CN111569881A - 单原子仿生酶的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了单原子仿生酶的制备方法及其产品和应用,具体方法是将六元杂环化合物、生物质氨基酸和含过渡金属源的乙酸盐进行物理复合,然后在惰性气体保护下以变速升温进行热解,进一步在惰性气氛下进行退火反应处理,接着用强酸处理去除金属颗粒和不稳定物质,最后在惰性气氛下加热恢复碳的结晶度,制得的单原子仿生酶修饰于电化学传感器的工作电极上,并应用于细胞释放超氧阴离子的检测,具有优异的选择性、极短的响应时间、较低的检测限,以及极高的反应灵敏度。相较于基于传统材料制备的电化学传感器,基于该单原子仿生酶构建的传感器显示出了更高的性能,在原位实时检测活细胞释放的超氧阴离子自由基方面有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及材料技术领域,具体涉及单原子仿生酶的制备方法,还涉及由单原子仿生酶制备的传感器和传感器的应用。
背景技术
超氧阴离子(O2 .-)是氧分子受单一电子还原的产物,也是细胞在氧代谢过程中最先形成的自由基,其它所有活性氧(ROS)都是从O2 .-衍生而来的。O2 .-的浓度波动与诸多生物学过程和疾病的发生发展密切相关。正常生理状态下,O2 .-在细胞内的浓度会被控制在较低的范围内并保持相对稳定的动态平衡,能协助细胞进行正常的生长和新陈代谢,且具有独特的生理作用。其生理作用主要包括参与抗感染免疫;协助清除褪变、突变和衰老的细胞;参与合成前列腺素、甲状腺素和凝血酶原;参与药物和毒物的解毒等。适度水平下,O2 .-在细胞内的浓度降低或升高,会导致细胞产生一些瞬间变化,包括生殖能力减弱及防御能力降低等。与此同时,细胞也会启动自我修复和调节机制,不会产生不可逆损伤。但是当细胞产生过量O2 .-时,会导致一系列毒副作用,对细胞造成不可逆的氧化损伤并对特定信号通路产生影响,包括引起自由基失活、损伤脱氧核糖核酸(DNA)、造成基因突变、对氨基酸及蛋白质造成损伤、以及其他生物分子的损伤等。这些毒副作用对机体的影响进一步引起生理病变,包括生物体的衰老、神经元退变疾病、心血管疾病、癌症等。因此,对活细胞释放的O2 .-进行定量检测,不仅能更全面了解其在细胞生理活动中的作用,更有助于我们揭示与其相关疾病的发生机制,从而提供在病理学认知下的可靠疾病诊断。
然而,O2 .-的细胞释放浓度很低且活性极高,对其定性定量检测十分困难。在诸多检测方法中,电化学方法表现出响应快、灵敏度高、操作简易、成本低等优点,非常适合在避免对活细胞新陈代谢和相关生理活动造成破坏的前提下,用于对活细胞实时释放O2 .-的浓度检测。因此,设计合成具有高灵敏度、高选择性、低检测限、成本低廉的O2 .-电化学生物传感器成为目前研究的重点和难点之一。传统O2 .-电化学传感器的敏感元件主要依赖于天然生物酶,而生物酶存在极易受到温度、湿度和pH等影响而导致其丧失催化活性的问题,且其成本相对较高。所以,开发基于仿生酶的新型O2 .-电化学传感器更具现实意义。
由于超氧化物歧化酶(SOD)是O2 .-的专一性酶,所以基于SOD构建的O2 .-电化学传感器能表现出优于其他生物酶的抗干扰能力,但其价格昂贵、产量低且易失活,故而关于能够有效替代SOD的仿生酶的研发,已成为多学科交叉的重点研究问题。近年来,科学家发现通过模仿天然酶的结合位点或活性位点,可以实现对基于仿生酶的电化学传感器的构建,尤其是结合了纳米科技的新型特殊纳米结构仿生酶,能够在生理条件下催化酶底物的反应,具有如同天然酶一样的催化效率和酶促反应动力性质。
