CN111568929A - 一种msc用于调节效应cd8+t细胞数量的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明具体公开了一种MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，尤其是MSC用于调节病毒性感染患者效应CD8+T细胞数量的应用，涉及生物医药工程技术领域。本发明通过将所制备的MSC制剂加入到MSC治疗组中对病毒性感染患者进行联合治疗，有效提高了MSC治疗组愈后患者的效应CD8+T细胞数量，由于愈后患者在愈后回复阶段仍然会存在一定程度的炎症，效应CD8+T细胞数量的增多使患者有更强的细胞毒性，从而参与愈后恢复阶段的炎性反应，因此通过MSC治疗组治疗的愈后患者具有更强的恢复能力。

Description

一种MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及一种MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用。
背景技术
T细胞表面有许多重要的分子，他们参与T细胞识别抗原，活化、增殖、分化，以及效应功能的发挥。成熟T细胞只表达CD4或CD8，即CD+T细胞或CD8+T细胞。CD4和CD8的主要功能是辅助TCR识别抗原和参与T细胞活化信号的转导。表达CD8的T细胞(CD8+T细胞)通常在活化后分化为细胞毒性T细胞(CTL)，能够特异性地杀伤靶细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。
病毒性感染是指能在人体寄生繁殖，并能致病的病毒引起的传染病。主要表现有发热、头痛、全身不适等全身中毒症状及病毒寄主和侵袭组织器官导致炎症损伤而引起的局部症状。人体的病毒性感染分为隐性感染、显性感染、慢病毒感染。多数情况下的感染呈隐性感染(指人体感染病毒后，不出现症状，但可产生特异性抗体)。少数为显性感染(指人体感染病毒后，出现症状)。显性感染中多数病毒性感染表现为急性感染，发病急、病程短，少数表现为潜伏性感染(如疱疹病毒感染等)和慢性感染(如乙型肝炎病毒感染等)。目前病毒感染疾病缺乏特异性治疗，以支持和对症治疗为主，抗病毒药物和激素治疗均无法起到有效治疗。且病毒感染(如流感、SARS、MERS和埃博拉)在人类中快速传播，对人类健康造成了巨大的威胁。尤其是2020年在全世界大爆发的新型冠状病毒，对人类健康、经济造成了严重的损失。
COVID-19的病原已被证实是一种新型冠状病毒，现称为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。目前，针对该病毒的特效药及疫苗均未研发成功，SARS-CoV-2的出现给临床医生带来了一个艰难的治疗困境。大多数感染患者表现出非特异性症状，如发热、干咳和疲劳。多数患者预后良好，部分病情严重者可迅速发展为急性呼吸窘迫综合征、感染性休克、代谢性酸中毒、凝血功能障碍，甚至死亡。病人病情的恶化可能是由于体内的细胞因子风暴，鉴于SARS-CoV-2是一种引起全球大流行病的新型毒株迫切需要有效的靶向治疗，包括抗病毒和免疫疗法。目前，尽管许多临床试验已经开始，但是目前还没有还没有有效的抗病毒或免疫调节疗法来治疗SARS-CoV-2。
临床研究已经发现了MSC成为治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)免疫异常、乙型肝炎病毒(HBV)慢性肝炎、流感病毒急性肺损伤(ALI)等病毒相关疾病的有效工具。间充质干细胞(Mesenchyma stem cell,MSC)是指一群具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的，具有多种分化潜能的多能干细胞。它们来源于胚胎发育早早期的中胚层和外胚层的未成熟的胚胎结缔组织，在体内外特定的诱导条件下可以分化成脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮甚至血液等多种组织细胞。