CN111560440B - 一种同时预示肉鸡腹脂性状、腿部骨骼性状和繁殖性能的分子标记方法及应用 - Google Patents

一种同时预示肉鸡腹脂性状、腿部骨骼性状和繁殖性能的分子标记方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种同时预示肉鸡腹脂性状、腿部骨骼性状和繁殖性能的分子标记方法及应用，属于动物分子遗传学技术领域。为了更准确方便地鉴定低脂肉鸡，加速肉鸡的育种过程，本发明根据鸡SREBP1基因外显子3的SNP位点g.3656C>T上游208bp和下游72bp序列设计引物，获得扩增引物，再根据所得引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，之后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，获得鸡标记基因型。本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测，是一种有效的分子标记育种手段，采用该方法可以加快鸡的育种进程，培育适合市场需求的腿部骨骼健康、繁殖性能好的低脂肉鸡，从而获得较好的经济效益。

Description

一种同时预示肉鸡腹脂性状、腿部骨骼性状和繁殖性能的分 子标记方法及应用
技术领域
本发明属于动物分子遗传学技术领域，具体涉及一种同时预示肉鸡腹脂性状、腿部骨骼性状和繁殖性能的分子标记方法及应用。
背景技术
经过长期的选育，肉鸡的生长速度和产肉量得以明显提高，然而肉鸡育种却面临着新的挑战。伴随着快速生长，肉鸡生理性不适症及相关疾病明显增加，如体脂蓄积过多、繁殖性能下降、腿部疾病发生等，这些问题给肉鸡生产者造成了巨大的经济损失。
肉仔鸡体内沉积过多的脂肪(尤其是腹脂)有诸多不利：(1)明显降低饲料转化效率，因为沉积单位重量的脂肪比沉积单位重量的瘦肉多消耗三倍的能量；(2)降低了胴体瘦肉对脂肪组织的比例，因而降低了分割肉产量；(3)加工者和消费者将肉仔鸡体内沉积的这些脂肪的很大一部分(腹脂垫、肌胃周围脂肪、嗉囔脂肪及肠系膜脂肪等)丢弃，这不仅增加了加工者和消费者的负担，而且增加了废物及处理水中的脂肪含量，从而污染了环境。
肉鸡快速生长所造成的种鸡过肥会严重影响产蛋率、受精率和孵化率等繁殖性能，并且会诱导脂肪肝综合症(FLHS)的发生，从而加大了产蛋期的死淘率。睾丸是雄性动物重要的生殖器官，具有产生精子和分泌雄激素的功能。种公鸡睾丸大小和重量与精子、精液的数量和质量有直接联系，对鸡群受精率的高低和维持很重要，而且繁殖后期种公鸡的繁殖机能逐渐减退，精液品质大幅下降，从而缩短种公鸡的使用寿命。
随着肉用仔鸡生产性能的快速提高，腿部疾病的严重程度也在增加。在正常情况下，肉鸡骨骼的生长速度与整个机体的生长速度保持一致，处于平衡状态。肉用仔鸡的早期生长速度大幅度提高，使得腿部骨骼越来越难以支撑不断增加的体重，打破了体组织生长发育的原有平衡性，使得胫骨软骨发育异常等一些遗传性腿病常有发生。
考虑到体脂蓄积过多、繁殖性能下降、腿部疾病发生给肉鸡产业带来了巨大的经济损失，因此，控制脂肪在鸡体内的过多蓄积、改善种鸡繁殖性能和减少腿部疾病的发生是亟待研究解决的重大问题。体脂性状是屠宰性状，繁殖性能和腿部疾病是低遗传力性状，传统的选择方法效果有限。标记辅助选择(MAS)是选择这类性状的有效方法。通过鉴定显著影响目标性状的分子标记，选留携带有利标记基因型的个体作为种用，就可改善后代的目标性状。
动物体内脂肪的形成包括脂肪细胞数目增加和体积增大两个方面,而脂肪组织中脂肪细胞过度增殖和分化则会造成过多的脂肪细胞生成，从而引发机体脂肪的过度蓄积，因此研究脂肪细胞分化对防止体内脂肪过度沉积具有特别重要的意义。脂肪细胞分化是一个由众多转录因子共同调控的过程，固醇调节元件结合蛋白家族(sterol regulatoryelement binding proteins, SREBPs)在此过程中发挥重要作用。SREBPs的靶基因众多,它们主要参与胆固醇合成、低密度脂蛋白(LDL)摄取、甘油三酯和磷脂的合成、脂肪酸合成和去饱和等重要生理过程。 SREBP1是SREBP家族中极为重要的一员。哺乳动物的研究结果表明，SREBP1是脂肪细胞分化过程中重要的核转录因子,它能与PPARs和C/EBPs共同控制脂肪细胞的分化，同时参与低密度脂蛋白(LDL)受体、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、葡萄糖激酶(GK)、磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)等与脂肪合成和葡萄糖代谢相关基因的表达调控。此外，SREBP1还参与了激素对脂肪代谢的调节过程。由此可见，SREBP1在脂肪合成及代谢的过程中发挥着不可替代的重要作用。
目前为止，应用分子标记进行预示和选择几乎都是针对一种性状，尚未发现应用一种标记同时对多个性状进行预示和选择的报道。
发明内容
为了更准确方便地鉴定低脂肉鸡，加速肉鸡的育种过程，本发明提供了一种同时预示肉鸡腹脂性状、腿部骨骼性状和繁殖性能的分子标记方法，步骤如下：
1)根据鸡SREBP1基因SNP位点g.3656C>T上游208bp和下游72bp序列设计引物，获得扩增引物；
2)利用步骤1)所得的扩增引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，获得扩增产物；
3)利用限制性内切酶对步骤2)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；
4)对步骤3)所得的酶切产物进行电泳分离，获得分离产物；
5)对步骤4)所得的分离产物进行基因型分析，获得鸡标记基因型。
进一步地限定，所述腹脂性状包括鸡的腹脂重和腹脂率；所述腿部骨骼性状包括鸡的跖骨长、跖爪重和跖爪比率；所述繁殖性能包括睾丸重和睾丸比率。
