扩增子池进一步组合，并通过高通量多重测序方法直接对组合的样品扩增子池进行测序。

在每个或任何上文或下文提及的实施方案的一些实施方案中，扩增子的长度不超过230个碱基对。在另一个实施方案中，扩增子的长度大于130个碱基对。在另一个实施方案中，包含一个或多个引物的PCR引物对通过形成交叉对引物二聚体或通过形成交叉对截短的扩增子来干扰，所述引物干扰另一PCR引物对产生扩增子。

在一些实施方案中，称为分隔池的方法用于扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝。在一个实施例中，为了验证来自每个活检样品的总DNA样品中幽门螺旋杆菌序列的存在，使用PCR引物SEQ ID No：45和46，对幽门螺旋杆菌23SrRNA基因中特定的125个碱基对片段独特高度保守区域进行PCR扩增。纯化PCR产物并测序，并通过BLAST分析证实对幽门螺旋杆菌具有特异性[Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,D.J.(1990)"Basic local alignment search tool."J.Mol.Biol.215:403-410]。缺少正确的扩增产物(扩增子)表明样品中不存在可用的幽门螺旋杆菌DNA。

进一步研究确实产生了125个碱基对的幽门螺旋杆菌特异性PCR扩增子的样品，以确定回收的DNA的质量。为了确定从含幽门螺旋杆菌的FFPE胃活检样品中提取的DNA对PCR扩增和测序的适用性，开发了一种多重PCR定性测定法。该定性测定法包括用一组能够产生100、200、300、400和500个碱基对片段的扩增子阶梯(ladder)的PCR引物对编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的人GAPDH基因进行PCR扩增。FFPE DNA无显著损坏，较大的片段大小和相对高的浓度产生扩增子阶梯的所有五个“梯级”，而高度受损且显著片段化的DNA将不产生任何预期的扩增子。根据我们在此方法上积累的经验，我们对从FFPE胃活检样品中回收的DNA进行了评级，如果该测试产生2到5条扩增子阶梯的条带，评为良好，如果仅产生单个条带，则为中等，如果根本没有观察到条带，则为差。在许多从FFPE提取的活检样品中观察到的扩增子条带数的总频率表明，将分析的扩增子大小限制为约200个碱基对或更小，可在产生尽可能多的连续序列与避免PCR扩增在模板DNA中终止性损伤之间达到最佳平衡。

使用含1U Taq DNA聚合酶、10mM dNTP混合物的100mM Tris-HCl、500mM KCl和25mM MgCl₂缓冲液，使用新鲜制备或冷冻的幽门螺旋杆菌染色体DNA(作为阳性对照)和从FFPE胃活检样品提取的样品(实验样品)进行PCR扩增反应。

对于通过Sanger测序方法分析的样品，如所示，使用图4中的PCR引物(SEQ IDNO.1-44)，其热循环参数为：在95℃下初始变性10分钟，然后进行35个循环的95℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 30秒，然后在72℃最终延伸10分钟。遵循制造商的说明，使用MiniElutePCR纯化柱纯化每个扩增反应产生的扩增子。

使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems，目录号4337455)，按照制造商的规程对纯化的扩增子进行Sanger测序。PCR测序反应使用以下热参数进行：95℃ 1分钟，然后25个循环的95℃ 30秒、56℃ 30秒和60℃1分钟。引物延伸反应使用Agencourt CleanSEQ试剂盒(Beckman Coulter Life Sciences目录号A29151)，按照制造商的说明进行。加载样品并在ABI 3500遗传分析仪(Applied Biosystems)上进行分析。用3500系列数据收集软件(Applied Biosystems)收集原始序列数据，并使用Sequencher v5.4软件(Gene Codes Corp.)针对参考序列进行组装和比对。

对于旨在用于NGS测序的样品，将Illumina突出端接头序列添加到图3中列出的基因座特异性引物序列(SEQ ID NO 1-44)。正向突出序列(添加至基因座特异性正向引物序列的5'端)为TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO.47)，反向突出序列(添加至基因座特异性反向引物序列的5'端)为GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ IDNO.48)。第一轮PCR扩增的热循环参数为：在95℃初始变性11分钟，然后是35个循环的95℃持续30秒、59℃持续1分钟和72℃持续1分钟，然后在72℃最终延伸10分钟。第二阶段PCR反应(包括添加多重索引接头)包括热循环参数：98℃持续30秒，17个循环的98℃持续20秒、60℃持续30秒和72℃持续45秒，最后在72℃持续5分钟进行延伸。然后用Agencourt AMPureXP试剂盒(Beckman Coulter Life Sciences目录号A63880)遵循制造商的说明处理文库，在2100BioAnalyzer(Agilent Technologies)上进行定量，必要时稀释，并加载到IlluminaMiSeq测序仪(Illumina，Inc.)上。使用NextGENe V 2.4.1.1软件(SoftGenetics)进行数据分析。