设计优异的纳米酶是实现O2 .-电化学传感器更高灵敏度和选择性的关键因素。纳米酶电化学传感器检测O2 .-的过程,本质上属于催化其电化学氧化行为的过程。因此,提高纳米酶表面的催化活性位点数目以及提高催化活性位点的催化活性是设计制备该类仿生酶的两个基本原则。但是,纳米材料复杂的结构和原子组成不利于确定生物催化本征活性位点。随着纳米催化的发展和表征技术的进步,科研人员发现表面不饱和配位原子往往是催化的活性位点,所以通过控制纳米晶的尺寸、形貌、晶面来调控催化剂表面原子的分布和结构以提高催化性能。当纳米晶尺寸降低到原子团簇、单原子时,其能级结构和电子结构会发生根本性的变化。现有的一些工作表明单原子催化剂具有原子级分散的活性位点,与天然的金属蛋白酶类似,且其独特的结构特点使得单原子催化剂往往表现出不同于传统纳米结构催化剂的活性、选择性和稳定性。理论上,单原子催化剂既然可以广泛而成功地应用于能量转换和储能中,便也可被应用于电化学传感中,并在此基础上进一步发展出全创新的单原子仿生酶,因为其原子分散的金属活性中心可以实现最大的原子效率以提高传感器的灵敏度,且其独特的单电子性质有助于提高选择性。因此,本发明开发出一种适宜检测活细胞释放O2 .-的单原子仿生酶传感器,并将其应用于细胞检测。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供单原子仿生酶材料的制备方法;本发明的目的之二在于提供所述制备方法制得的单原子仿生酶材料;本发明的目的之三在于提供基于所述的单原子仿生酶材料的电化学传感器;本发明的目的之四在于提供所述电化学传感器的制备方法;本发明的目的之五在于提供所述电化学传感器在检测活细胞释放超氧阴离子自由基中的应用。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
1、单原子仿生酶材料的制备方法,具体步骤如下:将六元杂环化合物、生物质氨基酸和含过渡金属源的乙酸盐进行物理复合,然后在惰性气体保护下以变速升温进行热解,进一步在惰性气氛下进行退火反应处理,接着用强酸处理去除金属颗粒和不稳定物质,最后在惰性气氛下加热恢复碳的结晶度,得到单原子仿生酶材料。
优选的,所述六元杂环化合物为三聚氰胺、吡啶、吡嗪、嘧啶和哒嗪中的一种或多种;所述生物质氨基酸为丝氨酸、半膀氨基酸或丙氨酸中的一种或多种;所述含过渡金属源的乙酸盐为钴、镍、锰、铜或铁源的乙酸盐;所述强酸为盐酸、硫酸和盐酸中的一种或多种。
优选的,所述物理复合为高能球磨方式。
优选的,所述分段梯度升温是25~600℃以2~10℃/min的升温速率,600℃下保持1~5h;600~900℃,以2~10℃/min的升温速率,900℃下保持1-5h。
优选的,所述强酸处理为先用HCl浸提后再用HNO3浸提。
更优选的,所述六元杂环化合物、生物质氨基酸和含过渡金属源的乙酸盐的质量比为50~70:10~20:0.5~2;最优为60:15:1。
2、由所述制备方法制得的单原子仿生酶材料,所述单原子仿生酶材料为过渡金属单原子通过N固定于类石墨烯材料缺陷结构处。
3、基于所述的单原子仿生酶材料的电化学传感器,所述电化学传感器的工作电极表面涂覆有权利要求7所述的单原子仿生酶材料。
4、所述电化学传感器的制备方法,将单原子仿生酶材料以0.5-5mg/mL的配比浓度分散于水中,获得电极修饰溶液,将所述电极修饰溶液涂覆到电极上,干燥后再涂覆粘接剂,再次干燥即可。
5、所述电化学传感器在检测活细胞释放超氧阴离子自由基中的应用。
本发明的有益效果在于:本发明根据需检测的物质或分子,进行单原子种类和分布的优化从而筛选单原子或多种单原子仿生酶的过渡金属活性中心以获得单原子仿生酶。以超氧阴离子为例,提供了一种单原子仿生酶材料及其制备方法和应用;本发明在制备单原子仿生酶材料,通过选定六元杂环化合物、生物质氨基酸和含过渡金属源的乙酸盐,设置合适条件在热解过程生成类石墨烯材料,同时在六元杂环中掺杂N和S,并与过渡金属结合,最终制备得到单原子仿生酶材料,用于构建的电化学传感器不仅具有优异的选择性、很短的响应时间、较低的检测限,还具有极高的反应灵敏度。其中,纳米碳材料的加入可以提高仿生材料的导电性,提升其整体的电子传递性能,选择合适的过渡金属及控制其负载量,可以很好的提升仿生材料的选择性,利用催化剂对碳纳米材料进行改造能够使其更适于负载更大量均匀的金属单原子,从而使仿生材料具有更多的检测活性位点。