CN111557896A - 一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法 - Google Patents

一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，包括向含有干细胞的水溶液中加入聚烯丙胺；并且在加入聚烯丙胺后，向所述产品中通入二氧化碳气体。本申请技术方案可使聚烯丙胺在二氧化碳作用下，与干细胞活性因子表面的电荷发生相互作用，从而自发形成三维网络凝胶结构，将干细胞活性因子有效固定在聚烯丙胺的凝胶网络结构中，提高了干细胞活性因子在制备过程中的稳定性；另外，该凝胶结构具有良好的稳定性，可保障在常规的冷藏或室温存储条件下的结构稳定，从而保障了干细胞活性因子在产品存储过程中的稳定性。

Description

一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞使用技术领域，具体是一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法。
背景技术
近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。
干细胞在美容中的应用，最早是干细胞在整形外科中的运用，它是目前研究较多的一种干细胞美容技术。而在整形外科中应用得较多的干细胞种类主要亦是人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞等。
将细胞因子添加到美容化妆品，不仅具有一般化妆品的保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色等，越来越受到人们的关注。
含细胞因子的化妆品现已在多个国家上市，尤其是在以美容整形行业最为发达的韩国，细胞因子化妆品尤为甚行。我国亦有多家规模较大的干细胞公司开发出了细胞因子化妆品。但市面上的细胞因子化妆品一般采用干细胞培养上清液直接掺入或经冻干后掺入化妆品基质的方式制造，细胞因子含量较低，且含有大量糖分等其它杂质，使用这些化妆品后反而会造成皮肤干燥等不适感。
研究表明细胞培养上清液含有各种具有生物活性的细胞因子，它的应用可以避免干细胞美容时的产生的免疫排斥反应。但是，液态的培养上清在常温保存时间短，这就阻碍了它的推广和应用。
目前也有一些对干细胞培养上清液进行提取纯化的报道，但效果依然不佳，例如公告号为CN102600057B的专利公开了一种人胎盘干细胞提取物冻干粉的制备方法，对得到的细胞培养液采用单一的3000D滤膜进行超滤截留，其去掉了部分杂质，但是糖类等杂质仍未除掉，并且还导致细胞因子大量损失，修复效果不佳，而且同样也会造成皮肤干燥等不适感，实际应用价值较低。
此外，目前人们还难以以高效和/或稳定的性能来制取干细胞活性因子，制备得到的产品在实际存放过程中也难以保障干细胞活性因子的性能稳定，从而导致产品的使用性能与预期相比较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，以解决现有技术中制备得到的产品在实际存放过程中也难以保障干细胞活性因子的性能稳定，从而导致产品的使用性能与预期相比较差的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，具体制备步骤包括：
向含有干细胞的水溶液中加入聚烯丙胺；
并且在加入聚烯丙胺后，向所述产品中通入二氧化碳气体。
上述技术方案的有益技术效果为：
上述技术方案通过在含有干细胞的水溶液中引入聚烯丙胺，并在此基础上进一步通入二氧化碳气体，通入二氧化碳气体后，可使聚烯丙胺在二氧化碳作用下，与干细胞活性因子表面的电荷发生相互作用，从而自发形成三维网络凝胶结构，将干细胞活性因子有效固定在聚烯丙胺的凝胶网络结构中，提高了干细胞活性因子在制备过程中的稳定性；另外，该凝胶结构具有良好的稳定性，可保障在常规的冷藏或室温存储条件下的结构稳定，从而保障了干细胞活性因子在产品存储过程中的稳定性；而在实际使用过程中，洗发时的热水或者摩擦头发产生的热量可以使得二氧化碳重新释放，起到发泡作用的同时，使得凝胶结构解体，干细胞活性因子得到有效释放，从而发挥其良好的功效。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，具体制备步骤包括：
向含有干细胞的水溶液中加入聚烯丙胺；
并且在加入聚烯丙胺后，向所述产品中通入二氧化碳气体。
优选的，所述二氧化碳气体的通入量为聚烯丙胺质量的10-20％。
优选的，所述具体制备步骤包括：干细胞活性因子的制备；
所述干细胞活性因子的制备过程为：
将干细胞培养液除菌后，继续培养；
再经超声破碎后，离心分离，收集上清液；
将上清液超滤浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液。
优选的，所述具体制备步骤包括：干细胞活性因子的制备；