在本发明的一方面，可以通过分隔PCR引物来同时表征编码不同形式的药物耐受性的多个基因座，所述PCR引物用于产生覆盖每个靶基因座的诊断扩增子。包含SEQ ID NO：1和2的PCR引物对，用于产生跨越幽门螺旋杆菌16S rRNA基因的926-928位的168个碱基对的扩增子(16SrRNA 168)。实际上，这些位置的任何突变都会产生低水平的四环素耐受性，而三突变AGA926-928TTC与非常高水平的四环素耐受性相关。包含SEQ ID NO：11和12的第二引物对产生162个碱基对的扩增子(16SrRNA 162)，其也包含幽门螺旋杆菌16S rRNA的926-928位。包含SEQ ID NO：3和4的另一PCR引物对产生194个碱基对的扩增子(23SrRNA194)，其跨越幽门螺旋杆菌的23S rRNA基因的2142和2143位。这些位置的突变，特别是A2142G、A2142C和A2143G突变与克拉霉素耐受性相关。包含SEQ ID NO：13和14的第二引物对产生170个碱基对的扩增子(23SrRNA170)，其也跨越幽门螺旋杆菌23S rRNA的2142和2143位。包含SEQ ID NO：5和6的另一PCR引物对产生193个碱基对的扩增子(gyrA 193)，其跨越编码由gyrA基因编码的幽门螺旋杆菌螺旋酶的A亚基的氨基酸87至91位的区域。已知Asn87突变为Lys或Tyr的突变和Asp91突变为Gly、Asn或Tyr的突变，单独或一起产生对氟喹诺酮抗生素的耐受性。跨越幽门螺旋杆菌gyrA基因的该区域的第二PCR引物对包含SEQ IDNO：15和16，产生139个碱基对的扩增子(gyrA 139)。跨越相同区域的第三PCR引物对包含SEQ ID NO：17和18，产生137个碱基对的扩增子(gyrA 137)。包含SEQ ID NO：7和8的另一PCR引物对产生159个碱基对的扩增子(pbpA 159)，其涵盖编码幽门螺旋杆菌pbp1基因的氨基酸414位的序列。通常在青霉素结合蛋白1的414位发现的丝氨酸突变为精氨酸将产生对阿莫西林和其他青霉素抗生素的耐受性。另一个PCR引物对，SEQ ID NO：19和20产生一个140个碱基对的扩增子(pbpA 140)，其也包含编码幽门螺旋杆菌青霉素结合蛋白1的414位的序列。另一PCR引物对包含SEQ ID NO：9和10，产生228个碱基对的扩增子，包含编码RNA聚合酶的β/β′亚基的幽门螺旋杆菌rpoB基因的密码子525至545。该区域内任何密码子的突变均可赋予对利福布汀和其他利福霉素类(like)抗生素的耐受性。包含SEQ ID NO：21和22的PCR引物对也产生167个碱基对的扩增子(rpoB-R-167)，并且该扩增子包含rpoB内的关键密码子。

将靶向可能编码药物耐受性突变的特定基因区域的每对PCR引物分隔至单独的PCR引物对池，其中包含一个或多个靶向不同基因的独特引物对。因此，对每个池的PCR扩增产生对每个池内的多个基因具有特异性的扩增子，并最小化PCR扩增伪影(artifact)的机会，例如由重叠的扩增子序列内发生同源配对而引起的引物二聚体或交叉对扩增子截短。如图3所示，池5GF包含PCR引物对16SrRNA 168、23SrRNA 194、gyrAl93、pbpA 159和rpoB228。当用这些引物对扩增源自FFPE的幽门螺旋杆菌靶DNA时，产生了159、168、193、194和228个碱基对的五个独特的扩增子。

扩增子池5GR(图3)包含PCR引物对16SrRNA 162R、23SrRNA 170R、gyrA 139R、gyrA137R、pbpA 140和rpoB-R-167。当使用这些引物对扩增源自FFPE的幽门螺旋杆菌靶DNA时，将产生多达8个扩增子。其中的四个是140、162、167和170个碱基对的独特扩增子(分别对应于pbpA特异性扩增子、16S rRNA特异性扩增子、rpoB特异性扩增子和23S rRNA特异性扩增子)。其余四个扩增子代表池5GR中存在的两对gyrA特异性PCR引物对的置换(permutation)。这些引物对在相同方向上彼此部分重叠，从而可以从两对引物中产生四个可能的扩增子。因为引物的部分重叠仅限于具有相同链定向(方向)的引物，所以没有引物二聚体形成的风险，并且由于引物之间的扩增序列相同(扩增序列的绝对长度除外)所以扩增子之间没有交叉杂交以产生新的序列。因此，两对半独特的引物可以容纳在扩增子池内。在这种情况下，这些引物可以产生131、137、139和145个碱基对的多达四个同源扩增子。这些扩增子的序列从头到尾与其他每个扩增子中的序列相同，除了从较短的扩增子末端缺失少数碱基对，而这些少数碱基对存在于较长的扩增子中。

每个测序的扩增子的比对允许鉴定赋予药物耐受性的突变。图4是在两个独立的源自FFPE的样品(“E”和“K”)中鉴定出的23S rRNA中A2142G突变的一个实例，表明这些样品所来源的幽门螺旋杆菌菌株患者不太可能对克拉霉素治疗产生反应。最上面的序列是已知的克拉霉素耐受性的幽门螺旋杆菌菌株，而紧邻对照下面的两个序列是来自样品“E”的独立PCR扩增子，最后两个序列是来自样品“F”的独立扩增子。