临床研究已经发现了MSC成为治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)免疫异常、乙型肝炎病毒(HBV)慢性肝炎、流感病毒急性肺损伤(ALI)等病毒相关疾病的有效工具。MSC具有低免疫原性以及显著和广泛的免疫调节功能。MSC不表达CD40、CD80和CD86等共刺激分子以及MHC-II类分子。MSC对T细胞的抑制作用不受MHC的限制，即对自体和异体的T细胞的作用相似。抗病毒反应对于根除病毒和防止病毒相关疾病的发展至关重要。如果允许抗病毒特异性T细胞在MSC存在的情况下发挥作用，它们就有能力保持宿主防御感染的完整性。有研究发现与MSC共同培养的EB病毒特异性细胞毒性T细胞(CTL)或巨细胞病毒CTL在体外保持了增殖和产生干扰素-的能力，并对病毒感染的细胞具有杀伤作用。MSC来源的干扰素-被认为通过介导病毒感染过程中的部分细胞毒性反应来抵消MSC的免疫抑制效应。因此，在将MSC作为再生医学使用时，认识到MSC对免疫系统抗病毒感染的双重作用是非常重要的。
鉴于此，本发明提供了一种MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，特别是MSC应用于调节病毒性感染患者效应CD8+T细胞数量的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，尤其是一种MSC用于调节病毒性感染患者效应CD8+T细胞数量的应用，通过MSC治疗组联合治疗有效提高了愈后患者效应CD8+T细胞的数量。
一种MSC用于调节病毒性感染患者效应CD8+T细胞数量的应用具体步骤包括：
S1、制备MSC制剂；
S2、筛选病毒性感染患者并将所筛选的病毒性感染患者纳入MSC治疗组中进行联合治疗；
S3、对愈后患者的外周血单个核细胞样本进行采样分析，从而获取愈后患者的效应CD8+T细胞数量。
优选地，所述MSC制剂的制备方法包括：
S11、采集脐带并置于培养皿中，然后通过生理盐水对脐带组织进行清洗；
S12、将清洗完毕的脐带组织剪成小组织块并种植于培养皿中培养；
S13、去除培养皿中的培养液，然后通过生理盐水清洗后加入胰酶进行消化，直至培养皿中细胞消化完成后加入终止液终止消化，将细胞悬液转移至离心管中离心并弃上层清液，再用适量培养液重悬细胞并计数，最后根据计数结果将细胞悬液种植于新培养皿进行培养；
S14、去除步骤S13中新培养皿中的培养液，然后通过生理盐水清洗后加入胰酶并进行消化，直至培养皿中细胞消化完成后加入终止液终止消化，再用细胞筛过滤并将过滤后的细胞悬液转移至离心管中计数离心弃上层清液，再配置细胞制剂悬液并加入细胞制剂悬液重悬细胞，最后将细胞悬液转移至转移袋中并放入低温环境中待取，从而完成MSC制剂的制备；
S15、对步骤S14中制备的MSC制剂进行合格检测。
优选地，所述MSC治疗组中的联合治疗是指：将步骤S1中所制备的MSC制剂纳入MSC治疗组中对病毒性感染患者进行联合用药。
优选地，所述联合治疗中的联合用药是指：在原有治疗方案中加入MSC制剂作为唯一干扰因素，同时在联合治疗过程中对联合用药情况进行跟踪记录。
优选地，所述愈后患者包括MSC治疗组治愈的病毒性感染患者和未经MSC治疗组治愈的病毒性感染患者。
优选地，所述步骤S3是通过单细胞转录组测序对外周血单个核细胞样本进行分析，进而获取愈后患者的效应CD8+T细胞数量。
与现有技术比较，本发明通过制备MSC制剂并将所制备的MSC制剂应用到MSC治疗组中对病毒性感染患者进行联合治疗，与未经MSC治疗组的愈后患者相比较，MSC治疗组的愈后患者的效应CD8+T细胞数量增长更多，而病毒性感染患者在愈后阶段仍然会存在一定程度的炎症，由于效应CD8+T细胞能够参与到愈后患者愈后恢复阶段的炎性反应，因此通过MSC治疗组的愈后患者具有更强的抗病毒能力和抗炎症能力。
附图说明
图1是本发明中一种MSC用于调节病毒性感染患者效应CD8+T细胞数量的应用流程图，
图2是本发明中MSC制剂的制备方法流程图，
图3是本发明中MSC治疗组愈后患者、未经MSC治疗组愈后患者和健康组人员中各组效应CD8+T细胞数量在对应总细胞数中的比例示意图，