以该仿生材料制备的传感器相比于传统材料制备的传感器,在实时定量检测超氧阴离子自由基时,显示出了更高的性能,能够在原位实时检测活细胞释放的超氧阴离子自由基方面有重要的应用前景。该材料性能突出、取材方便,利于商业化应用。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述,并且在某种程度上,基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的,或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图进行说明:
图1为实施例1中制备的单原子仿生酶材料的TEM图;
图2为实施例1中制备的单原子仿生酶材料的HAADF-STEM图;
图3为实施例1中制备的单原子仿生酶材料的高分辨率XPS N 1s光谱图;
图4为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的TEM图;
图5为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的XRD图;
图6为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的FESEM图;
图7为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的TEM图;
图8为在电压范围为0.2-1.2V下,实施例1中构建的传感器对O2 ·-的循环伏安响应测试结果图;
图9为实施例1中构建的传感器在不同扫速下的CV曲线图;(其中图9中a为该传感器在不同扫速下的CV曲线图,图9中b为氧化峰值电流和扫描速度的变化呈现出线性关系图)
图10为在循环伏安曲线的峰值电压(0.90V)下,实施例1中构建的传感器对O2 ·-的计时电流响应测试结果图;(图10中a为在0.90V的固定电位下,向电解液中连续添加80nmol/L O2 ·-时,实施例1中构建的工作电极相对于Hg/Hg2Cl2参比电极的i-t响应图,图10中b为实施例1中构建的传感器检测到的稳态电流与O2 ·-浓度之间的线性关系图);
图11为实施例1中构建的传感器对O2 ·-的响应时间图;
图12为实施例1中构建的传感器对不同干扰成分选择性测试结果图;
图13为实施例1中构建的传感器实时检测DU145细胞在酵母多糖(zym)刺激下释放的O2 ·-时的it曲线图(图13中a为DU145细胞的光学显微镜图像;图13中b为在0.90V的固定电位下,该传感器对DU145细胞释放O2 ·-的i-t响应图)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
超氧化物歧化酶仿生酶材料(A-Co-NSG)合成中,具体步骤如下:
(1)不同缺陷结构的纳米碳材料制备:将三聚氰胺(C3H6N6)(12g),1-半胱氨酸(C3H7NO2S)(3g)和乙酸钴四水合物(Co(CH3COO)2·4H2O)(0.2g)研磨成前质体;随后,进行两个阶段的热解和碳化过程(第一阶段:从25至600℃,以3℃/min的升温速率,在600℃下保持2h;第二阶段:600℃到900℃,以2℃/min的升温速率,在氩气氛下的管式炉中在900℃下保持1h);冷却至室温后,将所获类负载单原子金属Co的类石墨烯材料依次在80℃的1mol/LHCl中浸提12h,再在1mol/L HNO3中浸提24h,以去除金属颗粒和不稳定物质;之后,将样品再次在850℃的氩气中加热1h,以恢复碳的结晶度,获得超氧化物歧化酶仿生酶材料(简称为A-Co-NSG仿生酶材料);
涂覆单原子仿生酶材料的工作电极:
将上述制备的A-Co-NSG仿生酶材料以1mg/mL的配比浓度分散于水中,获得电极修饰溶液,将该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上,在26℃下干燥5h后再涂覆Nafion质量分数为0.1%的Nafion溶液,再次在26℃下干燥5h,制得表面涂覆单原子仿生酶材料的工作电极。