在本发明的另一方面，分隔的PCR引物池允许有效覆盖整个基因。可能是由于编码细菌的对氧不敏感(I型)NAD(P)H硝基还原酶的幽门螺旋杆菌rdxA基因中任何功能丧失的突变，导致对甲硝唑的耐受性。甲硝唑通过该酶的作用被激活，因此，编码该酶的rdxA基因内的任何移码或点突变都可能赋予甲硝唑耐受性。与先前描述的实施方案不同，没有单个短的扩增子可以涵盖幽门螺旋杆菌中遇到的已知对甲硝唑耐受性的突变谱。为了解决这个问题，设计了两个产生重叠扩增子的PCR引物对系列，使得每个系列中的引物产生短的扩增子，它们在一起覆盖了rdxA基因的整个编码区。两个系列之间的引物位于独特的位置，但有些可以位于rdxA基因的编码序列内，相对于另一个系列中的类似引物，在一个方向上仅偏移了几个碱基(以类似于之前段落中描述的扩增子池5GR中部分重叠的gyrA引物的方式)。该策略减少了由于完全阻断扩增子产生而在靶DNA中存在单个交联或加合的机会。可以将由一个系列的PCR引物所产生的扩增子来源的序列与由另一系列的PCR引物所产生的扩增子组装在一起，以确保从整个引物池组中实现完全覆盖rdxA基因。将每个系列的引物置于每个系列的两个扩增子池中的一个中，以使得系列中可能发生重叠并由易于形成引物二聚体的引物而产生的扩增子，被分隔到单独的池中。在幽门螺旋杆菌rdxA基因的情况下，一系列的五个短扩增子共同跨越了整个rdxA编码序列。从5'到3'，这五个扩增子包括rdxA 188扩增子(由PCR引物对SEQ ID NO：23和24产生)、rdxA-5-2-163扩增子(由PCR引物对SEQ IDNO：29和30产生)、rdxA 156扩增子(由PCR引物对SEQ ID NO：25和26产生)、rdxA 182扩增子(由PCR引物对SEQ ID NO：31和32产生)和rdxA177扩增子(由PCR引物对SEQ ID NO：27和28产生)。在该系列中，将产生扩增子rdxA 188、rdxA156和rdxA 177的PCR引物对放入称为rdxA-F1的单个池中，而将产生扩增子rdxA-5-2-163和rdxA 182的PCR引物对组合到称为rdxA-F2的不同池中(图3)。在另一个系列中，使用六个短扩增子跨越整个幽门螺旋杆菌rdxA基因。这些扩增子以5'至3'排列包括rdxA-R-150扩增子(由PCR引物对SEQ ID NO：33和34产生)、rdxA-R-187扩增子(由PCR引物对SEQ ID NO：39和40产生)、rdxA-R-164扩增子(由PCR引物对SEQ ID NO：35和36产生)、rdxA-R0174扩增子(由PCR引物对SEQ ID NO：41和42产生)、rdxA-R-171扩增子(由PCR引物对SEQ ID NO：37和38产生)和rdxA-R-189扩增子(由PCR引物对SEQ ID NO：43和44产生)。在该系列中，将产生扩增子rdxA-R-150、rdxA-R-164和rdxA-R-17l的PCR引物对组合为称为rdxA-R1的一个池，同时将产生扩增子rdxA-R-187、rdxA-R-l74和rdxA-R-189的PCR引物对组合为称为rdxA-R2的不同池(图3)。这些PCR引物池用于从FFPE活检样品中提取的幽门螺旋杆菌DNA产生其同源扩增子。取决于如何对扩增子进行测序，可以将来自每个PCR反应的扩增子进一步组合，使得每个系列由单个扩增子池代表。

如图5所示，适当的分隔池产生正确的(预期的)扩增子，而相同的引物在单个池中存在时会产生一系列包含不正确的扩增子和引物二聚体的PCR产物。如描述的那样处理两个FFPE样品，“FFPE_C”和“FFPE_E”，并用作分析rdxA基因的靶DNA。泳道6(最左边的泳道作为泳道1算起)是双链DNA大小标记物(即用型100bp DNA阶梯，Biotium，Inc.)。大小标记物的两侧分别是样品特异的合并扩增产物。标记为“RDX-A11”的泳道1和7是PCR扩增反应的结果，包含跨越上述整个rdxA基因的扩增子的所有PCR引物。标记为“F1”的泳道(泳道2和8)对应于包含rdxA 188、rdxA156和rdxA 177扩增子引物的rdxA-F1池，两个样品泳道均包含150至200个碱基对的扩增子，如预期的那样。标记为“F2”的泳道(泳道3和9)对应于包含rdxA-5-2-163和rdxA 182扩增子引物的rdxA-F2池，两个样品泳道均包含正确大小的扩增子。需要注意的是，也存在约60个碱基对的次要产物，但是该扩增子不会干扰对正确扩增子的测序，并且可能代表期望扩增子之一之内或之间的内部重组产物。标记为“R1”的泳道(泳道4和10)对应于rdxA-R1池，该池包含rdxA-R-150、rdxA-R-164和rdxA-R-171扩增子引物，并且期望的扩增子在凝胶上聚集，为150至170个左右的碱基对。标记为“R2”的泳道(泳道5和11)对应于rdxA-R2池，包含rdxA-R-187、rdxA-R-174和rdxA-R-189扩增子引物产生的适当大小的扩增子。

图6说明了，基于单个NGS分析，该方法能够确定源自FFPE样品的多个分离物中一种药物和多种药物耐受性的存在和模式。在这种情况下，如实施例1中所述分析的5个独立基因以及如实施例2所述分析的rdxA基因归纳为一份报告，概述源自每个患者的FFPE活检样品中的幽门螺旋杆菌对六种药物中每一种的潜在耐受性谱。

图7还示出了如上所述，基于NGS分析，该方法能够确定在源自FFPE样品的多个分离物中的一种和多种药物耐受性的存在和模式。该表列出了每个样品中发现的基因突变以及每个突变的频率。结果表明，NGS分析可以区分没有任何突变的FFPE样品和有突变的FFPE样品。例如，在24个样品中，有10个(42％)没有突变(第5、6、8、9、13、17和21-24号)。但是，结果还表明，NGS分析可以检测一个FFPE样品中的单个和多个突变。例如，14个样品(58％)具有至少一个基因突变(1-4、7、10-12、14-16和18-20号)。在这14个样品中，11个样品在单个基因中具有突变(第2、4、7、11-12、14-16、18、19和20号)，而3个样品在多个基因中具有突变(第1、3和10号)。

在具有单基因突变的样品中，5个样品仅具有gyrA基因突变(第2、4、15、18和19号)，2个样品仅具有rdxA基因突变(第7和20号)，4个样品仅具有23S rRNA基因突变(第11、12、14和16号)。在仅具有gyrA突变的样品中，其中一个样品的gyrA基因具有两个突变(第19号)。如上所述，gyrA基因突变的存在表明氟喹诺酮抗生素耐受性。在仅具有rdxA基因突变的样品中，其中一个样品在rdxA基因内具有两个突变(第7号)。如上所述，rdxA基因突变的存在表明对甲硝唑的耐受性。