图4是本发明中各组效应CD8+T细胞数量占比相对于健康组的变化倍数，其中，健康组人员的效应CD8+T细胞数量占比设为1。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
需要说明的是，本发明中所述原有治疗方案指的是国家卫生健康委员会办公厅和国家中医药管理局办公室印发的新型冠状病毒肺炎诊疗方案中所采取的治疗方案，MSC+表示MSC治疗组，MSC-表示未经MSC治疗组，Health表示健康组。
如图1所示，为了研究MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，本发明提供一种MSC用于调节病毒性感染患者效应CD8+T细胞数量的应用，其具体步骤包括：
S1、制备MSC制剂；
S2、筛选病毒性感染患者并将所筛选的病毒性感染患者纳入MSC治疗组中进行联合治疗；
S3、对愈后患者的外周血单个核细胞样本进行采样分析，从而获取愈后患者的效应CD8+T细胞数量。
如图2所示，其中所述MSC制剂的制备方法包括：
S11、采集脐带并置于培养皿中，然后通过生理盐水对脐带组织进行清洗；
S12、将清洗完毕的脐带组织剪成小组织块并种植于培养皿中培养；
S13、去除培养皿中的培养液，然后通过生理盐水清洗后加入胰酶进行消化，直至培养皿中细胞消化完成后加入终止液终止消化，将细胞悬液转移至离心管中离心并弃上层清液，再用适量培养液重悬细胞并计数，最后根据计数结果将细胞悬液种植于新培养皿进行培养；
S14、去除步骤S13中新培养皿中的培养液，然后通过生理盐水清洗后加入胰酶进行消化，直至培养皿中细胞消化完成后加入终止液终止消化，再用细胞筛过滤并将过滤后的细胞悬液转移至离心管中计数离心弃上层清液，再配置细胞制剂悬液并加入细胞制剂悬液重悬细胞，最后将细胞悬液转移至转移袋中并放入低温环境中待取，从而完成MSC制剂的制备；
S15、对步骤S14中制备的MSC制剂进行合格检测。
本实施例中，所述MSC制剂采用人脐带间充质干细胞(Human umbilical cordmesenchymal stem cells，hUC-MSC)制备而成，其制备过程均在消毒后的超净台中进行，且制备过程中所需器具和耗材等均需要75％酒精进行消毒，在制备过程中还需要对培养皿中的采集物或细胞以及操作具体过程进行详细标注；同时，在步骤S13和步骤S14之间还可以对干细胞进行冻存，若需要进行步骤S14干细胞制剂制备之前需要对冻存的干细胞进行复苏，其中干细胞冻存和复苏操作均属于现有技术，此处不再一一赘述。
本实施例中，对所述MSC制剂进行合格检测还包括采集物质量检测、脐带间充质干细胞初级细胞库入库检测和脐带间充质干细胞主细胞库入库检测，合格检测的步骤与标准均与现有通行检测一致，此处不再一一赘述。
其中，所述MSC治疗组中的联合治疗是指：将步骤S1中所制备的MSC制剂纳入MSC治疗组中并作为原有治疗方案中的唯一干扰因素以对病毒性感染患者进行联合用药，同时在联合治疗方案中对联合用药情况进行跟踪记录。本实施例中，所述MSC制剂中脐带间充质干细胞浓度为0.1×105-5×108细胞数/ml，在整个MSC治疗组过程中MSC制剂均采用外周静脉输注的方式并多次使用。其中使用次数可根据实际情况控制在1-10次之间。
本实施例中，我们将所选择的普通型新冠阳性患者(即SARS-CoV-2病毒性感染患者)平均分成两组并作为MSC治疗组样本和未经MSC治疗组(即原有治疗方案)样本，待两组样本中的病毒性感染患者均治愈后再对愈后患者的外周血单个核细胞进行采样，为了更好的说明本发明的工作原理和技术效果，我们同时选择对相应数量健康组人员的外周血单个核细胞进行采样，然后通过单细胞测序分别对所采集的外周血单个核细胞样本进行分组分析并对其分析结果进行处理，得到两组样本中MSC治疗组愈后患者、未经MSC治疗组愈后患者和健康组人员之间的效应CD8+T细胞数量关系(见表1)。在其他实施例中，也可以选择其他病毒性感染患者作为MSC治疗组和未经MSC治疗组的样本。
表1健康组人员、MSC治疗组愈后患者和未经MSC治疗组愈后患者之间的效应CD8+T细胞数量关系表
Figure BDA0002505413630000061