进一步地限定，步骤1)所述扩增引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示。
进一步地限定，步骤3)所述限制性内切酶，是限制性内切酶NSbⅠ。
进一步地限定，步骤4)所述电泳分离采用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶分离。
进一步地限定，步骤5)所述基因型分析通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应方法，对扩增结果进行分析。
进一步地限定，步骤5)所述鸡标记基因型，当鸡SREBP1基因SNP位点g.3656C>T为C碱基时，酶切产物大小为208bp，将其命名为CC基因型；当鸡SREBP1基因SNP位点 g.3656C>T为T碱基时，酶切产物大小为280bp，将其命名为TT基因型；当酶切产物电泳条带为两条，大小分别为208bp和280bp，将其命名为CT基因型。
本发明还提供了上述分子标记方法获得的鸡标记基因型在鸡遗传育种中的应用。
有益效果
本发明证明g.3656C>T突变位点的等位基因频率分布在高低脂双向选择品系两系间存在极显著差异(P<0.01)，该方法操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测，高效准确的鉴定低腹脂、腿部骨骼结实和睾丸大的肉鸡。利用本发明的分子标记方法可实现用同一种标记同时对鸡腹部脂肪含量、腿部跖骨长度和重量以及睾丸大小进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的腹部脂肪性状、腿部骨骼结实和繁殖性能的改良提供了一种有效的分子标记育种手段，能够更好的实现多性状平衡育种，培育适合市场需求的腿部骨骼健康、繁殖性能好的低脂肉鸡，从而获得较好的经济效益，加速肉鸡的育种进程。
附图说明
图1为SREBP1基因SNP位点g.3656C>T分析图谱，其中CC、CT、TT代表三种不同基因型。
具体实施方式
本发明所涉及的试剂、仪器设备、实验等描述如下：
1.实验动物和性状测定。
东北农业大学肉鸡高、低腹脂双向选择品系第8世代387只公鸡，第9世代383只公鸡，第10世代626只公鸡。在7周龄时进行翅静脉采血，EDTA-Na2抗凝。7周龄屠宰前测定活重，屠宰后测定腹脂重、睾丸重、跖爪重、跖骨长，重量性状除以7周龄活重计算相应比率。
2.药品和酶。
DNA Marker、dNTP、EasyTaq Buffer、Easy Taq购自全式金公司；限制性内切酶NSbⅠ购自NEB公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma Chemicals Co；Tris饱和酚，北京鼎国生物技术发展中心；蛋白酶K(Proteinase K)，MMERCK Co；琼脂糖(Agarose)，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，原平皓公司。
3.主要仪器设备。
PCR仪，微量移液器，均购自德国Eppendorf公司；电子秤ACS-30，购自上海华德公司； -20℃/4℃冰箱，购自青岛海尔公司；-80℃冰箱，购自美国Froma公司；电子恒温水浴锅，购自上海一恒科技有限公司；电泳仪、电泳槽，北京市六一仪器厂；电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；垂直板电泳槽，北京东方特力有限公司；凝胶成像系统，美国UVP公司；超纯水仪，美国Milli-Q公司；紫外分光光度计，美国Phamacia公司；高压蒸汽灭菌锅，购自日本SANYO公司；超净台，购自苏州净化设备有限公司。
4.缓冲液与常用试剂的配制。
0.5M EDTA(pH 8.0)：称取186.1g乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)置于烧杯中，加入800mL去离子水，逐滴加入氢氧化钠溶液(NaOH)调节溶液PH值至8.0，将溶液移入容量瓶定容至终体积1L，120℃高压蒸汽灭菌15min后保存。
5×TBE缓冲液：称取242g Tris碱量取57.1mL冰乙酸和100mL 0.5mol EDTA加水定容至终体积为1L，室温保存。
200ml银染液：NH3·H2O 2ml，3.6％NaOH 4.2ml，20％AgNO3 3.6ml，加去离子水至200ml。
200ml显色液：1％柠檬酸钠1ml，甲醛100μl，加去离子水至200ml。
其他试剂或制备方法如无特殊说明，均可通过商业化途径获得，或通过常规生物学实验记载进行。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1.同时预示肉鸡腹脂性状、腿部骨骼性状和繁殖性能的分子标记方法。
1.引物的设计与合成。
根据鸡SREBP1基因第3个外显子的SNP位点g.3656C>T上游208bp和下游72bp序列设计引物，由金唯智生物技术有限公司合成，引物序列如下：
SREBP1-F:5’-CGGCGTAATGCTGACC-3’
SREBP1-R:5’-GTGCCACACTCTGCCC-3’
2.利用步骤1所得的扩增引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，获得扩增产物。
DNA的提取、产物扩增：
1)鸡DNA的提取，鸡DNA的小样提取可采用以下两种方法：
方法一：(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为 100-200μg/ml，混匀55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的团块。