具有多个基因突变的三个样品在23S rRNA和gyrA(第1和3号)以及gyrA和rdxA(第10号)中都具有突变。同时发生的23S rRNA和gyrA突变表明克拉霉素和氟喹诺酮抗生素耐受性；而同时发生的gyrA和rdxA突变则表明氟喹诺酮抗生素耐受性和甲硝唑耐受性。

表2是幽门螺旋杆菌基因和与那些基因中的突变相关的抗生素耐受性的表。

表2

幽门螺旋杆菌基因	相关的抗生素
		23S rRNA	克拉霉素
gyrA	氟喹诺酮
		rdxA/frxA	甲硝唑
pbp1	阿莫西林
		16S rRNA	四环素
rpoB	利福布汀

结果，这些基因中的一个或多个可以用作确定由于扩增的靶向幽门螺旋杆菌DNA的区域的基础。在一个实施方案中，幽门螺旋杆菌DNA的区域可以是选自以下的幽门螺旋杆菌基因：23S rRNA、gyrA、rdxA、frxA、pbp1、16S rRNA和rpoB。在另一个实施方案中，幽门螺旋杆菌DNA的一个或多个扩增区域中的一个或多个突变选自：23S rRNA中的A2143G和A2142G突变；gyrA中的A272G Asp91Gly和G271A Asp91Asn；rdxA中的pGlu194、G352A、pCys87、pR41Rfs；和16A rRNA中的T926C和C927A。

可以使用以下方法测序幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝，包括但不限于高通量筛选、焦磷酸测序、合成测序、单分子测序、纳米孔测序或半导体测序。下一代测序或Sanger测序可用于检测幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中的突变。

扩增和测序幽门螺旋杆菌DNA的一个或多个区域的步骤可包括鉴定适合于产生扩增子的PCR引物对，所述扩增子包含幽门螺旋杆菌DNA的一个或多个区域；将包含一个或多个引物的PCR引物对分隔到单独的PCR引物对池中，所述引物对干扰另一PCR引物对产生扩增子，其中每个单独的PCR引物对池包含多个PCR引物对；从每个单独的PCR引物对池和幽门螺旋杆菌DNA中产生扩增子；和将从每个单独的PCR引物对池和幽门螺旋杆菌DNA中产生的所有扩增子组合到样品扩增子池中，向该样品扩增子池中的扩增子添加独特的索引序列，以产生索引样品扩增子池，任选地进一步将索引样品扩增子池与来自不同样品的一个或多个差异索引样品扩增子池组合，以及同时对所有索引样品扩增子进行测序。在一个实施方案中，通过参照相应的野生型基因序列在来自样品的索引序列扩增子内鉴定突变。

在一个实施方案中，提供了幽门螺旋杆菌DNA的扩增区域的一个或多个参考序列。将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与参考序列进行比较，以鉴定突变的存在。在一个优选的实施方案中，使用下一代测序平台，例如Illumina MiSeq或Thermo Fisher S5，制备幽门螺旋杆菌DNA序列的文库。

可以根据标准方法进行幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与参考序列的比较和其中存在的突变的鉴定。

来自样品的幽门螺旋杆菌DNA的序列可以与参考序列比对。优选地，使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)进行序列比对。序列比对可用于鉴定幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中存在的突变。另外，可以确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目。在一个实施方案中，该数目是百分比，其指示在来自样品的幽门螺旋杆菌DNA中检测到的突变的频率。

当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量时(例如，具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域为测序的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％、大约55％、大约60％、大约65％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更多)，样品中存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌。在一个优选的实施方案中，预定的量为5％；因此，检测到突变的频率必须大于5％，以表明为赋予抗生素耐受性的真正突变。另外，可以使用其他标准来确保突变检测的准确性。在一个实施方案中，来自样品的幽门螺旋杆菌DNA必须具有最小500个读数。

抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌可以对以下一种或多种抗生素具有耐受性：大环内酯、甲硝唑、喹诺酮、利福霉素、阿莫西林和四环素。

本文公开的方法还可用于确定样品中是否在幽门螺旋杆菌的多个菌株中存在多个突变。如上所述，该方法可以包括从样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA，扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝，对幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝进行测序，将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与参考序列进行比较，鉴定幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中存在的突变，和确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目。在一个实施方案中，幽门螺旋杆菌DNA的区域可以包含多个幽门螺旋杆菌基因，并且还可以包含那些基因的多个突变。对于每个扩增的幽门螺旋杆菌基因突变，可以确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目。如果对应于特定幽门螺旋杆菌基因突变的数目为5％或更大，则表明从样品获得的幽门螺旋杆菌DNA中存在突变。如果该数目小于5％，则从样品中获得的幽门螺旋杆菌DNA含有该基因的野生型版本。如果数目为95％或更高，则样品中可能存在一种具有突变的幽门螺旋杆菌菌株。但是，如果在样品中检测到两个或多个幽门螺旋杆菌基因突变，并且对于每个基因，数目在5％至95％之间，则该样品中包含不同的幽门螺旋杆菌菌株的混合物。

本公开提供了用于治疗受试者的幽门螺旋杆菌感染的方法。所述方法可以包括：从所述受试者获得样品，从所述样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA，扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝，对幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝进行测序，将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与一个或多个参考序列进行比较，检测幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中的突变，确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目，其中当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量时，则样品中存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌，和向受试者施用一种或多种幽门螺旋杆菌不具有耐受性的抗生素。

阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA是来自至少10个幽门螺旋杆菌基因组、至少50个幽门螺旋杆菌DNA片段、50至100个幽门螺旋杆菌DNA片段的DNA。

当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域为测序的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％、大约55％、大约60％、大约65％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％或更多时，可以确定突变高于预定的量。