同时，根据单细胞测序分析后的处理结果数据绘制出两组样本中愈后患者以及健康组人员之间的效应CD8+T细胞数量关系图(见图3和图4，其中，①表示Health，②表示MSC+，③表示MSC-)，图3中横坐标表示效应CD8+T细胞，纵坐标表示各组效应CD8+T细胞在对应总细胞数中的比例，图4中横坐标表示效应CD8+T细胞，纵坐标表示各组效应CD8+T细胞数量占比相对于健康组的变化倍数。
从表1、图3和图4可以得知，MSC治疗组愈后患者的效应CD8+T细胞数量占总细胞数比例的14.09％，未经MSC治疗组愈后患者的效应CD8+T细胞数量占总细胞数比例的9.76％，健康组人员的效应CD8+T细胞数量占总细胞数比例的6.67％，而MSC治疗组愈后患者的效应CD8+T细胞数量是未经MSC治疗组愈后患者的1.443倍，而MSC治疗组愈后患者中的效应CD8+T细胞数量是健康组人群的2.112倍，由于效应CD8+T细胞能够参与杀伤靶细胞的过程，因此，通过MSC治疗组治愈后的病毒性感染患者效应CD8+T细胞数量增加得更多就意味着经过MSC治疗组治愈后的患者具有更强的病毒感染免疫能力和更强的病毒杀伤能力。
以上对本发明所提供的一种MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用。
2.如权利要求1所述的MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，其特征在于，所述MSC用于调节病毒性感染患者效应CD8+T细胞数量的应用。
3.如权利要求2所述的MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，其特征在于，所述MSC用于调节病毒性感染患者效应CD8+T细胞数量的应用具体步骤包括：
S1、制备MSC制剂；
S2、筛选病毒性感染患者并将所筛选的病毒性感染患者纳入MSC治疗组中进行联合治疗；
S3、对愈后患者的外周血单个核细胞样本进行采样分析，从而获取愈后患者的效应CD8+T细胞数量。
4.如权利要求3所述的MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，其特征在于，所述MSC制剂的制备方法包括：
S11、采集脐带并置于培养皿中，然后通过生理盐水对脐带组织进行清洗；
S12、将清洗完毕的脐带组织剪成小组织块并种植于培养皿中培养；
S13、去除培养皿中的培养液，然后通过生理盐水清洗后加入胰酶进行消化，直至培养皿中细胞消化完成后加入终止液终止消化，将细胞悬液转移至离心管中离心并弃上层清液，再用适量培养液重悬细胞并计数，最后根据计数结果将细胞悬液种植于新培养皿进行培养；
S14、去除步骤S13中新培养皿中的培养液，然后通过生理盐水清洗后加入胰酶进行消化，直至培养皿中细胞消化完成后加入终止液终止消化，再用细胞筛过滤并将过滤后的细胞悬液转移至离心管中计数离心弃上层清液，再配置细胞制剂悬液并加入细胞制剂悬液重悬细胞，最后将细胞悬液转移至转移袋中并放入低温环境中待取，从而完成MSC制剂的制备；
S15、对步骤S14中制备的MSC制剂进行合格检测。
5.如权利要求4所述的MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，其特征在于，所述MSC治疗组中的联合治疗是指：将步骤S1中所制备的MSC制剂纳入MSC治疗组中对病毒性感染患者进行联合用药。
6.如权利要求5所述的MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，其特征在于，所述联合治疗中的联合用药是指：在原有治疗方案中加入MSC制剂作为唯一干扰因素，同时在联合治疗过程中对联合用药情况进行跟踪记录。
7.如权利要求6所述的MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，其特征在于，所述愈后患者包括MSC治疗组治愈的病毒性感染患者和未经MSC治疗组治愈的病毒性感染患者。
8.如权利要求7所述的MSC用于调节效应CD8+T细胞数量的应用，其特征在于，所述步骤S3是通过单细胞测序对外周血单个核细胞样本进行分析，进而获取愈后患者的效应CD8+T细胞数量。
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