(2)将溶液冷却至室温，加入5M NaCl至终浓度1.5M，混匀10min。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混匀10min。
(3)12,000rpm，室温离心10min。取上清，加等体积氯仿混匀10min。
(4)12,000rpm，室温离心10min。取上清2倍体积无水乙醇沉淀DNA。
(5)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。
(6)7,500rpm，室温离心5min，弃上清。
(7)将DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μlTE中。
方法二：(1)将20μl全血加入装有700μl 1×SET的1.5ml离心管中，轻轻混匀。
(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100-200μg/μl和10％的SDS至终浓度0.5％，55℃消化12h。
(3)待消化完全后，加入等体积的Tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀
(4)12,000rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。
(5)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为24：23：1)，混合10min。 12,000rpm.，离心10min，移出水相到另一个离心管。
(6)向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(23：1)，来回颠倒混合10min，12,000rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。
(7)向水相中加入1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，来回颠倒，沉淀DNA。
(8)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。
(9)7,500rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。
(10)加入200μl的TE，置50℃水浴中过夜溶解DNA。溶解后贮存于-20℃备用。
2)鸡DNA的扩增：
PCR扩增反应体系：
以上述提取获得的鸡DNA为模板进行PCR扩增，反应体系中包含以下溶液或试剂：
Figure BDA0002510966920000051
将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。94℃变性7分钟；94℃1分钟，59.2℃1分钟，72℃1分钟，35个循环；72℃延伸7分钟，获得扩增产物。
3.利用限制性内切酶对步骤2所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物。
酶切反应：用NSb Ⅰ酶对PCR扩增产物进行酶切鉴定分型，反应体系为：
Figure BDA0002510966920000061
37℃反应10h，回收酶切产物。
4.对步骤3所得的酶切产物进行14％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(或者2％琼脂糖凝胶电泳分离)，获得分离产物。以下以聚丙烯酰胺分离电泳产物为例，详细说明方法及步骤。
1)14％非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳
(1)清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用0.8％琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙。
(2)在100ml烧杯内加入30％丙烯酰胺11.7ml，50％甘油2.5ml，5×TBE5ml，10％过硫酸铵0.175ml，TEMED8μl，去离子水5.617ml，混匀后迅速灌胶。
(3)当浇灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚和半小时，多余的丙烯酰胺4℃保存。随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺。
(4)凝胶聚合好后，向电泳槽加入1×TBE，用注射器冲洗加样孔。
(5)预电泳10min，同时准备点样。
(6)取2μl PCR产物置于PCR管中，加2μl上样Buffer混匀，用微量注射器点样。
(7)120伏，电泳8-10h。
2)硝酸银染色方法
(1)电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于70％乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10-15min(乙醇用完可以回收)。
(2)双蒸水洗胶2遍，每次2min，去除残留乙醇。
(3)用200ml染色液染色30min。
(4)双蒸水洗胶3遍，每次2min。
(5)用200ml显色液显色，约10-30min，当DNA带的强度合适时，倒掉显色液。
(6)去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存。
5.检测酶切结果并进行基因分型。
1)统计模型建立：根据高、低脂双向选择系随机群体的特点，构建如下线性模型：
Y＝μ+G+L+GE+F(L)+D(F,L)+G*L+G*GE+BW7+e