如本文所用，术语疾病、疾患或病症的“治疗”或“治疗”或至少部分地包括：(1)预防疾病、疾患或病症，即，在暴露于疾病、疾患或病症或易患该疾病、疾患或病症，但尚未经历或显示该疾病、疾患或病症的症状的哺乳动物中，不发展该疾病、疾患或病症的临床症状；(2)抑制疾病、疾患或病症，即，阻止或减轻疾病、疾患或病症或其临床症状的发展；或(3)减轻疾病、疾患或病症，即引起疾病、疾患或病症或其临床症状的消退。

在以下实施例中举例说明本公开，其旨在帮助理解本发明，但不应解释为以任何方式限制如所附权利要求书所限定的本公开的范围。

实施例

实施例1：传统疗法治疗幽门螺旋杆菌感染失败

一位65岁的男性受试者表现出胃肠道不适病史。用标准的7天治疗方法治疗他的幽门螺旋杆菌感染，该治疗由20mg b.d.(例如每天两次)剂量的质子泵抑制剂(PPI)、500mgb.d.剂量的克拉霉素和1g b.d.剂量的阿莫西林组成。该受试者继续经历持续的胃肠道不适。因此，受试者进行了内窥镜检查，并使用所公开的方法和材料来收集和分析活检样品，以确定是否存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌。结果表明，受试者的幽门螺旋杆菌感染对克拉霉素和阿莫西林有具有耐受性。结果，使用了治疗感染的替代手段。

实施例2：多重治疗的失败

一位55岁的女性受试者，有胃肠道不适史。用标准的7天治疗方法治疗她的幽门螺旋杆菌感染，该治疗由20mg b.d.(例如每天两次)剂量的质子泵抑制剂(PPI)、500mg b.d.剂量的克拉霉素和1g b.d.剂量的阿莫西林组成。她的症状持续存在，因此接受了二线治疗。治疗后她的症状持续。进行了幽门螺旋杆菌呼气试验，结果表明仍然存在幽门螺旋杆菌。因此，受试者进行了内窥镜检查，并使用所公开的方法和材料来收集和分析活检样品，以确定是否存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌。结果表明，受试者的幽门螺旋杆菌感染对克拉霉素和阿莫西林具有耐受性。结果，使用了治疗感染的替代手段。

实施例3：幽门螺旋杆菌DNA样品的研究

使用含有多种不同抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌菌株的DNA的幽门螺旋杆菌DNA样品进行了研究。图8是使用含有多种抗生素耐受性幽门螺旋杆菌菌株的幽门螺旋杆菌DNA样品进行的各种混合实验产生的报告。分析的幽门螺旋杆菌基因是23S rRNA、gyrA、rdxA和165rRNA。分析各个样品以确定是否存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌，包括样品ID号1002、1025、1645，DG-1014和DG-1008。如图6所示，这些样品的每一个都包含赋予抗生素耐受性的突变，如特定突变所示，并且具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目以百分比表示。例如，样品1002的幽门螺旋杆菌DNA在23S rRNA中具有A214G突变(突变频率超过5％)，在gyrA中具有A272G和Asp91Gly突变，在165rRNA中具有T926C、C927A和T928G突变。样品的rdxA基因不包含与野生型基因版本相比的任何突变。样品1025在rdxA中具有pGlu194和G352A突变。当使用公开的技术合并样品1002和1025并进行分析时，在单个样品中检测到的所有突变，都以指示突变真实存在的数量被检测到。这表明所公开的方法可以用于同时检测幽门螺旋杆菌的多个菌株中的多个突变。

图9是具有混合抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌菌株的Sanger测序的图示。如图9所示，具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于5％，表明该突变存在于来自所示样品的幽门螺旋杆菌DNA中。

分析幽门螺旋杆菌DNA样品中23S rRNA幽门螺旋杆菌基因中存在的突变，并确定检测到该突变是否表明存在混合的幽门螺旋杆菌菌株。图10A是检测23S rRNA幽门螺旋杆菌基因中突变的汇总数据表，其显示突变的检测是否指示混合幽门螺旋杆菌菌株。数据表列出了来自下一代测序的样品的扩增或“读取”数目、具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目、以及具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目是否表明存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌。如图10A所示，如果具有23S rRNA突变中一个突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于5％，但小于95％，则样品中可能存在混合的幽门螺旋杆菌菌株。如果具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目为5％或更少，则23SrRNA基因是该基因的野生型版本(例如，无突变)。但是，如果具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目为95％或更高，则样品中可能存在一种幽门螺旋杆菌菌株，在这种情况下对克拉霉素具有耐受性。

分析了幽门螺旋杆菌DNA样品中23S rRNA和gyrA幽门螺旋杆菌基因中存在的突变，并确定检测到一个或多个突变是否表明存在混合的幽门螺旋杆菌菌株。图10B是在23SrRNA和gyrA幽门螺旋杆菌基因中检测到的突变的汇总数据表，其显示检测的一个或多个突变是否表明混合的幽门螺旋杆菌菌株。数据表列出了来自下一代测序的样品的扩增或“读取”数目、具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目、以及具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目是否表明存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌。图10B显示，如果具有两个突变中的突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目为95％或更大，则样品中存在一个对克拉霉素和氟喹诺酮都具有耐受性的一种幽门螺旋杆菌菌株。然而，如果具有两个突变中的突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目为5％或更大，但小于95％，则样品包含混合的幽门螺旋杆菌菌株。如果具有两个突变中的突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目小于5％，则两个基因均为野生型。