所述干细胞活性因子的制备过程为：
将干细胞培养液除菌后，继续培养；
再经超声破碎后，离心分离，收集上清液；
将上清液超滤浓缩，并加入纳米氧化石墨烯，即得干细胞活性因子浓缩液。
优选的，所述纳米氧化石墨烯的加入量为上清液超滤浓缩后质量的3-10％。
优选的，所述具体制备步骤包括：
(1)干细胞的获取；
(2)干细胞扩增；
(3)干细胞活性因子的制备。
优选的，所述具体制备步骤包括：
(1)干细胞的获取：将剖宫产孕妇脐带，通过华通氏胶法，获得华通氏胶；再将华通氏胶恒温培养至饱和状态后，进行传代培养；
(2)细胞扩增：待传代培养时细胞融合度达到70-80％时，继续进行传代3-6代；
(3)干细胞活性因子的制备：将传代培养后的培养液除菌后，加入生理盐水中，继续饥饿培养12-24h，再经超声破碎后，离心分离，收集上清液；将上清液超滤浓缩，并加入纳米氧化石墨烯和聚烯丙胺，经超声分散后，通入二氧化碳气体，即得干细胞活性因子浓缩液。
上述技术方案通过进一步在体系中引入纳米氧化石墨烯，利用氧化石墨烯的层间结构，作为干细胞活性因子的存放空间，将干细胞活性因子吸附固定在层间，从而可以有效保障干细胞活性因子在产品制备和存放过程中的稳定性，而氧化石墨烯层间结构中的含氧官能团与干细胞活性因子表面的官能团之间可以形成牢固的氢键吸附，从而将其吸附固定，在聚烯丙胺和二氧化碳相互作用过程中，将分散后的氧化石墨烯纳米片吸附固定在凝胶网络结构中，三者协同起到更好的稳定效果。
优选的，所述纳米氧化石墨烯的加入量为上清液超滤浓缩后质量的3-10％。
优选的，所述聚烯丙胺的加入量为上清液超滤浓缩后质量的5-10％。
优选的，所述二氧化碳气体的通入量为聚烯丙胺质量的10-20％。
实施例1
(1)干细胞的获取：将剖宫产孕妇脐带，通过华通氏胶法，获得华通氏胶；将华通氏胶放于T75培养瓶，加入适量间充质干细胞(MSC)无血清培养基，置于37℃，5％的CO2培养箱内培养；约12天细胞达到饱和状态后，进行传代培养；
(2)细胞扩增：当细胞融合度达70％时，用生理盐水冲洗培养瓶细胞1次，添加消化液(0.25％胰酶)，室温放置1分钟，镜下观察细胞接近球形，拍打瓶壁，中止消化，转移至离心管混匀，取样计数，按照8000个细胞/cm2进行传代，2天细胞密度达70％时，反复以上操作，继续进行传代3代；
(3)干细胞活性因子的制备：将传代培养后的培养液收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌后，加入生理盐水中，继续饥饿培养12h，再经超声破碎后，离心分离，收集上清液；将上清液超滤浓缩，并加入超滤浓缩液上清液质量3％的纳米氧化石墨烯和超滤浓缩液上清液质量5％的聚烯丙胺，经超声分散后，通入聚烯丙胺质量10％的二氧化碳气体，即得干细胞活性因子浓缩液。
实施例2
(1)干细胞的获取：将剖宫产孕妇脐带，通过华通氏胶法，获得华通氏胶；将华通氏胶放于T75培养瓶，加入适量间充质干细胞(MSC)无血清培养基，置于37℃，5％的CO2培养箱内培养；约12天细胞达到饱和状态后，进行传代培养；
(2)细胞扩增：当细胞融合度达75％时，用生理盐水冲洗培养瓶细胞1次，添加消化液(0.25％胰酶)，室温放置1分钟，镜下观察细胞接近球形，拍打瓶壁，中止消化，转移至离心管混匀，取样计数，按照8000个细胞/cm2进行传代，2天细胞密度达75％时，反复以上操作，继续进行传代5代；
(3)干细胞活性因子的制备：将传代培养后的培养液收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌后，加入生理盐水中，继续饥饿培养18h，再经超声破碎后，离心分离，收集上清液；将上清液超滤浓缩，并加入超滤浓缩液上清液质量5％的纳米氧化石墨烯和超滤浓缩液上清液质量8％的聚烯丙胺，经超声分散后，通入聚烯丙胺质量15％的二氧化碳气体，即得干细胞活性因子浓缩液。
实施例3
(1)干细胞的获取：将剖宫产孕妇脐带，通过华通氏胶法，获得华通氏胶；将华通氏胶放于T75培养瓶，加入适量间充质干细胞(MSC)无血清培养基，置于37℃，5％的CO2培养箱内培养；约12天细胞达到饱和状态后，进行传代培养；
(2)细胞扩增：当细胞融合度达80％时，用生理盐水冲洗培养瓶细胞2次，添加消化液(0.25％胰酶)，室温放置2分钟，镜下观察细胞接近球形，拍打瓶壁，中止消化，转移至离心管混匀，取样计数，按照8000个细胞/cm2进行传代，3天细胞密度达80％时，反复以上操作，继续进行传代6代；
(3)干细胞活性因子的制备：将传代培养后的培养液收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌后，加入生理盐水中，继续饥饿培养24h，再经超声破碎后，离心分离，收集上清液；将上清液超滤浓缩，并加入超滤浓缩液上清液质量10％的纳米氧化石墨烯和超滤浓缩液上清液质量10％的聚烯丙胺，经超声分散后，通入聚烯丙胺质量20％的二氧化碳气体，即得干细胞活性因子浓缩液。