构建超氧阴离子自由基电化学传感器:
将制得的表面涂覆单原子仿生酶材料的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(Hg/HgCl2电极)、电解池和电解液(浓度为0.01mol/L,pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液)一起组装成超氧阴离子自由基电化学传感器。
图1为实施例1中制备的单原子仿生酶材料的TEM图,由图1可知,石墨烯缺陷结构合成。
图2为实施例1中制备的单原子仿生酶材料的HAADF-STEM图,由图2可知,Co原子在石墨烯上分散良好。
图3为实施例1中制备的单原子仿生酶材料的高分辨率XPS N 1s光谱图,由图3可知,高分辨率XPS N 1s光谱解卷积为吡啶氮(ca.398.2eV)、Co-N(ca.399.5eV)、吡咯氮(ca.400.5eV)、四价氮(ca.401.3eV)和氧化氮(ca.403.0eV),证明Co原子通过N更好的固定在石墨烯上。
本实施例中三聚氰胺可以用吡啶、吡嗪、嘧啶和哒嗪等六元杂环化合物替换;半膀氨基酸可以用丝氨酸和丙氨酸等生物质氨基酸替换,乙酸钴四水合物可以用钴、镍、锰、铜或铁等过渡金属源的乙酸盐替换;HCl和HNO3浸提可以用盐酸、硫酸和硝酸中的一种或多种;本发明中六元杂环化合物、生物质氨基酸和含过渡金属源的乙酸盐的质量比为50~70:10~20:0.5~2均可实现发明目的。
实施例2
超氧化物歧化酶仿生酶材料,具体步骤如下:
将氧化石墨烯(GO)与三聚氰胺(C3H6N6)和3g/L半胱氨酸(C3H7NO2S)一起研磨成均匀混合物,在1000℃下的氩气氛围中热解2小时;冷却至室温后,通过超声将GO分散在去离子水中,加入乙酸钴四水合物(Co(CH3COO)2·4H2O)混合物在80℃的水浴中搅拌2小时,再冷冻干燥24小时以除去去离子水(DIW)。随后,用500mg C3H6N6将干燥后的产品研磨成均匀的混合物,然后在900℃下在氩气中热解2小时。通过冷却至室温得到仿生酶材料(简称为Co-NSG仿生酶材料);
涂覆Co-NSG仿生酶材料的工作电极:
将制备的Co-NSG仿生酶材料以5mg/mL的配比浓度分散于水中,获得电极修饰溶液,将该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上,在30℃下干燥3h后再涂覆Nafion质量分数为0.1%的Nafion溶液,再次在30℃下干燥3h,制得表面涂覆超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极。
构建超氧阴离子自由基电化学传感器:
将中制得的表面涂覆超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(Hg/HgCl2电极)、电解池和电解液(浓度为0.01mol/L,pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液)一起组装成超氧阴离子自由基电化学传感器。
图4为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的TEM图,由图4可知,Co纳米颗粒均匀分散且密集地生长在NSG表面,测量可知Co纳米颗粒的平均直径在60nm左右。
图5为实施例2中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的XRD图,由图5可知,Co的引入填补了NSG的结构缺陷。
实施例3
超氧化物歧化酶仿生酶材料,具体步骤如下:
将石墨烯分散于去离子水中,然后在持续搅拌下加入磷酸二氢钾,再加入硫酸钴,30℃下搅拌反应3h后以5000r/min的速度离心10min后取沉淀,将沉淀以去离子水洗涤后在80℃下真空干燥12h,制得超氧化物歧化酶仿生酶材料;其中,石墨烯、磷酸二氢钾与硫酸钴的质量比为20:5:10。