分析幽门螺旋杆菌DNA样品中23S rRNA、gyrA和rdxA幽门螺旋杆菌基因中存在的突变，并确定检测到的一个或多个突变是否表明存在混合的幽门螺旋杆菌菌株。图10C是在23S rRNA、gyrA和rdxA幽门螺旋杆菌基因中检测到的突变的汇总数据表，其显示检测到的一个或多个突变是否表明混合的幽门螺旋杆菌菌株。数据表列出了来自下一代测序的样品的扩增或“读取”数目、具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目、以及具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目是否表明存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌。图8C显示，如果具有所有三个突变中的突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目为95％或更高，则样品中存在一个对克拉霉素、氟喹诺酮和甲硝唑具有耐受性的幽门螺旋杆菌菌株。然而，如果具有两个突变中的突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目为5％或更大，但小于95％，则样品包含混合的幽门螺旋杆菌菌株。如果具有两个突变中的突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目小于5％，则两个基因均为野生型。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分的数量、性质如分子量、反应条件等的数字在任何情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求书中列出的数字参数是近似值，其可以根据本公开寻求获得的期望特性而变化。至少，并且不试图将等同原则的应用限制于权利要求的范围，至少应根据所报告的显著数字的数量并通过采用常规的舍入(rounding)技术，来解释每个数字参数。

尽管阐述本公开的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体的实施例中阐述的数值被尽可能精确地报告。但是，任何数值都固有地包含某些误差，这些误差必定是由它们各自的测试测量中存在的标准偏差所引起。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中使用的术语“一种(a)”、“一种(an)”、“该(the)”和类似指示物(特别是在以下权利要求的上下文中)应解释为涵盖单数和复数两者。本文中值范围的列举仅意图用作分别指代该范围内每个单独值的简写方法。除非本文另外指出，否则每个单独的值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独引用一样。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本公开，并且不对以其他方式要求保护的本公开的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示任何未要求保护的要素对于实施本公开是必不可少的。

本文公开中公开的替代要素或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组的成员可以单独引用并要求保护，也可以与该组的其他成员或本文存在的其他要素组合使用。预期出于方便和/或可专利性的原因，组中一个或多个成员可以包含在组中、或从组中删除。当发生任何这样的包含或删除时，说明书被认为包含经修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

本文描述了本公开的某些实施方案，包括发明人已知的用于执行本公开的最佳模式。当然，在阅读了前面的描述之后，这些描述的实施方案的变型对于本领域普通技术人员将变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本公开。因此，本公开包括适用法律所允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本公开内容涵盖上述要素在其所有可能的变化中的任何组合。

可以使用“由...组成”或“基本上由...组成”的语言在权利要求中进一步限制本文公开的特定实施方案。当在权利要求书中使用时，无论是申请时提出还是按修改提出，过渡词“由...组成”均不包括权利要求书中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡词“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及那些不会实质性影响基本特征和新颖特征的材料或步骤。如此要求保护的本公开的实施方案在本文中被固有地或明确地描述和实施。

应当理解，本文公开的本公开的实施方案是本公开的原理的说明。可以采用的其他修改在本公开的范围内。因此，作为示例而非限制，可以根据本文的教导利用本公开的替代条件。因此，本公开不限于精确地如所示出和描述的那样。

尽管本文已经通过参考各种特定的材料、过程和实施例描述和说明了本公开，但是应当理解，本公开不限于为此目的选择的材料和过程的特定组合。如本领域技术人员将理解的，可以隐含这种细节的多种变化。说明书和实施例旨在仅被认为是示例性的，本公开的真实范围和精神由所附权利要求指示。本申请中引用的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用整体并入本文。

序列表

<110> 美国分子生物学实验室公司

H·张

Y·周

R·卡库图鲁

<120> 从各种人物质和临床样品的单个或混合的幽门螺旋杆菌菌株中检测和预测多种抗生素耐受性的方法

<130> 116110-5003

<150> 62/587,097

<151> 2017-11-16

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 1

taacgcatta agcatcc 17

<210> 2

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ccagacactc cactattt 18

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

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ccgacctgca tgaat 15

<210> 4

<211> 15

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agccaaagcc cttac 15

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tatgcgatgc atgaattag 19

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 41

ctaactttat aagactccgg ataga 25

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 42

tgtgatggtt actgataagg at 22

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 43

ctggcgattt cagcgattt 19

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 44

tggtaattgt ttcgttaggg at 22

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 45

acaacccaga ctaccaaata ag 22

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCR引物

<400> 46

gtgagctgtt acgctttct 19

<210> 47

<211> 500

<212> DNA

<213> 幽门螺旋杆菌

<400> 47

gtaatccgta gagatcaaga ggaatactca ttgcgaggcg acctgctgga acattactga 60

cgctgattgc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccc 120

taaacgatgg atgctagttg ttggagggct tagttttcca gtaatgcagc taacgcatta 180

agcatcccgc ctggggagta cggtcgcaag attaaaatca aaggaataga cggggacccg 240

cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagatacacg aagaacctta cctaggcttg 300