实施例4
本实施例相比于实施例1而言，未添加氧化石墨烯，其余条件保持不变。
实施例5
本实施例相比于实施例1而言，未添加聚烯丙胺其余条件保持不变。
实施例6
本实施例相比于实施例1而言，未通入二氧化碳气体，其余条件保持不变。
将实施例1-6所得产品进行性能测试，具体测试方法如下所述：
取实施例1-6产品干细胞活性因子浓缩液，采用重组人源抗体包被的酶联免疫试剂盒(R&D公司供)测定干细胞活性因子(测定了四种典型活性因子EGF、FGF、VEGF、IL-6)的含量，以上述四种典型活性因子的总量作为浓缩液的总活性因子含量；
首先先测定刚制备得到的实施例1-6产品干细胞活性因子浓缩液中干细胞活性因子的含量，将产品于室温条件下静置放置28d后，再次测量干细胞活性因子浓缩液中干细胞活性因子的含量，计算得到干细胞活性因子的损失率；
损失率＝(静置后含量-刚制备得到的含量)/刚制备得到的含量；
具体测试结果如表1所示：
表1：产品性能测试结果
Figure BDA0002553088060000091
由表1测试结果可知，采用本申请技术方案得到的产品可以在产品存储过程中，损失率较低，可有效保证干细胞活性因子的稳定，而缺少氧化石墨烯后，性能下降明显，但是相比于缺少聚烯丙胺或二氧化碳气体后造成的性能下降较少，换言之，聚烯丙胺和二氧化碳对产品稳定性的影响更大。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (10)

1.一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，其特征在于，具体制备步骤包括：
向含有干细胞的水溶液中加入聚烯丙胺；
并且在加入聚烯丙胺后，向所述产品中通入二氧化碳气体。
2.根据权利要求1所述的一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，其特征在于，所述二氧化碳气体的通入量为聚烯丙胺质量的10-20％。
3.根据权利要求1所述的一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，其特征在于，具体制备步骤包括：干细胞活性因子的制备；
所述干细胞活性因子的制备过程为：
将干细胞培养液除菌后，继续培养；
再经超声破碎后，离心分离，收集上清液；
将上清液超滤浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液。
4.根据权利要求3所述的一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，其特征在于，具体制备步骤包括：干细胞活性因子的制备；
所述干细胞活性因子的制备过程为：
将干细胞培养液除菌后，继续培养；
再经超声破碎后，离心分离，收集上清液；
将上清液超滤浓缩，并加入纳米氧化石墨烯，即得干细胞活性因子浓缩液。
5.根据权利要求4所述的一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，其特征在于，所述纳米氧化石墨烯的加入量为上清液超滤浓缩后质量的3-10％。
6.根据权利要求1所述的一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，其特征在于，所述具体制备步骤包括：
(1)干细胞的获取；
(2)干细胞扩增；
(3)干细胞活性因子的制备。
7.根据权利要求1所述的一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，其特征在于，所述具体制备步骤包括：
(1)干细胞的获取：将剖宫产孕妇脐带，通过华通氏胶法，获得华通氏胶；再将华通氏胶恒温培养至饱和状态后，进行传代培养；
(2)细胞扩增：待传代培养时细胞融合度达到70-80％时，继续进行传代3-6代；
(3)干细胞活性因子的制备：将传代培养后的培养液除菌后，加入生理盐水中，继续饥饿培养12-24h，再经超声破碎后，离心分离，收集上清液；将上清液超滤浓缩，并加入纳米氧化石墨烯和聚烯丙胺，经超声分散后，通入二氧化碳气体，即得干细胞活性因子浓缩液。
8.根据权利要求7所述的一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，其特征在于，所述纳米氧化石墨烯的加入量为上清液超滤浓缩后质量的3-10％。
9.根据权利要求7所述的一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，其特征在于，所述聚烯丙胺的加入量为上清液超滤浓缩后质量的5-10％。
10.根据权利要求7或9任一项所述的一种用于毛囊活化功能的细胞因子的制备方法，其特征在于，所述二氧化碳气体的通入量为聚烯丙胺质量的10-20％。
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