涂覆单原子仿生酶材料的工作电极:
将制备的超氧化物歧化酶仿生材料以0.5mg/mL的配比浓度分散于水中,获得电极修饰溶液,将该电极修饰溶液涂覆到玻碳电极上,在20℃下干燥10h后再涂覆Nafion质量分数为0.1%的Nafion溶液,再次在20℃下干燥10h,制得表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极;
构建超氧阴离子自由基电化学传感器:
将制得的表面涂覆有超氧化物歧化酶仿生材料的工作电极与电化学工作站、对电极(铂丝电极)、参比电极(Hg/HgCl2电极)、电解池和电解液(浓度为0.01mol/L,pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液)一起组装成超氧阴离子自由基电化学传感器。
图6为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的FESEM图,由图6可知,片状磷酸钴均匀生长在二维石墨烯上。
图7为实施例3中制备的超氧化物歧化酶仿生材料的TEM图,由图7可知,该片状磷酸钴的尺度为微米级。
实施例4
将含有50μmol·L-1O2 ·-的磷酸缓冲溶液(PBS)加入到实施例1中构建的传感器的电解液中,在电压范围为0.2-1.2V下测试该传感器对O2 ·-的循环伏安响应,同时以该传感器对PBS的循环伏安响应作为空白对照。结果如图8所示,由图8可知,在含有50μmol·L-1O2 ·-的PBS中,氧化峰电流比不含O2 ·-的PBS中的氧化峰电流明显增加,说明该传感器对O2 ·-有明显的电化学催化氧化能力。
实施例5
将含有O2 ·-的PBS加入到实施例1中构建的传感器的电解液中,利用循环伏安法在不同扫速(10mV·s-1、20mV·s-1、50mV·s-1、)下进行扫描,结果如图9所示,其中图9中a为该传感器在不同扫速下的CV曲线图,图9中b为氧化峰值电流与扫描速度的线性关系图,由图9可知,氧化峰电流随扫描速度的增大而增大,且呈线性关系,其线性方程为y=1.48x+32.46(R2=0.999),表明传感器中工作电极上的单原子仿生酶材料对O2 ·-的催化是一种表面控制过程。
实施例6
在循环伏安曲线的峰值电压(0.90V)下测试实施例1中构建的传感器对O2 ·-的计时电流响应,测试时连续向实施例1中构建的传感器的电解液中加入不同浓度的O2 ·-溶液,时间间隔为50s,记录响应时间与电流值的关系曲线,即得该传感器对O2 ·-的安倍响应图,结果如图10所示,其中图10中a为在0.90V的固定电位下,向电解液中连续添加80nmol·L-1O2 ·-时,实施例1中构建的工作电极相对于Hg/Hg2Cl2参比电极的i-t响应图,图10中b为实施例1中构建的传感器检测到的稳态电流与O2 ·-浓度之间的线性关系图。由图10可知,响应电流随着O2 ·-浓度的增加而增长,响应电流与O2 ·-浓度的线性方程可以表示为:I(μA)=0.048C(O2 ·-)(nmol·L-1)-0.489(R2=0.999),灵敏度为685.74μA·(μmol·L-1·cm2)-1,检测限为1nmol·L-1(信噪比S/N=3)。
图11为实施例1中构建的传感器对O2 ·-的响应时间图,由图11可知,在注入O2 ·-后,传感器的响应非常迅速,且在1.2秒内即形成了稳态电流。
实施例7
将不同物质的溶液依次加入到实施例1中构建的传感器的电解液中,测试该传感器对不同干扰成分的计时电流响应,测试电压为0.90V,每隔50s分别依次连续地向传感器中的电解液中加入25nmol·L-1的O2 ·-、3μmol·L-1的KCl、NaNO3、DA、AA和UA,得到该传感器对不同干扰成分选择性测试的安培响应曲线,结果如图12所示,由图12可知,3μmol·L-1的K+、Na+、Cl-、NO3 -、DA、AA和UA均不会对该传感器检测25nmol·L-1的O2 ·-引起干扰,说明该传感器对O2 ·-具有良好的特异性。