acattgagag aatccgctag aaatagtgga gtgtctggct tgccagacct tgaaaacagg 360

tgctgcacgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 420

caaccccttt tcttagttgc taacaggtta tgctgagaac tctaaggata ctgcctccgt 480

aaggaggagg aaggtgggga 500

<210> 48

<211> 1500

<212> DNA

<213> 幽门螺旋杆菌

<400> 48

caagtgataa taaaaggggg tagagccctg attgggctag ggctgctcgc cgcggtacca 60

aaccctatca aacttcgaat accttttatc gtatcttggg agtcaggcgg tgggtgataa 120

aatcaatcgt caaaagggga acaacccaga ctaccaaata aggtccctaa gttctattct 180

gagtggaaaa agatgtgtgg ctactcaaac aaccaggagg ttggcttaga agcagccatc 240

ctttaaagaa agcgtaacag ctcactggtc tagtggtcat gcgctgaaaa tataacgggg 300

ctaagataga caccgaattt gtagattgtg ttaaacacag tggtagaaga gcgttcatac 360

cagcgttgaa ggtataccgg taaggagtgc tggagcggta tgaagtgagc atgcaggaat 420

gagtaacgat aagatatatg agaattgtat ccgccgtaaa tctaaggttt cctacgcgat 480

ggtcgtcatc gtagggttag tcgggtccta agccgagtcc gaaaggggta ggtgatggca 540

aattggttaa tattccaata ccgactgtgg agcgtgatgg ggggacgcat agggttaagc 600

gagctagctg atggaagcgc tagtctaagg gcgtagattg gagggaaggc aaatccacct 660

ctgtatttga aacccaaaca ggctctttga gtccttttag gacaaaggga gaatcgctga 720

taccgtcgtg ccaagaaaag tctctaagca tatccatagt cgtccgtacc gcaaaccgac 780

acaggtagat gagatgagta ttctaaggcg cgtgaaagaa ctctggttaa ggaactctgc 840

aaactagcac cgtaagttcg cgataaggtg tgccacagcg atgtggtctc agcaaagagt 900

ccctcccgac tgtttaccaa aaacacagca ctttgccaac tcgtaagagg aagtataagg 960

tgtgacgcct gcccggtgct cgaaggttaa gaggatgcgt cagtcgcaag atgaagcgtt 1020

gaattgaagc ccgagtaaac ggcggccgta actataacgg tcctaaggta gcgaaattcc 1080

ttgtcggtta aataccgacc tgcatgaatg gcgtaacgag atgggagctg tctcaaccag 1140

agattcagtg aaattgtagt ggaggtgaaa attcctccta cccgcggcaa gacggaaaga 1200

ccccgtggac ctttactaca acttagcact gctaatggga atatcatgcg caggataggt 1260

gggaggcttt gaagtaaggg ctttggctct tatggagcca tccttgagat accacccttg 1320

atgtttctgt tagctaactg gcctgtgtta tccacaggca ggacaatgct tggtgggtag 1380

tttgactggg gcggtcgcct cctaaaaagt aacggaggct tgcaaaggtt ggctcattgc 1440

ggttggaaat cgcaagttga gtgtaatggc acaagccagc ctgactgtaa gacatacaag 1500

<210> 49

<211> 550

<212> DNA

<213> 幽门螺旋杆菌

<400> 49

atgcaagata attcagtcaa tgaaacaaaa aatattgtag aagtggggat tgattcttct 60

attgaagaga gctatttagc ttattccatg agcgtgatca tagggcgcgc tttaccggac 120

gctagagatg gcttaaagcc cgtgcatagg cgtattttgt atgcgatgca tgaattaggc 180

cttacttcaa aagtcgctta caaaaaaagc gctaggatcg tgggtgatgt gattggtaaa 240

taccaccccc atggcgataa tgcggtttat gatgcgctag tgagaatggc gcaagatttt 300

tccatgcgtt tggaattagt ggatgggcag ggcaactttg gctctattga tggcgataac 360

gccgcagcga tgcgttacac tgaagccaga atgactaagg cgagtgaaga aattttaagg 420

gatattgata aagacaccat tgattttgtg cctaattatg acgatacctt aaaagagcca 480

gatattttac caagccgtct gcctaacctt ttagtcaatg gggctaatgg gatcgctgtg 540

gggatggcga 550

<210> 50

<211> 500

<212> DNA

<213> 幽门螺旋杆菌

<400> 50

aactaacgcg tctaatgaag atgaagacaa cttaaacgct agcatgatcg ttacagacac 60

gagcaccggt aagattttag ctttagtggg ggggattgat tataaaaaaa gcgctttcaa 120

tcgcgccacg caagccaaac ggcagtttgg gagcgcgata aagccttttg tgtatcagat 180

cgcttttgat aatggctatt ccacgacttc taaaatccct gataccgcgc gaaactttga 240

aaatggcaat tatagtaaaa acagtgaaca aaaccacgca tggcacccca gcaattattc 300

tcgcaagttt ttagggcttg taaccttgca agaagccttg agccattcgt taaatctagc 360

cacgatcaat ttaagcgatc agcttggctt tgaaaaaatt tatcaatctt taagcgatat 420

ggggtttaaa aacctcccta aggacttgtc tattgtgtta gggagctttg ctatctcacc 480

cattgatgca gctgaaaagt 500

<210> 51

<211> 600

<212> DNA

<213> 幽门螺旋杆菌

<400> 51

atgaagatat tatcaccacc gttaaatacc tcatgaagat caaaaacaat caaggcaaga 60

ttgatgacag ggaccacttg ggcaatcgta ggattagggc ggtaggggaa ttgttggcca 120

atgaattgca ttcaggttta gtgaaaatgc aaaagaccat taaagacaag ctcactacca 180

tgagcggggc ttttgattcg ctcatgcccc atgacttggt caattctaaa atgatcacaa 240

gcaccatcat ggaatttttc atgggcggtc agctctcgca atttatggat caaacgaatc 300

ccttgagtga ggttacgcac aagcgccgcc tttcagcgct cggcgaaggg gggttggtga 360

aagacagagt ggggtttgaa gccagggatg tgcaccccac gcattatggc cgaatttgtc 420

ccattgagac cccagaaggt caaaatatcg gtctgatcaa caccctttcc actttcacaa 480

gagtgaatga tttaggcttt attgaagccc cttataaaaa ggttgtggat ggcaaggtcg 540

tgggtgagac gatttatttg accgctattc aagaagacag ccacatcatc gctcccgcaa 600

<210> 52

<211> 1032

<212> DNA

<213> 幽门螺旋杆菌

<400> 52

atttgagcat ggggcagatt ttaagcttat ttatggtaat tgtttcgtta gggattttat 60