Y为性状观察值，μ为群体均值，G为基因型固定效应，GE为世代效应，L为品系固定效应，F(L)为品系内家系的随机效应，D(F，L)为家系与品系内母鸡的随机效应，G*L 为基因型与品系的互作效应，G*GE为基因型与世代的互作效应，BW7作为协方差变量，e 为剩余值。当Y为比率性状时，模型中不包括BW7。显著阈值为0.05，即当P≤0.05时，达到显著水平，P≤0.01时，达到极显著水平。
2)鸡SREBP1基因的多态性与肉鸡腹脂双向选择系腹部脂肪量、跖骨性状和睾丸性状的相关性分析：
利用本发明的引物(SREBP1-F、SREBP1-R)对东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择系三个世代(第8、第9和第10世代)共1394只公鸡的基因组DNA进行PCR扩增，然后针对位点g.3656C>T进行多态性分析。在高、低脂双向选择系中检测到3种基因型。对位点g.3656C>T进行酶切，以聚丙烯酰胺凝胶电泳为例，酶切产物聚丙烯酰胺凝胶电泳条带大小为208bp时，将其命名为CC基因型；酶切产物聚丙烯酰胺凝胶电泳条带大小为280bp 时，将其命名为TT基因型；该位点杂合的个体酶切产物聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳条带为两条，大小分别为208bp和280bp，将其命名为CT基因型(如图1所示)。
以东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择系第8、第9和第10世代合并群体为试验材料，分析g.3656C>T位点基因型对鸡腹脂性状、跖骨性状和睾丸性状的影响。相关分析结果显示，该位点基因型对腹脂率、腹脂重的影响达到极显著水平(P<0.01)；对跖骨重达到极显著影响，对跖骨长有显著影响；对睾丸重有接近显著的影响(表1)。等位基因频率分析显示，该位点的等位基因频率和基因型频率在两系间的分布存在极显著差异(P<0.01)(表2)。由此可见，该位点是影响鸡腹部脂肪含量、跖骨性状和睾丸性状的重要分子标记，多重比较结果显示，CC基因型是有利基因型，即具有CC基因型的个体具有腹脂含量低、跖骨结实、睾丸大的特点，选留CC基因型个体留作种用将能够同时改良以上三类性状。利用本发明的分子标记方法可实现用同一种标记同时对鸡腹部脂肪含量、腿部跖骨长度和重量以及睾丸大小进行选择，不仅为鸡育种中应用标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的腹部脂肪性状、腿部骨骼结实和繁殖性能的改良提供了一种有效的分子标记育种手段，能够更好的实现多性状平衡育种，加速肉鸡的育种进程。
表1 SREBP1基因g.3656C>T位点对鸡生长、体组成性状的影响(P值)
Figure BDA0002510966920000071
Figure BDA0002510966920000081
两系间等位基因频率和基因型频率差异进行卡方检验(表2)，g.3656C>T位点C、T等位基因和CC、CT、TT三种基因型在两系间的分布都达到极显著差异(P<0.01)。
表2 SREBP1基因g.3656C>T位点等位基因和基因型频率在两系间分布卡方检验
Figure BDA0002510966920000082
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 东北农业大学
<120> 一种同时预示肉鸡腹脂性状、腿部骨骼性状和繁殖性能的分子标记方法及应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> SREBP1-F
<400> 1
cggcgtaatg ctgacc 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> SREBP1-R
<400> 2
gtgccacact ctgccc 16

Claims (4)

1.一种同时预示肉鸡腹脂性状和腿部骨骼性状的分子标记方法，其特征在于，步骤如下：
1)根据鸡SREBP1基因SNP位点g.3656C>T上游208bp和下游72bp序列设计引物，获得扩增引物；所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；
2)利用步骤1)所得的扩增引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，获得扩增产物；所述限制性内切酶是限制性内切酶NSbⅠ；
3)利用限制性内切酶对步骤2)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；
4)对步骤3)所得的酶切产物进行电泳分离，获得分离产物；
5)对步骤4)所得的分离产物进行基因型分析，获得鸡腹脂性状和腿部骨骼性状的有利基因型；所述有利基因型为CC基因型；所述腹脂性状包括鸡的腹脂重和腹脂率；所述腿部骨骼性状包括鸡的跖骨长和跖骨重。
2.根据权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于，步骤4)所述电泳分离采用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶分离。
3.根据权利要求1所述的分子标记方法，其特征在于，步骤5)所述基因型分析通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应方法，对扩增结果进行分析。
4.权利要求1-3任意一项所述的分子标记方法在鸡腹脂率、腹脂重、跖骨重、跖骨长性状相关的遗传育种中的应用。
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