实施例8
将实施例1中构建的传感器用于DU145细胞检测,细胞密度为1×105个/mL,具体为在0.90V的固定电位下,通过计时电流法在如下三种情况下实时检测DU145细胞在zym刺激下释放的O2 ·-:(1)向细胞注射0.2mg·mL-1zym;(2)向细胞注射0.2mg·mL-1zym和300U·mL- 1SOD的混合液;(3)向未加入细胞的电解液中加入0.2mg·mL-1zym。结果如图12所示,其中,其中图13中a为DU145细胞的光学显微镜图像,图13中b为在0.90V的固定电位下,该传感器对DU145细胞释放O2 ·-的i-t响应图,由图13可知,当分析电位为0.90V时,加入0.2mg·mL- 1zym促使细胞释放O2 ·-,检测到较大的电流响应(如图13中b中曲线Ⅰ所示),而加入0.2mg·mL-1zym和300U·mL-1SOD的混合液并未引起显著的电流变化(如图13中b中曲线Ⅱ所示),表明细胞释放的O2 ·-已被SOD消耗掉,在相同试验条件下,向不存在DU145细胞的电解液中加入0.2mg·mL-1zym同样检测不到显著的电流变化(如图13中b中曲线Ⅲ所示)。因此,可以证实曲线Ⅰ展示的电流响应是由DU145细胞在zym刺激下释放的O2 ·-被传感器中工作电极上的仿生材料捕获并在其表面发生氧化反应而产生的。进而可根据标准线性方程计算出2.0mg·mL-1zym刺激DU145细胞释放的O2 ·-浓度。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.单原子仿生酶材料的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:将六元杂环化合物、生物质氨基酸和含过渡金属源的乙酸盐进行物理复合,然后在惰性气体保护下以变速升温进行热解,进一步在惰性气氛下进行退火反应处理,接着用强酸处理去除金属颗粒和不稳定物质,最后在惰性气氛下加热恢复碳的结晶度,得到单原子仿生酶材料。
2.根据权利要求1所述单原子仿生酶材料的制备方法,其特征在于:所述六元杂环化合物为三聚氰胺、吡啶、吡嗪、嘧啶或哒嗪中的一种或多种;所述生物质氨基酸为丝氨酸、半膀氨基酸或丙氨酸中的一种或多种;所述含过渡金属源的乙酸盐为钴、镍、锰、铜或铁源的乙酸盐;所述强酸为盐酸、硫酸或盐酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述单原子仿生酶材料的制备方法,其特征在于:所述物理复合为高能球磨方式。
4.根据权利要求1所述单原子仿生酶材料的制备方法,其特征在于:所述分段梯度升温是25~600℃以2~10℃/min的升温速率,600℃下保持1~5h;600~900℃,以2~10℃/min的升温速率,900℃下保持1-5h。
5.根据权利要求1所述单原子仿生酶材料的制备方法,其特征在于:所述强酸处理为先用HCl浸提后再用HNO3浸提。
6.根据权利要求1所述单原子仿生酶材料的制备方法,其特征在于:所述六元杂环化合物、生物质氨基酸和含过渡金属源的乙酸盐的质量比为50~70:10~20:0.5~2。
7.由权利要求1~6任一项所述制备方法制得的单原子仿生酶材料,其特征在于:所述单原子仿生酶材料为过渡金属单原子通过N固定于类石墨烯材料缺陷结构处。
8.基于权利要求7所述的单原子仿生酶材料的电化学传感器,其特征在于:所述电化学传感器的工作电极表面涂覆有权利要求7所述的单原子仿生酶材料。
9.权利要求8所述电化学传感器的制备方法,其特征在于:将单原子仿生酶材料以0.5-5mg/mL的配比浓度分散于水中,获得电极修饰溶液,将所述电极修饰溶液涂覆到电极上,干燥后再涂覆粘接剂,再次干燥即可。
10.权利要求8所述电化学传感器在检测活细胞释放超氧阴离子自由基中的应用。
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