tgtatgctac aaaaaattct aaaaaaataa aggaaaatca atgaaatttt tggatcaaga 120

aaaaagaaga caattattaa acgagcgcca ttcttgcaag atgtttgata gccattatga 180

gttttctagc acagaattag aagaaatcgc tgaaatcgcc aggctatcgc caagctctta 240

caacacgcag ccatggcatt ttgtgatggt tactgataag gatttaaaaa aacaaattgc 300

agcgcacagc tatttcaatg aagagatgat taaaagcgct tcagcgttaa tggtggtatg 360

ctctttaaga cccagcgagt tgttaccaca cggccactac atgcaaaatc tctatccgga 420

gtcttataaa gttagagtga tcccctcttt tgctcaaatg cttggcgtga gattcaacca 480

cagcatgcaa agattagaaa gctatatttt agagcaatgc tatatcgctg tggggcaaat 540

ttgcatgggc gtgagcttaa tgggattgga tagttgcatt attggaggct ttgatccttt 600

aaaggtgggc gaagttttag aagagcgtat caataagcct aaaatcgcat gcttgatcgc 660

tttgggcaaa gggtggcaga agcgagtcaa aaatcaagaa aatcaaaagt tgatgcgatt 720

acttggttgt gattaaacaa aatcaaaaac tttttaacta taatcaaacc taaattaaag 780

ttcaaggagt ggcattttgt ttaaaagaat ggttttaatc gctcttttag gggtgttttc 840

aagcgtttca ttaagcgcta agagtctttt aagagatgat gggattttag tctctgattt 900

aaagggcatg aaatcagaac tatctgatgc tcctgcttgg gtttttgaag acgctaaagc 960

cccctacgaa gaaatgggcg tggcgtatat ccctgttaat aataaatatt tagggattga 1020

gcaagcgacc tt 1032

Claims

1.一种用于确定样品中是否存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌(H.pylori)的方法，所述方法包括:

a)从样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA；

b)扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝；

c)对幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝进行测序；

d)将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与参考序列进行比较；

e)鉴定幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中存在的突变；和

f)确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目，

其中当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量时，则所述样品中存在抗生素耐受性幽门螺旋杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是排泄物样品。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述排泄物样品通过以下方法获得，所述方法包括：

a)将所述排泄物样品的第一部分暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体；

b)从所述排泄物样品的第一部分中的排泄物材料中分离结合抗幽门螺旋杆菌抗体的幽门螺旋杆菌；

c)从分离自第一排泄物材料的幽门螺旋杆菌中提取幽门螺旋杆菌DNA；

d)将排泄物样品的第二部分暴露于结合幽门螺旋杆菌DNA的DNA探针；

e)从排泄物样品的第二部分中提取幽门螺旋杆菌DNA；和

f)合并从排泄物样品的第一部分获得的幽门螺旋杆菌DNA和从排泄物样品的第二部分获得的幽门螺旋杆菌DNA。

4.根据权利要求1所述的方法，其中通过下一代测序检测幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中的突变。

5.根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供扩增的幽门螺旋杆菌DNA区域的一个或多个参考序列的步骤。

6.根据权利要求1所述的方法，其中扩增和测序幽门螺旋杆菌DNA的一个或多个区域的步骤包括：

a)鉴定适于产生扩增子的PCR引物对，所述扩增子包含幽门螺旋杆菌DNA的一个或多个区域；

b)将包含一个或多个引物的PCR引物对分隔到单独的PCR引物对池中，所述引物对干扰另一PCR引物对产生扩增子，其中每个单独的PCR引物对池包含多个PCR引物对；

c)从每个单独的PCR引物对池和幽门螺旋杆菌DNA中产生扩增子；和

d)将从每个单独的PCR引物对池和幽门螺旋杆菌DNA中产生的所有扩增子组合到样品扩增子池中，向该样品扩增子池中的扩增子添加独特的索引序列，以产生索引样品扩增子池，任选地进一步将所述索引样品扩增子池与来自不同样品的一个或多个差异索引样品扩增子池进行组合，以及同时对所有索引样品扩增子进行测序。

7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括通过参照相应的野生型基因序列从样品中鉴定索引序列扩增子中突变的步骤。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述幽门螺旋杆菌DNA区域是选自以下的一个或多个幽门螺旋杆菌基因：23S rRNA、gyrA、rdxA、frxA、pbp1、16S rRNA和rpoB。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中的突变选自：23S rRNA中的A2143G和A2142G突变；gyrA中的A272G Asp91Gly和G271A Asp91Asn；rdxA中的pGlu194、G352A、pCys87、pR41Rfs；和16A rRNA中的T926C和C927A。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA是来自至少10个幽门螺旋杆菌基因组的DNA。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA是来自至少50个幽门螺旋杆菌DNA片段的DNA。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA是来自50至100个幽门螺旋杆菌DNA片段的DNA。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是牙菌斑、胃液或胃活检。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是福尔马林固定的、或福尔马林固定且石蜡包埋的(FFPE)。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗生素耐受性幽门螺旋杆菌对以下一种或多种具有耐受性：大环内酯、甲硝唑、喹诺酮、利福霉素、阿莫西林和四环素。

16.一种从排泄物样品中获得幽门螺旋杆菌DNA的方法，所述方法包括：

a)将排泄物样品的第一部分暴露于抗幽门螺旋杆菌抗体；

e)从排泄物样品的第二部分中提取幽门螺旋杆菌DNA；和

17.根据权利要求16所述的方法，进一步包括使所述排泄物样品均一化的步骤。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述抗幽门螺旋杆菌抗体是带标记的。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗幽门螺旋杆菌抗体是生物素标记的。

20.一种用于治疗受试者中幽门螺旋杆菌感染的方法，所述方法包括：

a)从所述受试者获得样品；

b)从所述样品中获得阈值水平的幽门螺旋杆菌DNA；

c)扩增幽门螺旋杆菌DNA的区域以产生幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝；

d)对幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝进行测序；

e)将幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的序列与一个或多个参考序列进行比较；

f)检测幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝中的突变；

g)确定具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目，其中当具有突变的幽门螺旋杆菌DNA区域的多个拷贝的数目大于预定的量时，则样品中存在抗生素耐受性的幽门螺旋杆菌；和

h)向受试者施用一种或多种幽门螺旋杆菌不具有耐受性的抗生素。